3

Veleučilište u Požegi

Poljoprivredni odjel

Smjer: Vinogradarstvo – Vinarstvo – Voćarstvo

ZAVRŠNI RAD

Tema: Virusi i viroze vinove loze

Predmet: Fitopatologija

Student: Mentor:Maja Far mr.sc. Brankica Svitlica

Broj indeksa:249/02

U Požegi, svibanj, 2009. godine

4

SADRŽAJ

Uvod………………………………………………...…………………………………….31.VIRUSI…………………….……………………….……...........................................4 1.1. Povijest virologije…………..…………………………..……………………....5 1.2. Osnovne karakteristike virusa ………………………………..…………..…..6

1.3. Građa virusa…………………………..…………..…………………………….7 1.3.1. Oblik virusnih čestica………………………..……………….…………….8 1.3.2. Veličina virusnih čestica…………………..…………..............................8 1.4. Viroidi i satelitni virusi……….………...……………………………………….92. NAČINI NA KOJE SE PRENOSE VIRUSI……………………………….……...10

2.1 Mehanički prijenos virusa …………...………….……….…………………..11 2.2. Prijenos virusa vegetativnim razmnožavanjem virusa……………………11 2.3. Prijenos virusa insektima………………………………..............................11 2.3.1. Odnos virus – vektor ima nekoliko slučajeva…………………………..12 2.3.2. Lisne uši……………………...…………………………………………….12 2.3.3. Prijenos virusa kornjašima...….………………….….............................14 2.3.4. Prijenos virusa nematodama………………….…….............................14 2.4. Prijenos virusa gljivicama………………………….…………………………15 2.5 Prijenos virusa sjemenom…………..………………..………………………16 2.6. Prijenos virusa polenom……………..……………………………………….16 2.5. Prijenos virusa Vilinom kosicom (cuscuta spp.)…………………………...163. OSNOVNI SIMPTOMI VIRUSNIH INFEKCIJA……….……...……………….....17 3.1. Lokalni simptomi………..………………...………..…………………………17 3.2. Sistemični simptomi………………………………………………………......18 3.2.1. Sistemični simptomi nastali zbog promjena u boji……………………..18 3.2.2. Sistemični simptomi nastali zbog histopatoloških promjena…...…..…19 3.2.3. Sistemični simptomi nastali zbog patomorfoloških promjena……..…214. LABORATORIJSKA TESTIRANJA BOLESTI VINOVE LOZE…………….…23 4.1. Dijgnostika na terenu…………………………………….……………..…….23 4.2. Serološka testiranja ELISA………………………..………………....………24 4.3. Molekularna testiranja PCR…………………………………...……………..26 4.4. Biološko indeksiranje…………………………….……………..…………….27 4.5. Pouzdanost laboratorijskih testiranja………………………………..……...27 4.6. Selekcija i rukovanje uzorcima……………………………………………....28 4.6.1. Upute za uzimanje uzoraka i testiranje na bolesti……………………..295.VIROZE VINOVE LOZE……………….…………..……………………...………...30 5.1. Klasifikacija virusa………………………………………………….…………31 5.2. Taksonomija virusa na vinovoj lozi (prema Walter et Martelli, 1966.)......32 5.3. Virusi infektivne degeneracije……………………………………….……....34 5.3.1. Sindrom deformacije lišća – lepeza lista………...…..………………...35 5.3.2. Sindrom žućkasto – smeđeg mozaika vinove loze……………....…....36 5.3.3. Virus mozaika gušarke …………………….………………...…………..36 5.4. Virus uvijenosti lista……….……………………...………………….……….37 5.5. razni tipovi naboranosti drveta vinove loze………….……………………..38 5.6. Manje važni virusi i njima slične parazitske bolesti…...….….…………....40 5.6.1. Priraslice (enacije) na listovima (grapevine enation) ..........................40 5.6.2. Nekroza žilica lista (vein necrosis)……………..………………………..40

5

5.6.3. Mozaik uz glavne žile lista (grapevine vein mosaic disease) .............41 5.6.4. Šarena pjegavost lista (grapevine fleck disease) …………….…….…41 5.7. Viroidne bolesti vinove loze……….…………………...…………….………42 5.7.1. Žuta pjegavost (vein speckle) …………………………….….……........42 5.8. Fitoplazme - infektivne žutice vinove loze …………….……...….………..426. OSNOVNE MJERE SUZBIJANJA VIRUSNIH ZARAZA……….……………...45 6.1. Uklanjanje i izbjegavanje izvora zaraze …………………...………...….…45 6.2. Suzbijanje vektora ………………………...….…………………...…………46 6.3. Sprečavanje virusnih infekcija kultiviranjem otpornih biljaka ………....…46 6.3.1. Certifikacija…………….…………………………………………...…….. 47 6.4. Glavni termini koji se danas upotrebljavaju u označavanju otpornosti biljaka ………………..…………………………………..…………………….48Zaključak ………………………..….....……………………………………………….49Literatura …………………………….…..…………………………………………….50

6

Uvod

Virusi uzrokuju bolesti u čovjeka, životinja i u biljaka. Bitno se razlikuju od svih

parazitskih bolesti. Zahvaljujući molekularnoj biologiji otkrivene su mnoge bitne

osobine virusa, ali još su uvijek velika nepoznanica.

Virusi uzrokuju mnogo važnih biljnih bolesti, koji uzrokuju ogromne gubitke u

prinosima, proizvodnji i kvaliteti u svim dijelovima svijeta.

Do danas je opisano više od 700 biljnih virusa, od toga 60 - ak na vinovoj lozi.

Za razliku od gljivičnih oboljenja koje se uspješno suzbijaju, čokoti zaraženi virusima

ne mogu se izliječiti. Jednom zaražena biljka zaražena je cijeli životni vijek, time daje

slabiji ili nikakav urod. Viruse nije lako otkriti u biljkama. Simptomi mogu biti više ili

manje izraženi, a neki se čak mogu zamijeniti drugim bolestima. Uzrokuju razne

promjene : deformacija biljnih dijelova, šarenilo listova, kržljanje biljaka te druge

promjene.

Mnogi bakterijski virusi mogu posve razoriti bakterijsku stanicu u kojoj

paratiziraju, a na mnogim bakterijskim osobinama se temelje biotehnološki procesi.

Biljne viroze u modernom poljodjelstvu vrlo brzo mogu poprimiti epidemijske

razmjere, i sve su prisutniji ograničavajući čimbenici u biljnoj proizvodnji. Zbog toga je

kod podizanja novih nasada bitno, da je sadni materijal sanitarno zdrav. Kod

vegetativno razmnožavanih nasada, kao vinove loze provode se preventivno mjere;

proizvodi se cijepljeni sadni materijal sa zdravstvenim statusom, koji je kompatibilan

sa ekonomskom isplativošću.

Zbog nekontrolirane domaće i internacionalne trgovine (posebno poslije 2.

svjetskog rata), sanitarno nekontrolirani sadni materijal je uzrokovao distribuciju

infektivnih bolesti i njihovih agenasa, virusa, viroida i intracelularnih prokariota po

cijelom svijetu.

Karantenske mjere nisu dovoljne da zaustave širenje, no moderna tehnologija je

razvila učinkovite alate, za proizvodnju sanitarno poboljšanog sadnog materijala,

otkrivanjem infektivnog agensa i uspostavljanjem učinkovite certifikacijske sheme.

7

1. VIRUSI

Naziv virus dolazi od latinske riječi virus što znači otrov. Bolesti uzrokovane

virusima zovemo viroze, a znanost o virusima naziva se virologija. Virusi su najmanji

i najjednostavniji mikroorganizmi koji nemaju staničnu građu. Nalaze se na najnižem

stupnju organizacije živih sustava. Metabolički su neaktivni i na granici su žive i

nežive prirode .

Virusi uzrokuju mnogo bolesti koji su od internacionalne važnosti. Uzrokuju

bolesti u čovjeka, životinja i u biljaka, a napadaju i bakterije i druge mikroorganizme.

Među ljudskim i životinjskim virusima su osobito poznate: boginje, dječja paraliza,

gripa, hepatitis, prehlada, bjesnoća, slinavka, šap, žuta groznica, HIV-AIDS, SARS te

mnoge druge bolesti.

Definicija virusa prema Fraenkel – Conrat 1988. godina (1.):

Virusi su zarazni uzročnici (čestice) koji sadrže samo jedan tip nukleinske

kiseline: DNA ili RNA; njihova je nukleinska kiselina umotana u proteinski omotač

izgrađen od jednog ili nekoliko proteina; kod nekih virusa oko proteinskog omotača

dolazi složeno građena ovojnica izgrađena od proteina, lipida i ugljikohidrata; virusi

su sposobni svoju nukleinsku kiselinu prenositi od jednog do drugog domaćina;

sposobni su, dalje, nametnuti stanici domaćina svoju genetičku informaciju, zbog

čega se mogu koristiti enzimatskim ustrojem domaćina za svoje razmnožavanje; neki

virusi mogu svoju nukleinsku kiselinu ugraditi na više ili manje reverzibilan način u

DNA domaćina te tako postati latentni ili perzistentni: neki su od takvih virusa

sposobni transformirati genom stanice domaćina i ometati njezin kontrolni

mehanizam rasta, te uzrokovati tumore.

8

1.1. Povijest virologije

1886. je Adolf Mayer opisao mozaik duhana i uspio sokom zaraženih biljaka

reproducirati simptome.

1892. ruski mikrobiolog Dimitrije Josifovič Ivanovski je proučavajući mozaičnu

bolest duhana, utvrdio da se radi o česticama manjim od bakterija, i njemu se

pripisuju zasluge da je otkrio viruse.

1898. mikrobiolog Martinus Williem Beijerinck je izvodeći identične pokuse,

utvrdio da se radi o novom tipu infektivnog uzročnika.

1935. W. M. Stanley uspijeva izolirati virus (TMV) u čistom stanju.

1937. Bawden i Pirie otkrivaju da u građi virusa mozaika duhana (TMV), osim

proteina, ima i nukleinska kiselina.

1939. promatrana je virusna čestica (TMV) pod elektronskim mikroskopom,

Kausche, Pfankuch i Ruska.

Nakon toga slijedi dvadesetogodišnje razdoblje brojnih drugih otkrića koji su se

ticala fizičke građe biljnih virusa.

Iako su virusi otkriveni krajem 19. stoljeća oni su se u prirodi javili mnogo ranije.

Iz brojnih opisa bolesti koje su harale davnim civilizacijama može se zaključiti da su

neke od njih bile virusne prirode. Primjerice prema sačuvanim opisima i crtežima

bolesnih ljudi, vidi se da je već u 10. stoljeću prije Krista u kini postojala virusna

bolest koja bi opisom odgovarala velikim boginjama. Na crtežima starih Egipćana vidi

se da su ljudi u to doba bolovali od dječje paralize. I Aristotel ( 4. st . pr. Krista )

spominje bjesnoću pasa. Postoje opisi biljnih bolesti iz 8. stoljeća za koje se utvrdilo

da su virusnog podrijetla. U 16. stoljeću u Nizozemskoj su na cijeni bili tulipani koji su

na laticama imali bijele ili žućkaste pruge (virus šarenila cvijeta tulipana). Gotovo

stotinu godina prije Ivanovskijevog otkrića engleski liječnik Jenner zapazio je da žene

koje muzu krave često obolijevaju od blagog oblika boginja, koje su sa kravljeg

vimena prešle na ruke žena. Ta bolest nije imala štetne posljedice za žene ali je

Jenner zapazio da su te žene bile kasnije zaštićene od velikih boginja koje su

pogubne za čovjeka. Dakle muzačice su bile na neki način cijepljene ili vakcinirane

(lat. Vacca = krava) blagim kravljim boginjama koje su uzrokovale imunost

(otpornost) organizma na prave, velike boginje. 1798. godine načinjeno je cjepivo

9

protiv velikih boginja. Isto tako je L.Pasteur (1885.) načinio cjepivo protiv bjesnoće, a

i ne znajući da bolest uzrokuje virus.

1.2. osnovne karakteristike virusa:

- virusi su obligatni paraziti;

- submikroskopske su veličine (samo se virus velikih boginja čovjeka može

vidjeti dobrim svjetlosnim mikroskopom);

- prolaze kroz bakterijski filtar

- umnažaju se samo u živoj stanici odgovarajućeg domaćina (ne

razmnožavaju se);

- nemaju vlastiti fermentni sustav niti izmjenu tvari (metabolizam);

- otporni su prema antibioticima.

Svi obvezatni paraziti stanične građe crpe iz žive stanice domaćina tvari, koje

uključuju u svoj metabolizam i tako osiguravaju svoje životne funkcije. Budući da

virusi nemaju vlastiti metabolizam ne mogu se neposredno koristiti sastojcima iz

stanice domaćina, oni zato mogu preusmjeriti metabolizam domaćina prema

stvaranju novih virusnih čestica.

Kada virusna čestica dospije u stanicu domaćina, ona se rastavlja na sastavne

dijelove (protein i nukleinsku kiselinu). Virusna nukleinska kiselina primorava da

stanica domaćina svoje životne funkcije usmjerava na sintezu pojedinih dijelova

virusnih čestica. Sastavljanjem tih dijelova nastaju nove virusne čestice. Virus sve što

mu nedostaje za reprodukciju uzima od stanice domaćina (energiju, mnoge enzime,

aminokiseline, nukleotide i dr.).

Specijalizirani su patogeni tako da neki parazitiraju samo u bakterijskim

stanicama (bakteriofagi), neki samo u animalnim stanicama (animalni virusi), a neki

samo u biljnim stanicama (biljni virusi).

Virusi nemaju staničnu građu, pa se za tijelo virusa kaže da čini česticu,

odnosno virusnu elementarnu česticu. Samo ona virusna čestica koja je potpuna i

može se razmnožavati odnosno koja može uzrokovati zarazu, zove se virion. Dakle

virion je kompletna virusna čestica koja s može razmnožavati.

10

Dok antibiotici mogu biti vrlo efektivni protiv bolesti koje uzrokuju bakterije,

nemoćni su protiv virusa. Borba protiv virusa oslanja se na cjepiva u kojima se

nalaze uzgojena antitijela koja olakšavaju simptome i potiču obrambeni sustav.

1.3. Građa virusa :

slika 1 - građa: A) neovijenog i B) ovijenog tipa virusa

1. kapsida , 2. nukleinska kiselina , 3. kapsomer , 4. Nukleokapsid , 5. Virion ,

6.ovojnica , 7. projekcije ili peplomere

Virusnu česticu (virion, 5) čini nukleokapsida (4) koja se sastoji od nukleinske

kiseline (DNA ili RNA) (2) – i sadrži nasljedne upute potrebne za umnožavanje

virusa, tvori virusni genom. Za infekcioznost virusa značajna je; Kapsida (1) –

proteinska ljuska koja obavija nukleinsku kiselinu. Građena je od kapsomera (3) i

nositelj je virusnih antigena.

Kod složenijih virusa kapside su obavijene virusnom ovojnicom (6), osim

proteina sadrži još i lipide i ugljikohidrate od kojih je ovojnica građena.

11

Iz nje strše glikoproteinski izdanci (7) kojima se virus prihvaća na stanicu

primatelja. Takvi su npr. virusi gripe, bjesnoće i HIV.

U kemijskom smislu biljni virusi su nukleoproteidi, sastoje se od jednog tipa

nukleinske kiseline (DNA ili RNA) i bjelančevina (proteina).

Dok se u staničnim organizmima nalaze uvijek obje vrste nukleinskih kiselina

DNA i RNA kod virusa dolazi samo jedna od njih. Zahvaljujući istraživanju virusa

doznalo se da i RNA može biti nosilac genetske informacije.

Nukleinske kiseline su građene od nukleotida. Nukleotidi su građeni od purinske

i pirimidinske baze, šećera; riboze u RNA i deoksirboze u DNA, i ostataka fosfatne

kiseline.

Jedan dio proteina izgrađuje kapsidu (građevni proteini), i određuju oblik virusa;

kod poduženih oblik valjka, a kod poliedričnih oblik pravilnog poliedra. Drugi dio

proteina su virusni enzimi (funkcionalni enzimi). Složeniji virusi koji sadrže ovojnicu

sadrže više vrsta proteina. Najveći dio mase virusnih čestica otpada na proteine.

U česticama biljnih virusa mogu se naći i anorganski i organski kationi te znatne

količine vode.

1.3.1. Oblik virusnih čestica

Produženi oblik - zavojit (helikalni) ili spiralni; virusi štapićastog ,nitastog oblika,

kapsomeri su različitih veličina

Okruglasti - izometrični (poliedrični) ili kubični; kuglasti virusi, jednaki kapsomeri.

Slika. 2 - Kuglasti virusi slika 3 - štapićasti virusi slika 4 - nitasti virusi

1.3.2. Veličina virusnih čestica

Virusi su submikroskopskih veličina, i ne mogu se vidjeti bez elektronskog

mikroskopa. Njihove dimenzije variraju od svega nekoliko desetaka nm do preko

dvije tisuće nm. Nanometar (nm), je milijunti dio milimetra.

12

Viroidi i satelitni virusi

Viroidi - viroidi su infektivne čestice manje od virusa. Gole su jer ne posjeduju

kapsidu. To su jednolančane kružne molekule RNA koje su infektivne i uzrokuju

bolesti viših biljaka. Ne upravljaju sintezom proteina jer su suviše mali.

Viroidna RNA dosta je stabilna i neobično infekciozna; izračunato je da u 1g

ukupne RNA, koja je izolirana iz biljke inficirane viroidom, ako se razrijediti u gotovo 2

milijuna litara vode takva otopina ostaje infekciozna.

Prvi puta su otkriveni 1984, iznimno su učestali i distribuirani su širom svijeta.

Satelini virusi – virusi koji se ne mogu se razmnožavati samostalno, bez

pomoći određenih drugih virusa (virus pomagač), a mogu stvarati vlastiti proteinski

omotač.

Virusne satelitne RNA su gole molekule RNA i ne mogu stvarati vlastiti

proteinski omotač, dolaze unutar omotača virusa pomagača.

13

2. NAČINI NA KOJE SE PRENOSE VIRUSI

Neki važniji životinjski i ljudski virusi se mogu širiti preko aerosola. Virusi imaju

sposobnost da uđu u životinjsku stanicu direktno, stapajući se sa staničnom

membranom.

Infekcija virusima ostvaruje se pasivno. Biljni virusi se ne mogu apsorbirati na

površinu biljne stanice. Razlog tomu je činjenica što se na površini biljne stanice

nalazi kutikula ili kutinizirani slojevi, te čvrsta stanična stjenka na kojima nema

receptora za koje bi se virusne čestice mogle vezati. Isto tako, biljni virusi nisu u

stanju probiti staničje biljke i ući u unutrašnjost stanice. Oni ulaze u stanicu domaćina

pasivno preko rana u epidermi biljnih stanica, pa se zbog toga za biljne viruse kaže

da su paraziti rane.

Da bi opstali, virusi se kao obligatni paraziti moraju sa vremena na vrijeme

prenositi sa zaraženih biljaka na zdrave, nezaražene biljke. Ako se virus nalazi u

jednogodišnjoj ili dvogodišnjoj biljci, on će se morati češće prenositi na zdrave biljke

nego ako se nalazi u nekoj višegodišnjoj biljci.

Prenošenje virusa sa bolesne na zdravu biljku preko rana naziva se mehaničkim

prijenosom virusa. U prirodi on se zbiva posredovanjem životinjskih ili biljnih

organizama; ti organizmi probijaju staničnu epidermu radi uzimanja soka kojim se

hrane.

Za razliku od pseudogljiva, bakterija i nekih gljiva kojima je neophodna kap vode

u početnoj fazi infekcije, virusima nije potrebna voda.

Svi organizmi koji prenose viruse s jedne biljke na drugu nazivaju se vektorima.

Mehanički prijenos u prirodi bez sudjelovanja vektora, to jest, neposrednim

kontaktom bolesne i zdrave biljke, ograničen je samo na neke viruse.

14

2.1. Mehanički prijenos virusa

U prirodi se na ovaj način virusi ne šire često. Neki se virusi mogu mehanički

prenijeti s inficirane na zdravu biljku kad se listovi inficirane biljke za vrijeme vjetrovita

vremena trljaju o listove susjednih zdravih biljaka. Mehanički je prijenos moguć i

preko kontakta korijena zdrave biljke s korijenom zaražene biljke. Ako se u tlu nađu

ostaci tkiva zaraženog ili čak same virusne čestice apsorbirane na tlo, mlade sadnice

često će se inficirati tim virusom. Infekcija nastaje tako, što se korjenčići oštete za

vrijeme probijanja kroz grube čestice tla. Češća je pojava da se virusi mehanički

prenose za vrijeme agrotehničke obrade usjeva. Na primjer neki se virusi mogu

prenijeti kontaminiranim rukama, odjećom i alatom.

2.2 Prijenos virusa vegetativnim razmnožavanjem biljaka

Ljudi su najučinkovitiji prijenosnici virusnih bolesti preko premještanja i

razmnožavanja reznica, cijepljenjem, lukovicama, gomoljima. Budući da većina

virusa uzrokuje sistemičnu (sveobuhvatnu) infekciju, svaki biljni dio sadrži virus, i

cijepljenjem se viroza prenosi na potomstvo.

Na ovaj način virusi se šire ne samo lokalno nego i interkontinentalno.

2.3. Prijenos virusa insektima

Među organizmima koji prenose viruse (vektori) najviše je insekata. Oko 94%

vrsta pripada razredu Arthropoda (člankonošci) , a 6% razredu Nematoda (crvi);

većinu artropodnih vektora (oko 99%) čine insekti. Više od 70% insekata koji prenose

biljne viruse pripada redu Homoptera (jednokrilci). Tom redu pripada i porodica

Aphididae (lisne uši) čiji su članovi najvažniji prenosioci biljnih virusa, no tu su još i

cvrčci, crvci, štitasti moljci, cikade, stjenice, iz reda Cloeptera (kornjaši), iz reda

Acarina i porodice Eriophydae - grinje, red Thysanoptera – resičari (tripsi)

15

2.3.1. Odnos virus vektor ima nekoliko slučajeva:

Veza koja se zbiva unutar usnog ustroja insekta gdje se virus apsorbira i onda

oslobađa u različite biljne stanice dok se insekt hrani. Insekt gubi virus ubrzo nakon

što se hranio nezaraženom biljkom. Takva veza se stoga naziva kratkotrajna.

Druga veza je trajna ili cirkulativna. Virus cirkulira unutar vektora i ispušta se

preko žlijezda slinovnica. Vektor se treba hraniti nekoliko sati na zaraženoj biljci dok

se virus ne prenese u vektor. Jednom kada vektor postane virulentan ostat će još

neko vrijeme.

U nekim slučajevima virus se razmnožava unutar vektora i takva veza se naziva

propagativna.

Slika 5 - lozin zeleni cvrčak, slika 6 - šteta od cvrčka na vinovoj lozi, slika 7 - resičar ili trips

2.3.2. Lisne uši

Lisne uši su najvažniji prenosioci virusa. Hrane se biljnim

sokom. Sišući sok zaraženih biljaka (u prvom redu iz lista), one

mogu prenositi biljne viruse na tri načina: na neperzistentan,

semiperzistentan i perzistentan način, pa zbog toga govorimo

o neperzistentnim, semiperzistnimn i perzistentnim virusima.

Slika 8 - Lisna uš

16

a) Neperzistentan način prijenosa virusa

— Virus ulazi u insekta za vrijeme njegova hranjenja biljnim sokom. Vrijeme

„uzimanja” virusa vrlo je kratko; ono može trajati od samo nekoliko sekundi do

nekoliko minuta.

— Virus se može prenijeti na zdravu biljku odmah nakon što je insekt rilcem

probio epidermu biljke (faza inokuliranja virusa).

— Insekti razmjerno brzo nakon napuštanja inficiranih biljaka (obično unutar

četiri sata) gube sposobnost daljnjeg inficiranja drugih biljaka. To se događa zato što

se nerezistentni virusi zadržavaju na usnim dijelovima insekta; ti se virusi ne

razmnožavaju u unutrašnjosti insekta. Smatra se da je nerezistentan način prijenosa

virusa u biti pasivan proces; u njemu se virus prenosi preko usnih dijelova kukca, koji

su kontaminirani virusom.

b) perzistentan način prijenosa virusa

Virusi koji se prenose lisnim ušima na perzistentan ili cirkulativan način imaju

ove osobine:

— Faza stjecanja virusa traje dugo. Iako neke uši mogu prenijeti pojedini

rezistentan virus nakon što je faza stjecanja virusa na inficiranoj biljci trajala

razmjerno kratko (pr. 20 minuta), ipak prijenos je mnogo uspješniji ako vrijeme

stjecanja virusa traje između šest i dvanaest sati.

— Insekt ne može odmah nakon uzimanja virusa prenijeti virus na biljku; kod te

vrste prijenosa postoji latentni period koji traje 12 ili više sati. U tom razdoblju insekt,

iako sadrži virusne čestice, ne može ih prenijeti na zdravu biljku.

— Nakon latentnog perioda insekt je sposoban u duljem razdoblju inficirati

zdrave biljke. On može najmanje sedam dana biti izvor virusnih zaraza. To je

vrijeme, međutim, obično znatno duže, a katkad insekt, nakon što je jednom stekao

virus, može cijelog života ostati izvor zaraza.

— Rezistentan virus zadržava se u insektu u svim razvojnim stadijima koji se

smjenjuju u insektovom životnom ciklusu; ta je pojava poznata pod nazivom

transstadijalni prijenos virusa.

Rezistentni ili cirkularni virusi mogu se podijeliti u dvije kategorije: jednu

kategoriju čine virusi koji se ne razmnožavaju u insektu to su nepropagativni virusi.

17

Za razliku od takvih virusa, neki se rezistentni virusi mogu razmnožavati u

insektu a to su propagativni virusi. Katkada te propagativne rezistentne viruse

vektori prenose preko jajašaca na svoje potomstvo. Taj se tip prijenosa virusa naziva

transovarijalnim prijenosom.

c) Semiperzistentan način prijenosa virusa

Ima virusa, koji se po načinu prijenosa lisnim ušima nalaze između

nerezistentnih i rezistentnih virusa. To su semiperzistentni virusi. Oni su

neperzistentni po tome što ne cirkuliraju unutar svojih vektora. No, njihov vektor

zadržava sposobnost da ih stalno kroz tri-četiri dana prenosi. Vektor može steći virus

za 30 minuta, ali je prijenos obično znatno uspješniji ako je hranjenje vektora na

inficiranoj biljci trajalo nekoliko sati. Ono što je zajedničko semiperzistentnim i

perzistentnim virusima jest to da jedni i drugi dolaze u floemu. Zbog toga kod oba

tipa virusa vektor mora svojim rilcem probijati duboko u biljno tkivo da bi uzeo virus i

da bi ga poslije na isti način prenio u druge biljke.

Do pojmova nerezistentan, semirezistentan i rezistentan došlo se istraživanjem

prijenosa virusa lisnim ušima.

2.3.3. Prijenos virusa kornjašima

Prenose oko 45 različitih biljnih virusa, zanimljivo je to da nemaju usni ustroj za

sianje već za grizenje. Do danas su poznate četiri skupine koje se prenose

kornjašima : to su virusi iz rodova: Bromovirus, Comovirus, Tymovirus i Sobemovirus.

2.3.4. Prijenos virusa nematodama

Slika 9 - Nematoda : Xiphinema indeks, slika 10 - guke na korijenu vinove loze

18

Nematode su najbrojniji višestanični organizmi na zemlji. Spadaju u valjkaste

crve, i paraziti su bilja, insekata i životinja. U razredu nemathelminthes klasificirano

je oko 20 000 vrsta. Veličine su od 300 mikrona do preko 8 metara, no većina su

veličine od 400 mikrona i 5 milimetara. U svakom cm³ tla nalazi se od 5 – 100 raznih

vrsta nematoda.

Nematode koje žive u zemlji važni su vektori biljnih virusa. Oni se hrane

sadržajem stanica biljnog korijenja. Glavni dio njihova usnog ustroja je u obliku stileta

(bodlji) kojim probijaju površinu korijena i pomoću kojeg sišu sadržaj stanice. Na tim

mjestima nastaju zadebljanja - ''guke'' (slika10).

Zaražene nematode se hrane od biljke do biljke i na taj način šire bolest, no šire

se i preko zemlje i vode.

Virusi koje prenose nematode se zovu NEPO virusi (nematode transmitted

polyhedral – shaped), pliedričnoga mnogoplošnog oblika. U tu skupinu su svrstani:

virus lepezastog lista vinove loze (GFLV), virus mozaika gušarke (ArMV), virus crnih

prstenova rajčice (TBRV), virus prstenaste pjegavosti maline (RV), latentni virus

prstenaste pjegavosti jagode (SRLV) i virus žućkasto smeđeg mozaika (GCMV).

Kod nas su u vinogradima i voćnjacima utvrđene vrste Xiphinema indeks i

Longidorus, koje su inače prenositelji virusa infektivne degeneracije vinove loze.

2.4. Prijenos virusa gljivicama

Prijenos virusa je povezan sa stvaranjem zoospora u ciklusu gljivice. Gljivice

koje prenose viruse su obligatni paraziti na korijenu biljaka. Postoje dva načina

stvaranja zoospora i dva načina prijenosa virusa.

U prvom slučaju; gljivica inficira stanice korijena inficiranog virusom i na njima

stvara zoosporangije, u zoosporangijima se stvaraju zoospore (pokretne spore) koje

posjeduju jednu ciliju za koju se virus pričvrsti. Zoospore izlaze iz biljnih stanica i

plivaju kroz smjesu vode i tla i pričvršćuju se za korijen druge zdrave biljke.

U drugom slučaju; gljivice se mogu pri spolnom razmnožavanju fuzionirati u

parove i stvoriti zigote koje mogu ući i stanice korijena i stvoriti mirujuće spore u

kojima se virus pritaji i čeka da gljivice dočekaju povoljne uvijete za klijanje, kada

proklijaju stvaraju se zoospore preko kojih se virus prenosi na korijen biljke.

19

2.5. Prijenos virusa sjemenom

Prijenos virusa sjemenom ima veliku važnost ne samo za širenje virusa nego i

za kontinuirano održavanje štetnih virusnih bolesti biljaka u prirodi. Virusi se prenose

sjemenom preko različitih dijelova sjemenke. Neki se prenose preko sjemene ljuske

(teste); kod tih sjemenki dolazi do (površinske) kontaminacije sjemenke, pa se virus

može eliminirati ako se takve sjemenke tretiraju nekim kemijskim sredstvima, pr.

fosfatima. Neki se drugi virusi mogu također naći na površini nezrelih sjemenki. No,

nakon pune zrelosti, kad se sjemenke dobro osuše, virus nestaje s njihove površine.

Drugi način prijenosa virusa sjemenom jest prijenos preko sjemenog zametka

(embrija) biljke. Takav prijenos imaju virusi koji ulaze u embrionalne stanice. Većina

biljnih virusa koji se prenose sjemenom, prenose se preko embrija, pa je to najvažniji

način prijenosa virusa sjemenom. Zna se da je za prijenos virusa preko embrija

nužno da se matična biljka rano u svojem životu inficira virusom. Do zaraze u tom

slučaju mora doći prije cvatnje i prije nego biljka stvori ženske gamete. Iz toga

proizlazi da se infekcija zbiva preko ženskih gameta. U pogledu prijenosa virusa od

matične biljke na zametak još je dosta nejasnoća.

2.6. Prijenos virusa polenom

Neki se virusi mogu prenositi polenom zaraženih biljaka. Inficirani polen pri

oprašivanju zdravih biljaka može zaraziti ženske gamete. Vjerojatno je da virusi koji

se prenose polenom ulaze u jajnu stanicu zajedno s muškim gametama kroz

peludovu cjevčicu.

2.7. Prijenos virusa vilinom kosicom (cuscuta spp.)

To je parazitna biljka, koja svojim korjenastim prihvataljkama (haustorijama)

ulazi u tkivo domaćina i povezuje sa njegovim žilnim sustavom. Ovaj način prijenosa

nema gospodarko značenje.

20

3. OSNOVNI SIMPTOMI VIRUSNIH INFEKCIJA

Svi simptomi jedne bolesti naziva se sindrom.

Virusi uzrokuju raznolike simptome na zaraženoj biljci, od nevidljivih do smrti

biljke. Mnogi virusi vinove loze uzrokuju smanjenje produktivnosti i kasnije dozrelosti.

Virusi mogu inficirati vinovu lozu bez da biljka pokazuje neke očite simptome

(latentni ili spavajući virusi). Jačina razvoja simptoma virusa i utjecaja na biljku ovisi o

virusnoj vrsti, vrsti biljke i okolišu. Latentni virus može postati virulentan, uslijed

promjena u okolišu ili razmnožavanja na različite podloge. Simptomi mogu biti slabo

uočljivi pa je potrebno provesti testiranja, da bi se detektirao virus u biljci.

Simptomi kao što su odbacivanje mladica, ubrzano propadanje loze, prestanak

rasta, kasnije cvjetanje, kasno i slabo dozrijevanje grožđa su jasnije vidljivi. Simptomi

se javljaju na lišću, grožđu, i trsu, a to su: crvenilo lišća na crvenim sortama vinove

loze, kraći internodiji, šarenilo lišća, fascijacija trsa, dvostruka koljenca (internodiji),

neumjeren rast iz sporednih pupova, rastresiti grozdovi sa malim i velikim bobicama,

kovrčanje lišća u jesen, izbrazdanost drveta i td.

Vanjski simptomi su promjene na biljci koji se vide golim okom. Razlikuju se

dvije vrste vanjskih simptoma: lokalni i sistemični simptomi.

3.1 Lokalni simptomi

Javljaju se na mjestu gdje je virus ušao u biljku. Na tom se mjestu javljaju

klorotične (žute) ili nekrotične (smeđe) promjene koje se nazivaju lokalne lezije.

Postoje tri vrste lokalnih lezija : klorotične lokalne lezije, nekrotične i prstenaste

lokalne lezije.

- Klorotična lokalna lezija je maleni dio tkiva koji je nešto svjetlije boje od

okolnog tkiva, a nastaje zbog smanjenja količine klorofila i smanjenja broja

kloroplasta u stanici.

- Nekrotična lokalna lezija sastoji se od uginulih stanica pa su srebrnasto sive,

sivkastosmeđe ili smeđkasto crne boje. Neke su obrubljene klorotičnom zonom, a

kod nekih se nakuplja antocijan u obliku prstenastih obruba.

- Prstenasta lokalna lezija se sastoji od klorotičnog ili nekrotičnog prstena

unutar kojeg se nalazi normalno zeleno tkivo.

21

3.2 Sistemični simptomi

Odraz su sveopće infekcije biljke, a simptomi se javljaju na mlađim,

neinokuliranim listovima, dok stariji listovi ne pokazuju sistemne simptome. Ti

simptomi su dosta raznoliki i svrstavaju se u tri osnovne skupine: oni koji su nastali

zbog promjena u boji, oni koji su posljedica histopatoloških promjena (promjene u

stanicama), i oni koji nastaju zbog patomorfoloških promjena.

3.2.1. Sistemični simptomi nastali zbog promjena u boji:

Mijenja se boja lista, gubi se klorofil ta pojava naziva se kloroza. Pevladavaju

crvena ili žuta boja koje potječu od pigmenata karotenoida ili naknadno sintetiziranih

pigmenata antocijana. Najčešći simptomi koji se javljaju kao posljedica promjena u

boji biljke su:

- Prosvjetljenje žila, je ujedno i prvi simptom sistemične virusne infekcije, a

javlja se na najmlađim dijelovima biljke: žile na listu postaju žute ili prozirne tako da

se jako ističu osobito žile drugog i trećeg reda. Kako bolest napreduje prosvjetljenje

žila ubrzo iščezava, a pojavljuju se drugi trajni sistemni simptomi;

- Mozaik nastaje kad se mali žućkastozeleni, žuti ili čak bijeli dijelovi lista

jednolično izmjenjuju sa zelenim dijelovima lista. Mozaik je najčešći simptom virusnih

zaraza biljaka, pa su po tom simptomu mnogi virusi dobili ime (virus mozaika

gušarke).

- Pjegavost čine okruglaste pjege svjetlije boje koje su nejednolično

rasprostranjene po listu; klorotične pjege nemaju oštar rub pa postupno prelaze u

normalno zeleni dio plojke. Ako pjege imaju oblik prstenova, tada se pjegavost

naziva prstenastom pjegavošću. Prstenaste se pjege sastoje od središnjeg

normalnog dijela koji je okružen prstenastom klorotičnom ili nekrotičnom zonom.

- Šarenilo, simptom gdje svjetlija područje zauzimaju velike dijelove lista.

- Simptom vrpčastih žila se javlja kada se sa obje strane većih lisnih žila

javlja jednolično široka vrpca tamnije boje.

- Žutica je simptom koji se javlja u obliku jednolične kloroze (žućenja) cijele

lisne plojke. Žutice osim virusa, mogu izazvati i razni drugi čimbenici (mikroorganizmi,

poremećaji u ishrani …)

22

- Crtičavost, ovaj simptom se sastoji od klorotičnih ili nekrotičnih šara u obliku

dužih ili kraćih crta.

- Šarenilo cvijeta, ploda i sjemena uzrokuju mnogi virusi, a osobito oni koji

uzrokuju mozaične simptome na listu. Nastaju svjetlije šare ili pruge zbog gubitka

antocijana; (virus šarenila cvijeta tulipana).

3.2.2. Sistemični simptomi nastali zbog histopatoloških promjena

Morfološke promjene u tkivu pod utjecajem virusnih infekcija mogu nastati iz

više razloga:

Zbog poremećaja u dijeljenju stanica (histogene promjene), zbog poremećaja u

rastu i oblikovanju stanica (histotrofične promjene), zbog pojave nastajanja novih

tkiva (neoplazmatske promjene), zbog nastajanja posebnih patoloških izraslina

(strukturne promjene i zbog uginuća stanice (nekrogene promjene)

A) Simptomi nastali zbog histogenih promjena

Virusna infekcija može uzrokovati pojačanu diobu stanica (hiperplazija), a

najčešće promjene su:

- Enacije,* To su izrasline slične malenim listićima, koje se obično javljaju na

donjoj epidermi lista, a ponekad i na laticama. Anatomski su građene kao list,

odnosno latica.

- Tumorske izrasline, Tumorska tkiva uzrokuje virus tumora rane, tumorsko

tkivo se razvija na mjestu ozljede biljke koja je inficirana virusom.

- Mesnatost biljne plojke, uzrokuje virus žutice šećerne repe. Žuti dijelovi

biljke su odebljali i krhki.

- Ispupčenja i nabranost lisne plojke, takve promjene nastaju kada pojedini

dijelovi lista pojačano rastu. Ispupčenja nastaju zato jer tkivo oko njih raste normalno.

- Zastoj u rastu, nastaju zakržljali dijelovi biljke zbog smanjene brzine

dijeljenja inficiranih stanica.

* Enátuslat – koji je nastao koji je izrastao; ex…(e) + natus sum – izrasti iz unutrašnjiosti

23

Izobličenje biljnih dijelova. Ne samo da virusne infekcije koče ili pospješuju

diobu stanica već u nekim slučajevima potpuno zaustavljaju dijeljenje stanica.

Nastaju promjene u izgledu, a tri su najčešća simptoma kao posljedica tih promjena

na biljci:

Lepezavost lista, nastaje zbog izostanka stvaranja parenhimskog tkiva između

glavnih žila, na rubu se stvaraju duboki urezi pa list poprima izgled lepeze. (virus

lepeze lista vinove loze)

Nitavost lista, javlja se kod rajčice ili na kužnjaku koji su zaraženi virusom

mozaika krastavca: prestaje se stvarati parenhimsko i drugo lisni tkivo, a od plojke

ostaje samo središnje rebro s nešto malo okolnog tkiva. Zbog toga list poprima nitast

oblik.

Uginuće biljke, ako abortivne promjene zahvate sve biljne organe, tada biljka

ugine. Nije česta pojava.

B)Simptomi nastali zbog histotrofičnih promjena

Stanice se pod utjecajem infekcije povećavaju (hipertrofija), a ponekad i

smanjuju (hipotrofija). Hipertrofija nastaje u hiperplastičnih stanica u vidu lokalnih

zadebljaja (enacije i tumori), do hipotrofije, smanjenja dolazi u klorotičnim dijelovima

mozaičnih listova.

C)Simptomi nastali zbog neoplazmatskih promjena

U inficiranim biljkama se stvaraju nova tkiva.

D)Simptomi nastali zbog metaplazmatskih promjena

To su promjene kada se jedan tip tkiva preobražava u drugi tip poprimajući novu

građu i funkciju. Preobrazba parenhimskog tkiva u meristemsko tkivo, stvara se

pluto. To je u biti obrambena reakcija biljke na virusnu infekciju. Svrha pluta je

izolacija žarišta virusa. I tumori rane su posljedica pretvorbe floemskog parenhima u

meristemske stanice koje se dijele i stvaraju tumorsko tkivo.

Preobrazbom jednog tipa stanica u drugi tip mijenja se i funkcija tkiva.

- Lignizacija (odrvenjavanje) stanične stjenke parenhimnih stanica.

24

E) Simptomi nastali zbog strukturnih promjena

- Tile, tiloza, su izrasline u ksilemskom tkivu. Tile urastaju u lumen traheja ili

traheida i na taj način sprečavaju protok vode kroz njih. Tilozu uzrokuju virusi koji

uzrokuju žutice.

F) Simptomi nastali zbog nekrogenih promjena

Nekroze uzrokuju uginuće stanica. Razlikujemo lokalne i sistemne nekroze.

Lokalne nekroze ili lokalne lezije. Javljaju se kod preosjetljivih ili hipersenitivnih

biljaka koje reagiraju na virus tako da njene stanice odmah nakon infekcije uginu, a

virus se iz mrtvih stanica ne može širiti u okolna tkiva.

Sistemične nekrotične šare mogu obuhvatiti samo pojedine dijelove biljke ili

pojedina tkiva. Ako se nekroza proširi u druga tkiva i pri tome zahvati vršni meristem

biljka će uginuti.

3.2.3. Sistemični simptomi nastali zbog patomorfoloških promjena

To su najvidljivije promjene, odnosno simptomi na virusno inficiranoj biljci, a

posljedica su prethodno opisanih histopatoloških učinaka. Ove promjene zahvaćaju

svaki biljni organ i mijenjaju njegov oblik, veličinu, položaj i druge osobine.

- Morfološke promjene na korijenu

Smanjenje korijena, na korijenu pod utjecajem virusa tumora rane može

uzrokovati tumorske izrasline, na korijenu se može razviti veliki broj malih korjenčića;

bolest bradatost korijena.

- Morfološke promjene na stablu

Skraćenje internodija stabljike, a kasniji simptom zastoj u rastu. Kod virusa

lepezastog lista vinove loze internodiji mogu biti toliko blizu da izgledaju kao

dvostruki, a iz takvih nodija izbijaju izdanci koji zbog abnormalnosti nodija stvaraju

rozetu izbojaka. Krastavost stabla, jamičavost stabla te tumorske izrasline.

- Morfloške promjene na listu

Listovi su deformirani, to je posljedica poremečaja u rastu pojedinih dijelova

lista. Uvijenost lista, nitavost lista, enacije i prijevremeno opadanje listova.

- Morfološke promjene na cvijetu

Cvjetovi mogu biti sitniji i izobličeni.

25

- Morfološke promjene na plodu

Plodovi mogu biti sitniji i malobrojniji, mogu prijevremeno otpadati , neki virusi

uzrokuju sterilnost i slabo zametanje plodova. Neki virusi čak razgrađuju plodnicu,

odnosno plod, tako da su sjemenke izložene vanjskim utjecajima.

26

4. LABORATORIJSKA TESTIRANJA BOLESTI VINOVE LOZE

Za dijagnosticiranje problema u vinogradima, koriste se laboratorijska testiranja.

Otkrivanjem zaraženog sadnog materijala pomaže se uzgajivačima da izbjegnu

širenje bolesti na nove vinograde.

U prošlosti detekcija virusa na vinovoj lozi je uvelike postignuta napornim i

sporim biološkim testovima. Danas, mnogi od važnijih loznih virusa se mogu

detektirati brzim laboratorijskim testovima. Tim testovima je moguće detektirati i

bolesti koje uzrokuju gljive i bakterije.

Kako se radi o virusnoj bolesti, točnu dijagnozu nije moguće odrediti na osnovi

simptoma, već samo korištenjem adekvatnih seroloških ili molekularnih tehnika u

laboratoriju.

Tehnike koje je moguće koristiti u dokazivanju biljnih virusa su

imunodifuzija, ELISA, hibridizacija nukleinskih kiselina i lančana reakcija polimeraze.

Najpraktičnija i najčešće korištena metoda dokazivanja biljnih virusa je ELISA,

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.

4.1 dijagnostika na terenu

Dijagnosticiranje loznih bolesti može biti naporno. Simptomi u polju su rijetko

jedinstveni za određenu bolest. Ponekad zaražena loza ne pokazuje nikakve

simptome koji bi mogli indicirati na zdravstveni status. Dok u nekim slučajevima

bolesti vinove loze pokazuju jasne simptome, pa ih je lakše otkriti na terenu. Mnogo

češće, poseban skup simptoma može rezultirati većim brojem uzroka.

Pr. Crveno lišće može biti najava virusne bolesti, gljivična bolest korijena,

nedostatak hranjiva, fizičko oštećenje, ili oštećenje hranidbom crva, insekata,

glodavaca. Slično i opeklina može biti simptom nedostatka vode, opekotina od

sumpora ili šteta nastala prskanjem.

Kod mnogih virusnih bolesti vinove loze dijagnostički simptomi se javljaju u

određeno godišnje doba. Uvijanje lišća pr. simptom je crvenilo lišća na crvenim

voćnim sortama u kasno ljeto i jesen. Pregledom tih voćaka u proljeće nećemo naći

naznake bolesti.

27

Zimi za vrijeme spavanja vinove loze praktički je nemoguće dijagnosticirati

virusnu bolest na terenu, a to je vrijeme rezanja loze za razmnožavanje.

Vinova loza zaražena nekim agensom bolesti (posebice virusima), možda

nikada ne pokaže neke očite simptome. Koncentracija agensa koji uzrokuju bolest

može biti niska pa se ne razvijaju nikakvi simptomi, ili infekcija može biti na sorti koja

je tolerantna na tu određenu bolest. Takve latentne infekcije se mogu otkriti samo

pouzdanim metodama testiranja. Ovo je važna okolnost kada se sakuplja drvo za

razmnožavanje novih sorata.

4.2. Serološka testiranja (ELISA)

Serološke metode se koriste reakcijama antitijela sa agensima bolesti, obično

virusima ili bakterijama.

Antiserum se proizvodi tako što se najprije pročišćeni pripravak biljnog patogena

virusa, ili bakterije ubrizga u životinju (obično zeca). Životinja reagira na taj strani

materijal tako što stvara antitijela. Ta antitijela reagiraju samo na patogen koji se

koristio za stvaranje antitijela. Antitijela se onda pročišćavaju iz krvi i dobiva se

antiserum koji se dalje koristi u dijagnostičkim testiranjima.

Najuobičajeniji serološki test koji se koristi je ELISA, enzimski vezana

imunološka kiselina. To je metoda u kojoj se osim antitijela i virusa upotrebljavaju još

i enzimi.

ELISA metoda : virusna antitijela adsorbiraju se na stjenku zdenčića u kojem će

se zbiti serološka reakcija, dodaje se virus koji se veže na adsorbirana protutijela,

dodaje se konjugat protutijelo – enzim koji se veže na virusnu česticu (koja je već

ranije reagirala s protutijelom adsorbiranim na površini zdenčića), dodaje se enzimski

supstrat zbog čega se on oboji (obično u žuto). Između pojedinih faza nevezana

protutijela i virus se uklanjaju ispiranjem.

28

Pozitivna reakcija antigen (virus) antitijelo se Enzimska reakcija se spaja s antitijelom spaja s antigenom sa supstratom reagira (virusom) žutom bojom

Antitijelo se spaja dodan je blokirajući dodan je biljni sok dodano je antitijelo dodan je supstrat sa dnom zdenca agens da popuni prostor iz uzorka sa pričvršćenim koji nije vezan sa enzimom antitijelom

Negativna reakcija Ako antigen nije dodano je antitijelo, dodan je supstrat ali prisutan u biljnom soku, ali nema nema prisutnog ne dolazi do spajanja antigena na koji bi enzima, boja se se vezao ne pojavljuje

strelice označavaju ispiranje

Slika 11 - ELISA metoda, pozitivna i negativna reakcija

Elisa testiranja se koriste za detektiranje bolesti vinove loze uzrokovanih

virusima i bakterijama.

Elisa testovi su prilično jednostavni za provođenje i mogu omogućiti rezultate u

samo jedan ili dva dana. Da bi ELISA bila uspješna u laboratoriju moraju biti dostupni

antiserumi za sve bolesti, a uzorci za testiranje moraju biti uzeti sa prikladnog tkiva, i

u određeno doba godine, uz to moraju biti i u dobrom fizičkom stanju. Nedostatak je

taj, da se nisu proizveli antiserumi za sve viruse vinove loze. Dakle ako je loza i

zaražena baš tim virusom za koji ne postoji antiserum, virus neće biti otkriven. To je

slučaj kod nekih virusa uvijanja lišća.

Drugi problem seroloških testiranja je čistoća antiseruma. Kod nekih slučajeva

antiserum može reagirati na više od jednog virusa, ili na neku drugu komponentu

biljke, na primjer biljni sok koji je bio prisutan sa virusom kada se proizvodio

antiserum. To može dovesti do zbunjujućih rezultata ili lažnih pozitivnih rezultata ako

antiserum reagira na nešto drugo a ne na virus.

Dobar laboratorij bi trebao provoditi kontrolu u svakom testu i savjetovati klijente

o tome koji ELISA test na patogen je sklon tom problemu.

29

4.3. Molekularna testiranja - PCR – lančana reakcija polimeraze

To je laboratorijska tehnika koja oponaša postupak prepisivanja DNA

(replikaciju) koja se odvija u svakoj živoj stanici.

PCR tehnologiju je zamislio Kary Mullis, a razvio tim znanstvenika Cetus

Corporation. Metoda je prvi puta opisana 1985. godine i od tada se smatra jednim od

najmoćnijih oruđa u molekularnoj biologiji. Za ovo revolucionarno otkriće Dr. Mullis je

1993. godine dobio Nobelovu nagradu za kemiju. PCR je patentom zaštićena

tehnologija.

U kliničkoj dijagnostici dovoljan je mali uzorak koji sadrži genetički materijal

(DNA) čiji genski zapis se kopira u velikom broju primjeraka stvarajući dovoljnu

količinu za otkrivanje prisustva pojedinog virusa, bakterije ili promijenjenog gena

vlastitih stanica.

Ne oslanja se na reakcije antitijela, već testira specifičan molekularni slijed koji

je jedinstven za određeni patogen.

PCR tehnika : izrezuje se sekvencija (gen) DNA koji se želi istražiti i umnaža

nekoliko milijuna puta tako da se može opaziti na gelu.

PCR postupak : izrezana se dvolančana DNA u prisutnosti oligonukleotidnih

početnica (primers) zagrijava da bi se lanci odvojili. Nakon toga pripravak se hladi; na

određenoj temperaturi, na svaki od odvojenih lanaca se veže svojom

komplementarnom sekvencijom po jedna početnica (na suprotnim krajevima lanaca);

potom na određenoj temperaturi djeluje termostabilna DNA polimeraza (enzim) koja

omogućuje početnicama da kopiraju svaki od dvaju lanaca izrezane DNA; zatim

slijedi ponovno zagrijavanje koje omogućava odvajanje lanaca novonastalih

dvolančanih DNA. Sukcesivnim ciklusima denaturiranja i sintetiziranja novih lanaca

postiže se logaritamsko umnožavanje izrezane DNA ( 2,4,8,16,32,64…). Općenito,

svaki novi ciklus udvostručuje iznose DNA.

PCR se može koristiti za detekciju patogena u vinovoj lozi zato što svaki virus,

bakterija ili gljivica ima svoj vlastiti jedinstveni genetički kod. U prošlom desetljeću,

molekularna znanost je identificirala genetičke markere za mnoge patogene.

Komercijalno testiranje PCR trenutno je dostupno za mnoge virusne i bakterijske

patogene vinove loze.

30

Značaj PCR metode je vrlo veliki, kako u području

genetičkih eksperimenata tako i u istraživanjima na

području molekularne biologije te u biotehnologijama. Među

brojnim važnim područjima primjene PCR-a su:

arheologija, kriminalistika, utvrđivanje očinstva,

genetika, biotehnologija i klinička dijagnostika.

Slika 12 - Termocikler

4.4. Biološko indeksiranje

Prije pouzdanih laboratorijskih testova za detekciju patogena koristilo se

biološko indeksiranje. Indeksiranje se odvija u staklenicima u proljeće i sastoji se od

trljanja ekstrakta iz loze koja se testira, na lišče osjetljive indikator biljke. Ako je koji

virus prisutan u ekstraktu test biljke, indikator biljka će razviti simptome za nekoliko

tjedana. Za terensko indeksiranje potrebno je 2 godine.

Indikatori su cijepovi sa pupovima od loze koja se testira. Oni su posađeni u

polju i promatraju se 2 sezone .

Iako je indeksiranje vrlo naporno i zahtijeva dosta vremena, još je uvijek korisna

metoda za lozu koja je vrijedna i potrebna je velika sigurnost u dijagnostici.

4.5. Pouzdanost laboratorijskih testiranja

Niti jedna dijagnostička metoda nije savršena. Sve ove opisane metode mogu

proizvesti lažni pozitivni ili lažni negativni rezultat.

Lažni pozitivni se događa kada biljka nije bolovala od određene bolesti ali

rezultati pokazuju da je bolest bila prisutna. To se obično događa zbog kontaminacije

ili pogrešnog obilježavanja uzoraka. Pogreške se mogu dogoditi i na terenu kada se

sakupljaju uzorci ili u laboratoriju kada uzorci stignu.

Kontaminacija se posebice odnosi na PCR zbog osjetljivosti testiranja. Samo

nekoliko bakterija ili virusnih čestica prenesenih iz jednog uzorka na drugi može

dovesti do lažnih pozitivnih ili negativnih rezultata.

31

Kod ELISA testova lažni pozitivni rezultati se događaju ako antiserum reagira na

biljne komponente u aditivu. Lažni negativni rezultati su uobičajeniji nego lažni

pozitivni. Lažni negativni se mogu dogoditi i zbog toga što u uzorku koji je dan na

analizu nema agenasa bolesti ili se uzorkom pogrešno rukovalo, pa uzorak nije bio u

dobrom stanju kada je stigao u laboratorij.

Virusne infekcije su obično neravnomjerno rasprostranjene u vinogradu. Čak na

samoj lozi mogu biti prisutni na samo pojedinim dijelovima. Ako je tkivo koje se šalje

u laboratorij bilo sa zaražene biljke, ali sa mjesta koji nije sadržavao virus rezultat će

biti lažno negativan. Lažno negativni rezultati mogu se dogoditi uslijed raznih

problema u laboratoriju koji obavljaju procedure testiranja. Dobar laboratorij uključuje

kontrolu njihovih testova.

4.6. Selekcija i rukovanje uzorcima

Uzimanje uzoraka sa određenih dijelova biljke u određeno doba godine može

uvelike povećati pouzdanost testiranja na bolesti.

Na primjer kod testiranja vinove loze na lepezu lista, sakupljaju se izdanci u

proljeće. Virus je toplinski osjetljiv pa je preko ljeta njegova koncentracija u lozi vrlo

niska i testiranja su nepouzdana. Za pouzdanost rezultata također je bitno pravilno

rukovanje i slanje uzoraka. U glavnom uzorci bi se trebali dostaviti u laboratorij što je

moguće brže. Ako su uzorci bili izloženi neumjerenoj vrućini, sušenju ili su predugo

čuvani neće biti moguće dobiti pouzdane rezultate. U glavnom , što je poslan veći

broj uzoraka iz vinograda na testiranje, veća je pouzdanost rezultata. Treba imati na

umu da u jednom vinogradu može biti više od jednog virusa, a moguće je da loza u

nekim vinogradima bude zdrava iako su zaražena virusom ili više virusa.

Pozitivni rezultati iz laboratorija mogu se uglavnom smatrati točnima. Lažni

pozitivni nisu uobičajena pojava, osim ako nije došlo do značajnijih problema u

laboratoriju. No ako se sumnja na problem, zato što su svi uzorci ispali pozitivni treba

razmisliti da se ponovno provedu. Uključujući zdravi uzorak zajedno sa bolesnima.

Negativni rezultati su na drugu ruku ograničene vrijednosti, i to zato što je

nejednaka distribucija agenasa bolesti u vinovoj lozi, a i koncentracija se mijenja

tokom godine. Lažni negativni rezultati su učestali. Treba imati na umu da negativni

rezultati ne znače da loza nije zaražena sa bolesti. Ako se sumnja na bolest loze, a

rezultati testiranja budu negativni ne treba odustati od postavljanja dijagnoze.

32

Treba uzeti u obzir dokaze kao što je ponašanje loze i simptomi,a onda

poduzimati daljnja testiranja dok se ne otkrije uzrok.

Ako koristimo laboratorijska testiranja za lozu za razmnožavanje potrebna je

veća opreznost.

Podloge vinove loze bi se trebale dvije godine testirati ELISA metodom i PCR

testovima. Ovim testovima se ne mogu ocijeniti cjelokupno zdravlje vinove loze, oni

mogu pomoči u otkrivanju da li je ili nije loza zaražena nekim od patogena na koji se

testira.

Testovi nisu dostupni za sve znane bolesti loze pa tako, niti jedan cijep ne može

biti krajnje deklariran kao virus free. Ipak tehnologije koje se koriste u laboratoriju za

dijagnosticiranje pouzdanije su nego što su bile nekada.

4.6.1. Upute za uzimanje uzoraka i testiranje na bolesti

BOLEST KADA

TESTIRATI

UZORAK TKIVA ELISA PCR

Lepeza lista i drugi

nepovirusi

Najbolje u proljeće,a

može i u jesen i zimu

Žive mladice u

proljeće;odsječak

mladice sa trskom

za kambij u jesen i

zimu

Pouzdano u proljeće Pouzdano u

proljeće, manje

pouzdano u jesen i

zimu

Uvijenost lista Kasno ljeto jesen i

zima

Peteljke u kasno

ljeto i jesen;

odsječak mladice sa

trskom za kambij u

jesen i zimu

Pouzdano u kasno

ljeto i

jesen

Pouzdano u kasno

ljeto, jsen i zimu

Ižljebljenost drveta

podloge rupestris Cijelu godinu

Peteljke, lišće ili

kambijski odsječci Nije dostupno Pouzdano

vitivirusi Proljeće, jesen i

zima

Peteljke, lišće ili

kambijski odsječci

Jedino za GVA,

Najbolje pouzdan u

proljeće

GVA, GVB, GVD

šarena pjegavost

lista

Proljeće, jesen i

zima

Mladice i mlado lišće

u proljeće,odsječak

mladice u jesen i

zimu

Pouzdano u proljeće Pouzdano u

proljeće, jesen i zimu

33

5. VIROZE VINOVE LOZE

Virusne i virusima slične bolesti i druge infektivne bolesti vinove loze su

uzrokovane raznim intracelularnim patogenima. Bolesti su rasprostranjene po cijelom

svijetu gdje god se uzgaja vinova loza. Iako se agensi virusa mogu širiti prirodno

putem vektora (nematode, lisne uši, kukci…), glavni i najznačajniji način širenja ovih

bolesti je preko zaraženog sadnog materijala.

Virusi vinove loze veoma su rasprostranjeni. Do danas je otkriveno i opisano

više od 60 različitih viroza na vinovoj lozi. Mogu uzrokovati ozbiljnije posljedice na

zdravlje vinove loze, urod i kvalitetu vina. Zbog promjena koje nastaju u zaraženom

trsu, neki trsovi pokazuju veću osjetljivost na niske temperature i smanjuje se urod.

Virusi mogu i utjecati na kvalitetu vina uzrokujući smanjenje postotka šećera, kiselina

i slabo razvijanje boje. Smanjenje uroda 5 – 10% nije neuobičajeno za viroze vinove

loze, ali čak i malo štete na urodu će s vremenom porasti, uzrokujući značajnije

ekonomske gubitke.

Simptomi nisu uvijek očiti. Neke viroze imaju relativno karakteristične simptome

pa se lako mogu prepoznati, dok drugi simptomi viroza mogu ukazivati na neke

druge uzročnike koji imaju slične simptome. Teškoće u detektiranju virusnih infekcija

mogu voditi do ubrzanog širenja virusno inficiranog materijala preko razmnožavanja.

Ako se koriste zaražene reznice za razmnožavanje cijeli vinogradi mogu biti

zaraženi. Na zaraženim podlogama ili reznicama pri proizvodnji cijepova je otežano

stvaranje kalusa.

34

Klasifikacija virusa

Biljni virusi se svrstavaju u virusne skupine na osnovi zajedničkih svojstava.

Johnson 1927.,: Ime virusa se određuje narodnim imenom domaćinske biljke u kojoj

je neki virus prvi put nađen i nazivom glavnog simptoma koji virus uzrokuje na toj

biljci (1.).

Budući da su imena virusa u većini slučajeva prilično dugačka, virolozi ih krate;

obično se uzimaju početna slova riječi koje čine ime tog virusa ali na engleskom

jeziku. Tako je za engleski naziv lepeza lista vinove loze „grapevine fan leaf “ kratica

GFLV. Stvaranje takvih kratica nije službeno standardizirano.

Pedesetih i šezdesetih godina klasifikacijski sustav biljnih virusa se temeljio na:

obliku virusne čestice, tipu i količini nukleinske kiseline, organizaciji genoma i tipu

vektora. Taj je klasifikacijski sustav bio u uporabi sve do 1993.

Današnja klasifikacija biljnih virusa svrstava se u redove, porodice i rodove, u

obzir se uzima i oblik virusne čestice, tip i količina nukleinske kiseline, organizacija

genoma i tip vektora.

U klasifikaciji biljnih virusa samo je jedan dio virusa svrstan u porodice. Drugi

dio je nesvrstan i izvan je postojećih porodica. Osim toga, postoje i oni virusi koji nisu

klasificirani ni u rodove.

Za sada je uspostavljen samo jedan red (sufiks virales) u biljnoj virologiji i to je

red Mononegavirales koji obuhvaća dvije porodice (sufiks viridae) : rhabdoviridae i

bunyaviridae; porodica obuhvaća srodne rodove. Naziv roda ima sufiks virus, a

obuhvaća jednu ili nekoliko srodnih virusnih vrsta. Pojam vrsta predstavlja pojedini

virus koji se toliko razlikuje od sličnih virusa da se može sigurno identificirati. No

virusna vrsta se ne označuje latinskom nomenklaturom, nego narodnim opisnim

imenom pr. Virus mozaika duhana.

Kao što vidimo u klasifikaciji iz 1966. godine virusi su se svrstavali u porodice

rodove i vrstu.

35

5.2. Taksonomija virusa na vinovoj lozi (prema Walter et Martelli, 1966.)

a)virusi razvrstani u porodice i rodove

Porodica Rod Vrsta

Bromoviridae alfamovirus Alfa mozaic (AMV)

1. Cucumovirus

Ilarvirus

Cucumber mosaic virus (CMV)

Grapevine line pattern (GLPV)

2. Bunyaviridae Tospovirus Tomatto spotted wilt (TSWV)

3. Comoviridae fabavirus Broadbean wilt (BBWV)

Artichoke Italian latent (AILV)

Arabis mozaic (ArMV)

Blueberry leaf mottle (BBLMV)

Grapevine fanleaf virus GBLV

Grapevine chrom mosaic

(GCMV)

Grapevine fanleaf (GFLV)

Grapevine Tunisian ringspot

(GTRV)

Peach rosette mosaic (PRMV)

Raspberry ringspot (RRV)

Tabacco ringspot (TRSV)

Tomato ringspot (ToRSV)

Tomato black ringspot (TBRV)

4. Tombusviridae Tombusvirus

Carmovirus

Petunia asteroid mosaic (PAMV)

Grapevine algerian latent

(GALV)

Carnation mottle (CarMV)

5. Closteroviridae Closterovirus Grapevine leafroll – associated

1 (GLRaV- 1)

Grapevine leafroll – associated

2 (GLRaV- 2)

Grapevine leafroll – associated

3 (GLRaV- 3)

Grapevine leafroll – associated

4 (GLRaV- 4)

Grapevine leafroll – associated

5 (GLRaV- 5)

Grapevine leafroll – associated

6 (GLRaV- 6)

Grapevine leafroll – associated

7 (GLRaV- 7)

36

b)virusi razvrstani u rodove

Porodica rod vrsta

.

Sobemovirus

Necrovirus

Potexvirus

Tobamovirus

Sowbane mosaic (SoMV)

Tabacco necrosisi (TNV)

Potato X (PVX)

Tobbaco mosaic (TMV)

.

Trichovirus Grapevine A (GVA)

Grapevine B (GVB)

Grapevine C (GVC)

Grapevine D (GVD)

Grapevine berry inner

necrosis (GIBNV)

.

Capillovirus

Furovirus

Presunto nuovo genere

Nema imena

Virus bez naziva

Grapevine labile rod-shaped

(GLRSV)

Grapevine fleck (GFkV)

Grapevine asteroid mosaic

(GAMV)

c)nerazvrstani virusi

porodica rod vrsta

.

Grapevine ajinashika

(GAV)

.

Grapevine stunt (GSV)

37

5.3. VIRUSI INFEKTIVNE DEGENERACIJE

Pod pojmom infektivne degeneracije podrazumijeva se niz simptoma na vinovoj

lozi u čijoj etiologiji može sudjelovati nekoliko europskih NEPO virusa . To su virusi

poliedričnoga oblika koje prenose nematode (xiphinema indeks i longidorus).

Ova grupa uključuje najmanje 13 različitih bolesti koje uzrokuju viroze na vinovoj

lozi.

U ovu skupinu su svrstani: virus lepezastog lista vinove loze (GFLV), virus

mozaika gušarke (ArMV), virus crne pjegavosti rajčice (TBRV), virus prstenaste

pjegavosti maline (RV), latentni virus prstenaste pjegavosti jagode (SRLV) i virus

žućkasto–smeđeg mozaika (GCMV) .

Među nabrojenima posebno mjesto pripada virusu lepezastog lista (GFLV)

(Grapevine fanleaf virus) , jer je proširen u gotovo svim područjima uzgoja vinove

loze. U nas je čest naziv čičak ili metlica.

Lepezatost lista vinove loze

Zbog širenja po cijelom svijetu GFLV je najvažniji virus koji inficira vinovu lozu.

Svi kultivari i hibridi mogu biti domaćini GFLV.

Infekcija može uzrokovati ili brzo propadanje i smrt biljke ili dužu bolest sa

smanjenim rastom. Simptomi variraju sa virusnom kulturom i osjetljivosti sorte vinove

loze.

Virus se prenosi nematodama Xiphinema index i Xiphinema longidorus. Širenje

na veće udaljenosti se događa transportom inficiranih biljaka i sadnica.

Simptomi koji karakteriziraju ovu bolest ovise o; vrsti virusa (GFLV), o sorti

vinove loze i o uvjetima u okolišu.

Znakovi bolesti očituju se u tri osnovna sindroma s nizom prijelaza:

Etiolgija grč. (aitia – uzrok, povod + logos – riječ govor), znanost o uzrocima nekog reda pojava

NEPO;nematode transmitted polyhedral – shaped

38

5.3.1. Sindrom deformacije lišća – virus lepeze lista GFLV (Grapevine

fanleaf virus)

Na listovima dolazi do deformacija, asimetrični su, katkad naborani, često

izraženo nazubljenih rubova. Na listovima zbog znatne otvorenosti sinusa lista u

dijelu peteljke i istodobnog suženja dijela plojke između glavnih žila na listu, list

poprimi izgled lepeze, po čemu je bolest dobila ime.

Slične se promjene mogu uočiti pri oštećenju od

herbicida (2,4D ili MCPA).

Osim promjene u izgledu, mogu se pojaviti

mozaične promjene ili blaga kloroza.

Slika13 - Klorotična lepezatost

i deformiranost

Mladice imaju kraće internodije, koji rastu cik-cak,

katkada su popraćeni fascijacijama.

Slične promjene na mladicama mogu proizvesti i

grinje (calepitrimerus vitis ), tripsi (drepanotrips reuteri,

Anaphotrips vitis). U virotičnih trsova su gale na listu

izazvane grinjama žute boje ,a na zdravom listu zelene.

Abnormalne mladice mogu biti spljoštene s izraženim

bifurkacijama, katkad i s pojavom fascijacija.

Slika14 - fascijacija cvata Grozdovi su rehuljavi, bobe na grozdu ostaju male

i kasne u sazrijevanju.

Biljke zaražene virusom često su kržljave i daju niži

urod. Rehuljavost grozdova karakteristika je i za

nedostatak bora, pa treba razlučiti jednu pojavu od

druge.

fascijacija - nakazna promjena na biljnom organizmu,koja se najčešće pojavljuje na stabljici,a svojstveno joj je da stabljika-mladica poprima oblik široke vrpce ili šupljeg valjka;može se pojaviti na grozdu,i cvatu,listu i vitici bifurkacije - rašljanje mladica iz jednog koljenca,račvaste dvojne mladice

39

Slika15 - račvanje, bifurkacija

5.3.2. Sindrom žućkasto – smeđeg mozaika vinove loze (žuti krom mozaik),

GCMV (Grapevine chrome mosaic virus).

Zaraženi trs se najlakše uočava u proljeće. U to doba svi zeljasti organi

(listovi,vitice,mladice) mogu biti svijetložute boje. Boja varira intenzitetom posebno na

listovima – od svijetložute do krom žute. Promjena boje može zahvatiti cijeli list ili

samo dio između žila.

Ponekad se pojavljuje žuta pjegavost koja može dobiti

oblik prstena ili linija. Promjeni boje mogu se pridružiti i

abnormalnosti mladica spomenutih kod lepezastog lista. U

ljetnim mjesecima kad se temperature podižu,simptomi

virusne infekcije se smanjuju, žuti dijelovi starih listova

izblijede postajući bjelkasti, i novonastali vršni listovi imaju

relativno normalan izgled.

Slika16 - Žuta pjegavost

5.3.3. virus mozaika gušarke - ArMV (Arabis mozaic)

Treći sindrom infektivne degeneracije prouzrokuje

slične simptome kao GFLV (lepeza lista vinove loze) i

često dolaze zajedno. Uz pojavu kratkih internodija,

dvostrukih koljenaca i oštro nazubljenih listova, listovi i

cvat su potpuno žuti, a drvo mladice najčešće crveno.

Slika17 - Prosvjetljenje žila

Ostale simptome u kompleksu infektivne degeneracije karakterizira žutilo u

predjelu glavnih žila koje se difuzno širi po plojci u međužilni prostor. Unatoč

promjeni u boji ne dolazi do deformacije lista. Grozdovi su mali i rehuljavi, a mogu i

otpasti prije nego dozore.

Istraživanja pokazuju da korovi žuta vučja stopa (Aristolochia clematitis) i

troskot, zubača (Cynodon dactylon) mogu biti zaraženi virusom lepeze lista vinove

loze.

40

U cijelom svijetu , GFLV uzrokuje velike ekonomske gubitke. Osim strogih

testiranja materijala za razmnožavanje, uzgajaju se otporne sorte, a učinkovita

kontrola vektora je praktički nemoguća.

5.4. UVIJENOST LISTA VINOVE LOZE - GVFL (Grapevine leafroll)

Uvijanje lista je vjerojatno najraširenija virusna bolest vinove loze u cijelom

svijetu.

Taj kompleks virusnih bolesti loze izazivaju klosterovirusi, a u svijetu ih je

poznato više od deset. To su nitaste čestice dužine 2000nm. Prenose ih štitaste uši,

najviše sa sadnim materijalom.

Najočitiji simptomi pojavljuju se krajem ljeta i početkom jeseni, ovisno o

interakciji domaćin – patogeni – okoliš. Donji listovi na trsu savijaju se od rubova

prema naličju, poprimajući ukrućen izgled. Uz te pojave prisutna je tipična promjena

boje na plojci lista. Na crnim sortama na plojkama dio između glavnih žila poprime

nijanse crvene boje, a u bijelih sorata listovi žute, a glavne žile zadrže zelenu boju.

Na osjetljivim sortama oplodnja je nepotpuna pa grozdovi ostaju rehuljavi. Bobice su

manje i kasne u sazrijevanju. Sve to utječe na kvalitetu sirovine za vino.

Bolest je latentna na podlogama koje vuku podrijetlo od američkih vitis vrsta, ali

nakon cijepljenja simptom se manifestira na plemki.

Etiologija bolesti je složena. Prema današnjim saznanjima nitasti virusi (GLRaV)

označeni brojevima 1 – 8 mogu sudjelovati u njezinoj etiologiji.

Klosterovirus GLRaV–2 smatra se među ostalim važnim agensom

inkompatibilnosti nakon cijepljenja na podlogu kober 5BB. Među nabrojenim virusima

najčešći su ampelovirusi GLRaV - 1 i GLRaV – 3, a njihovi prijenosnici su štitaste uši.

Virus GLRaV - 1 prenose: javorova štitasta uš; šljivina štitasta uš i lozina uš

GLRaV - 1 Je grupa od najmanje 7 serološki zasebnih virusa koji se pojavljuju

na vinovoj lozi, obično kao miješana infekcija. Svi uobičajeni kultivari i korijenjaci

mogu biti domaćini virusima, ali na američkim podlogama obično se ne razvijaju

simptomi.

Najupečatljiviji simptomi se mogu promatrati na crvenim sortama. Područje lišća

crveni sa malom zelenom linijom uz glavne vene. Lišće se uvija, a može se i pojaviti

nekroza na gornjoj epidermi. Dozrijevanje kasni a akumulacija ugljikohidrata u grožđu

je smanjena. Kod bijelih sorata simptomi se očituju u laganom žućenju lišća.

41

GLRaV-1 se obično prenosi cijepljenjem na zaražene podloge koje ne pokazuju

simptome. Da bi se kontroliralo širenje potrebno je testirati rasadni materijal.

Vektori GLRaV – 3 jesu: planococcus ficus, pseudococcus longispinus,

pseudococcus affinis, pseudoccocus viburni, pseudoccocus maritimus i vunasta

lozina uš (Pulvinaria vitis). Za druge GLRa viruse vektori nisu poznati.

Slika 18 - uvijenost lista na bijeloj sorti slika19 - uvijenost lista na crvenoj sorti

5.5 RAZNI TIPOVI NABORANOSTI DRVETA VINOVE LOZE (Rugose

wood complex)

Trsovi pogođeni ovom bolešću manje su bujni, slabije napreduju, cvjetaju

kasnije u proljeće, a samo nekoliko godina nakon sadnje trs može propasti.

Karakteristični simptomi su redovito jasno vidljivi

samo na podlozi. Rijetko, samo u nekih europskih sorata,

pojavljuju se simptomi na podlozi i plemki.

U zaraženih biljaka vinove loze dolazi do

inkompatibiliteta, pa na mjestu cijepljenja nastaje

dijametralno proširenje plemke s obzirom na podlogu.

Slika 20 - Ižljebljenost

(izbrazdanost stabla)

42

Podloga ostaje tanja od plemke. Kora stabla trsa je zadebljana i izborana,

poprimajući spužvastu strukturu. Ispod kore na površini drva nastaju dulje ili krače

udubine ili fisure koje podsjećaju na žljebove. Tipični sindrom plutavosti kore koji se

može zapaziti na jednogodišnjim dijelovima trsa jest zadebljanje i raspuklina na

bazalnim međukoljencima mladica.

Novija su istraživanja pokazala da se radi o kompleksnoj bolesti koju uzrokuje

nekoliko virusa, izazivajući slične simptome. Poznati su slučajevi potpune odsutnosti

simptoma u trsova za koje se pouzdano utvrdilo da su zaraženi, a tek se testiranjem

utvrdila nazočnost patogena.

Naboranost drva je kompleksna bolest od nekoliko uzročnika koje je moguće

identificirati biološkim testom uz pomoć za to određenih drvenastih testnih indikatora.

Tako ima četiri tipa, od kojih su za tri poznati uzročnici:

Plutavost kore vinove loze (CB) corky barc; uzročnik je GVB, prenose ga uši

Nabornaost drvta podloge Rupestris du lot (RSP); uzročnik je GPSPaV, a

vektor nepoznat, vjerovatno se prenosi polenom

Ižljebljenost drveta podloge kober (KSG) uzročnika GVA, a prenose ga uši

Ižljebljenost hibrida LN – 33 (LNSG); uzročik kao i vektor nisu poznati.

Slika 21 - klasični simptomi plutavosti kore, u uspoedbi sa zdravom rozgvom

43

5.6. MANJE VAŽNI VIRUSI I NJIMA SLIČNE PARAZITSKE BOLESTI

5.6.1. Priraslice (enacije) na listovima (Grapevine enation)

Bolest čija je etiologija još uvijek nepoznata,

karakterizira je prisutnost proliferacija na donjoj strani

mladih listova. Najupečatljiviji simptom su priraslice na

naličju plojke. Glavne žile na listu postaju izražajnije, često

bliže jedna drugoj zbog čega se list deformira. Listovi s

enacijama su u pravilu manji od zdravih, a uz to poprimaju

lepezast izgled. Broj listova s enacijama na zaraženom trsu

Slika 22 - enacije može jako varirati.

Kad je na listovima malen broj enacija ili ako se enacije pojave samo na

malom broju listova, simptomi mogu lako ostati nezapaženi. Te promjene na

listovima su uz to često vezane za uočljivo kašnjenje u kretanju vegetacije.

Glavna karakteristika te biljne bolesti je ciklično pojavljivanje simptoma, koji se

ne pojavljuju svake godine na istoj biljci. To upućuje na više-manje dug latentni

period, ovisno o biotskim i abiotskim čimbenicima koji najvjerojatnije utječu na

njihovo pojavljivanje. Navedeni simptomi dosta su rijetko primijećeni na području

Hrvatske.

5.6.2. Nekroza žilica lista (Vein necrosis)

Ta zarazna bolest vinove loze još se smatra sličnom virusu budući da patogeni

agens još uvijek nije određen. U europske vinove loze (V.vinifera) i u većine

američkih vrsta i njihovih križanaca (podloge), ne uočavaju se nikakvi vanjski

simptomi.

Karakteristični simptomi se pojavljuju nakon cijepljenja

zaražene biljke vinove loze na podlogu V.rupestris ×

V.berlandieri 110R i sastoje se od vrlo uočljive nekroze

sekundarnih žila na listu.

proliferation franc. (proliferacija) – nicanje, bujanje, umnožavanje

44

Slika 23 - nekroza žilica na indikatoru 110 R

Nekroze su uočljive u početku na donjoj strani bazalnih listova a potom se

proširuju prema gornjim listovima. Ponekad se mogu razviti koncentrične nekrotične

zone raširene po rubu listova, na peteljci lista i na mladicama. Mladice na zaraženim

trsovima su tanje i slabo odrvenjuju. Zaražene biljke su kržljave i teško odolijevaju

niskim temperaturama.

Širi se preko materijala za razmnožavanje.

5.6.3. Mozaik uz glavne žile lista (Grapevine vein mosaic disease)

Zbog svoje još uvijek neodređene etiološke prirode i ta se bolest ubraja u

virusima slične bolesti vinove loze V.riparia. Gloire de Montpellier je u početku

zabilježena kao vrsta jako osjetljiva na infekcije, pa je korištena kao drvenasti

indikator. Bolest može biti latentna u nekih europskih (V.vinifera) sorata i u pojedinih

podloga. Simptomi se sastoje od blijeđenja plojke, posebno duž žilica. Ta pojava

nastaje po pravilu u proljeće ili u jesen. Posebno je uočljiva na biljkama koje se

nalaze u sjeni ili koje su uzgajaju u zaštićenim prostorijama. Njezino širenje je

vezano za zaražene materijale za razmnožavanje.

5.6.4. Šarena pjegavost lista (Grapevine fleck disease)

Na mnogim sortama europske loze kao i podlogama simptomi se

manifestiraju, dakle ostaju latentni. To je vjerojatno i razlogom da se bolest znatno

proširila. U nas je bolest dokazana. Simptomi se jasno

vide na drvenastom indikatoru Vitis rupestris St. George u

obliku prosvjetljavanja sekundarnih žila na plojci. Plojka

lista može biti deformirana i savinuta prema licu lista.

Prenosi se cijepljenjem.

Slika 24 - šarena pjegavost lista

45

5.7. VIROIDNE BOLESTI VINOVE LOZE

5.7.1. Žuta pjegavost (Vein speckle)

Postoje šest viroida vinove loze ali su samo dva zabilježena : viroid žute

pjegavosti 1 i 2 (GYSVd – 1 i GYSVd – 2), koji su patogeni za vinovu lozu.

Žuta pjegavost prema vanjskim simptomima koje pokazuje je bolest koja je

dosta varljiva, a uvjetovana je klimatskim i varijabilnim faktorima. Simptomi se sastoje

od nekoliko do šezdesetaka kromskih žutih točkica ili fleka raspršenih preko dijela ili

cijele lisne površine, ili su sakupljene oko glavnih žila.

Kasnije stanje, znano kao „pruganje žila“, je pojačano sinergičnim utjecajem

popratne infekcije od GFLV (lepeze lista vinove loze) i viroida žute pjegavosti tipa 1

(GYSVd – 1).

Tipična žuta pjegavost ne mora biti opasna, iako blijeđenje žila ima jako štetan

utjecaj na prinos određenih sorata.

Kao i sa drugim viroidima, GYSVd nema

vektora, a se prenosi i širi se preko sadnog

materijala. Moguć je mehanički prijenos na druge

vinograde preko površinski zagađenog alata za

rezidbu.

Slika 25 - Žuta pjegavost

5.8. FITOPLAZME – INFEKTIVNE ŽUTICE VINOVE LOZE (Grapevine yellows)

Pod nazivom infektivne žutice vinove loze podrazumijevamo nekoliko uzročnika

iz skupine fitoplazma koji izazivaju slične promjene na vinovoj lozi. Među

fitoplazmama koje izazivaju žutice na vinovoj lozi navode se: Flavescence doree,

Bois Noire i Aster yellows.

Štete su vrlo velike jer zaraženi trsovi propadaju, a oni koji preživljavaju nekoliko

godina prije nego se osuše, daju manje urode i slabiju kakvoću grožđa za preradu

(manje šećera i visoke kiseline).

46

Bolest se pojavljuje periodično. Vjerojatno je pojava bolesti povezana s

populacijom i pojavom vektora. Razdoblje šoka traje obično jednu do dvije godine,

nakon kojih dolazi do smirivanja bolesti.

Sorte vinove loze su različito osjetljive. Najosjetljivija sorta je chadonnay, zatim

cabarnet sauvignon, frankovka, pinot bijeli, pinot sivi, pinot crni, traminac i td. U

južnoj Hrvatskoj zaraze su primijećene na sortama plavac mali crni, pošip bijeli, grk

bijeli i dr.

Navedene fitoplazme uzrokuju gotovo identične simptome. Prve patološke

promjene pojavljuju se oko cvatnje, ali mnogo jasniji simptomi pojavljuju se krajem

lipnja pa do kraja vegetacije. Znakovi bolesti mogu se pojaviti na cijelom trsu, rjeđe

samo na mladicama jednoga kraka. Biljke sa simptomima životare 2 – 3 godine

nakon čega propadaju. Pojedine biljke nakon te šok faze prežive te dolazi do

„samoozdravljenja“.

Simptomi se pojavljuju na svim zelenim dijelovima

vinove loze, ali variraju ovisno o sorti, vremenu infekcije i

klimatskim prilikama. Ovisno o osjetljivosti kultivara

simptomi mogu biti manje ili više izraženi. Na zaraženim

mladicama svi cvatovi se posuše i tako osušeni ostaju neko

vrijeme na trsu. Nakon završene cvatnje simptomi na

grozdovima očituju su u gubitku turgora i venućih boba i

cijelog grozda.

Mladice osjetljivih sorata ako su rano zaražene ostaju

Slika 26 - žućenje lišća i tanke, slabo i nepravilno dozrijevaju, a vrlo često ostaju

sušenje grozdova zeljaste do kraja vegetacije. Mladice se lako lome, a katkad

dolazi do nekroze pupova.

Pri kraju vegetacije na mladicama se najbolje vide simptomi, zbog slabijeg i

nejednakog odrvenjavanja mladica to je popraćeno neujednačenom promjenom boje

na njima. Katkad zakašnjele u odrvenjavanju mladica zahvati samo neke internodije.

Na mladicama osjetljivih kultivara mogu se pojaviti mala

crna uzdignuća poput prištića. Nedozrele mladice tijekom

zime pocrne i osuše se. Na listovima koji su izloženi

suncu dolazi do promjene boje.

47

U bijelih sorata u zoni glavnih žila nastaju različiti stupnjevi promjene boje, od

svijetlozelenih do žutih, a uz to boja ima specifičan metalni odsjaj.

Slika 27 - žućenje lišća i nekroza uz glavne žile

U crnih sorata nastaju slične promjene, svijetlog do

tamnog crvenila na listovima. Uz promjenu boje katkad se

pojavljuju nekroze na plojci. Istodobno dolazi do

karakterističnog savijanja rubova plojke prema naličju,

tako da savijeni list poprimi trokutast oblik. Plojka nije

savitljiva i stisnemo li ju, lako puca.

U Bois Noire često se pojavljuje pocrnjenje

neodrvenjelih mladica, po čemu je bolest dobila ime. Ostali

simptomi su manje - više isti.

Slika 28 - bois noir u

crnih sorata

Flavescence doree fitoplazmu prenosi cikada Scaphoideus titanus, a

fitoplazmu Bois Noire cikada Hyalesthes obsoletus, Reptalus panzeri; prijenosnik

fitoplazme Aster yellows je za sad nepoznat.

Slika 29 - Cikada

slika 30 - jaja cikade položena pod koru trsa

48

6.OSNOVNE MJERE SUZBIJANJA VIRUSNIH ZARAZA

Da bi se izbjegle infekcije treba saditi samo potpuno virusno testiranu lozu da se

smanji rizik od unošenja virusnih bolesti u vinograd. U budućnosti bi se mogla

očekivati rješenja s rezistentnim tipovima, koji su ponudili genetičari. Za sada je na

selekcionerima i rasadničarima da proizvedu i stave u promet certificirani sadni

materijal. Samo takav material je jamstvo sortnosti i zdravstvenog stanja cijepa i

osnovna mjera zaštite. Radi suzbijanja virusa mogu se poduzimati razne mjere, a to

su : preventivne i terapijske mjere.

Terapijske mjere kao što je terapija povišenom temperaturom se koristi kod

selekcije i sanitacije pri proizvodnji cijepova.

Kemijske mjere ne daju dobre rezultate i uništavaju samu stanicu u kojoj se

virus nalazi. Virusi su kao paraziti iznimno vezani za metabolizam stanice domaćina i

ako se želi uništiti virus, moraju se uništiti i fiziološki procesi same stanice. I zbog

toga se u suzbijanju i kontroli širenja virusa koriste preventivne mjere a to su:

6.1. Uklanjanje i izbjegavanje izvora zaraze

- Uklanjanje korovnih biljaka, koji su često rezervoari virusa i izvor virusnih

zaraza. Stoga korove treba iskorijeniti odgovarajućim kultivacijskim zahvatima i

herbicidima (pr. Divlji sirak).

- Uklanjanje inficirane loze iz vinograda,

- Higijenske mjere u obradi, važno je kada su u pitanju stabilni virusi kao TMV.

Treba ukloniti biljne ostatke iz tla, treba voditi računa o tome da se ne kontaminira

odjeća, ruke te alat kojim se obrađuje. Dezinfekcija alata i ruku se može obaviti 3 –

10 % otopinom Na3PO4.

- Uporaba bezvirusnog sadnog materijala, vinova loza se razmnožava

vegetativno, a ako je izvorna biljka inficirana i ako se od nje uzima vegetativni

materijal za razmnožavanje, tada će svi potomci koji potječu od te biljke biti inficirani.

No u nedostatku bezvirusnog izvora, od inficiranog se klona ipak mogu metodom

kulture vršnog meristema ili metodom povišene temperature uzgojiti bezvirusne

biljke, koje mogu biti izvor bezvirusnog sadnog materijala. Tim se metodama mogu

49

izbjeći virusne zaraze sadnog materijala koje se danas lako i brzo šire i

međukontinentalno.

6.2. Suzbijanje vektora

- Kemijsko suzbijanje vektora: suzbijanje insekata, a suzbijaju se insekticidima.

Time se uspješno suzbijaju virusi koji se prenose na perzistentan način, jer je

potrebno više vremena dok insekt preuzme virus i zarazi biljku.

- Suzbijanje korovskih biljaka koji su domaćini virusnih vektora herbicidima.

- Suzbijanje nematoda. Obrađivanje tla nematocidima, no tim se načinom ne

mogu suzbiti sve nematode jer se one nalaze duboko u tlu i neke su izvan domašaja

pesticida.

- Suzbijanje gljivica, uništavaju se spore gljivica, osobito njihove pokretne spore

(zoospore), a preko njih se prenose neki biljni virusi. Za suzbijanje se koriste različiti

pripravci kojima se zadimljuje (fumigira tlo), metil bromid. Suzbijanje spora gljiva

fungicidima kao izvora virusnih zaraza i vektora virusa, isplativo je samo kada se

obrađuju male površine.

6.3. Sprečavanje virusnih infekcija kultiviranjem otpornih biljaka

Do otpornih (rezistentnih) sorata dolazi se selekcijom i uzgojem. Razlikuje se

genetski kontrolirana (nasljedna) otpornost i stečena (inducirana) otpornost.

Inducirana otpornost nije nasljedna i biljka ga stječe odgovarajućom obradom prije

infekcije. Primjerice, zdrava biljka se inficira blagim sojem virusa i tako biljka razvije

otpornost na agresivniju infekciju tim istim ili usko srodnim virusom. Taj se postupak

zove ukrižna zaštita bilja.

Inducirana se otpornost isto može postići tako da se u zaraženu biljku inokulira

salicilna kiselina (aspirin), i još dodatno virus, pa će infekcija biti ograničena ili

spriječena.

Pronalaženje otpornih biljaka se temelji na nasljednoj otpornosti.

Uporaba virusno otpornih biljaka u sprečavanju virusnih infekcija ima prednost

pred ostalim načinima suzbijanja viroza. Izbjegava se uporaba insekticida, hrana je

zdravija, smanjuje se onečišćenje okoliša a smanjuje se i mogućnost da insekti

steknu otpornost na insekticide. Uporabom otpornih biljnih sorata na virusne

50

infekcije, suzbijaju se neperzistentni virusi koji se drugim postupcima teško mogu

suzbiti

6.3.1. certifikacija

Zdravstveno poboljšanje se postiže kroz selekcije i zdravstvene mjere koje se

najbolje ističu u okviru certificiranih programa. Certificirani cijepovi garantiraju:

ispravnost vrste, osnovne kvalificirane značajke i sanitarni status. Takav materijal

nosi oznaku VT (virus tested), što znači da nije zaražen virusima niti fitoplazmama

koje izazivaju ekonomske štete i posebno je označen.

Certifikacija se može definirati kao procedura gdje se kandidat majke biljke

koristi kao izvorni materijal za razmnožavanje, i prolazi kroz kontrole i kad god je

potrebno tretmane da se osigura čistoća i odsustvo patogena.

Specificira se propisima određenim ili potvrđenim od ovlaštene vladine agencije.

Testiranje je predviđeno za ove viruse vinove loze:

Za sorte

1. lepezasti list vinove loze – Grapevine Fanleaf Virus (GFLV)

2. virus mozaika gušarke – Arabis Mosaic virus (ArMV)

3. virus uvijenosti lista vinove loze – Grapevine Leafroll Virus (GLRV)

a) uvijenost lista pridruženi virus 1 – Grapevine Leafroll – associated

virus 1 (GLRa V – 1)

b) uvijenost lista pridruženi virus 3 - Grapevine Leafroll – associated

virus 3 (GLRa V – 3).

Za podloge

4. virus šarene pjegavosti lista – Grapevine Fleck Virus (GFkV)

Predviđa se i testiranje i analize na prisutnost fitoplazma.

1. flavescence doree (FD)

2. Bois Noire (BN)

3. Aster yellows (AY)

51

6.4. Glavni termini koji se danas upotrebljavaju u označavanju otpornosti

biljaka:

- Osjetljivost, biljka je osjetljiva ako je virus lako inficira i ako se lako

razmnožava unutar nje. Suprotan pojam otpornosti je rezistentnost

(otpornost).

- Imunost, biljka je imuna na neki virus ako je taj virus ne može inficirati tj.

Kad biljka nije domaćin toga virusa. Pojam imun se još upotrebljava

kada virus ne može inficirati samo jednu određenu sortu neke biljne

vrste dok su ostale sorte normalno osjetljive.

- Rezistentnost, biljka je rezistentna ako je sposobna smanjiti ili spriječiti

razmnožavanje virusa ili ako je sposobna spriječiti ili odgoditi pojavu

prvih simptoma. Dakle rezistentna biljka ne pokazuje simptome bolesti ili

pokazuje male simptome.

- Tolerantnost, ovu osobinu pokazuju biljke koje virus može zaraziti, ali

koje zbog svog genetskog ustroja, pokazuju blage ili gotovo neprimjetne

simptome zaraze; u takvim biljkama se virus normalno razmnožava i širi

sistemno. Tolerantnost biljke prema virusu je nasljedna otpornost biljke.

Za višegodišnje biljne vrste to i nije dobro jer onda mogu biti potencijalni

izvori zaraze.

- Hipersenzitivnost ili preosjetljivost , neke biljke reagiraju na virusnu

infekciju tako da tkivo, u kojem je došlo do prvotne infekcije, vrlo brzo

ugine (nekrotično tkivo). Kod nekih hipersenzitivnih biljaka virus se

prestaje dalje širiti kroz uginulo tkivo. Svaranje nekrotičnih lokalnih lezija

je isto hipersenzitivna reakcija; virus je u leziji ograničen na inokulirane i

susjedne stanice koje brzo nakon infekcije uginu. U nekim slučajevima

virus je posve ograničen na mjestu lokalne lezije, a u drugim slučajevima

se virus brzo širi kroz žilni sustav biljke, uzrokujući nekroze u žilama te

brzo uginuće dijelova biljke ili smrt biljke. Hipersenzitivnost je nasljedna

osobina pa se selekcijom mogu dobiti hipersenzitivne sorte.

52

ZAKLJUČAK

Ukupni svjetski gubitci u biljnoj proizvodnji, koje uzrokuju sve biljne bolesti

zajedno, iznose oko 60 milijardi američkih dolara na godinu. Glavni uzroci tih

gubitaka su gljivične bolesti, a odmah nakon njih virusne bolesti

Suvremeno vinogradarstvo se danas susreće sa sve većim prisustvom viroza.

Štete od virusa mogu biti vrlo značajne i uzrokuju ozbiljne posljedice na zdravlje

vinove loze, urod i kvalitetu vina. Urod se smanjuje 5 – 10%, a virusi mogu utjecati i

na kvalitetu vina uzrokujući odgodu akumulacije šećera, slabo razvijanje kiselina, i

boje.

Virusi se sastoje od nukleinske kiseline i proteinskog omotača, a jedinstveni su

u prirodi po tome što, za razliku od svega ostalog živog, sadrže samo jedan tip

nukleinske kiseline ili samo DNA ili samo RNA.

Jednom kada virus uđe u živu biljku ima sposobnost da reprogramira biljnu

stanicu u svoju korist i na taj način se razmnožava. U vinovoj lozi virusi se šire

sistemično, na sve dijelove loze (korijenje i vegetativne dijelove). Jednom zaražena

biljka ostaje zaražena cijeli život.

Na zaraženim trsovima slabiji je porast mladica, rijetko nastupa uginuće trsa, a

vidljivi simptomi mogu biti više ili manje izraženi što ovisi o virulentnosti soja i

osjetljivosti sorte.

Identifikacija virusa vinove loze je vrlo delikatna, a metode koje se primjenjuju

(vizualna detekcija, indeksiranje na Vitis indikatore, serološke metode - ELISA, PCR

metoda) se međusobno nadopunjuju.

Ljudi su najučinkovitiji prijenosnici virusnih bolesti preko premještanja i

razmnožavanja podloga i plemki koji su zaraženi virusom i gotovim biljem. Većina

virusa ima i druge načine širenja putem sjemena, korova, peluda, gljivica. Insekti ili

drugi organizmi koji šire virus zovu se vektori.

Za razliku od drugih uzročnika bolesti virusi se ne mogu suzbijati, mogu se

jedino primijeniti preventivne mjere. Osnovni vid borbe protiv virusa vinove loze, je

osiguranje zdravog, certificiranog sadnog materijala.

53

Literatura

1. Nikola Juretić; Osnove biljne virologije; školska knjiga, Zagreb 2002.

2. Nikola Mirošević; Razmnožavanje loze i lozno rasadničarstvo; Golden

marketing – tehnička knjiga, zagreb, 2007.

3. Milan Maceljski, Bogdan Cvjetković, Zvonimir Ostojić, Božena Barić;

Štetočinje vinove loze; knjiga 54; Čakovec:Zrinski d.d.,2006.

4. Internet :

- Ed Weber, Deborah Golino & Adib Rowhani ; Laboratory testing

for grapevine diseases;

URL:http://www.practicalwinery.com/janfeb02p13.htm.

- IAM Plant Biotech Unit;Plant pathology webpages; URL:http://

www.boku.ac.at/iam/pbiotech/phytopath/col.html#esfy

- Site for plant virologist; Descriptions for plant viruses;

URL: http://www.dpvweb.net/index.php.

- Graft transmissible diseases of grapevine;

URL: http://www.fao.org

- Virusi; URL: http://hr.wikipedia.org.wiki / virusi # column – one #

column – one

- PCR; URL: http://hr.wikipedia.org.wiki / PCR # standardni PCR#

standardni PCR

- Načini širenja virusa; URL: http:// www.biolozi.net/ upload/

Anin_drugi_deo.pdf.

- Phitoplasma diseases; Ministry of Agriculture and Lands,British

Columbia URL: http:// www.gov.bc.phitoplasma.htm ,

- Grape virus diseases; Ministry of Agriculture and Lands,British

Columbia URL: http:// www.agf.gov.bc.ca/cropprot/grapeipm/virus

- Arabis mozaic nepovirus; URL: http://

www.eppo.org/QUARANTINE/virus/Arabis_mosaic_nepovirus

- Nematodes; URL: http://maths.gla.ac.uk/ nematodes.html

- Virus diseases; URL: http://wine.edu/virology/virus diseases.html

- Grapevine disease testing; URL: http://www.mercier-groupe.com