C19-Steroid-glucuronide in menschlichem Plasma nach intravenöser Injektion von freiem [7α-3H]-3β-Hydroxy-Δ5-androstenon-(17)

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    30-Sep-2016

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  • European J. Biochem. 2 (1967) 384-386

    C,,-Steroid-glucuronide in menschlichem Plasma nach intravenoser Injektion von freiem [ 7 c ~ - ~ H ] - 3 P-Hydroxy-A5-androstenon-( 1 7 )

    P. KNAPSTEIN, F. WENDLBERGER und G. W. OERTEL

    Abteilung fur Experimentelle Endokrinologie, Universitats-Frauenklinik Maine und Chirurgische Universitatsklinik Homburg/Saar

    (Eingegangen am 10. Marzl18. August 1967)

    Free 7a-[3H]dehydroepiandosterone (DHEA) was injected intravenously into a 46 year old woman ; I0 minutes afterwards the 3H-labelled glucuronosides of dehydroepiandrosterone, androsterone, etiocholanolone and A4-androstendione could be isolated and identified in peripheral venous plasma; 2O/, of the conjugated dehydroepiandrosterone were found to be coupled with glucuronic acid and 98Ol0 with sulphuric acid.

    Wghrend aus menschlichem Urin bereits ver- schiedene C,,-Steroidglucuronide isoliert werden konnten [I-51, IieRen sich im Plasma Testosteron-, 5/3-Androstanolon- und Androsteronglucuronid bisher nur auf indirektem Wege, d. h. im AnschluB an eine enzymatische Hydrolyse mit P-Glucuronidase der Qesamt-Konjugatfraktion, nachweisen [B-91. Die Schwierigkeiten einer Isolierung von Glucuronid aus Plasma sind bedingt durch die niedrige physiologische Konzcntration, die auf etwa 2-4 pg Clg-Steroid- glucuronid/100 ml Plasma geschatzt wird [9] und nur bis der entsprechenden Sulfokonjugate ausmacht [ 101. Im folgenden Experiment sollte daher versucht werden, das Gluruconid von Dehydroepian- drosteron (DHEA), bzw. seiner Metaboliten nach i.v. Applikation von radioaktiv markiertem Substrat im menschlichen Plasma zu isolieren. Dieser Nach- weis erschien von besonderem Interesse im Zusam- menhang mit dem kurzlich beschriebenen direkten Metabolismus von [7cc-3H]DHEA-[14C]glucuronid [Ill.

    METHODIK

    Versuchsdurchfiihrung und chemische Aufarbeitung Einer 46 jahrigen gesunden Frau im Klimakte-

    rium injizierte man 0,201 p.g [7w3H]DHEA (Radio- chemical Centre, Amersham, England) mit 101400000 Imp/min in eine Vena cubitalis. 10 min spater entnahm man aus einer Vene des gegenseitigen Armes 102 ml Blut, welches mit 100 IE Liquemin (Hoffmann-La Roche) pro Milliliter heparinisiert und dann zentrifugiert wurde. Aus 25 ml Plasma wurden freie Steroide mit 3 x 2 Vol. Methylenchlorid extra- hiert, wahreud man die gesamten Steroid-konjugate

    lVicht allgemein gebrauchliche Abkurzung. Dehydro- epiandrosteron, DHEA,

    durch Behandlung mit Chloroform-Methanol (1 : I, v/v) gewann [I I]. Eine einwandfreie Auftrennung in Steroid-sulfatide, -sulfate und -glucuronide lie13 sich durch Anionenaustauscher-Chromatographie an DEAE-Sephadex A-50 [ 121 sowie mehrfache Dunn- schicht-Chromatographie in den Systemen A (Tab. l) , B und C erreichen, wobei sich erfahrungsgemaB die ursprunglichen Steroid-sulfatide in -sulfate um- wandelten. Die Sulfokonjugate wurden sodann einer Ather-Solvolyse nach Treiber und Oertel [I31 unter- worfen. Die weitere Auftrennung der Glucuronid- fraktion in Einzelverbindungen gelang durch Chro- matographie in den Systemen D, E und F. Das nach Chromatographie in System D und E isolierte DHEA- glucuronid wurde vor Chromatographie in System F rnit 180 pg authentischem DHEA-glucuronid1 ,(ent- sprechend 104pg freiem DHEA) verdunnt und die spezifische Aktivitat mit Hilfe der Oertel-Eiknes- Reaktion [ 141 bestimmt. Die einzelnen Glucuronid- fraktionen hydrolysierte man sodann fermentativ durch Bebrutung mit P-Glucuronidase (Warner-Chil- cott-Morris Plains, N.J., USA) in I M Acetatpuffer pH 4,75, und chromatographierte die freigesetzten Clg-Steroide in den Systemen G und H. AnschlieBend wurden die freien markierten Verbindungen jeweils rnit entsprechendem unmarkiertem Standard ver- dunnt, nach Rechromatographie im System J der Reaktion mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin [I51 unter- worfen und die farbigen Derivate in den Systemen G und K bis zu konstanter spezifischer Aktivitat ge- reinigt. Letztere wurde als konstant angesehen, wenn sie sich bei zweimaliger Chromatographie um weniger als 1O0/, anderte (Tab. 3). Die qualitative Auswertung der Chromatogramme geschah im ,,Berthold"-Dunn-

    Herrn Prof. Dr. Klyne (Medical Research Council Steroid Reference Collection, London), danken wir sehr fur die freundlichc uberlassung der Referenzsubstanz.

  • Vo1.2, No.4,1967 P. KNAPSTEIN, F. WENDLBERGER und G. W. OERTEL 385

    Tabelle 1. Die zur Isolierung konjugierter und freier Steroide, bzw. ihrer 2,4-Dinitrophenylhydrozone, benutzten chromatographischen Systeme

    Systerne" Lanfmittel

    A DSC B DSC C DSC D DSC E PC F PC G DSC H PC J DSC I< DSC

    Kieselgel G Kieselgel G Kieselnel G Kieseliel G PaDier MN 214 FF Papier MN 214 FF Kieselgel G I'apier MN 214 FP ICieselgel G Kieselgel G

    Isooctan-,&ther (1 : 1, v/v) Chloroform-Methanol- Ammoniak (20: 5 : 0,2, v/v) Chloroform-Methanol-Ammoniak (10: 10: 0,2, v/v) Chloroform-Methanol-Ammoniak (5: 15 :0,2, v/v) Athylacetat-n-Hexan--Essigsaure-Wasser (6: 4: 3: 7, v/v) Tert. Butanol-Dichlorathan-Essigsaure-Wasser (5: 15: 6: 14, v/v) Chloroform-Dioxan (94:6, v/v) Propylenglycol b -Methyleyelohexan Athylacetat - Cyclohexan (1 : 1, v/v) 10001, Chloroform

    a DSG = Diinnschicht-Chromatographie, P C = Yapier-Chromatographie. b Impragnierungsmittcl.

    Tabelle 2. Die nus den einzelnen Steroidfraktionen isolierteu Metaboliten von ?'cr-3H-DHEA

    Mctabolit Steroidfraktion - ~ _ _ _

    A B C D

    Imp./min Imp./min Imp./min Imp./min

    Freie Steroide 5310 15250 1930 620 Steroid-sulfatide 75200 7620 12910 2650 Steroid-sulfate 14340 1300 2440 530 Steroid-glucuronide 1190 8770 9050 1500

    a A = Dehydroepiandrosteron = DHEA = 3p-Hydroxy-d6-Andro- stenon-(17); B = 5p-Androstanolon = 3a-Hydroxy-5p-Androstanon-(17); C = Androsteron = 3a-Hydrosy-5a-Androstenon-(17); D = d4-Andro- stendion43.17).

    ERGEBNISSE UND DISKUSSION

    Die aus 25 ml Plasma isolierten Steroid-sulfatide enthielten insgesamt 106 860 Implmin 3H, die -sulfate 20160, die -glucuronide 26940 und die freien Ste- roide 27 160. Durch sechsfache Chromatographie (Tab.1) lieB sich die Fraktion der Glucuronide in 4 Einzelverbindungen auftrennen, wobei 1870 Imp/ min 3H auf DHEA-glucuronid entfielen, 10790 auf Androsteron-, 10580 auf 5p-Androstanolon- und 1910 auf ein unpolares Glucuronid. I n Tab.2 sind die aus den verschiedenen Fraktionen freigesetzten und charakterisierten Steroide aufgefuhrt.

    Das hier beschriebene Experiment galt vor allem dem Nachweis einer Glucuronidierung von DHEA

    Tabelle 3. SpezijisciLe Aktivitat der Glucuronidfraktionen, bzw. der daraus freigesetzten Steroide, i m Verlaufe zusatzlicher Chromatographie

    Spezifische AktivitBt. nach Chromatographie in System Steroid (-glucuronid)

    F" G b Hb J b GC KC

    Imp./min 'H/&g Steroid

    DHEA 19,7 - - 18,8 16,4 16,l Androsteron - - - 385,O 355,O 359,O 5,~?-Androstanolon - - - 425,O 387,O 382,O A4-Androstendion - - - 159,O 165,O 153,O

    ~

    a als Glueuronid. b nls freies Steroid. C als 2,4-Uinitrophen~lhydraaon.

    schicht-Scanner, Mod. LB 2720, wahrend man die quantitative Bestimmung von 3H im ,,Tricarb"- Szintillations-Spectrometer, Mod. 3003, (Packard Instr., La Grange, Ill., USA) vornahm.

    Chromatographie Die zur Charakterisierung der konjugierten und

    freien Steroide, bzw. ihrer 2,4-Dinitrophenyldrazone benutzten chromatographischen Systeme sind in Tab. 1 zusammengefaot und die zugehorigen Wan- derungsgeschwindigkeiten in 1.c. [ 111 aufgefuhrt.

    unter physiologischen Bedingungen beim Menschen, fehlen doch bislang Hinweise fur das Vorliegen von 3~-Hydroxy-Steroid-glucuronid im Plasma. Auch aus dem Urin wurde DHEA-glucuronid nur im Falle eines Nebennieren-Tumors mit enorm erhohter DHEA-Produktion [4] oder nach Gabe von un- physiologisch grol3en DHEA-Dosen [3] isoliert.

    Die Identitat des oben aufgefiihrten 3H-markier- ten Steroidglucuronides mit DHEA-glucuronid er- scheint aufgrund sechsfacher Chromatographie des Konjugatcs, anschlieoender dreifacher Chromato- graphie des hieraus freigesetzten Steroidanteiles,

  • 386 P. KNAPBTEIN, F. WE:ZJDLBERUE~< und 0. W. O B ~ T E L : C,,-Steroide in menschliehem Plasma European J. Biocheni.

    Derivatbildung und Reinigung bis zu konstanter spezifischer Aktivitat (Tab. 3) gesichert. In guanti- tativer Hinsicht war die Paarung von DHEA mit Glucuronsaure offensichtlich gering. 10 min nach i.v. Injektion des markierten Substrates lagen im peri- pheren Venenplasma 84,50/, der Radioaktivitat in Form von Steroid-konjugat vor. Hiervon entfielen 69,501, auf die Fraktion der Sulfokonjugate und 15,0/0 auf die der Glucuronide. Bei den Sulfo- konjugaten machte DHEA 76,50/, der Radioaktivitat aus, wahrend die an Glucuronsaure gebundenen Steroide zu 5,40/, aus DHEA bestanden '(Tab. 2). Hinsichtlich des Verhiiltnisses von DHEA-glucuronid zu -sulfatid plus -sulfat waren 2,02O/, der gesamten DHEA-Konjugate mit Glucuronsaure und 97,980/, mit Schwefelsaure gepaart . FaBt man die Tatsache ins Auge, da13 nur etwa 10-30/, des im Neben- nierenvenenplasma gefundenen DHEA in Form freien Steroides, etwa 70-900/, als Sulfokonjugat vorliegen [9,16] und andererseits cine intravitale Hydrolyse von DHEA-sulfonkonjugat oder -glum- ronid zu vernachlassigen ist [li, 171, so 1a6t sich hier- aus schlieBen, daB unter physiologischen Bedingun- gen etwa 0,2-0,6/0 des im peripheren Plasma kreisenden DHEA-Konjugates an Glucuronsaure ge- bunden sind. Dies wiirde einer Plasmakonzentration von etwa 0,l-0,6 pg DHEA-glucuronid/100 ml ent- sprechen. In diesem Zusammenhang fand Baulieu [4], daB auch im Urin DHEA-glucuronid nur 0,3O/, des -sulfates ausmachte. Wenn sich diese Untersuchun- gen iiberhaupt vergleichen lassen, so konnte ein iibereinstimmendes Verhaltnis von DHEA-glucu- ronid zu -sulfokonjugat in Plasma und Urin bedeuten, daB DHEA-glucuronid ebenso wie das Sulfokonjugat im Organismus einem direkten Metabolismus unter- liegt. Ein solcher direkter Metabolismus beider Kon- jugate wurde qualitativ unter Einsatz doppelt- markierten Substrates schon friiher nachgewiesen [ 11,17, IS].

    Als Glucuronide konnten weiterhin Androsteron, B,!?-Androstanolon und ein unpolares Steroid isoliert werden, welches sich nach Hydrolyse als A4-Andro- stendion erwies (Tab.2). In der Fraktion der Steroid- sulfokonjugate wurden neben DHEA Androsteron, 5,!?-Androstanolon und A4-Androstendion gefunden, wahrend bei den freien Steroiden 5B-Androstanolon die Hauptmenge der Radioaktivitat enthielt (Tab. 2).

    Vorliegende Arbeit wurde mit Unterstutzung der Deut- schen Forschungsgemeinschaft, Bad Godesberg, Deutsch- land, durchgefiihrt.

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    Gegenwartige Adresse von P. Knapstein: Hospital of the University of Pennsylvania 5 Dulles 581, Philadelphia, Pa. 19104 Vereinigte Staetcn von Amerika

    P. Wendlberger Abteilung fur Experimentelle Endokrinologie Universitats-Frauenklinik Mainz 6500 Mainz, LangenbeckstraBe 1, Deutschland

    G. W. Oertel Chirurgische Universitatsklinik 6650 Homburg/Saar, Deutschland

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