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922 © Masson, Paris, 2005. Gastroenterol Clin Biol, 2005, 29 CA45 ÉTUDE PROSPECTIVE DES PRÉCURSEURS SANGUINS DES CELLULES DENDRITIQUES CHEZ DES MALADES INFECTÉS PAR LE VIRUS DE L’HÉPATITE C ET TRAITÉS PAR IFN PÉGYLÉ ET RIBAVIRINE M Neau-Cransac (1), J Foucher (2), PH Bernard (2), D Neau (3), P Blanco (1) (1) Laboratoire d’Immunologie, Hôpital Pellegrin, Bordeaux, (2) Service d’Hépato-Gastroentérologie, Hôpital Saint-André, Bordeaux, (3) Fédération des Maladies Infectieuses, Hôpital Pellegrin, Bordeaux. La réponse immunologique cellulaire est primordiale dans l’évolution de l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC). Lorsque la réponse lymphocytaire T CD4+ est forte et asso- ciée à une réponse T CD8+, l’évolution est favorable avec clairance du VHC. À l’inverse, l’infection chronique est caractérisée par une réponse T CD4+ faible. Les cellules dendritiques (CD) sont impliquées dans la persistance de la réplication du VHC. Les précurseurs circulants des CD (pDC) représentent 0,1 % des cellules sanguines circulantes mononucléées. Deux types sont décrits : les pDC myéloides (pDC1) expriment le CD11 et le CD33, sécrètent de l’IL12 et orientent vers une réponse de type TH1 ; les pDC plasmocy- toïdes (pDC2) expriment le CD123, sécrètent de grande quantité de type I interféron et jouent un rôle majeur dans la défense anti-virale. Une diminution de la fréquence et des anomalies fonctionnelles des pDC ont été décrites au cours de l’infection par le VHC. But : Etudier prospectivement les pDC chez des malades infectés par le VHC au cours du traitement par IFN pégylé et ribavirine. Méthodes : Avant traitement, les résultats ont été comparés à ceux de 10 malades VHC-, appariés pour l’âge et le sexe. Le sang est prélevé sur tube EDTA avant puis 1, 3 et 6 mois après le début du traitement antiviral puis 6 mois après la fin du traitement. Les pDC1 sont identifiées par un double mar- quage ILT3+/CD33+, les pDC2 par un double marquage ILT3+/CD123+ (Immunotech, Marseille, France). L’analyse est réalisée en cytométrie de flux (cytomètre FACSCalibur, Becton Dickinson). Résultats : Onze malades (âge moyen : 47 ans, 23-69) ont été étudiés. Médiane de suivi : 6 2 mois. Six mois après le début du traitement, 8 ont négativé leur ARN VHC. Avant traitement, il n’existe pas de différence significative dans le pourcentage des pDC2 et des pDC1 entre les malades VHC+ et les témoins. Pendant le traitement, le nombre de pDC2 n’est pas significativement modifié. Par contre, il existe une diminution transitoire mais significative (P = 0,03) des pDC1 au 3 e mois. À notre connaissance, il s’agit de la 1re étude lon- gitudinale des pDC au cours d’un traitement par IFN pegylé- ribavirine chez des malades VHC+. Le petit nombre de mala- des peut expliquer l’absence de modification importante de la fréquence des pDC observée. Par ailleurs, le sang périphéri- que est un mauvais reflet des modifications cellulaires intra- hépatiques survenant au cours des infections par le VHC. Cette étude doit être poursuivie chez un plus grand nombre de malades. Néanmoins, la baisse des pDC1 pourrait rendre compte de leur activation et de leur migration au niveau des organes lymphoïdes secondaires, lieu d’induction des répon- ses immunes. En outre, il serait intéressant de corréler cette observation à l’apparition de manifestations auto-immunes. CA46 MISE AU POINT D’UNE TECHNIQUE PERMETTANT D’OPTIMISER LA DÉTECTION DE LA RÉPLICATION DU VIRUS DE L’HÉPATITE C M Carrière (1), A Breiman (2), V Pène (3), F Conti (1, 4), S Chouzenoux (1), M Andrieu (5), P Jaffray (6), L Grira (6), O Soubrane (1, 4), P Sogni (1, 7), Y Calmus (1, 4), S Chaussade (1, 7), AR Rosenberg (3, 8), P Podevin (1, 7) (1) Upress 1833, Faculté de Médecine Paris 5, (2) Groupe Hépacivirus, Institut Pasteur Paris, (3) INSERM, Equipe Avenir, Institut Cochin, Paris, (4) Services de Chirurgie, Hôpital Cochin, Paris 5, (5) INSERM U567, CNRS UMR 8104, Paris 5, (6) Biochimie, Hôpital Cochin, Paris 5, (7) Hépatogastroentérologie, Hôpital Cochin, Paris 5, (8) Virologie, Hôpital St-Vincent de Paul, Paris 5. Introduction : La détection du brin anti-sens de l’ARN du virus de l’hépatite C (VHC) est habituellement reconnue comme une preuve de réplication du génome viral. Cepen- dant, cette détection se heurte à différents problèmes prati- ques. D’une part, la spécificité de l’amplification peut être prise en défaut par mésappariement des amorces. D’autre part, la sensibilité de la quantification peut être prise en défaut par la très faible réplication du VHC in vitro. But de l’étude : Nous décrivons une nouvelle technique de RT PCR permettant de concilier ces deux impératifs, et en présentons des applications in vivo et in vitro. Matériels et méthodes : Des ARN sens et anti-sens du VHC ont été synthétisés par transcription in vitro à partir d’un plasmide portant l’ADNc de la région 5’ non codante d’un isolat de génotype 1b. La transcription inverse a été faite à 60 C à l’aide de thermoscriptTM (Life technologies) et d’une amorce comportant une séquence d’hybridation spéci- fique à la région 5’ non codante du génome viral ainsi qu’une étiquette. Une première PCR a été réalisée avec un couple d’amorces dont l’une était complémentaire de la séquence servant d’étiquette. La quantification faisait appel à une seconde PCR en temps réel (DNA FastStart SYBR Green Kit, Roche) à l’aide d’amorces nichées. La technique a été validée in vivo à partir d’ARN extraits de biopsies hépatiques de malades ayant une hépatite chronique C. Pour la valida- tion in vitro, des hépatocytes humains isolés par dissociation enzymatique (collagénase) et cultivés sur support collagène ont été mis en présence du sérum d’un malade ayant une hépatite chronique C pendant 12h à 37 C. Résultats : La sensibilité de l’amplification du brin anti sens, évaluée par dilutions croissantes de l’ARN synthétique, était de 25 copies. En présence de quantités croissantes d’ARN synthétique sens, le signal de détection du brin anti sens con- servait sa spécificité jusqu’à 10 5 copies d’ARN sens ajoutées par réaction. Appliquée à deux biopsies hépatiques, notre technique a permis de quantifier respectivement 3 210 et 2 592 copies/ g d’ARN de brin anti-sens, pour 105 900 et 2 180 000 copies/ g d’ARN de brin sens, soit un ratio brin sens/anti-sens de 32 et 841 respectivement. Trois jours après l’infection d’hépatocytes en culture primaire, notre technique a permis de quantifier 300 copies/ g d’ARN de brin anti- sens, pour 1700 copies/ g d’ARN de brin sens, soit un ratio brin sens/anti-sens de 6. Conclusion : Très sensible, la présente technique permet avec une bonne spécificité de quantifier in vivo et in vitro la répli- cation du VHC.

CA45 - Étude prospective des précurseurs sanguins des cellules dendritiques chez des malades infectés par le virus de l’hépatite c et traités par IFN pégylé et ribavirine

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© Masson, Paris, 2005. Gastroenterol Clin Biol, 2005, 29

CA45ÉTUDE PROSPECTIVE DES PRÉCURSEURS SANGUINSDES CELLULES DENDRITIQUES CHEZ DES MALADESINFECTÉS PAR LE VIRUS DE L’HÉPATITE C ET TRAITÉSPAR IFN PÉGYLÉ ET RIBAVIRINE

M Neau-Cransac (1), J Foucher (2), PH Bernard (2),D Neau (3), P Blanco (1)(1) Laboratoire d’Immunologie, Hôpital Pellegrin,Bordeaux, (2) Service d’Hépato-Gastroentérologie,Hôpital Saint-André, Bordeaux, (3) Fédération desMaladies Infectieuses, Hôpital Pellegrin, Bordeaux.

La réponse immunologique cellulaire est primordiale dansl’évolution de l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC).Lorsque la réponse lymphocytaire T CD4+ est forte et asso-ciée à une réponse T CD8+, l’évolution est favorable avecclairance du VHC. À l’inverse, l’infection chronique estcaractérisée par une réponse T CD4+ faible. Les cellulesdendritiques (CD) sont impliquées dans la persistance de laréplication du VHC. Les précurseurs circulants des CD(pDC) représentent 0,1 % des cellules sanguines circulantesmononucléées. Deux types sont décrits : les pDC myéloides(pDC1) expriment le CD11 et le CD33, sécrètent de l’IL12 etorientent vers une réponse de type TH1 ; les pDC plasmocy-toïdes (pDC2) expriment le CD123, sécrètent de grandequantité de type I interféron et jouent un rôle majeur dans ladéfense anti-virale. Une diminution de la fréquence et desanomalies fonctionnelles des pDC ont été décrites au coursde l’infection par le VHC.

But : Etudier prospectivement les pDC chez des maladesinfectés par le VHC au cours du traitement par IFN pégylé etribavirine.

Méthodes : Avant traitement, les résultats ont été comparés àceux de 10 malades VHC-, appariés pour l’âge et le sexe. Lesang est prélevé sur tube EDTA avant puis 1, 3 et 6 moisaprès le début du traitement antiviral puis 6 mois après la findu traitement. Les pDC1 sont identifiées par un double mar-quage ILT3+/CD33+, les pDC2 par un double marquageILT3+/CD123+ (Immunotech, Marseille, France). L’analyseest réalisée en cytométrie de flux (cytomètre FACSCalibur,Becton Dickinson).

Résultats : Onze malades (âge moyen : 47 ans, 23-69) ont étéétudiés. Médiane de suivi : 6 2 mois. Six mois après ledébut du traitement, 8 ont négativé leur ARN VHC. Avanttraitement, il n’existe pas de différence significative dans lepourcentage des pDC2 et des pDC1 entre les malades VHC+et les témoins. Pendant le traitement, le nombre de pDC2n’est pas significativement modifié. Par contre, il existe unediminution transitoire mais significative (P = 0,03) des pDC1au 3e mois. À notre connaissance, il s’agit de la 1re étude lon-gitudinale des pDC au cours d’un traitement par IFN pegylé-ribavirine chez des malades VHC+. Le petit nombre de mala-des peut expliquer l’absence de modification importante de lafréquence des pDC observée. Par ailleurs, le sang périphéri-que est un mauvais reflet des modifications cellulaires intra-hépatiques survenant au cours des infections par le VHC.Cette étude doit être poursuivie chez un plus grand nombrede malades. Néanmoins, la baisse des pDC1 pourrait rendrecompte de leur activation et de leur migration au niveau desorganes lymphoïdes secondaires, lieu d’induction des répon-ses immunes. En outre, il serait intéressant de corréler cetteobservation à l’apparition de manifestations auto-immunes.

CA46MISE AU POINT D’UNE TECHNIQUE PERMETTANTD’OPTIMISER LA DÉTECTION DE LA RÉPLICATION DUVIRUS DE L’HÉPATITE C

M Carrière (1), A Breiman (2), V Pène (3), F Conti (1, 4),S Chouzenoux (1), M Andrieu (5), P Jaffray (6), L Grira(6), O Soubrane (1, 4), P Sogni (1, 7), Y Calmus (1, 4),S Chaussade (1, 7), AR Rosenberg (3, 8), P Podevin (1, 7)(1) Upress 1833, Faculté de Médecine Paris 5,(2) Groupe Hépacivirus, Institut Pasteur Paris, (3) INSERM,Equipe Avenir, Institut Cochin, Paris, (4) Services deChirurgie, Hôpital Cochin, Paris 5, (5) INSERM U567, CNRSUMR 8104, Paris 5, (6) Biochimie, Hôpital Cochin, Paris 5,(7) Hépatogastroentérologie, Hôpital Cochin, Paris 5,(8) Virologie, Hôpital St-Vincent de Paul, Paris 5.

Introduction : La détection du brin anti-sens de l’ARN duvirus de l’hépatite C (VHC) est habituellement reconnuecomme une preuve de réplication du génome viral. Cepen-dant, cette détection se heurte à différents problèmes prati-ques. D’une part, la spécificité de l’amplification peut êtreprise en défaut par mésappariement des amorces. D’autrepart, la sensibilité de la quantification peut être prise endéfaut par la très faible réplication du VHC in vitro.

But de l’étude : Nous décrivons une nouvelle technique deRT PCR permettant de concilier ces deux impératifs, et enprésentons des applications in vivo et in vitro.

Matériels et méthodes : Des ARN sens et anti-sens du VHCont été synthétisés par transcription in vitro à partir d’unplasmide portant l’ADNc de la région 5’ non codante d’unisolat de génotype 1b. La transcription inverse a été faite à60 C à l’aide de thermoscriptTM (Life technologies) etd’une amorce comportant une séquence d’hybridation spéci-fique à la région 5’ non codante du génome viral ainsi qu’uneétiquette. Une première PCR a été réalisée avec un coupled’amorces dont l’une était complémentaire de la séquenceservant d’étiquette. La quantification faisait appel à uneseconde PCR en temps réel (DNA FastStart SYBR GreenKit, Roche) à l’aide d’amorces nichées. La technique a étévalidée in vivo à partir d’ARN extraits de biopsies hépatiquesde malades ayant une hépatite chronique C. Pour la valida-tion in vitro, des hépatocytes humains isolés par dissociationenzymatique (collagénase) et cultivés sur support collagèneont été mis en présence du sérum d’un malade ayant unehépatite chronique C pendant 12h à 37 C.

Résultats : La sensibilité de l’amplification du brin anti sens,évaluée par dilutions croissantes de l’ARN synthétique, étaitde 25 copies. En présence de quantités croissantes d’ARNsynthétique sens, le signal de détection du brin anti sens con-servait sa spécificité jusqu’à 105 copies d’ARN sens ajoutéespar réaction. Appliquée à deux biopsies hépatiques, notretechnique a permis de quantifier respectivement 3 210 et2 592 copies/ g d’ARN de brin anti-sens, pour 105 900 et2 180 000 copies/ g d’ARN de brin sens, soit un ratio brinsens/anti-sens de 32 et 841 respectivement. Trois jours aprèsl’infection d’hépatocytes en culture primaire, notre techniquea permis de quantifier 300 copies/ g d’ARN de brin anti-sens, pour 1700 copies/ g d’ARN de brin sens, soit un ratiobrin sens/anti-sens de 6.

Conclusion : Très sensible, la présente technique permet avecune bonne spécificité de quantifier in vivo et in vitro la répli-cation du VHC.