Bolile genetice rezultă prin tulburări ereditare ale sistemelor complexe care controlează componentele normale ale dezvoltării şi homeostaziei organismului. Factorii de mediu contribuie variabil la fenotipul acestor boli prin destabilizarea sistemelor deficiente. Tratamentul bolilor genetice îşi propune restabilirea homeostaziei. Strategiile utilizate în prezent acţionează în special în aval de cauzele acestor boli, care sunt mutaţiile genice. Ca urmare, se urmăreşte restabilirea fenotipului în absenţa corecţiei genotipului. Termenul de terapie genică descrie orice procedură care intenţionează să trateze sau să amelioreze o boală genetică prin modificarea genotipului celulelor pacientului.

Necesitatea dezvoltării tratamentului bolilor genetice este reală deoarece către vârsta de 25 de ani aproape 5% din populaţia ţărilor dezvoltate suferă consecinţele unor mutaţii genice iar, pe parcursul întregii vieţi, circa două treimi din populaţie va dezvolta o boală multifactorială în care există o componentă genetică majoră.

Ideea instituirii unor metode de tratament pentru bolile genetice, considerate altădată ca boli fatale, a fost pentru prima dată discutată ca o problemă prioritară în cadrul celui de-al 3-lea Congres Internaţional de Genetică Umană de la Chicago, 1966, când una dintre secţiuni a fost intitulată: "Tratamentul în Genetica Medicală". Incă de atunci această problemă a fost văzută cu mult optimism. Cu un deceniu mai înainte începuse deja utilizarea tratamentului dietetic în fenilcetonurie, care a permis prevenirea retardului mintal asociat acestei boli. Icterul neonatal determinat de incompatibilitatea materno-fetală în sistemul Rh, putea fi, de asemenea, prevenit. A fost propus chiar un algoritm simplu de tratament pentru bolile produse prin erori de metabolism în care măsurile de bază erau restricţia substratului toxic, înlocuirea produsului final deficitar, suplimentarea unor coenzime (care să stimuleze activitatea limitată a enzimelor mutante), ori înlocuirea proteinei – enzimei deficitare. Chiar şi ideea "ingineriei genetice" era percepută ca o modalitate posibilă, cu cert potenţial curativ. Cu toate acestea, la peste trei decenii după momentul mai sus amintit, tratamentul bolilor genetice este considerat, încă, a fi nesatisfăcător.

In cazul bolilor multifactoriale principalul obstacol în calea dezvoltării unor tratamente eficiente este înţelegerea încă modestă a factorilor de mediu şi genetici care intervin în etiologia lor. Atunci când este identificat un anumit factor de mediu, există posibilitatea unei intervenţii eficiente prin modificarea expunerii la acel factor.

De exemplu, alături de predispoziţia genetică, fumatul este un factor de risc major pentru producerea emfizemului pulmonar. Înţelegerea mecanismului prin care fumul de ţigară este implicat în producerea emfizemului a fost rezultatul studierii unei boli monogenice, deficienţa de alfa 1-antitripsină. Constituienţii din fumul de ţigară induc oxidarea unui reziduu critic de metionină din situsul activ al proteinei, reducând de circa 2000 de ori capacitatea acesteia de a inhiba elastază. Ca urmare, fumul de ţigară produce o "formă dobândită" de deficienţă a alfa 1-antitripsinei.

Multe dintre bolile multifactoriale beneficiază în prezent de anumite forme de tratament medical sau chirurgical, deşi adesea aceste forme de tratament nu au un "substrat genetic". Exemple sunt tratamentul intensiv cu insulină în diabetul zaharat tip 1, care reduce considerabil rata complicaţiilor, sau tratamentul chirurgical al anomaliilor congenitale (malformaţii cardiace, despicături labio-palatine, stenoza hipertrofică de pilor) care îmbunătăţeşte considerabil calitatea vieţii. In cazul bolilor multifactoriale cu

1

CAPITOLUL 19

TRATAMENTUL BOLILOR GENETICE

debut la adult (hipertensiunea arterială esenţială, boala coronariană, diabetul zaharat tip 2, psihozele majore) rezultatele încă nesatisfăcătoare ale tratamentului reflectă complexitatea patogeniei şi lipsa înţelegerii sale complete.

Tratamentul bolilor monogenice este încă şi mai deficitar. De exemplu, un studiu publicat în 1995 asupra a 65 de boli mendeliene arată că tratamentul la acea dată era considerat complet eficient în 12% din cazuri, parţial eficient în 57% din cazuri şi fără nici un beneficiu în 31% din cazuri. Există două cauze majore ale acestor rezultate modeste. În primul rând, în peste 75% dintre bolile genetice, locusul mutant nu este încă cunoscut, iar pentru multe din bolile cartografiate înţelegerea patogeniei bolii este încă incompletă. De exemplu, chiar şi în cazul fenilcetonuriei, una dintre primele boli genetice studiate, mecanismul prin care hiperfenilalaninemia conduce la alterarea dezvoltării cerebrale este încă puţin înţeles. In al doilea rând, multe dintre mutaţii acţionează precoce în cursul dezvoltării sau determină tulburări ireversibile înainte de punerea diagnosticului. Această problemă poate fi anticipată în unele cazuri dacă există un istoric familial de boală genetică, iar screening-ul purtătorilor identifică cupluri cu risc. In asemenea circumstanţe o posibilitate este utilizarea tratamentului prenatal, fie medical fie chirurgical, utilizabil în prezent pentru unele boli. Exemple sunt administrarea la mama de cobalamină în cazul aciduriei metilmalonice ce răspunde la cobalamină sau vezicostomia ori cateterizarea percutanată în cazul hidronefrozei determinate de existenţa unei valve uretrale.

Inainte de a prezenta principalele strategii utilizate în tratamentul bolilor genetice vom sublinia că dezvoltarea unor noi metode de tratament pentru această categorie de boli este îngreunată de doi factori: necesitatea unei studieri îndelungate a tratamentului înainte de standardizarea sa, pe de o parte, şi heterogenitatea genetică, pe de altă parte.(1) Există mai multe cauze care fac necesară o analiză îndelungată a fiecărei noi modalităţi de tratament. In primul rând modalităţi de tratament care par a avea la început succes deplin pot

releva pe parcurs unele deficienţe. De exemplu, deşi tratamentul dietetic în fenilcetonurie permite evitarea retardului mintal sever, persistă adeseori unele deficite în procesele de învăţare şi unele tulburări de comportament.

In al doilea rând, prelungirea duratei de viaţă a pacienţilor, ca urmare a aplicării unor metode de tratament, poate să releve noi manifestări clinice ale bolii, care nu erau evidente în cazul unei evoluţii naturale. Un exemplu este retinoblastomul familial, boala altădată fatală în primii ani de viaţă datorită dezvoltării unor tumori oculare maligne. Pacienţii trataţi cu succes au însă un risc crescut de apariţie a unor tumori independente, osteosarcoamele, care devin evidente clinic după prima decadă de viaţă.

In sfârşit, unele metode de tratament foarte eficace pe termen scurt pot să evidenţieze în timp efecte secundare importante. Exemple sunt dezvoltarea anticorpilor în cazul tratamentelor de înlocuire a proteinelor mutante sau riscul mutagenezei inserţionale în cazul unor metode de terapie genică.

(2) Aşa cum am discutat în capitolul 4.A.5 bolile genetice sunt caracterizate adeseori de fenomenul de heterogenităţii genetice (alelică sau de locus). Tratamentul corect al bolilor genetice impune adeseori adaptarea sa la nivelul moleculei afectate. De exemplu, hiperfenilalaninemia rezultă atât prin anomalii ale fenilalanin hidoxilazei, cât şi prin deficitul enzimelor care intervin în metabolismul biopterinei (vezi capitolul 11.C.1), dar

2

tratamentul la nivel molecular al acestor afecţiuni este diferit. Uneori chiar şi mutaţiile diferite ale aceleiaşi gene pot necesita tratament diferit. Exemple sunt talasemia şi sicklemia, ambele fiind boli determinate de mutaţii ale genei pentru beta-globina. Mutaţiile aceleiaşi gene pot determina nu numai boli diferite, dar, mult mai frecvent, grade diferite de severitate ale aceleiaşi boli, fapt care impune necesitatea unui grad suplimentar de “personalizare” a terapiei. In sfârşit, tratamentul trebuie să ţină seama de consecinţele mutaţiei asupra proteinei codificate: mutaţii cu pierderea sau câştigul funcţiei, mutaţii cu efect dominant negativ etc. (vezi capitolul 11.B).

A. STRATEGII DE TERAPIE ALE BOLILOR GENETICE Modalităţile de tratament al diferitelor boli genetice utilizate în prezent depind în

mare măsură de nivelul cunoştinţelor disponibile privitoare la bazele moleculare şi patogenia bolii. In general, bolile moleculare beneficiază, cel puţin la nivel de posibilităţi teoretice, de mai multe strategii de abordare a tratamentului, în timp ce bolile cu substrat genetic necunoscut sunt adeseori tratate simptomatic. Ca urmare, daca privim boala ca un model biologic, putem deosebi: strategii care acţionează asupra fenotipului clinic (tratamentul simptomatic), metode de tratament care vizează corectarea tulburărilor metabolice sau ale altor

defecte biochimice asociate, metode de tratament care acţionează la nivelul proteinei mutante transplantele de organ, metode de modulare a expresiei genice, terapia genică (care va fi discutată separat în cadrul subcapitolului 19.B).

1. METODE DE TRATAMENT CARE ACŢIONEAZĂ LA NIVELUL FENOTIPULUI

Tratamentul simptomatic este, chiar şi în prezent, strategia principală la care se poate apela într-o multitudine de boli genetice, atât monogenice cât şi multifactoriale. In această categorie sunt incluse metode educaţionale pentru prevenirea unor factori declanşatori ai manifestărilor clinice, precum şi metode farmacologice sau chirurgicale de tratament. Defectul genetic de bază nu este modificat, însă manifestările clinice sunt adeseori ameliorate semnificativ. Exemple de metode de prevenţie sunt educarea pacienţilor cu anumite boli obiectivul fiind acela al evitării expunerii la factorii de mediu şi la medicamentele care declanşează apariţia simptomelor (vezi capitolul 8) sau limitarea expunerii la radiaţiile ultraviolete a pacienţilor cu albinism ori xeroderma pigmentosum. Printre exemplele de procedee farmacologice pot fi menţionate administrarea de agenţi blocanţi beta-adrenergici la pacienţii cu sindrom Marfan în vederea evitării dilatării rădăcinii aortice şi a dezvoltării disecţiei de aortă, ori administrarea de droguri anticonvulsionante la pacienţii cu diverse boli genetice neurodegenerative. In sfârşit, intervenţiile chirurgicale sunt metode eficiente în corecţia malformaţiilor congenitale, a condrodistrofiilor sau la pacienţii cu risc crescut de dezvoltare a unor neoplazii la nivelul unui anumit organ (precum tiroidectomia profilactică la copiii cu MEN2b – vezi capitolul 17.D.1.1).

3

2. TRATAMENTUL TULBURĂRILOR METABOLICE SAU BIOCHIMICE ASOCIATE BOLILOR GENETICE

Tratamentul la acest nivel se realizează prin metode farmacologice sau nutriţionale şi depinde în mare măsură de înţelegerea patogeniei bolii. Aşa cum aminteam în capitolul 11.C.1, modalităţile prin care o enzimă mutantă poate determina fenotipul bolii sunt: acumularea substratului la niveluri toxice, producerea în exces a unui metabolit alternativ, deficienţa produsului de reacţie sau diverse combinaţii ale acestora. Deşi această paradigmă este cel mai uşor vizibilă în cazul bolilor produse prin deficite enzimatice, ea este valabilă în cazul tuturor produşilor genici care participă în interacţiuni biochimice sau moleculare dinamice. Ca urmare a proceselor fiziopatologice amintite, se pot utiliza următoarele modalităţi de tratament: restricţia substratului, utilizarea unor căi metabolice alternative pentru îndepărtarea metaboliţilor toxici, utilizarea unor inhibitori metabolici sau înlocuirea produsului de reacţie deficitar (vezi tabelul 19.1).

Tabelul 19.1. Modalităţi de tratament ale bolilor genetice prin manipulare metabolicăTIPUL DE INTERVENŢIE SUBSTANŢA SAU

TEHNICA UTILIZATĂBOALA

Restricţia dietetică FenilalaninaGalactoza

FenilcetonuriaGalactozemia

Utilizarea unor căi metabolice alternative

Benzoatul de sodiuPenicilamina

Tulburări ale ciclului ureeiBoala Wilson

Inhibiţia metabolică AllopurinolulStatinele

GutaHipercolesterolemia familiala

Inlocuirea produsului deficitar TiroxinaBiotina

Hipotiroidismul congenitalDeficienţa de biotinidază

2.1. RESTRICŢIA DIETETICĂ A SUBSTRATULUI

Reducerea aportului alimentar al unui anumit substrat poate fi eficientă în bolile în care fenotipul este consecinţa dominană a efectului toxic indus de acumularea sa în organism. În prezent sunt tratate în acest fel boli determinate prin mutaţii la nivelul a peste 24 loci. Dietele restrictive în fenilalanină sau aminoacizi ramificaţi începute precoce după naştere sunt eficiente în prevenirea retardului mintal asociat fenilcetonuriei, respectiv bolii urinii cu miros de sirop de artar. La fel, reducerea aportului alimentar de galactoză corectează deficitul de creştere, previne cataracta şi reduce, dar numai parţial, deficitele cognitive în galactozemie. Cu toate acestea, insuficienţa ovariană la femeile cu galactozemie care au fost tratate precoce persistă ca o complicaţie tardivă a bolii. Nivelul restricţiei substratului poate fi adaptat gradului de deficit al activităţii enzimatice, formele moderate sau uşoare de boală beneficiind de o restricţie moderată.

2.2. UTILIZAREA UNOR CĂI ALTERNATIVE DE ÎNDEPĂRTARE A METABOLIŢILOR TOXICI

Pentru acele boli în care fenotipul clinic este consecinţa acumulării unor metaboliţi toxici, pot fi utilizate modalităţi de conversie a acestora în produşi mai puţin toxici şi care pot fi eliminaţi mai uşor din organism. Eficacitatea unor asemenea procedee

4

este însă adeseori limitată de capacitatea sistemului de conversie şi necesită combinarea cu procedeele de restricţie ale substratului. Administrarea de benzoat de sodiu la pacienţii cu tulburări ale ciclului ureei ilustrează această modalitate de tratament. Benzoatul de sodiu suferă reacţii de conjugare cu glicina, formând hipuratul, produs care este eliminat mai uşor prin urină şi care conţine o cantitate mai mare de azot decât precursorii săi, realizând astfel o modalitate eficientă de eliminare a excesului de amoniu, caracteristică ale acestor boli. Adeseori este însă asociată şi restricţia aportului alimentar de proteine. Modalităţi similare sunt: utilizarea glicinei pentru conjugarea cu izovaleril-CoA în acidemia izovalerică, folosirea cisteaminei pentru a uşura eliminarea cistinei în cistonoză sau a penicilaminei pentru eliminarea excesului de cupru în boala Wilson.

2.3. UTILIZAREA INHIBITORILOR METABOLICI

In anumite boli, cum sunt cele în care simptomatologia clinică este rezultatul acumulării toxice a produşilor de reacţie ai unor căi metabolice alternative, o modalitate eficientă de tratament este utilizarea unor inhibitori specifici pentru acele căi metabolice. O consecinţă o reprezintă acumularea substratului din amonte, dar acesta poate fi uneori mai bine tolerat. De exemplu, allopurinolul este utilizat ca inhibitor al xantin oxidazei în gută şi în alte boli caracterizate prin degradarea excesivă a purinei şi acumularea acidului uric. Inhibiţia xantin oxidazei conduce la reducerea nivelelor sanguine ale acidului uric, şi, ca urmare, scade posibilitatea apariţiei nefropatiei urice şi a artritei din cadrul gutei. O consecinţă a acestui tratament este însă acumularea xantinei, dar aceasta este mai bine tolerată de către organism deoarece este mai solubilă. În hipercolesterolemia familială, heterozigoţii pentru mutaţiile receptorului LDL (vezi capitolul 11.C.4) trataţi cu inhibitori de tip statină ai HMG-CoA reductazei1 vor beneficia de o reducere semnificativă a nivelului plasmatic al colesterolului. In sfârşit, un alt exemplu de utilizare foarte eficientă a terapiei cu un inhibitor enzimatic este îmbunătăţirea evidentă a prognosticului pacienţilor cu tirozinemie ereditară de tip I prin utilizarea NTBC2, un inhibitor al 4-hidroxifenilpiruvat dioxigenazei.

2.4. INLOCUIREA PRODUSULUI DEFICITAR

Inlocuirea unui produs de reacţie deficitar este una dintre modalităţile cele mai eficiente de tratament al unor boli monogenice. Un exemplu semnificativ este cel al hipotiroidiei congenitale, boala cu determinism monogenic în 10-15% din cazuri. Această boală rezultă prin diverse defecte în dezvoltarea glandei tiroide sau în sinteza principalului sau hormon, tiroxina. Deoarece hipotiroidia congenitală este o boală foarte frecventă (1 la circa 4000 nou-născuti), iar administrarea de tiroxină poate preveni instalarea retardului mintal, screening-ul neonatal este practicat extensiv în numeroase ţări (vezi capitolul 18.B.3.2) pentru ca terapia să poată fi iniţiată cât mai precoce după naştere. La fel, administrarea de biotină la pacienţii cu deficit de biotinidaza permite restabilirea activităţii carboxilazelor biotin-dependente şi prevenirea apariţiei manifestărilor clinice. In sfârşit, administrarea de uridină la pacienţii cu deficit de sinteză

1 3-hidroxi-3metilglutaril-CoA reductază este enzimă care catalizeaza etapa cheie precoce în sinteza colesterolului.

2 2-(2-nitro-4-trifluorometilbenzoil)-1,3-ciclohexandiona

5

a pirimidinei ca urmare a aciduriei orotice ereditare permite corectarea anemiei macrocitare determinate de deficitul de pirimidină.

3. METODE DE TRATAMENT CARE ACŢIONEAZĂ LA NIVELUL PROTEINEI DEFICITARE

Tratamentul la acest nivel presupune fie restabilirea activităţii unei proteine mutante (prin stimularea activităţii reziduale sau prin creşterea stabilităţii sale), fie înlocuirea proteinei defective cu varianta normală (în cazul mutaţiilor care abolesc complet funcţia proteinei) – vezi tabelul 19.2.

Tabelul 19.2. Modalităţi de tratament care acţionează la nivelul proteinei mutante

STRATEGIA TERAPEUTICA EXEMPLU STATUSUL TRATAMENTULUI

Stimularea funcţiei proteinei mutanteAdministrarea unor cofactori pentru a creşte activitatea enzimatică

Homocistinuria ce răspunde la piridoxină

Tratamentul de elecţie pentru circa 50% dintre pacienţi

Inlocuirea proteinei mutanteInlocuirea unei proteine extracelulare

Inlocuirea extracelulară a unei proteine intracelulareŢintirea intracelulară a unei proteine

Factorul VIII în hemofilia Aα1-AT în deficienţa α1-AT

PEG-ADA în deficienţa ADAGlucocerebrozidaza modificată în boala Gaucher

EficientAdministrarea intravenoasă sau sub formă de aerosoli pentru a creşte nivelul activităţii în interstiţiul pulmonar.

Bine standardizat, sigur şi eficient, dar costisitorStandardizat, eficient clinic şi biochimic, dar costisitor

3.1. Stimularea funcţiei proteinei mutanteIntensificarea activităţii unei enzime disfuncţionale poate fi realizată prin

administrarea în doze farmacologice a unor vitamine, atunci când acestea sunt cofactori ai acelei proteine. De fapt, bolile genetice ce răspund la administrarea unor vitamine sunt afecţiuni care pot fi tratate cu cel mai mare succes. Aceasta pentru că organismul tolerează adeseori administrarea unor cantităţi de până la 100-500 de ori mari mari decât necesarul pentru nutriţia normală.

Mecanismul responsabil pentru beneficiul terapeutic variază de la boală la boală. De exemplu, homocistinuria este rezultatul unor mutaţii ale cistationin-sintetazei care reduc afinitatea acestei proteine pentru cofactorul său – piridoxal fosfatul. Aproximativ 50% dintre aceşti pacienţi redobândesc o activitate semnificativă a enzimei prin administrarea unor doze crescute de vitamina B6 – precursorul piridoxal fosfatului (50-500 mg piridoxina/zi). Creşterea activităţii hepatice a enzimei este relativ mică – de la 1,5% la 4,5% din activitatea normală – dar chiar şi o astfel de creştere poate îmbunătăţi dramatic evoluţia clinică a bolii şi determină dispariţia homocistinei din plasmă. In cazul deficitului de biotinidază (vezi subcapitolul 19.A.2.4) mutaţiile acestei enzime au ca rezultat limitarea capacităţii de reciclare a biotinei din proteinele biotinilate. Administrarea orală a unor cantităţi crescute de biotină permite compensarea deficitului

6

enzimatic şi prevenirea dezvoltării sechelelor neurologice.

3.2. Inlocuirea proteinei mutanteInlocuirea proteinei mutante cu varianta proteică normală continuă să fie un

domeniu de interes major în tratamentul bolilor genetice, dar în prezent este utilizată cu succes în mai puţin de 1% dintre bolile genetice pentru care există o formă de tratament.

Pentru ca această formă de terapie să aibă succes, proteina normală trebuie să fie capabilă să ajungă la nivelul compartimentului funcţional. Acest obiectiv este uşor de realizat atunci spaţiul ţintă îl constituie compartimentul extracelular, precum tractul gastrointestinal (de exemplu, tratamentul insuficienţei pancreatice asociate fibrozei chistice), plasma (de exemplu, tratamentul hemofiliilor) sau spaţiul extracelular (precum tratamentul deficienţei alfa1-antitripsinei – vezi mai jos).

Alfa1-antitripsina (α1-AT) este inhibitorul major al elastazei produsă de către neutrofile (vezi şi capitolul 6.C.1). Indivizii homozigoţi pentru varianta Z (circa 40.000 numai în America de Nord) au o activitate enzimatică redusă sub 15% şi un risc crescut de dezvoltare a insuficienţei pulmonare precoce. Cea mai eficientă modalitate de prevenire a instalării manifestărilor clinice ale deficienţei alfa1-antitripsinei este evitarea fumatului. In prezent este însă posibilă administrarea intravenoasă de α1-AT în doze suficient de mari pentru a menţine un nivel eficient al activităţii enzimatice în interstiţiul pulmonar pentru cel puţin o săptămână. Această modalitate de tratament este eficientă clinic numai la pacienţii care au o afectare pulmonară moderată (funcţie pulmonară restantă între 30 şi 65%). α1-AT poate fi administrată, de asemenea, inhalator, iar această modalitate permite atingerea unor nivele eficiente atât în plasmă cât şi în interstiţiul pulmonar prin utilizarea a două doze zilnice.

In cazul deficienţelor unor proteine intracelulare a fost necesară dezvoltarea unor modalităţi direcţionate (ţintite) de administrare către compartimentul intracelular corespunzător. Fezabilitatea acestui obiectiv a fost demonstrată pentru bolile de stocaj lizozomale (vezi capitolul 11.C.1), precum boala Gaucher (vezi mai jos), sindromul Hunter, boala Hurler sau boala Pompe.

Boala Gaucher este cea mai frecventă boală de stocaj lizozomală fiind întâlnită cu o frecvenţă de 1/450 în populaţia evreilor Ashkenazi şi de circa 1/40.000 – 1/100.000 în populaţia generală. Această boală autosomal recesivă este determinată de deficienţa enzimei glucocerebrozidaza localizată la nivelul lizozomilor. Rezultatul acestei deficienţe este acumularea subtratului, glucocerebrozidul, în special la nivelul lizozomilor macrofagelor. Consecinţele clinice sunt hepatosplenomegalia şi aplazia medulară, la care se adaugă în unele cazuri degenerarea progresivă a SNC. Modalitatea clasică de tratament al acestor pacienţi constă în transplantul medular, procedură care este însă asociată cu un risc crescut. In prezent peste 2500 de pacienţi sunt trataţi prin administrarea de glucocerebrozidaza. Pentru a rezolva problema orientării acestei proteine catre lizozomii macrofagelor a fost necesară îndepărtarea unor resturi de carbohidraţi de la nivelul capătului carboxiterminal al proteinei, ceea ce permite expunerea unui miez de α-manozil. Manoza expusă este recunoscută prin intermediul unui receptor pentru manoză existent pe suprafaţa macrofagelor şi astfel proteina este internalizată şi eliberată către lizozomi.

Terapia de substituţie ridică două probleme majore: stabilitatea proteinei administrate şi capacitatea acesteia de a determina formarea de anticorpi neutralizanţi, care pot anula eficacitatea tratamentului. O modalitate inovativă care încearcă să rezolve aceste probleme a fost dezvoltată în cadrul tratamentului deficienţei adenozin dezaminazei.

Adenozin dezaminaza (ADA) este o enzimă critică în cadrul metabolismului purinic care catalizează dezaminarea adenozinei către inozină şi a dezoxiadenozinei către dezoxiinozină. Deficienţa ADA este o boală autosomal recesivă caracterizată prin insuficienţa activităţii atât a imunităţii celulare (limfocitele T) cât şi a celei umorale (limfocitele B) – imunodeficienţa combinată severă (SCID). Pacienţii netrataţi decedează datorită unor infecţii severe în primii doi

7

ani de viaţă. Transplantul de măduvă de la un donor compatibil HLA este în prezent modalitatea standard de tratament. In cazul pacienţilor pentru care nu există un donor corespunzător a fost însă dezvoltată o modalitate de tratament bazată pe administrarea de ADA bovină modificată. Pentru a evita problemele legate de stabilitatea proteinei şi imunogenicitatea sa, ADA a fost ataşată covalent la un polimer inert – polietilen glicolul (PEG). PEG-ADA administrată sub forma de injecţii intramusculare săptămânale nu pătrunde în celule, are imunogenicitate redusă3 şi un timp de înjumătăţire plasmatică de 3-6 zile. Chiar dacă proteina nu pătrunde la nivel intracelular, ea este capabilă să îşi exercite activitatea în plasmă şi corectează aproape complet anomaliile metabolice, ceea ce determină o îmbunătăţire spectaculoasă a tabloului clinic.

Alte probleme considerate în cadrul terapiilor de înlocuire a proteinelor mutante includ costul procurării unor cantităţi suficiente pentru a trata toţi pacienţii prin administrări conform timpului lor de înjumătăţire (de exemplu 8-10 ore pentru factorul VIII al coagulării) sau contaminarea proteinei cu agenţi străini, în particular cu virusuri (precum virusurile hepatitice sau HIV). Introducerea tehnologiei ADN recombinant (caseta 19.1) promite a elimina cele mai multe dintre aceste probleme. CASETA 19.1

AGENŢI TERAPEUTICIOBŢINUŢI PRIN TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

1. Proteinele recombinante sunt obţinute prin exprimarea unei gene umane specifice introdusă într-un microorganism (E. coli) sau în animale transgenice, care au sistem translaţional similar cu cel uman. Prin această metodologie de succes au fost deja obţinute numeroase produse farmaceutice: factorii VIII şi IX antihemofilici, eritropoietina, insulina, hormonul de creştere, activatorul tisular al plasminogenului (t-PA), interferoni, interleukină 2, dezoxiribonuclează, etc.

Avantajele metodei sunt: obţinerea de cantităţi mari de proteine recombinante; expresia în bacterii este simplă şi puţin costisitoare; riscuri minime pentru pacienţi, deoarece dispar efectele secundare ale produselor convenţionale animale sau umane (reacţii imunologice) şi se evitã introducerea unor agenţi patogeni prin purificare imperfectă (HIV, prioni inductori ai bolii Creutzfeld Jacob în terapia clasică cu GH extras din glanda pituitară a cadavrelor).

Dezavantajele metodei sunt: purificarea produselor recombinante este costisitoare; uneori produsele de expresie în bacterii nu sunt adecvate (modificări post-translaţionale neadecvate, produs instabil sau fără funcţie biologică la om); pacienţii cărora le lipseşte complet produsul normal pot dezvolta o reacţie imună la administrarea produsului recombinant.

2. Vaccinuri modificate genetic S-au folosit mai multe strategii pentru construcţia noilor vaccinuri:

vaccinuri cu acizi nucleici plasmide bacteriene care conţin genomul agentului patogen sau antigene tumorale sub controlul unui promotor viral puternic;

antigene modificate genetic fuziunea cu o genă care codifică o citokină care îi sporeşte anti-genitatea;

virusuri modificate genetic virusuri utilizate pentru introducerea şi expresia unor gene care aparţin unor patogeni heterologi;

microorganisme modificate genetic atenuarea agenţilor patogeni prin deleţia unor gene de patogenitate sau necesare supravieţuirii; rezultă vaccinuri “vii” care pot fi folosite fără riscuri.

3. Anticorpi monoclonali şi anticorpi recombinanţi parţial sau total umanizaţiAnticorpii monoclonali (peste 30 de produse intrate în uzul curent) sunt produşi de o

singură clonă a limfocitelor B; fiind monospecifici, recunosc un singur situs antigenic şi proteina asociată acestuia; inhibă activitatea alo- şi autoimună în terapia antitumorală, antivirală şi

3 moleculele de PEG care învelesc enzima, deşi permit difuziunea substraturilor şi a produşilor de reacţie nu permit recunoaşterea antigenelor de către componentele sistemului imun.

8

antiagregantă.Anticorpii recombinanţi parţial umanizaţi de tip himeră, constituiţi dintr-o parte umană şi

una provenind de la şoarece, se folosesc în depistarea markerilor de suprafaţă ai celulelor (spre exemplu, antigene ale celulelor tumorale).

Anticorpii total umanizaţi sunt obţinuţi prin transfer de cromosomi artificiali (YAC) ce conţin segmente ale lanţurilor H şi L de Ig, în celulele embrionare stem murine (şoarece transgenic).

4. METODE DE TRATAMENT BAZATE PE MODULAREA FARMACOLOGICA A EXPRESIEI GENICE

Aşa cum am amintit în cazul mutaţiilor cistationin-sintetazei care sunt responsabile de producerea homocistinuriei, chiar şi o mică creştere a activităţii proteinei mutante poate avea un impact semnificativ asupra tabloului clinic al unei boli. Condiţia necesară este ca mutaţia să nu abolească complet funcţia proteinei, deci să existe un anumit nivel de activitate reziduală. O modalitate care poate avea ca rezultat creşterea nivelului funcţional al proteinei este modularea expresiei genice. Aceasta strategie de tratament este în studiu în cazul sicklemiei.

Sicklemia (vezi capitolul 4.B.3) este o boală determinată de o mutaţie punctiformă a hemoglobinei β (HbS). Două observaţii sugerează ca inducţia unei creşteri a nivelului hemoglobinei F (HbF) – α2γ2 – ar fi benefică pentru aceşti pacienţi. In primul rând, HbF este perfect funcţională în transportul oxigenului către ţesuturi, deşi nivelul său la adult nu depăşeşte de regulă 1% din totalul hemoglobinei. In al doilea rând, nivele crescute ale HbF (peste 20g/100ml) par a inhiba polimerizarea deoxi-HbS. S-a constatat ca nou-născuţii din mame diabetice tratate cu butiraţi prezintă o întârziere a tranziţiei de la expresia genei pentru γ-globina către expresia β-globinei. Un număr de studii efectuate în prezent arată ca administrarea de butirat la pacienţii cu sicklemie creşte intr-adevar expresia γ-globinei. Nu se cunosc încă beneficiile pe termen lung, ca şi efectele secundare potenţiale, dar aceste observaţii demonstrează posibilitatea reglării expresiei genelor până la un nivel ce permite obţinerea unor beneficii terapeutice.

5. Terapia celulară

Transplantele de organe ori implantarea unor celule diferenţiate sau celule stem se plasează la limita dintre metodele bazate pe înlocuirea proteinelor mutante şi terapia genică. Pe de o parte organul sau celulele transplantate pot suplea proteina dorită, iar, pe de altă parte, are loc modificarea informaţiei genetice la nivel somatic, deşi aceasta nu este integrată în genomul gazdei. Transplantele alogenice de organ au fost utilizate cu tot mai mult succes în ultima decadă şi reprezintă probabil cea mai importantă modalitate de îmbunătăţire a tratamentului bolilor genetice din ultimii 15 ani.

Diverse boli genetice beneficiază în prezent de transplante renale, medulare sau hepatice. Dezvoltarea unor imunosupresoare eficiente, precum ciclosporina, alături de lipsa altor metode de tratament, a contribuit în mare măsură la creşterea interesului pentru această formă de tratament. Rata de supravieţuire a fost îmbunătăţită continuu, la copii find mai mare de 85-90% la un an după transplantul hepatic şi de 70-85% la 5 ani. In prezent sunt în desfăşurare trialuri de scară mică care încearcă implementarea transplantelor de ţesut nervos porcin la pacienţii cu boala Parkinson sau de insule Langerhans în tratamentul diabetului zaharat.

Transplantele de organ pot fi utilizate în două scopuri: cea mai utilizată indicaţie este aceea a înlocuirii unui organ care a fost alterat ca

urmare a bolii genetice (de exemplu ficatul devenit cirotic ca urmare a deficienţei de α1-AT ori rinichii afectaţi în cistinoză);

9

de asemenea, transplantele de organ pot avea ca scop asigurarea unei surse de proteină funcţională care poate astfel preveni afectarea altor organe (precum transplantele medulare în bolile de stocaj lizozomale sau talasemia β, ori transplantul hepatic pentru glicogenoza tip I). Atunci când scopul transplantului este să reprezinte o sursă de proteină, aceasta trebuie să fie capabilă să ajungă la nivelul tuturor ţesuturilor cu semnificaţie fiziopatologică. Acest fapt este important în mod particular în cazul transplantelor medulare pentru bolile de stocaj lizozomale. Enzimele lizozomale de la nivelul celulelor donor trebuie să ajungă la nivelul lizozomilor a multiple tipuri celulare. O problemă particulară este cea a compatimentului cerebral, bariera hematoencefalică fiind adeseori impermeabilă pentru proteine. Cum afectarea SNC este o trăsătură majoră în multe boli de stocaj lizozomale, orice eşec în a suplimenta nivelul proteinei la nivelul acestui compartiment poate limita sever aplicabilitatea transplantului medular ca formă eficientă de tratament.

Principalele efecte secundare pe termen lung asociate transplantelor de organ sunt creşterea riscului unor neoplazii (în special limfoame) ca urmare a imunosupresiei prelungite şi riscul afectării funcţiei renale ca urmare a tratamentului cu ciclosporină. La aceasta se adaugă numărul limitat de organe disponibile pentru transplant. O soluţie în măsură să permită eliminarea multora dintre aceste probleme ar fi cea a combinării transplantului de celule stem cu terapia genică. In această situaţie celulele stem ale pacientului însuşi ar putea fi cultivate în vitro şi utilizate pentru transfecţia genei de interes, iar reintroduse apoi în organismul gazdă pentru a repopula cu celule funcţionale ţesutul afectat.

B. TERAPIA GENICĂ

Tehnologia ADN recombinat a făcut posibilă dezvoltarea unor noi metode de tratament al bolilor genetice care corectează însăşi cauza esenţială a bolii – mutaţia genică. A apărut astfel terapia genică, care constă în modificarea genetică a celulelor implicate prin transferul de material genetic – ADN (gene, fragmente de gene, oligonucleotide) sau ARN (oligonucleotide anisens), cu ajutorul unui vector. Scopul terapiei genice este îmbunătăţirea stării de sănătate a individului prin modificarea genotipului mutant. Pentru aceasta este necesară utilizarea unor procedee capabile să elibereze gena normală către celulele ţintă somatice – terapia genică somatică. Experimental, în modele pe animale, este posibilă şi terapia genică germinală, dar aceasta este interzisă la om datorită unor motive etice temeinice.

Au fost iniţiate numeroase trialuri de terapie genică4, atât pentru boli ereditare, cât şi pentru boli ale celulelor somatice (precum neoplaziile maligne). Până în prezent nici unul dintre aceste protocoale nu a demonstrat o eficacitate foarte bună (în sensul obţinerii unor efecte terapeutice semnificative şi de durată); cu toate acestea, terapia genică rămâne o speranţă majoră pentru tratamentul bolilor umane.

Pentru a se putea preta la elaborarea unor protocoale de terapie genică, bolile genetice trebuie să îndeplinească câteva condiţii. In primul rând este necesară identificarea locusului care determină boala şi clonarea genei respective. In al doilea rând boala trebuie să fie suficient de frecventă, iar raportul risc-beneficiu trebuie să fie substanţial favorabil în comparaţie cu metodele alternative de tratament existente. Este necesară, de asemenea, cunoaşterea bazelor moleculare ale bolii, întrucât modalităţile de terapie genică pot fi diferite. De exemplu, bolile produse prin mutaţii cu pierderea

4 Până la nivelul anului 2000 au fost aprobate peste 400 de protocoale de terapie genică în care au fost înrolaţi câteva mii de pacienţi.

10

funcţiei beneficiază de înlocuirea genei mutante cu o genă funcţională, în timp ce în cazul mutaţiilor cu efect dominant negativ va fi indicată inactivarea genei mutante. Mecanismele de reglare a expresiei genice pot avea de asemeni o importanţă deosebită. De exemplu, hiperexprimarea genei transferate în cazul tratamentului talasemiei poate induce un nou dezechilibru între lanţurile de globină, în timp ce un nivel redus al expresiei ar putea fi ineficient. In sfârşit, orice nou protocol de terapie genica trebuie implementat după revizuirea şi aprobarea de către agenţii guvernamentale specializate.

1. TERAPIA GENICĂ SOMATICĂ

Introducerea unei gene în celulele somatice poate fi realizată prin manipularea celulelor proprii ale pacientului în afara organismului (terapie ex vivo) sau, în unele cazuri, prin tratarea celulelelor fără îndepărtarea lor din organism (terapie in vivo). Unele tipuri de celule somatice sunt mult mai potrivite pentru terapia genică decât altele.

Celulele care se pretează cel mai bine metodelor de transfer sunt cele care au o viaţă lungă în organism şi o capacitate proliferativă ridicată, întrucât vectorul care conţine gena se poate integra mai uşor în genomul gazdă în cursul replicării ADN. Celulele stem ale măduvei osoase îndeplinesc toate aceste condiţii şi, ca urmare, au fost primele celule candidat pentru terapia genică somatică. In schimb, ele sunt greu de manipulat şi de izolat din măduva osoasă (reprezentând doar o minoritate la acest nivel). De aceea, au fost investigate numeroase alte tipuri celulare, precum fibroblaştii cutanaţi, celulele musculare, endoteliale, hapatocitele sau limfocitele. Principalul dezavantaj pentru multe dintre tipurile celulare amintite este timpul de viaţă limitat, care impune repetarea administrării tratamentului.

Din punct de vedere al scopului urmărit, se pot deosebi două categorii majore de terapie genică somatică: terapia genică de înlocuire (numită şi terapia genică “clasică”) şi terapia genică de blocare.

1.1. TERAPIA GENICĂ DE ÎNLOCUIRE

Majoritatea protocoalelor de terapie genică utilizate în prezent constau în transferul în celulele somatice a unei gene normale corespunzătoare genei mutante. Această modalitate de tratament este potrivită în special bolilor genetice recesive, care presupun o mutaţie cu pierderea funcţiei; inserţia genei normale va suplimenta produsul genic absent. Multe dintre deficientele enzimatice transmise ca boli recesive pot fi corectate în mod particular prin aceasta modalitate de tratament, întrucât chiar şi atingerea unei activităţi enzimatice de circa 10% faţă de valorile normale poate conduce la corectarea fenotipului. Cele trei componente esenţiale necesare pentru terapia genică de înlocuire sunt gena, celula ţintă şi vectorul de transfer (figura 19.1).

a. Gena transferatăIn principiu, protocoalele de terapie genică de înlocuire nu vizează introducerea în

celule a unei gene în întregime, ci – cel mai adesea – a unei minigene artificiale alcătuită din secvenţa ADNc (care conţine întreaga regiune codantă, corespunzătoare exonilor) flancată de secvenţe reglatorii (precum promotori virali), care să asigure un nivel crescut de expresie. Gena inserată poate să se integreze în cromosomii celulei ţintă sau să rămână sub forma unor elemente genetice extracromosomale (episomi). Integrarea în cromosomi asigură stabilitatea efectului terapeutic (deoarece gena poate fi transmisă în succesiunea generaţiilor de celule), ceea ce face această metodă potrivită pentru tratamentul bolilor

11

ereditare. In schimb, integrarea este adeseori întâmplătoare, ceea ce poate conduce la lipsa exprimării genei în anumite celule (integrarea într-o regiune heterocromatică), declanşarea apoptozei (afectarea expresiei unei gene esenţiale pentru activitatea celulară) sau chiar declanşarea unei neoplazii (activarea unei oncogene sau inactivarea unei gene supresoare a creşterii tumorale. Transferul unor gene care rămân extracromosomale este o metoda potrivită în special în tratamentul bolilor infecţioase (precum infecţia HIV) sau a neoplaziilor, în care se are în vedere un efect terapeutic temporar.

b. Celulele ţintă Celulele ţintă pentru terapia genică de înlocuire sunt cel mai adesea cele de la

nivelul ţesutului afectat. Cu toate acestea, uneori se poate avea în vedere ţintirea deliberată a celulelor neafectate, precum celulele sistemului imun cu activitate citotoxică în vederea creşterii răspunsului imunitar împotriva celulelor tumorale sau a agenţilor infecţioşi.

c. Vectorii de transfer5

Există numeroase metode de transfer al genelor în celulele ţintă, alegerea depinzând de tipul ţesutului ţintă şi de realizarea transferului in vivo sau in vitro. Fiecare dintre sistemele de transfer disponibile în prezent au avantajele şi limitele lor (vezi tabelul 19.3). Vectorii virali (retrovirusuri, adenovirusuri etc) sunt însă probabil cei mai utilizaţi datorită eficienţei lor crescute de transducţie în celulele umane. Vectorii retrovirali sunt capabili sa însere cu mare eficacitate genomul lor în ADN-ul celulei gazdă ca

urmare a unui proces de retrotranspoziţie. In prezent peste 60% dintre protocoalele de terapie genică utilizează vectori retrovirali. Retrovirusul trebuie să fie însă modificat astfel încât să îşi piardă capacitatea de replicare. Retrovirusurile sunt capabile să accepte inserţia unor fragmente ADN de până la 8 kb. Asemenea vectori au fost utilizaţi în tratamentul unor boli precum deficienţa adenozin dezaminazei. Principalele dezavantaje sunt integrarea aleatorie în genom (cu riscul activării unor oncogene) şi capacitatea lor de a pătrunde în nucleu numai în cursul diviziunii celulare (atunci când membrana nucleară este dezintegrată) – ceea ce limitează eficacitatea acestei metode numai pentru celulele cu activitate proliferativă intensă.

Adenovirusurile au un genom ADN bicatenar şi pot integra fragmente de până la 30 kb în celule care nu se divid activ. Adenovirusurile au fost utilizate în protocoale de terapie genică pentru fibroza chistică. Deoarece nu se integrează în genomul celulei gazdă nu există riscul activării unor oncogene, dar, pe de altă parte, expresia genei inserate este tranzitorie, ceea ce necesită administrări repetate.

Alţi vectori virali. Virusurile adeno-asociate sunt o formă particulară de parvovirusuri care oferă câteva avantaje, precum integrarea stabilă în genom6 şi lipsa răspunsului imun. In schimb pot accepta numai fragmente mici de ADN, de până la 5 kb. Virusurile herpetice modificate sunt, de asemenea, investigate, în special datorită capacităţii lor de a infecta neuronii, celule care sunt inaccesibile faţă de numeroase alte tipuri de vectori. In sfârşit, lentivirusurile modificate sunt studiate în special datorită capacităţii lor de a infecta celule care nu se divid.

Tabelul 19.3. Proprietăţi şi utilizări ale principalelor metode de transfer folosite în terapia genicăCaracteristica Retrovirusuri Adeno

virusuriVirusuri adeno-asociate

Lentivirusuri Liposomi

Dimensiunea maximă a insertului

7 – 7,5 kb > 30 kb 5 kb 7 – 7,5 kb Nelimitată

Integrare cromosomică Da Nu, episomală

Da/Nu Da Frecvenţă foarte

5 Surprinzător, ADN-ul poate să pătrundă uneori în celule chiar şi fără utilizarea vreunui sistem de transport – “ADN-ul gol” (naked DNA).

6 Integrarea virusurilor adeno-asociate se realizează cel mai adesea la nivelul unui situs specific de pe cromosomul 19q13.3-qter.

12

redusăDurata expresiei in vivo

Scurta Scurtă Lungă Lungă Scurtă

Stabilitate Bună Bună Bună Necunoscută ExcelentăRuta de transfer In vitro In vivo şi in

vitroIn vivo şi in vitro

In vivo şi in vitro

In vivo şi in vitro

Concentraţia (particule per ml)

> 108 > 1011 > 1012 > 108 Nelimitată

Răspuns imunologic Puţine probleme

Intens Necunoscut Puţine probleme Absent

Imunitate preexistentă a gazdei

Puţin probabil

Da Da Puţin probabil, excepţie pacienţii HIV+

Nu

Siguranţa Posibilitatea mutagenezei inserţionale

Răspuns inflamator, toxicitate

Răspuns inflamator, toxicitate

Posibilitatea mutagenezei inserţionale

Excelentă

Vectori non-virali. Deşi vectorii virali asigură transferul eficient al genelor în celulele ţintă, dezavantajele asociate fiecărui tip au condus la îndreptarea atenţiei cercetătorilor către mijloace alternative de transfer. Succesul utilizării acestor vectori este însă limitat până în prezent. Printre cei mai studiaţi vectori non-virali sunt liposomii, particule delimitate de un strat lipidic bilamelar care înconjoară un miez apos. Liposomii pot accepta inserturi ADN de dimensiuni mari, nu declanşează răspuns imun (deoarece nu conţin nici un peptid), însă au o eficienţă foarte redusă de integrare a ADN la nivelul celulei ţintă. Conjugatele ADN-proteine (în care proteina facilitează pătrunderea în celulă a ADN mediată printr-un receptor membranar) au avantajul ţintirii selective a celulelor de interes (caracteristică importantă în tratamentul cancerului de exemplu), dar eficienţa transferului este redusă întrucât există tendinţa preluării ADN de către lizozomi şi a degradării sale. Cromosomii artificiali umani conţin centromerul şi telomerle funcţionale şi pot integra 5 până la 10 Mb ADN.

1.2. TERAPIA GENICĂ DE BLOCARE

Terapia genică de înlocuire nu poate fi utilizată cu succes în cazul tratamentului bolilor genetice determinate de mutaţii cu câştig de funcţie sau de mutaţii cu efect dominant negativ (precum boala Huntington sau sindromul Marfan). In schimb, în aceste cazuri este posibilă utilizarea unor metode care inactivează activitatea genei mutante. Deşi terapia genică de blocare nu este la fel de bine dezvoltată ca terapia genică de înlocuire, există mari speranţe în rezultatele viitoare ale unor asemenea metode, în special în tratamentul cancerului şi al unor boli infecţioase (precum infecţia HIV).

a. Oligonucleotidele antisens Utilizarea oligonucleotidelor (OGN) antisens se bazează pe principiul legării

acestora, pe bază de complementaritate, cu un acid nucleic ţintă a cărui funcţie va fi astfel inhibată. Oligonucleotidele antisens pot fi “construite” pentru a se lega atât la nivelul ADN (formând un triplu helix care inhibă transcripţia) cât şi la nivelul ARNm (formând un dublu helix care blocheazî matisarea sau translaţia), ultima modalitate fiind însă preferată datorită eficienţei mai crescute. In plus, hibrizii ADN-ARN astfel formaţi sunt ţinta atacului unei clase specifice de ribonucleaze intracelulare, ARN-aza H, care clivează

13

selectiv lanţul ARN (figura 19.2). Legarea la nivelul ARNm codificat de o genă care a suferit o mutaţie cu câştig de funcţie permite astfel prevenirea translării sale într-o proteină cu efecte patogenice.

b. RibozimeleRibozimele, descoperite cu circa 20 de ani în urmă, sunt molecule de ARN dotate

cu capacitate enzimatică intrinsecă. Ele conţin două componente esenţiale: secvenţa de recunoaştere (care se leagă pe bază de complementaritate la molecula ARN ţintă) şi componenta catalitică care clivează molecula ARN ţintă legată (figura 19.3). Exemple de ribozime sunt ribonucleaza P umană sau diverse ribozime izolate din viroizi de la plante. Prin inginerie genetică asemenea ribozime pot fi modificate astfel încât să recunoască şi să degradeze secvenţe ARNm specifice, care conţin o mutaţie nedorită.

c. ARN interferent (ARNi)Moleculele de ARN interferent sunt molecule de ARN bicatenar cu lungimi de

21-23 nucleotide, care au fost identificate recent ca fiind o modalitate majoră de inhibare specifică a expresiei genice la numeroase specii, acţionând la nivel posttranscripţional printr-un mecanism numit interferenţă. Deşi descoperite cu numai 5 ani în urmă, moleculele de ARNi au fost utilizate cu succes în atenuarea a numeroase gene în celule de mamifere şi au putut fi introduse cu succes in vivo la şoarece. Ca urmare, atenţia este îndreptată în prezent spre dezvoltarea unor protocoale de terapie genică, în special în două domenii: cancerul şi bolile infecţioase, deşi există potenţial terapeutic şi pentru unele boli genetice dominante.

2. TERAPIA GENICĂ GERMINALĂ

Spre deosebire de terapia genică somatică ce constă în modificarea informaţiei genetice numai a anumitor celule ale organismului, terapia genică germinală implică modificarea tuturor celulelor viitorului organism, inclusiv a celor care vor da naştere gameţilor. Ca urmare, această formă de tratatement afectează nu numai pacientul, dar şi toţi descendenţii acestuia.

Terapia genică germinală a fost realizată pentru prima dată la şoarece în 1983, prin introducerea (prin microinjecţie) la embrionul de şoarece a unor copii ale genei pentru hormonul de creştere uman; din numărul redus de embrioni la care gena a fost integrată cu succes, gameţii au fost de asemeni modificaţi, iar gena a fost transmisă şi la generaţiile următoare (şoarecii prezentând macrosomie). Deşi este teoretic posibilă şi la om, terapia germinală nu este acceptată, existând probleme medicale şi etice semnificative.

In primul rând, majoritatea embrionilor mor, iar unii vor dezvolta tumori sau malformaţii. In al doilea rând, chiar pentru bolile genetice dominante, circa jumătate dintre embrioni sunt genetic normali, iar aceştia pot fi eventual identificaţi prin utilizarea unor metode moleculare de diagnostic prenatal. In sfârşit, există şi numeroase probleme de ordin etic privind posibilitatea alterării definitive a genomului uman. Ca urmare, pare puţin posibil ca terapia genică germinală să devină utilă sau de dorit în viitorul apropiat.

3. BOLI EREDITARE CANDIDATE PENTRU TERAPIA GENICĂ

O dată cu identificarea şi caracterizarea genelor implicate în diferite afecţiuni, un

14

număr tot mai mare de boli monogenice au devenit candidate potenţiale pentru implementarea unor protocoale de terapie genică. Primul trial clinic de terapie genică pentru o boală ereditară a fost iniţiat în anul 1990 (deficienţa adenozin deaminazei). Cu toate acestea, progresele obţinute până în prezent au fost modeste, iar durata efectelor terapeutice a fost în general scurtă. Principala problemă care trebuie să fie depăşită în viitor este găsirea unor metode de eliberare a genelor care să fie mult mai eficiente. In plus, există dificultăţi în abordarea terapiei genice care depind de natura particulară a genei şi a mutaţiei implicată în etiologia bolii.

In cazul bolilor multifactoriale, utilizarea metodelor de terapie genică este în principiu mult mai dificilă, datorită implicării mai multor loci, precum şi a unor factori de mediu.

3.1. BOLI MONOGENICE PENTRU CARE EXISTĂ PROTOCOALE DE TERAPIE GENICĂ

Deficienţa adenozin dezaminazei. Primul protocol de terapie genică (septembrie 1990) a fost iniţiat pentru această formă rară de imunodeficienţă combinată severă (vezi şi subcapitolul 19.A.3.2.). Boală a fost în mod particular potrivită pentru implementarea unui protocol de terapie genică întrucât gena mutantă, care fusese în prealabil clonată şi intens studiată, este o genă de mici dimensiuni, iar celulele ţintă sunt limfocitele T, uşor accesibile şi relativ uşor de cultivat, permiţând transferul in vitro al genei. In plus, boala este recesivă, iar expresia genei nu este riguros controlată, în populaţia normală existând diferenţe semnificative de activitate a enzimei. Metodele de tratament utilizate anterior pentru această boală aveau o serie de limite semnificative, precum necesitatea existenţei unor donori compatibili (pentru transplantele medulare – circa 80% din cazuri) sau necesitatea administrării săptămânale a PEG-ADA. Pentru acest protocol de terapie genică, ADNc a fost inserat într-un vector retroviral care a fost transferat apoi în limfocitele T cultivate ale pacientului. Concomitent s-a continuat administrarea PEG-ADA. Deşi limfocitele T trăiesc în circulaţie ani de zile, s-a constatat ca efectul acestei metode de tratament este de scurtă durată, iar beneficiul clinic care poate fi atribuit terapiei genice este extrem de limitat. O consecinţă neaşteptată a fost dezvoltarea de către 2 din cei 10 pacienţi la care a fost iniţiat acest trial a unei proliferări celulare tip leucemie. Aceasta a determinat FDA7 să stopeze temporar toate cele 27 de trialuri de terapie genică în derulare, ce utilizau retrovirusuri ca metodă de transfer, până la studierea mai amănunţită a acestui efect secundar cu potenţial foarte serios.

Hemofilia B. Această boală recesivă legată de X determinată de o mutaţie a genei care codifică factorul IX al coagulării este o altă boală monogenică pentru care terapia genică s-a dovedit a avea efect terapeutic, deşi rezultatele sunt încă modeste. Factorul IX al coagulării este o proenzimă care intervine în formarea cheagului de fibrină. Formele severe de hemofilie B sunt rezultatul unei reduceri a nivelelor circulante ale factorului IX sub 1% din valorile normale; nivele între 1 şi 5% determină forme moderate de boală. A fost iniţiat un trial clinic de terapie genică care a folosit injectarea intramusculară a unui vector adeno-asociat ce conţine gena pentru factorul IX al coagulării. La primii doi pacienţi la care s-a utilizat acest protocol s-a obţinut un nivel circulant al proteinei de circa 1% faţă de normal, dar acest nivel a fost menţinut pentru perioade scurte de timp, de

7 Food and Drug Administration

15

sub trei luni. Nu s-a evidenţiat dezvoltarea anticorpilor anti-factor IX. Se speră că prin creşterea dozelor de vector administrate să se prelungească perioada de eficienţă terapeutică.

Distrofia musculară Duchenne (vezi capitolul 11.C.3) Principala problemă în cazul acestei boli este dimensiunea crescută a ADNc pentru distrofina – 11 kb – care depăşeşte capacitatea de transport a vectorilor retrovirali utilizaţi în prezent. In plus, aceşti vectori nu sunt capabili să pătrundă în interiorul unor celule care nu se divid, aşa cum sunt celulele musculare. De aceea, vectorii utilizaţi până în prezent sunt cei adenovirali. A fost identificat un pacient cu forma Becker de boală la care peste jumătate din porţiunea codantă a genei este absentă. Ca urmare, chiar şi transferul unei porţiuni trunchiate a genei ar putea fi eficientă clinic. O altă problemă majoră este necesitatea obţinerii unui nivel crescut de expresie la nivelul muşchilor scheletici şi, la unii pacienţi, chiar şi la nivelul muşchiului cardiac. O modalitate alternativă este hiperexprimarea unor proteine înrudite, precum urotrofina, care este exprimată la niveluri crescute în perioada fetală.

Fibroza chistică (vezi capitolul 11.C.2). Protocoalele de terapie genică utilizate până în prezent se bazează pe administrarea cu ajutorul unui bronhoscop sau cu aerosoli a unui vector adenoviral ori a unor liposomi care conţin o minigenă CFTR. Deşi primele încercări au debutat în anul 1993, rezultatele obţinute până în prezent sunt modeste. In cazul administrării cu ajutorul adenovirusurilor, principala problemă este răspunsul imun (dezvoltarea unei pneumonii interstiţiale care poate pune chiar probleme vitale). In schimb, administrarea cu ajutorul liposomilor, deşi sigură, are o eficacitate redusă a transferului genei în celulele epiteliale.

Hipercolesterolemia familială (vezi capitolul 11.C.4). Primul şi unicul protocol de terapie genică a fost iniţiat în anul 1992 la cinci pacienţi cu forma homozigotă de boală. Principala piedică în dezvoltarea terapiei genice în acestă boală este organul ţintă – ficatul. Hepatocitele nu se divid în mod normal, astfel încât utilizarea vectorilor retrovirali este ineficientă. S-a dovedit însă că hepatocitele pot fi cultivate in vitro şi, în aceste condiţii, vectorii retrovirali ce conţin gena LDLR inserată pot fi utilizaţi pentru transfer. Ulterior, celulele modificate pot fi reinserate în organism cu ajutorul unui cateter intraportal. Deşi s-a dovedit a fi eficientă clinic, invazivitatea metodei limitează mult aplicabilitatea sa.

4. TERAPIA GENICĂ PENTRU BOLILE NEEREDITARE

Aplicarea terapiei genice nu este limitată doar la bolile ereditare. Circa două treimi din protocoalele de terapie genică ce se derulează în prezent sunt concentrate asupra unor diverse forme neereditare de cancere şi circa 10% pentru SIDA. In curs de dezvoltare sunt, de asemenea, protocoale de terapie genică pentru boli comune ale adultului, precum unele boli cardiovasculare.

4.1. PRINCIPII DE TERAPIE GENICĂ ÎN CANCER

Cancerul este în prezent domeniul cel mai intens de aplicare a metodelor de terapie genică. Aceasta se datorează atât severităţii bolilor neoplazice şi resurselor financiare care se alocă în această direcţie, cât şi unei serii de condiţii care fac relativ mai

16

simplă aplicarea metodelor de terapie genică. Există numeroase procedee de terapie genică în cancer (vezi tabelul 19.4), unele dintre acestea aducând deja rezultate promiţătoare în ceea ce priveşte limitarea extensiei locale a bolii, precum şi a metastazelor.

a. Modalităţi generale Uciderea ţintită a celulelor canceroase prin inserţia unei gene care codifică o toxină

(precum toxina difterică) sau a unei gene care conferă sensibilitate la acţiunea unui medicament (precum gena pentru timidin kinază de la Herpes simplex, care induce sensibilitate la acţiunea ganciclovirului).

Stimularea activităţii de distrugere a celulelor canceroase de către celulele NK prin creşterea antigenicităţii celulelor tumorale (de exemplu prin inserţia în celulele tumorale ale unor gene care codifică antigene străine) sau creşterea activităţii celulelor sistemului imun prin inserarea la nivelul lor ale unor gene care codifică citokine (precum IL2 şi IL4 în melanomul malign).

Protejarea ţesuturilor normale împotriva efectelor chimio/radioterapiei (prin inserţia la nivelul acestora a unor gene de rezistenţă (de exemplu gena MDR1 – multiple drug resistance type 1).

b. Inactivarea oncogenelor Inhibarea selectivă a transcripţiei unei oncogene (de exemplu a genei KRAS în

cancerele pulmonare). Utilizarea unor oligonucleotide antisens sau a unor ribozime care se leagă şi clivează

ARNm codificat de oncogenă. Utilizarea unor anticorpi monoclonali care se leagă specific şi inactivează proteina

codificată de oncogena activată (de exemplu administrarea Transtuzumab – Herceptin, un anticorp monoclonal împotriva proteinei ERBB2 în tratamentul cancerelor de sân).

c. Inserţia unor gene supresoare a creşterii tumorale Inserarea variantei normale a genei supresoare de tumori în celulele tumorale (precum

gena TP53 în cancerele ovariene).

4.2. TERAPIA GENICĂ ÎN BOLILE INFECŢIOASE

Metodele utilizate în terapia genică a bolilor infecţioase sunt în parte diferite faţă de cele utilizate pentru tratamentul cancerului. Unele metode au ca obiectiv intensificarea răspunsului imun al organismului împotriva celulelor infectate. Alte metode ţintesc însă ciclul de viaţă al agentului infecţios, reducându-i capacitatea de proliferare. OGN reprezintă o speranţă autentică în terapia antivirală8. O problemă particulară în cazul terapiei genice în bolile infecţioase este modificarea continuă a genomului agentului infecţios (asemănător într-un anumit fel cu acumularea de noi mutaţii în cazul celulelor canceroase). Aşa este cazul infecţiei HIV în care agentul infecţios prezintă o rată crescută a mutaţiilor.

4.3 TERAPIA GENICĂ ÎN BOLILE CARDIO-VASCULARE

8 Fomivirsen sodium (VITRAVENE) reprezintă primul medicament oligonucleotidic antisens acceptat de FDA (1998) pentru tratamentul unor infecţii cu citomegalovirus. Alte OGN şi ribozime antivirale se află în stadiul de testare clinică.

17

În ultimii 10 ani s-au înregistrat progrese considerabile în descifrarea mecanis-melor moleculare ale bolilor cardiovasculare (procesele ce duc la ateroscleroză şi ocluzie vasculară, disfuncţia celulelor endoteliale, ş.a). Aceste progrese au deschis perspectivele aplicării terapiei genice şi în câţiva ani s-au obţinut rezultate promiţătoare în: stimularea angiogenezei în bolile ischemice (folosind ADNc pentru factorul de

creştere endotelială vasculară – VEGF sau factorul de creştere fibroblastică – FGF); prevenirea restenozării după angioplastie transluminală, prin blocarea proliferării

celulare folosind oligonucleotide antisens faţă de ARNm al unor CDK-cicline sau factori de creştere;

tratamentul arteriopatiei membrelor inferioare (cu ADNc pentru VEGF)

Desigur, sunt încă multe dificultăţi de depăşit (mai ales în găsirea unor vectori eficienţi) dar acest domeniu rămâne foarte actual în cercetările din terapia cardio-vasculară.

5. CONSIDERAŢII ETICE PRIVIND TERAPIA GENICĂ

La fel ca în cazul a numeroase alte forme noi de tratament, trialurile de terapie genică au fost subiectul unei atenţii deosebite a comitetelor de reglare a problemelor etice. Cu toate acestea, majoritatea agenţiilor guvernamentale şi religioase care au examinat propunerile pentru terapia genică a unor boli genetice umane au fost de acord ca această oportunitate terapeutică să fie studiată şi aplicată. Spre deosebire de terapia genică germinală, terapia genică somatică ridică puţine probleme de ordin etic care nu sunt întâlnite de rutina în cazul evaluării altor noi metode de tratament (de exemplu, implementarea unui nou medicament citostatic).

INTERNET

The American Society of Gene Therapy – www.asgt.orgThe European Society of Gene Therapy – www.esgt.org

BIBLIOGRAFIE SPECIFICĂ SELECTIVĂ

1.Astărăstoae V., Stoica Ortansa – Genetică versus Bioetică – Editura Polirom, 2002.

2.Caplen N.J. – RNAi as a gene therapy approach – Expert. Opin. Biol. Ther. 2003,3: 575-586.

3.Li S, Ma Z. – Nonviral gene therapy – Curr. Gene Ther. 2001, 1: 201-226.4.Pfeifer A, Verma IM. – Gene therapy: promises and problems – Ann. Rev. Genomics

Human Genetics. 2001, 2: 177-211.5.Stoica Ortansa, Astărăstoae V – Terapia genică – în: Ungureanu G.,

Covic Maria. Terapeutică medicală. Editura Polirom, 2000.6.Stoica Ortansa, Braha Elena, Ungureanu G – The drug therapy at the

beginning of genomic era – Revista Medico-Chirurgicalã, vol 107, nr. 2-3, 2002.

7.Tauşer Georgiana, Stoica Ortansa. Strategia antisens, Editura Junimea, 2003.

8.Thomas CE, Ehrhardt A, Kay MA. – Progress and problems with the use of viral

18

vectors for gene therapy – Nat. Rev. Genet. 2003, 4: 346-358.9.Treacy EP, Valle D, Scriver CR. – Treatment of genetic disease – în Scriver CR,

Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) The metabolic and molecular bases of inherited disease, 8th ed. McGraw-Hill, New York, 2001, p.175-191.

19