Cellular Enginering

7/25/2019 Cellular Enginering

1/17

Ann als ofBiomedicalEngineering,

Vol. 19, pp. 529-545 , 1991 0090-696 4/91 $3.00 + .00

Printed in the USA . All rights reserved. Copyright 9 1991 Pergamon Press plc

ellular Engineering

R o b e r t M . N e r e m

T h e 1 9 9 1 A L Z A D i s t i n g u i s h e d L e c tu r e *

B i o m e d i c a l E n g i n e e r i n g S o c ie t y A n n u a l M e e t i n g

A t l a n t a, G A

Received 4/22/91)

C e l lu l a r e n g i ne e r in g a p p l i e s t h e p r i n c i p l e s a n d m e t h o d s o f e n g i n e e ri n g t o t h e p r o b -

l e m s o f c e ll a n d m o l e c u l a r b i o lo g y o f b o t h a b a s ic a n d a p p l i e d n a t u re . A s b i o m e d i -

c a l e n g i n e e r in g h a s s h i f t e d f r o m t h e o r g a n a n d t i s s u e l e v e l t o t h e c e l l u l a r a n d

s u b - c e l l u la r l ev e l, c e l lu l a r e n g i n e e r i n g h a s e m e r g e d a s a n e w a r e a . A c o r n e r s t o n e o f

m u c h o f t h i s a c t iv i t y i s c e l l c u l t u r e t e c h n o l o g y , i . e ., t h e a b i l i t y t o g r o w l i v i n g c e l l s i n

t h e a r ti f ic i a l e n v i r o n m e n t o f a la b o r a t o r y . C e l l u l a r e n g i n e e r i n g i n c l u d e s t h e r o l e o f

e n g in e e ri n g i n b o t h b a s ic ce l l b i o l o g y r e s ea r ch a n d i n t h e m a k i n g o f p r o d u c t s w h i c h

u s e li v i n g ce l ls , e . g . , t i s s u e e n g i n e e r i n g a n d b i o p r o c e s s e n g i n e e r i n g . T h e f o r m e r i n -

v o l v e s t h e u s e o f l i v in g c e ll s in t h e d e v e l o p m e n t o f b i o l o g i ca l s u b s t i t u t e s f o r t h e r e s-

t o r a ti o n o r r e p l a c em e n t o f f u n c t i o n , a n d t h e l a t te r t h e u s e o f l i v in g c e l ls to

m a n u f a c t u r e a b i o c h e m i c a l p r o d u c t , e . g ., t h r o u g h t h e u s e o f r e c o m b i n a n t D N A t e c h -

n o l o g y . I n f a c t , a s b i o m e d i c a l e n g i n e e r i n g h a s e x p a n d e d t o i n c l u d e t h e c e l l u l a r l e ve l ,

a n d b i o p r o ce s s e n gi n ee r in g h a s s h i f t e d i n i n t e re s t f r o m m i c r o b i a l o r g a n i s m s t o i n c l u d e

m a m m a l i a n c e ll s , t h e r e a r e i n t e ll e c t u a l is s u e s i n w h i c h a n i n t e r e s t is s h a r e d b y t h e s e

t w o f o r m e r l y s e p a r a t e a r ea s o f e n g i n e e r i n g a c t i v it y . C e l l u l a r e n g i n e e r i n g t h u s t r a n -

s c e n d s t h e f i e l d o f b i o m e d i c a l e n g in e e ri n g .

K e y w o rd s - C e l lu la r e ng ine e ring , T i s sue e ng ine e r ing , B ioproc e s s e ng ine e r ing , C e l l and

m o l e c u l a r b i o l o g y .

I N T R O D U C T I O N

O v e r t h e p a s t t w e n t y - f i v e y e a r s t h e f ie l d o f b i o m e d i c a l e n g i n e e r i n g h a s u n d e r g o n e

s i g n i f i c a n t d e v e l o p m e n t , e v o l v i n g i n m a n y d i f f e r e n t w a y s . F o r e x a m p l e , t h e c o n t r i -

b u t i o n s b y e n g i n e e r s to t h e a r c h i v a l l i t e r a t u r e f o r b i o m e d i c a l r e s e a r c h h a s b e e n

s t e a d i l y i n c r e a s i n g . T h e m e d i c a l d e v i c e a n d p r o d u c t i n d u s t r y , i n c l u d i n g i n s t r u m e n -

A c k n o w l e d g m e n t s - T h i s

r e v ie w w a s w r i t t e n b a s e d o n t h e a u t h o r ' s o w n r e s e a r c h a c t i v i ti e s w h i c h a r e

c u r r e n tl y s u p p o r t e d b y N a t i o n a l S c ie n c e F o u n d a t i o n G r a n t E C S - 8 8 1 5 6 56 a n d N a t i o n a l I n s t i t u te s o f H e a l t h

G r a n t s H L - 2 6 8 9 0 a n d H L -4 11 75 . T h e a u t h o r t h a n k s P . G i r a r d , T . S a m b a n i s , T . W i c k , a n d C . Z h u , h i s co l -

l e ag u e s a t G e o r g i a T e c h w h o w o r k i n t h e a r e a o f c e ll u la r e n g i n e er i n g . T h e a u t h o r a l s o t h a n k s h i s r e s e a r c h

c o l l a b o r a t o r s , R . W . A l e x a n d e r , B .C . B e r k , P . D e l a f o n t a i n e , M . J . L e v e s q u e , M . S a t o , C . J . S c h w a r t z , a n d

E . A . S p r a g u e , f o r t h e i r c o n t r i b u t i o n s t o t h e w o r k a n d i d e a s r e f l ec t e d in t h i s p a p e r . F i n a l l y , t h e a u t h o r

th a n k s h i s s tu d e n t s w h o k e e p c o m in g u p w i th n e w id e a s a n d w h o w i l l b e t h e c e l lu l a r e n g in e e r s o f t o m o r ro w .

* Th e l e c tu re w a s d e li ve re d o n A p r i l 2 2 , 1 9 9 1 b y R .M. N e re m , P a rk e r H . Pe t i t P ro fe sso r fo r En g iv .e er in g

in Me d ic in e , Sc h o o l o f M e c h a n ic a l En g in e e r in g , G e o rg i a In s t i t u t e o f Te c h n o lo g y , A t l a n t a , G A 3 0 33 2 -0 4 05 .

5 2 9


2/17

530 R M Nerem

t a t i o n a n d i m a g i n g , h a s g r o w n s u b s t a n ti a ll y , a n d a l t h o u g h , i n g e n e ra l , o n e w o u l d n o t

c h a r a c t e r i z e th i s a s a h i g h t e c h n o l o g y i n d u s t ry , t h e r e c l e a r ly a re a r e a s o f c o m m e r c i a l

a p p l i c a t i o n w h e r e t h e li m i ts o f o u r k n o w l e d g e a r e b e i n g p u s h e d . I n th e l a s t t w o d e -

c a d e s t h e n u m b e r o f i n d i v id u a l s w h o h a v e i d e n t i f i e d t h e m s e l v e s a s b i o m e d i c a l e n g i-

n e e r s , o r b i o e n g i n e e r s , h a s d r a m a t i c a l l y i n c r e a se d , a n d t h e n u m b e r o f p r o g r a m s a t

a c a d e m i c i n s ti t u ti o n s , a n d t h e n u m b e r o f s tu d e n t s p a r t i c i p a t i n g i n t h e s e p r o g r a m s ,

c o n t i n u e s t o g r o w . F i n a l l y , b o t h t h e e n g i n e e r a n d t h e p h y s i c a l s c i e n t i s t a r e i n c r e a s -

i n g l y b e i n g r e c o g n i z e d a s i m p o r t a n t m e m b e r s o f t h e i n te r d i s c i p l i n a r y t e a m s , a n d t h e i r

a p p r o a c h e s a s n e c es s ar y fo r r e s e ar c h a n d d e v e l o p m e n t a t t h e f o r e f r o n t o f t h e b i o m e d -

i ca l f i e l d .

W i t h th i s ev o l u ti o n c om e s a d i f fe r e n t t y p e o f c h a n g e - o n e i n w h ic h t h e s p e ct ru m

o f a c t i v it y h a s b e e n e x t e n d e d f r o m t h e o r g a n a n d t is s u e le v e l t o i n c l u d e c e l lu l a r

p h e n o m e n a . J u s t a s m e d i c i n e in g e n e r a l h a s m o v e d t o f o c u s o n c e ll a n d m o l e c u l a r

b i o l o g y , s o h a v e e n g i n e e r s p a r t i c ip a t i n g i n b i o m e d i c a l r e s e a r c h a n d i n h e a l th c a r e t e ch -

n o l o g y a p p l i c a t io n s . T h i s h a s g i v e n ri s e to w h a t s o m e m i g h t c a l l a s u b - s p e c ia l t y o f b i o -

m e d i c a l e n g i n e e r i n g , i .e . , t h e f i e l d o f c e l lu l a r e n g i n e e ri n g . H o w e v e r , t h i s e m e r g i n g

a r e a o f c e l l u l a r e n g i n e e r i n g is n o t j u s t a s u b - s p e c i a l t y , b e c a u s e i t t ra n s c e n d s t h e n o r -

m a l b o r d e r s o f b i o m e d i c a l e n g i n e e r i n g , r e a c h i n g b e y o n d t o p r o v i d e a b r i d g e t o t h e

f i e ld o f b i o c h e m i c a l e n g i n e e r in g o r b i o p r o c e s s e n g i n e e r i n g .

J u s t w h a t is c e ll u l ar e n g i n e e r i n g ? A s d e f i n e d h e r e i t is t h e a p p l i c a t i o n o f t h e p r i n c i -

p l e s a n d m e t h o d s o f e n g i n e e r in g to p r o b l e m s i n ce ll a n d m o l e c u l a r b i o l o g y o f b o t h

a b a s ic a n d a p p l i e d n a t u r e . T o e l a b o r a t e o n t h i s , le t u s e x a m i n e th e v a r i o u s e l e m e n t s

o f t h i s d e f in i t i o n . T h e a p p l i c a t i o n o f t h e p r in c i p l e s a n d m e t h o d s o f e n g i n e e r in g m e a n s

t o i n c l u d e t h e a b i li t y t o q u a n t i f y i n f o r m a t i o n a n d t o e s t a b li s h i n t e r r e la t i o n s h i p s , a s

w e l l a s t o m o d e l b i o l o g i c a l, c h e m i c a l , a n d p h y s i c al p h e n o m e n a . I n a p p l y i n g t h is t o

p r o b l e m s i n c el l a n d m o l e c u l a r b i o l o g y , i t is b o t h c e l l u la r a n d s u b - c e l lu l a r p r o c e s s e s

w h i c h a r e o f i n te r e s t. F i n a l l y , i n i n c l u d i n g a p p l i c a t i o n s o f b o t h a b a s ic a n d a p p l i e d

n a t u r e , t h e s p e c t r u m o f a c t i v it ie s ra n g e s f r o m v e r y b a s ic r e s e a r c h , i . e . , i n v e s ti g a t io n s

i n c el l b i o l o g y c o n d u c t e d w i th a n e n g i n e e r i n g p e r s p e c t i v e , t o t h e d e v e l o p m e n t a n d

m a n u f a c t u r i n g o f p r o d u c t s b a s e d o n t h is s c ie n c e , i . e ., t h e c o m m e r c i a l i z a t i o n o f t h e

t e c h n o l o g y a r i si n g o u t o f t h e s c i en c e o f c el l a n d m o l e c u l a r b i o l o g y .

T h e d e v e l o p m e n t o f t h e t e c h n o l o g y n e c e s s a ry t o g r o w c ell s i n t h e l a b o r a t o r y h a s

b e e n c r i t i c a l i n t h e a d v a n c e m e n t o f c e l lu l a r e n g i n e e r i n g . I n f a c t , i f t h e r e i s a s u b t i tl e

t o t h e t h e m e o f t h is p r e s e n t a t i o n , i t m i g h t b e s e x a n d t h e s in g l e c e l l . T h i s is b e c a u s e

t h e a c t o f c e ll r e p l i c a t i o n is a n u n d e r l y i n g t o p i c , a t h r e a d , i n t e r w o v e n t h r o u g h o u t t h e

r e m a i n d e r o f th i s t e x t . I n t h e n e x t s e c t i o n w e w il l b r i e f l y e x a m i n e c e ll c u l t u r e t e c h -

n o l o g y , i . e . , t h e te c h n o l o g y o f g r o w i n g c e ll s i n t h e l a b o r a t o r y .

C E L L C U L T U R E T E C H N O L O G Y

T h e b i o l o g i c a l c e ll i s t h e b a s i c s u b - u n i t o f a n y l iv i n g s y s te m , t h e s i m p l e s t u n i t t h a t

c a n e x i st a s a n i n d e p e n d e n t l i v in g s y s t e m ( 2 ). A n i n d i v i d u a l c e l l h a s t h e a b i l it y t o r e p -

l ic a t e , t o d i f f e r e n t ia t e , t o m i g r a t e , t o c o m m u n i c a t e , a n d t o p e r f o r m a w h o l e h o s t o f

o t h e r f u n c t i o n s . I n e f f e c t , t h i s b i o l o g i c a l c e ll is a v e r y so c i a l a n i m a l . I t a l s o is a n

a m a z i n g l y c o m p l e x sy s t e m , t h e u n d e r s t a n d i n g o f w h i c h c h a l le n g e s o u r e n g i n e e r i n g

a b i l i t i e s t o t h e u t m o s t . I n d o i n g r e s e a r c h o n c e l l u l a r a n d s u b - c e l l u l a r p r o c e s s e s , n o t

o n l y c a n e n g i n e e r s c o n t r i b u t e t o t h e b a s ic u n d e r s t a n d i n g o f t h e b i o l o g y o f c e ll s, b u t

o u r e n g i n e e r i n g s k i l l s c a n b e e x p a n d e d , p e r h a p s f a r m o r e t h a n w e s u s p e c t .


3/17

Cellular En ginee ring 53

A l t h o u g h r e s e a r c h d e s ig n e d t o in v e s t i g a te th e p r o p e r t i e s a n d b e h a v i o r o f b i o l o g i -

c a l c e ll s g o e s b a c k m a n y c e n t u r i e s , i t is in t h e l a s t f i f t y y e a r s t h a t t h e l e v e l o f a c t i v -

i ty in t h is f i el d h a s , l i te r a ll y , e x p l o d e d . A n i m p o r t a n t p a r t o f t h is i n c r e a s e w a s d u e

t o t h e a d v e n t o f c e l l c u l t u r e , i . e . , t h e a b i l i t y t o g r o w l i v i n g c e l l s i n t h e a r t i f i c i a l e n -

v i r o n m e n t o f a l a b o r a t o r y ( 1 9 ) . I n t h i s o u t o f b o d y e x p e r i e n c e , c e l l s n o t o n l y s u r v i v e ,

b u t c a n m u l t i p l y a n d e v e n e x p r e s s d i f f e r e n t i a t e d p r o p e r t i e s . T h r o u g h t h e u s e o f c el l

c u l t u r e t e c h n o l o g y , i .e . , th e a b i l i ty to g r o w c e l ls u n d e r c o n t r o l l e d l a b o r a t o r y c o n d i -

t i o n s , n ew o p p o r t u n i t i e s f o r b a s ic re s e a r c h h a v e o p e n e d u p . F u r t h e r m o r e , t h is te c h -

n o l o g y h a s le d t o c o m m e r c i a l a p p l i c a ti o n s w h i c h w i ll b e d is c u s se d i n t h e s e c o n d h a l f

o f t h i s t e x t .

M o d e r n c el l c u l tu r e d a t e s b a c k t o t h e b e g i n n i n g o f t h is c e n t u r y . A p a r t i c u l ar l y i m -

p o r t a n t c o n t r i b u t i o n w a s t h a t o f A l e x i s C a r r e l , a F r e n c h s c ie n t is t w o r k i n g a t t h e

R o c k e f e l l e r R e s e a r c h I n s t it u t e in N e w Y o r k ( 2 7 ). O n J a n u a r y 1 7, 1 9 12 h e p l a c e d a ti n y

s li ce o f h e a r t m u s c l e ta k e n f r o m a c h i c k e m b r y o i n a c u l t u r e m e d i u m . T h i s c u l t u r e

c o n t i n u e d f o r t h i r t y - f o u r y e a r s , u n t i l t w o y e a r s a f t e r C a r r e l s o w n d e a t h . A l o n g t h e

w a y , t h e h e a r t m u s c l e c e l l s e x p i r e d a n d w h a t c o n t i n u e d t o p r o p a g a t e w e r e f i b r o b l a s t s .

S t il l, C a r r e l s h i s t o r i c c h i c k - c e ll c u l t u r e f l o u r i s h e d f o r m o r e t h a n t h i r t y y e a r s . T h e f a c t

t h a t i t w a s t h e f i b r o b l a s t s , n o t t h e h e a r t m u s c l e c e l l s , w h i c h f l o u r i s h e d f o r t h i r t y - f o u r

y e a r s , p o i n t s o u t o n e f a c t a b o u t c e ll c u l t u r e; s o m e c e ll s a r e n o t a s e a s y t o g r o w a s o t h -

e r s . C e ll s w h i c h a r e n o t e a s y t o g r o w a r e c a l l e d r e c a l c i t r a n t c e ll s .

A t t i m e s , o n e i s i n t e r e s t e d i n u s i n g p r i m a r y c e l l s , i . e . , c e l l s p r e p a r e d d i r e c t l y f r o m

t h e ti s su e s o f a n o r g a n i s m . I n o t h e r c a s e s , ce ll s a r e p a s s a g e d t h r o u g h s u b c u l t u r i n g ,

a n d i n t h is w a y a r e m a i n t a i n e d f o r e x t e n s i v e p e r i o d s o f t i m e . M o s t c e l ls in c u l t u r e

h a v e a l i m i t e d l if e s p a n , i . e . , a f t e r a f in i t e n u m b e r o f d i v i si o n s i n c u l t u r e , t h e y d i e .

H o w e v e r , o c c a s i o n a ll y , ce ll s b e c o m e i m m o r t a l a n d c a n b e p r o p a g a t e d i n d e f i n i te l y a s

a c el l l in e . S u c h c e ll s a r e o f t e n r e f e r r e d t o a s t r a n s f o r m e d . W h e r e a s c el ls c u l t u r e d f r o m

t i s su e a r e a n c h o r a g e - d e p e n d e n t , i . e . , a d h e r e n c e t o a s u r f a c e i s r e q u i r e d f o r s u r v i v a l ,

t r a n s f o r m e d c e l ls o f t e n g r o w i n s u s p e n s i o n . W h a t e v e r t h e c a s e , a w i d e v a r i e t y o f c e ll s

i s n o w a v a i l a b l e f o r b a s i c r e s e a r c h a n d f o r m o r e a p p l i e d s t u d i e s .

B e c a u s e o f th e c o m p l e x n u t r it io n a l r e q u i r e m e n t s o f m a m m a l i a n c el ls , t h e m e d i u m

i n w h i c h t h e c e ll s a r e c u l t u r e d is i m p o r t a n t i f a s p e c i f i c ce ll t y p e i s to b e s u c c e s s f u l l y

g r o w n . T r a d i t i o n a l l y , w h a t h a s b e e n u s e d i n m o s t c a s e s i s a b a s a l m e d i u m s u p p l e -

m e n t e d w i th s e r u m ; t h is h a s u s u a l l y b e e n f e t a l c a l f , n e w b o r n c a l f , h o r s e , o r h u m a n

s e r u m a t c o n c e n t ra t io n s f r o m 2 p e r c e n t t o 2 0 p e r c e n t o r g r e at e r . F o r m a n y t y p e s o f

c e ll s, t h e a d d i t i o n o f s e r u m , w h i c h p r o v i d e s g r o w t h f a c t o r s , h o r m o n e s , t r a n s f e r r i n

( a n i r o n - b i n d i n g p r o t e i n ) , s e l e n i u m ( a t r a c e e l e m e n t n e c e s s a r y f o r th e g r o w t h o f h u -

m a n c e ll s) , a n d o t h e r r e q u i r e d n u t r i e n t s , i s e s s e n t i a l if t h e c e l ls a r e to g r o w .

H o w e v e r , s e r u m i s a c o m p l e x f l u id a n d c a n b e v a r i a b l e ; t h u s e a c h l o t m u s t b e

t e s te d p r i o r t o u s e . T h e r e a r e a l s o c e r ta i n d r a w b a c k s t o s e r u m , e . g . , i n s o m e c a s es th i s

g r o w t h p r o m o t e r c a n e v e n b e t o x i c t o c e ll s. B e c a u s e o f t h i s, t h e r e h a v e b e e n a n u m -

b e r o f a t t e m p t s t o d e v e l o p s e r u m s u b s t it u t e p r o d u c t s w h i c h c a n r e p l a c e a ll o r p a r t o f

t h e s e r u m r e q u i r e d i n a m e d i u m . I n g e n e r a l, t r a n s f o r m e d c el l l in e s h a v e s i m p l e r m e -

d i a r e q u i r e m e n t s t h a n u n t r a n s f o r m e d c el l l in e s , a n d t h u s a r e m o r e l ik e l y t o g r o w i n

s e r u m - f r e e c u lt u r e . H o w e v e r , e v e n t h o u g h t h e r e a r e in c r e a s i n g r e p o r t s o f su c c e ss in

u s i n g l o w - s e r u m o r s e r u m - f r e e m e d i a , t h e r e s ti ll a re m a n y p r o b l e m s t o b e s o l v ed . F o r

e x a m p l e , d i f f e r e n t c el l l in e s o f t h e s a m e c e ll t y p e m a y h a v e d i f f e r e n t m e d i a r e q u i r e -

m e n t s , p a r t i c u l a r l y w i t h s e r u m - f r e e m e d i a . T h e f a c t is t h a t , i n s p it e o f t h e p r o g r e s s

w h i c h h a s b e e n m a d e , s e r u m h a s s o f a r d e f i e d a l l a t t e m p t s a t s i m u l a t i o n .


4/17

532 R M Nerem

F o r a n c h o r a g e - d e p e n d e n t c ell s, a n o t h e r i m p o r t a n t f a c t o r i n ce ll c u l tu r e i s t h e s u r-

f a c e o n w h i c h t h e c e ll s a r e g r o w n . T h e c h a r a c t e r i s t ic s o f th i s s u r f a c e , e . g . , i ts m i c r o -

s t r u c t u r e a n d s u r f a c e c h e m i s t r y , c a n i n d u c e c h a n g e s i n t h e c e ll . I n f a c t , it is t h e

i n t e r a c t i o n o f a ce ll w i t h i ts e n v i r o n m e n t w h i c h m a y d e t e r m i n e t h e s tr u c t u r e a n d f u n c -

t i o n o f a ce ll . T h i s e n v i r o n m e n t i n c l u d e s t h e m e d i u m , t h e s u r f a c e t o w h i c h t h e c ell s

a r e a d h e r e n t , a n d o t h e r f a c t o r s , e . g ., t h e p r e s e n c e o f f lo w .

C e ll c u l t u r e i s i m p o r t a n t b e c a u s e i n m a n y c a s e s c e ll u la r e n g i n e e r in g e f f o r t s a r e c e n -

t e r e d a r o u n d i ts u se . A t G e o r g i a T e c h th i s f o c u s is t h e B i o e n g i n e e r i n g C e n t e r s M a m -

m a l i a n C e ll C u l t u r e L a b o r a t o r y . A s s o c i a t e d w i t h t h is f a c il it y a r e 5 f a c u l t y a n d n e a r l y

2 0 g r a d u a t e s t u d e n ts . T h e l a b o r a t o r y s r e s e ar c h p r o j e c t s c o v e r th e s p e c t r u m f r o m b a -

s i c t o a p p l i e d r e s e a r c h , a n d t h e t y p e s o f c e l l s u s e d i n t h i s l a b o r a t o r y c a n s e r v e a s a n

e x a m p l e o f t h e w i d e r a n g e a v a i l a b l e f o r r e s e a r c h t o d a y . I n c l u d e d a r e a v a r i e t y o f v a s -

c u l ar e n d o t h e li a l ce lls ( b o v i n e a o r ti c h u m a n d e r m a l m i c r o v a s c u la r , a n d h u m a n u m -

b i li c al v e in ) a n d s m o o t h m u s c l e ce ll s ( b o v i n e , a n d r a t a o r t i c ) w h i c h a r e u s e d i n o u r

s t u d ie s o f v a s c u l a r b i o l o g y a n d i n re s e a r c h r e l a t e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f t is s u e-

e n g i n e e r e d v a s c u l a r p r o s t h e s e s . I n a d d i t i o n , w e u s e a n u m b e r o f d i f f e r e n t c el l l in e s

i n o u r r e s e a r c h . T h i s in c l u d e s 3 T 3 m o u s e f i b r o b l a s t s , B o w e s m e l a n o m a c el ls , ~3 TC 3

m o u s e p a n c r e a t i c c e ll s, a n d t w o l in e s o f t h e A R T - 2 0 m o u s e p i t u i t a r y c ell , o n e g e n e t -

i c al ly e n g i n e e r e d t o se c r e te i n su l in , a n d t h e o t h e r h u m a n g r o w t h h o r m o n e . T h e s e a r e

u s e d i n p r o j e c t s r e l a t e d t o e i t h e r t i s s u e e n g i n e e r i n g o r b i o p r o c e s s e n g i n e e r i n g .

C e ll c u lt u r e t e c h n o l o g y c a n t h u s p r o v i d e t h e f o u n d a t i o n f o r a w id e a r r a y o f a c t iv -

i ti e s. A s i l l u s tr a t e d i n F i g . 1 , t h i s n o t o n l y i n c l u d e s b a s i c c e ll b i o l o g y r e s e a r c h , b u t a l s o

s u c h a p p l i c a t i o n s a s ti s s u e e n g i n e e r in g a n d b i o p r o c e s s e n g i n e e r i n g . T h e s e w i ll b e d is -

c u s s e d l a t e r .

el l u lture Te ch no logy

Cell

B io logy

Bioprocess

Engineer ing

T issue

Engineer ing

Othe r

ppl icat ions

F I G U R E 1

T h e d e v e l o p m e n t o f c e ll c u l t u r e te c h n o l o g y h a s n o t o n ly r e s u l t e d in a n a c c e l e r a t io n o f

b a s i c r e s e a r c h i n c e l l a n d m o l e c u l a r b i o l o g y

i t a l s o h a s l e d t o

t h e u s e o f l i v i n g c e l l s i n

c o m m e r c i a l

p r o d u c t a p p l ic a t io n s e . g . t is s u e e n g i n e e ri n g a n d b i o p r o c e s s e n g i n e e ri n g .


5/17

Cel lular Engineer ing 5

A s d e s c r i b e d e a r l i e r , t h e r e a r e m a n y f a c t o r s w h i c h i n f l u e n c e o u r a b i l i t y t o g r o w

c e ll s, h o w e v e r , t o a l a rg e d e g r e e th e s e a r e a t b e s t o n l y p a r t i a l ly u n d e r s t o o d . T h e r e -

s u lt is t h a t , a l t h o u g h t h e c u l t u r a l r e v o l u t i o n h a s b e g u n a s a d v e r t i s e d a fe w y e a r s a g o

b y I n v i t r o n , a S t. L o u i s - b a s e d c o m p a n y , c e ll c u l t u r e t e c h n o l o g y r e m a i n s m o r e a n a r t

t h a n a s c ie n c e . S ti ll , t h e te c h n o l o g y u s e d i n c u l tu r i n g m a m m a l i a n c e l ls h a s b e c o m e

a c o r n e r s t o n e f o r t h e d e v e l o p m e n t o f c el l a n d m o l e c u l a r b i o l o g y a s a s c ie n t if i c d i s-

c i p li n e a n d i n th e c o m m e r c i a l a p p l i c a t i o n s a r i si n g o u t o f t h is b a s i c r e s e a r c h .

B A S I C R E S E A R C H I N C E L L B I O L O G Y

A s n o t e d i n t h e p r e v i o u s s e c t io n , t h e a d v e n t o f c e ll c u l t u r e t e c h n o l o g y h a s h e l p e d

t o d r a m a t i c a l l y a c c e l e r a t e a d v a n c e s i n c e ll b i o l o g y . T h i s i s t r u e o f t h e e n t i r e s p e c t r u m

o f re s e a r c h o n c el lu l a r a n d s u b - c e l l u l a r p h e n o m e n a . T h e e n g i n e e r , t h r o u g h t h e v a r i -

e t y o f w a y s i n w h i c h t h e p r in c i p l e s a n d m e t h o d s o f e n g i n e e r i n g c a n b e a p p l i e d , h a s

b e e n a p a r t i c i p a n t i n t h i s a r e a . A n o t h e r k e y f a c t o r w h i c h l in k s e n g i n e e r i n g t o c e ll b i -

o l o g y is i ts r e l a t i o n s h i p t o t h e b i o p h y s i c s o f a c e ll , i . e ., t h e r o l e o f p h y s i c a l m e c h a -

n i s m s a n d t h e i n f lu e n c e o f p h y s i c a l f a c t o r s o n c e l l u l ar b e h a v i o r .

B e c a u s e m o s t b i o m e d i c a l r e s e a r c h e r s , e . g . , M D s a n d l if e s c ie n t is t s, h a v e a tr a i n -

i n g w h i c h , i n g e n e r a l , is b i o c h e m i s t r y b a s e d , a n d w h i c h d o e s n o t e m p h a s i z e p h y s i c s ,

t h e s e re s e a r c h e rs h a v e t e n d e d t o f o c u s m o r e o n t h e b i o c h e m i s t r y o f a c el l a n d n o t o n

t h e b i o p h y s i c s o f a ce ll . H o w e v e r , p h y s i c a l f a c t o r s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d t o b e i m -

p o r t a n t , a n d o n e e x a m p l e o f th i s is i n t h e i n f l u e n c e o f m e c h a n i c a l s t r es s e s a n d t h e r e -

s u l ti n g m e c h a n i c s o f d e f o r m a t i o n . E n g i n e e r s i n v o l v e d in s u c h s tu d i e s o f b i o m e c h a n i c s

h a v e c o n t r i b u te d a n d c o n t i n u e t o c o n t r i b u t e to o u r u n d e r s t a n d i n g o f o r g a n p h y s i o l -

o g y a n d t i s su e b e h a v i o r . T h e y a r e n o w a p p l y i n g t h e i r k n o w l e d g e t o t h e i n v e s t ig a t i o n

o f t h e m e c h a n i c a l n a t u r e o f m u c h o f c e ll u la r p h e n o m e n a a n d t h e a p p l i c a t io n o f th e

p r i n c ip l e s o f m e c h a n i c s i n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f c e ll s ( 3 8) .

T h i s t y p e o f c e ll u la r b i o m e c h a n i c a l p h e n o m e n a c a n b e i l lu s t ra t ed b y t h e p r o c e s s

o f c e ll d i v i si o n . I n e x a m i n i n g t h is p r o c e s s f o r a n e u k a r y o t i c c e ll , o n e m u s t c o n s i d e r

t h e e n t i r e r e p r o d u c t i v e c y c l e o f t h e c e l l ( 2 ). T h i s c e ll c y c l e i n c l u d e s a n u m b e r o f s e p -

a r a t e p h a s e s . T h e a c t u a l p r o c e s s o f ce ll d i v i s i o n is c a l l ed M p h a s e ( M = m i t o s i s ) , a n d

t h e n e x t c y c l e s t a r ts w i t h t h e G 1 p h a s e ( G = g a p ) w h i c h i s t h e p e r i o d o f t i m e b e t w e e n

t h e e n d o f M p h a s e a n d t h e b e g i n n in g o f D N A s y n th e s is . T h e p e r i o d o f D N A s y n -

t h e s is is c a l le d S p h a s e ( S = s y n t h e s i s ) , a n d i t e n d s w h e n t h e D N A c o n t e n t o f t h e n u -

c le u s h a s d o u b l e d a n d t h e c h r o m o s o m e s h a v e r e p l ic a t ed . T h e c e ll t h e n e n t e r s t h e

G

p h a s e , w h i c h m a y b e v i e w e d a s p r e p a r a t o r y f o r th e a c t u a l p r o c e s s o f c el l d i v i s io n . T h e

G 2 p h a s e i s f o l l o w e d b y M p h a s e w h i c h i n it s e lf is c o m p o s e d o f t w o s p e c i fi c e v e n t s ,

m i t o s i s a n d c y t o k i n e s is . M i t o s is i n v o l v e s t h e s p l i tt in g o f t h e c o n t e n t o f t h e n u c l e u s ,

w h i c h c a u s e s a v a ri e ty o f i n tr a c el lu l a r m o v e m e n t s , o f m e c h a n i c a l n a t u r e , t o t a k e p l a c e

d u r i n g t h e d i f f e r e n t m i t o t i c p h a s e s . A l s o , d u r i n g c y t o k i n e s i s , w h e n t h e c e l l d i v i d e s i t s

c y t o p l a s m , t h e r e is a v e r y d is t in c t m e c h a n i c a l e v e n t w h e n t h e c o n t r a c t il e r i n g , w h i c h

h a s f o r m e d f r o m c y t o s k e l e t a l c o m p o n e n t s , c l e av e s t h e c el l i n to t w o d a u g h t e r c e ll s.

T h e s e , o f c o u r s e , a r e n o t p u r e l y m e c h a n i c a l e v e n t s . T h e y a r e m o r e a c c u r a t e l y c a l le d

m e c h a n o - c h e m i c a l p h e n o m e n a , a n d t h e r e is i n fa c t a n in c r e a si n g r e c o g n i t i o n o f t h e

i m p o r t a n c e o f s u c h p h e n o m e n a , a n d t h e s tr o n g c o u p l i n g b e tw e e n s t r u c t u r e a n d f u n c -

t i o n i n a n e u k a r y o t i c c e l l .

T h e s t u d y o f th e i n fl ue n ce o f h e m o d y n a m i c s o n v a s c u l a r b i o l o g y / p a t h o b i o l o g y ,

a n d a s a f a c t o r i n th e l o c a l i z a t io n o f a t h e r o s c l e r o s i s ( 4 5 ) , is o n e a r e a o f b i o m e d i c a l


6/17

534 R M Nerem

r e s e a r c h w h e r e t h e im p o r t a n c e o f p h y s i c a l f a c t o r s a s a n e f f e c t o n c e l lu l a r b e h a v i o r

i s r e c o g n i z e d , a n d i n w h i c h e n g i n e e r s h a v e b e e n i n v o l v e d . I n t h e e a r l y d a y s t h is i n -

v o l v e m e n t w a s d u e t o t h e r e a l i z a ti o n t h a t t h e p h y s i c a l f o r ce s im p o s e d b y f lo w i n g

b l o o d m i g h t b e a n i m p o r t a n t i n f l u e n c e o n t h e b i o l o g y o f th e a r t e r ia l w a l l. In vivo

s t u d ie s d e m o n s t r a t e d d i f f e r e n c e s in e n d o t h e l i a l c e ll s h a p e a n d F - a c t i n l o c a l iz a t io n , t h e

p e r m e a b i l i ty o f t h e e n d o t h e l iu m , a n d t h e r e c r u i tm e n t o f m o n o c y t e s i n t o t h e a r te r ia l

w a l l i n r e g i o n s o f d i f f e r i n g h e m o d y n a m i c e n v i r o n m e n t ( 3 5 ). S u c h s t u d i e s a ls o su g -

g e s te d a p o s s ib l e in f l u en c e o f h e m o d y n a m i c e n v i r o n m e n t o n t h e e n d o t h e l i a l c ell t u r n -

o v e r r a t e ( 9) , t h e p r o c e s s o f ce ll r e p l i c a t io n w h e r e b y a c o n f l u e n t e n d o t h e l i a l

m o n o l a y e r i s m a i n t a i n e d , a s a g i n g c el ls d ie . U n f o r t u n a t e l y , i t i s v e r y d i f f ic u l t to q u a n -

t i f y

in vivo

t h e d e t a il e d c h a r a c t e r i st i c s a s s o c i a t e d w i t h t h e f l o w o f b l o o d ; t h u s t h e s e

in vivo

r es u lt s, i n te r m s o f a n y d e m o n s t r a t i o n o f a h e m o d y n a m i c e f f ec t , h a d t o b e

v i e w e d a s q u a l i t a t i v e i n n a t u r e .

F o r t hi s re a s o n , m o r e t h a n a d e c a d e a g o a n u m b e r o f l a b o r a to r i e s b e g a n t o u s e ce ll

c u l t u r e i n t h e s t u d y o f f l o w e f f e c t s o n v a s c u l a r b i o l o g y . T h e f i rs t e f f o r t i n s t u d y i n g

c u l t u r e d v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c el l m o n o l a y e r s i n t h e p r e s e n c e o f f l o w w a s t h a t o f

D e w e y

et aL

( 1 7) w h o u s e d a c o n e - p l a t e v i s c o m e t e r t o i n v e s t i g a t e s h e a r s t r e s s e f f e c t s .

O t h e r l a b o r a t o r i e s , i n c l u d in g m y o w n ( 2 9 ,3 0 ) , h a v e jo i n e d i n th e u s e o f c e ll c u l t u r e

t o s t u d y t h e e f f e c t s o f a c e l l s b i o m e c h a n i c a l e n v i r o n m e n t . T h i s h a s i n c l u d e d s tu d i es

o n t h e i n f lu e n c e o f a f lu i d - i m p o s e d s h e a r s t re s s, o n c h a n g e s d u e t o t h e d i r e c t e ff e c t

o f p r e s s u r e , a n d o n a l t e r a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t h e c y c li c s t r e t c h i n g o f c e ll s g r o w n o n

a c o m p l i a n t m e m b r a n e ( 3 5 ). R e c e n t l y a w o r k s h o p o n m e c h a n i c a l s tr e s s e f f e c t s o n v a s -

c u l a r c e ll s w a s h e l d in A t l a n t a , a n d t h e a b s t r a c t p r o c e e d i n g s o f t h is m e e t i n g a r e r e p -

r e s e n t a t i v e o f t h e c u r r e n t s t a t e o f k n o w l e d g e ( 3) . W h a t is c l e ar f r o m t h i s m e e t i n g i s

t h a t , i n r e s p o n s e to i ts b i o m e c h a n i c a l e n v i r o n m e n t , t h e v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c el l r e -

s p o n d s b y a l t e r in g i ts c y t o s k e l e t a l s t r u c t u r e . W i t h t h i s a l t e r a t i o n t h e r e i s a c h a n g e i n

c e ll s h a p e a n d a n a l i g n m e n t o f t h e c e l l s m a j o r a x i s w i t h i n t h e s t r e ss f i e ld , a s i ll u s-

t r a t e d i n F i g . 2 , a n d t h e r e a r e a v a r i e t y o f a s s o c i a t e d c h a n g e s i n c e ll f u n c t i o n .

A s p a r t o f t h i s t h e r e is a n i n f l u e n c e o f m e c h a n i c a l s t r e ss o n t h e c e l l s a b i li t y t o r e p -

l i c a t e . A s n o t e d e a r l i e r ,

in vivo

o b s e r v a t i o n s s u g g es t a n i n fl u e n c e o f a h e m o d y n a m i c

e n v i r o n m e n t o n e n d o t h e l i a l c e ll t u r n o v e r r a t e s , a n d i t is b e l ie v e d t h a t h i g h e r r a t e s o c -

c u r i n r e g i o n s c h a r a c t e r i z e d h e m o d y n a m i c a l l y a s l o w - s h e a r s t re s s i n c o m p a r i s o n t o

t h o s e c h a r a c t e r i z e d a s h i g h - s h e a r s t r e s s (9 ) . W h e t h e r o r n o t i t i s i n f a c t a s h e a r -s t r e s s

e f f e c t c a n n o t b e d e t e r m i n e d f r o m

in vivo

e x p e r i m e n t s . F u r t h e r m o r e , i t is w el l k n o w n

t h a t t h e t u r n o v e r r a t e o f a n e n d o t h e l i a l m o n o l a y e r i n c u l t u r e is f a r h i g h e r t h a n t h a t

o b s e r v e d

in vivo

i n e n d o t h e l i u m . T h u s , i n o u r o w n l a b o r a t o r y w e h a v e fo c u s e d o n

s t u d y i n g t h e e f f e c t s o f l a m i n a r f l o w a n d t h e a s s o c i at e d f l u i d - i m p o s e d s h e a r s tr e ss o n

t h e p r o c e s s o f c ell r e p l i c a ti o n i n c u l t u r e d e n d o t h e l i a l m o n o l a y e r s . W h a t w e h a v e

f o u n d i s t h a t i n t h e p r e s e n c e o f s h e a r s t r e s s , t h e o v e r a l l p r o l i f e r a t i o n r a t e o f s u b - c o n -

f l u e n t e n d o t h e l i a l c e ll s i s a l t e r e d ( 3 0 ). F o r e n d o t h e l i a l c e l ls c u l t u r e d o n a p o l y e s t e r s u b -

s t r a te , e . g . , T h e r m a n o x o r M y l a r , a n d f o r l o w - s h e a r s t r e ss e s, e . g ., 5 d y n e s / c m 2 o r

l e s s , a n y e f f e c t i s a b s e n t a s w a s n o t e d i n t h e e a r l i e r s t u d y o f D e w e y

et al

( 1 7 ) . H o w -

e v e r , f o r s h e a r s t re s s es i n t h e r a n g e f r o m 3 0 t o 9 0 d y n e s / c m 2 , c e ll p r o l i f e r a t i o n i s s ig -

n i f i c a n t ly s l o w e d , w i t h t h e g r o w t h a t 9 0 d y n e s / c m 2 b e i n g a l m o s t t o t a l ly a r r e s t e d , a t

l e a s t f o r 2 4 h o u r s .

T h e s e e a r l ie r r es u l ts w e r e b a s e d o n c e l l d e n s i t y d a t a , a n d t o c o n f i r m t h is 3 H - t h y -

m i d i n e i n c o r p o ra t io n a n d a u t o r a d i o g r a p h y m e a s u r e m e n t s w e r e p e r fo r m e d . T h e se

w e r e c o n d u c t e d p o s t - s h e a r , i .e ., a f t e r r e m o v a l o f th e c o v e r s li p f r o m t h e f l o w c h a m -


7/17

Cellular Engineering 5 5

A)

B)

FIGURE 2 . Pho tomicrographs o f cu l tu red BAEC grow n on Therm anox under con t ro l con d i t ions

a) and under a laminar steady state f lo w shear stress = 85 dyne s/cm 2) for 24 hours b) , f low from

le f t to r igh t , R eproduced f rom re fe rence 28 . pub l ished by permiss ion o f ASME .


8/17

5 3 6 R . M . N e r e m

b e r , a n d t h e s e r e s u l ts s u g g e s t t h a t t h e i n h i b i t i o n o f ce ll p r o l i f e r a t i o n b y s h e a r s t r e s s

is a t t h e l e v el o f D N A s y n t h e s i s , a n d n o t d u e t o e n d o t h e l i a l c e ll s r o u n d i n g u p d u r i n g

m i t o s i s a n d b e i n g r e m o v e d b y f lo w ( 30 ). F u r t h e r m o r e , t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e ef -

f e c t o f s h e a r s t r e s s o n e n d o t h e l i a l c e l l g r o w t h w a s r e l a t e d t o a n a l t e r a t i o n i n ce ll c y -

c le k i n et ic s , b o t h c e ll s iz e a n d D N A c o n t e n t w e r e a n a l y z e d b y f l o w c y t o m e t r y ( 3 3) .

F o r s u b - c o n f l u e n t c e ll s a n d f o l lo w i n g e x p o s u r e t o a s h e a r s t re s s o f 3 0 d y n e s / c m 2 f o r

2 4 h o u r s , t h e p e r c e n t a g e o f s u b - c o n f l u e n t c e l l s i n S p h a s e w a s r e d u c e d s i g n i f i c a n t l y ,

w i t h t h e r e s i m u l t a n e o u s l y b e i n g a n i n c r e a s e in t h e p e r c e n t a g e o f c el ls in G 0 / G 1

p h a s e . W h e n t h e se e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d w i t h c o n f l u e n t c e ll s, s i m i la r re s u l ts w e r e

o b t a i n e d . T h u s , s h e a r s t r es s a p p e a r s t o i n h i b i t th e t r a n s i t io n o f e n d o t h e l i a l c e ll s f r o m

t h e G o / G I p h a s e t o S p h a s e i n t h e c el l c y c le .

I n s e p a r a t e e x p e r i m e n t s , c e l l s i n b o t h s h e a r e d a n d s t a t i c c u l t u r e s w e r e v i d e o t a p e d

a t 4 0 0 m a g n i f i c a t i o n i n o r d e r t o v is u a li z e a n d q u a n t i f y th e p r o c e s s o f m i t o s i s a n d

c y t o k i n e s i s ( 4 6 ). W h e r e a s i n s ta t i c c u l t u r e a c e ll r o u n d s u p a s p a r t o f t h e p r o c e s s o f

d i v i s i o n , e l o n g a t e d e n d o t h e l i a l c e ll s i n th e p r e s e n c e o f f l o w p r e s e r v e t h e i r e l o n g a t e d ,

f l a t t e n e d s h a p e o v e r t h e e n t i r e d u r a t i o n o f c e ll d i v i s io n . I n s o m e c a s e s , t h e t e m p o r a l

n a t u r e o f th e i n t r a c e l l u l a r m i t o t i c e v e n t s w a s o b s e r v e d t o b e a lt e r e d . T h u s , t h e i n f lu -

e n c e o f f l o w is n o t o n l y t o h o l d u p e n t r y i n t o S p h a s e , b u t a l s o t o a f f e c t t h e c e l l d i -

v i s i o n p r o c e s s i ts e l f.

F i n a l l y , a l t e r a t i o n s i n t h e e n d o t h e l i a l c e l l s g r o w t h s t a t e w e r e f u r t h e r s t u d i e d b y

a n a ly s i s o f t h e c ell c y c l e -d e p e n d e n t a c c u m u l a t i o n o f th e m e s s e n g e r R N A ( m R N A ) f o r

t h e p r o t o - o n c o g e n e c - m y c ( 8 ) . B o t h c o n t r o l a n d s h e a r s t r e s s t r e a t e d e n d o t h e l i a l c e l l s

w e r e e x p o s e d t o t h e p o t e n t a g o n i s t c ~ - t h r o m b i n , a n d t o t a l c e l l u l a r R N A w a s p r e p a r e d

a n d a n a l y z e d o n n o r t h e r n b l o t s . U s i n g a p r o b e f o r t h e p r o t o - o n c o g e n e c - m y c w e o b -

s e r v e d t h a t c - m y c l e v e l s a t o n e h o u r i n c r e a s e d 2 8 f o l d i n e n d o t h e l i a l c e l l s i n s t a t i c c u l -

t u r e , b u t o n l y 4 fo l d in e n d o t h e l i a l c el ls w h i c h h a d b e e n e x p o s e d t o f l o w . F u r t h e r

e x p e r i m e n t s w i t h o t h e r a - t h r o m b i n s i g n al t r a n s d u c t i o n e v e n t s w il l n e e d t o b e p e r -

f o r m e d i n o r d e r t o d e l i n e a te t h e m e c h a n i s m i n v o l v ed ; h o w e v e r , it is c l ea r th a t t h e i n-

f l u e n c e o f f l o w a n d t h e a s s o c i a t e d s h e a r - s t r e s s le v e l is m a n i f e s t a t t h e g e n e e x p r e s s i o n

l e ve l .

A n o b v i o u s l y c r it ic a l q u e s t i o n i s h o w d o e s a n e n d o t h e l i al c e ll r e c o g n i z e a m e c h a n -

i c al s t i m u l u s , a n d h a v i n g d o n e s o , h o w d o e s i t t r a n s d u c e t h a t s i g n a l i n t o t h e t y p e s o f

c h a n g e i n c e l l r e p l i c a t i o n w h i c h w e h a v e o b s e r v e d ? T h e i n t r a c e l l u l a r e v e n t s t h a t r e g -

u l a t e t h e e n d o t h e l i a l c e ll s g r o w t h p r o g r a m i n r e s p o n s e t o s h e a r s tr e s s a r e n o t k n o w n .

H o w e v e r , i n m a n y c el l t y p e s , it is t h o u g h t t h a t t h e s i g n a li n g m e c h a n i s m s i m p o r t a n t

t o a l t e r a t i o n s i n c el l s h a p e a n d c y t o s k e l e t a l s t r u c t u r e a l s o a r e i n v o l v e d i n g r o w t h c o n -

t r o l . I f t h i s is t r u e i n r e g a r d t o e n d o t h e l i a l c e ll g r o w t h , t h e n t h e r e c o g n i t i o n i s p e r h a p s

a m e m b r a n e e v e n t, p o s s i b l y li n k ed t o t h e c o n t r o l o f C a + + m e t a b o l i s m . T h e r e a r e re -

p o r t s o f a t r a n s i e n t e l e v a t i o n i n i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n r e s p o n s e t o f l o w ( 4 ) , a n d w e

h a v e s e e n t h i s r e c e n t l y i n o u r o w n l a b o r a t o r y ( 2 1 ) . A n i m p o r t a n t b i o c h e m i c a l p a t h -

w a y c o n t r o l l i n g C a + + m o b i l i z a t i o n i s t h e p h o s p h o l i p a s e C - m e d i a t e d h y d r o l y s is o f

p o l y p h o s p h o i n o s i t i d e s . I n t h is p a t h w a y , a c t i v a t io n o f a c el l s u r f a c e r e c e p t o r s t i m u -

l a t e s a p h o s p h o i n o s i t i d e - s p e c i f i c p h o s p h o l i p a s e C t o h y d r o l y z e p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l

4 ,5 b i s p h o s p h a t e ( P I P 2 ) to f o r m i n o s i to l 1, 4 , 5, t r i s p h o s p h a t e ( I P 3) , a p o t e n t

m o b i l i z e r o f i n t r a c e l lu l a r C a + +, a n d d i a c y l g ly c e r o l , a s t i m u l a t o r o f t h e C a + + / p h o s -

p h o l i p i d - d e p e n d e n t e n z y m e , p r o t e i n k i n a s e C . R e c e n t l y , i t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t

t h e r e i s s h e a r - s tr e s s s t i m u l a t i o n o f th i s p a t h w a y , w i t h a p e a k i n I P3 b e in g m e a s u r e d

s h o r t l y a f t e r t h e o n s e t o f f l o w ( 3 7) . F u r t h e r m o r e , s tu d i e s in o u r l a b o r a t o r y h a v e i m -


9/17

Cellular Engineering 5 7

p l i c a te d p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) a s p a r t o f th e s i g n a l in g p a t h w a y w h i c h l in k s a s h e a r -

s t r e s s - r e l a t e d m e c h a n i c a l s i g n a l t o t h e i n t r a c e l l u l a r e v e n t s u n d e r l y i n g a l t e r a t i o n s i n c e l l

m o r p h o l o g y ( 22 ). T h i s s e c o n d m e s s e n g e r m a y a ls o b e i n v o l v e d in t h e c o n t r o l o f t h e

e n d o t h e li a l c e l l s g r o w t h p r o g r a m .

I t sh o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t in vivo e n d o t h e l i a l c e ll s r e s id e i n a f l o w e n v i r o n m e n t ,

a n d t h u s t o s t u d y v a s c u l a r e n d o t h e l i a l b i o l o g y in s t a ti c c u l t u r e i s a t b e s t a s i m u l a t i o n

o f a r e g i o n o f f l o w s t a si s a n d a t w o r s t a r t i f a c t u a l . F u r t h e r m o r e , e n d o t h e l i a l c el ls r e -

s p o n d d i f f e r e n t l y t o d i ff e r i n g f l o w e n v i r o n m e n t s , a n d o n e s h o u l d n e v e r c o l le c t iv e l y

t a l k o f f l o w a s a s i n g l e s t i m u l u s . J u s t a s t h e r e a r e d i f f e r e n t c h e m i c a l a g o n i s t s , e a c h

w i t h t h e ir o w n s e p a r a t e e f f e c t , t h e r e a l s o a r e d i f f e r e n t t y p e s o f f l o w a g o n i s t s , i .e . , a

v a r i e t y o f t y p e s o f f l o w e n v i r o n m e n t s , e a c h o f w h i c h w i ll h a v e t h e i r o w n a g o n i s t e f -

f e c t ( 23 ). T h u s , a s i m p o r t a n t a s ce ll c u l t u r e s t u d i es h a v e b e e n t o t h e s t u d y o f v a s c u -

l a r b i o l o g y , i t is c l e ar t h a t t h e r e i s m u c h m o r e w h i c h n e e d s t o b e d o n e i f w e a r e t o

e n g i n e e r th e c e ll cu l tu r e e n v i r o n m e n t s o a s to m a k e i t t r u l y s i m u l a t e p h y s i o l o g i c c o n -

d i t io n s . T h i s i n c lu d e s t h e u s e o f r ea l is t ic f l o w e n v i r o n m e n t s , b u t o t h e r f a c t o r s , e . g . ,

t h e m e d i u m , e x t r a c e ll u l ar m a t r i x c o m p o n e n t s , a n d t h e p r e se n c e o f n e i g h b o r i n g c e ll s,

w i l l a l s o n e e d t o b e i n c l u d e d .

T I S S U E E N G I N E E R I N G

T i s s u e e n g i n e e r i n g , s t i l l i n i t s i n f a n c y , i s a n a c t i v i t y w i t h i n t h e f i e l d o f m e d i c a l a n d

b i o l o g i c a l e n g i n e e r i n g w h i c h p r e d a t e s i ts n a m e . T h e t e r m o r i g i n a t e d i n 1 98 7 a t a b i -

o e n g i n e e r i n g p a n e l m e e t i n g h e l d a t t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n . I n e a r ly 1 9 8 8

t h e f i r s t t i s s u e e n g i n e e r i n g m e e t i n g w a s h e l d a t L a k e T a h o e , C a l i f o r n i a . A t t h i s m e e t -

i n g a w o r k i n g d e f i n i t i o n w a s f o r m u l a t e d ( 3 9 ) :

Tissue engineering i s the ap pl ic a t io n of the pr inc iples and m ethod s of engineer ing

a nd t he l if e s ci enc es t owa rd t he fund a m e nt a l un de rs t a nd i ng of s t ruc t u re - func t i on

re la t ionsh i ps i n norma l a nd pa t ho l og i c a l ma m m a l i a n ti ssues a nd t he de ve l op me n t

of b i o l og i c a l subs t it u te s t o r e s t o re , m a i n t a i n , o r i m prov e func t i ons .

C o n t a i n e d i n t h e a b o v e i s t h e e s s e n c e o f t i s s u e e n g i n e e r i n g , i . e . , t h e u s e o f l i v i n g c e l l s ,

t o g e t h e r w i t h e x tr a c e l lu l a r c o m p o n e n t s , e i th e r n a t u r a l o r s y n t h e t ic , i n t h e d e v e l o p -

m e n t o f i m p l a n t a b l e p a r t s o r d e v ic e s f o r t h e r e s t o r a t io n o r r e p l a c e m e n t o f f u n c t i o n .

A n e x c e l le n t e x a m p l e o f ti s su e en g i n e e r in g , o n e w h i c h d e m o n s t r a t e s t h e i m p o r t a n c e

o f c e ll cu l t u r e , i s t h e d e v e l o p m e n t o f a r t if i c ia l s k i n ( 3 2 ,4 0 ) . T h e u s e o f t h e t e r m a r -

t i f i c i a l h e r e m u s t b e q u a l i f i e d s i n c e m a n y o f t h e a p p r o a c h e s , i n u s i n g l i v i n g c e l l s a n d

m a t r i x m o l e c u l e s , a r e q u i t e n a t u r a l . I n a t l e a s t o n e c a s e , d e r m a l a n d e p i d e r m a l c el ls ,

t o g e t h e r w i t h e x t r a c e ll u l a r m a t r i x a n d n u t r i e n t s , a r e g r o w n i n c u l t u r e t o p r o d u c e a

s k i n w h i c h i n e f f e c t is a li v in g e q u i v a l e n t o f t h a t f o u n d n o r m a l l y o n t h e b o d y ( 6 ,7 ) .

A n o t h e r t y p e o f a r t i f i c i a l s k i n g r a f t i n v o l v e s a h i g h l y p o r o u s c o l l a g e n m a t r i x w h i c h

s e rv e s a s a t e m p l a t e f o r t h e g r a f t ( 44 ). W h e n t h e g r a f t is a tt a c h e d t o a w o u n d , f i b r o -

b l a st s m i g r a t e t o i t f r o m s u r r o u n d i n g t is s u e a n d p e r m e a t e t h e c o ll a g e n s p o n g e . T h e s e

f i b r o b l a s t ce ll s p r o d u c e n e w c o l l a g e n , t h e o r i g i n a l m a t r i x is s l o w l y d e g r a d e d , a n d e p i -

d e r m a l c el ls f r o m t h e e dg e s o f t h e w o u n d g r o w i n w a r d s a n d c o v e r t h e g r a f t a r e a .

T h e r e a r e s t i l l o t h e r e n t r i e s i n t o t h i s m a r k e t . C u r r e n t l y t h e r e a r e f o u r d i f f e r e n t

c o m p a n i e s w o r k i n g t o d e v e l o p a t i s s u e -e n g i n e e r e d a r t if i c ia l s k i n . T h i s s k i n , a s t h e f i r st

p r o d u c t d e v e l o p e d w i t h t h e t e c h n o l o g y o f t i s s u e e n g i n e e r i n g , i s a n i m p o r t a n t d e v e l o p -

m e n t . H o w e v e r , t h e r e a r e a n u m b e r o f o t h e r a p p l i c a ti o n s o f th i s em e r g i n g t e c h n o l o g y .


10/17

538 R M Nerem

O n e o f t h e m o r e p r o m i s i n g a r e a s o f ti ss u e e n g i n e e ri n g is in t h e d e v e l o p m e n t o f b i o -

l o g i c al su b s t i tu t e s b a s e d o n t h e e n c a p s u l a t i o n o f c u l t u r e d c e ll s. O n e o f t h e i m p o r t a n t

a r e a s f o r u s e o f e n c a p s u l a t e d c e ll t e c h n o l o g y is in t h e d e v e l o p m e n t o f b io a r t i f ic i a l o r -

g a n s , e . g . , a n a r t i fi c i a l p a n c r e a s ( 2 0 ). P a n c r e a s t r a n s p l a n t s h a v e f a i l e d t o b e u s e f u l

b e c a u s e o f i m m u n o l o g i c a l r e j e ct io n . A n a l te r n a ti v e a p p r o a c h is th e d e v e l o p m e n t o f

i m p l a n t a b l e i n s u l i n p u m p s ; h o w e v e r , t h e s e a r e n o t w i t h o u t p r o b l e m s e i t h e r . T h i s h a s

l e d t o t h e i n t e r e s t i n d e v e l o p i n g a b i o a r t i f ic i a l p a n c r e a s ( 1 2) . A l t h o u g h t h e r e a r e s e v -

e r a l p o s s ib l e d e s ig n s f o r a b i o a r t i f i c i a l p a n c r e a s , o n e i n v o l v e s t h e u s e o f m i c r o e n c a p -

s u l a t ed i s le t c e ll s ( 3 1 ) . I n s u ch a d ev i ce , t h e i s l e t c e l ls , w h i c h s e c r e t e i n s u l i n , a r e

s u r r o u n d e d b y a s e m i - p e r m e a b l e m e m b r a n e . T h i s m e m b r a n e m u s t b e p e r m e a b l e to

t h e t r a n s p o r t o f i n s u l i n so i t c a n b e p a s s e d i n t o t h e b l o o d s t r e a m . T h e c e ll s a l s o w il l

n e e d n u t r i e n t s, o x y g e n , a n d o t h e r m o l e c u l e s n e c e s s a r y f o r t h e m a i n t e n a n c e o f m e t -

a b o l i c f u n c t i o n . H o w e v e r , t h e m e m b r a n e m u s t , i n a d d i t i o n , p r o t e c t th e is le t c e ll s f r o m

b a c t e r ia , l y m p h o c y t e s , a n d o t h e r p r o t e i n s r e s p o n s ib l e f o r im m u n e r e j e c ti o n . I m p o r -

t an t i n t h e d e s i g n o f a b i o a r t i f i c i a l p an c r ea s i s i ts ab i l it y t o r e s p o n d r ap i d l y t o ch an g es

i n g l u c o s e l e v e l. E q u a l l y n e c e s s a r y i s t h e l o n g t e r m s u r v i v a l o f t h e i sl e t c e ll s a n d t h e

s ec r e t i o n o f t h e i n s u l in . A s p a r t o f t h i s , it a l s o is i m p o r t a n t t h a t i s l e t c e l l f u n c t i o n n o t

c h a n g e w i t h a b u i l d u p o f h o r m o n e s . A l t h o u g h , i n m o s t o f t h e s e a r e a s, m i c r o e n c a p -

s u l a t e d i s le t c e ll s f u n c t i o n q u i t e w e l l , o n e p r o b l e m is t h a t t h e i n s u l i n p r o d u c t i o n r a t e

i s o n t h e l o w s i d e .

T h e r e a r e o t h e r a p p l i c a t i o n s o f e n c a p s u l a t e d c e ll t e c h n o l o g y i n t is s u e e n g i n e e r i n g .

C i m a et al ( 1 1 ) h av e s h o w n t h a t b o t h l i v e r an d ca r t i l ag e ce i l s c an b e t r an s p l an t ed s u c -

c e s s f u l l y , a t l e a s t i n s m a l l a n i m a l s , u s i n g c e l l s w h i c h a r e e n c a p s u l a t e d i n a d e g r a d a -

b l e p o l y m e r s u b s t r a te . N e u r o l o g i c a l d e f ic i ts a ls o c a n b e t r e a t e d b y t r a n s p l a n t a t i o n

w i t h i n t h e b r a i n o f p o l y m e r e n c a p s u l a t e d c e ll s w h i c h r e l e a se t h e m i ss in g n e u r o t r a n s -

m i t t e r , a n d A e b i s c h e r et al ( 1) h a v e i n v e s ti g a t ed t h e a b i l it y o f e n c a p s u l a t e d d o p a m i n e

s e c r e t i n g c el ls t o r e v e r s e e x p e r i m e n t a l P a r k i n s o n s d i s e a s e . F i n a l l y a m a j o r t i ss u e -

e n g i n e e r i n g m a r k e t , w h e r e e n c a p s u l a t e d c e ll t e c h n o l o g y m a y h a v e a p p l i c a t io n , is i n

t h e d e v e l o p m e n t o f b l o o d s u b s ti t u te s , i . e ., a n a r t if i c ia l b l o o d ( 36 ). C u r r e n t e f f o r t s a r e

b a s e d o n t h e c h e m i c a l c r o s s -l i n k in g o f h e m o g l o b i n , i n m a n y c a s e s b o v i n e d e r i v e d , b u t

t h e r e a r e p o t e n t i a l p r o b l e m s a s s o c i a t e d w i t h b o t h i n c o m p l e t e c r o ss - l in k i n g a n d t h e i n -

t r o d u c t i o n o f t h e f o r e i g n , b o v i n e p r o t e i n s in t o t h e b o d y . I n t h e f u t u r e t h e u se o f m i -

c r o e n c a p s u l a t i o n , t o g e t h e r w i th s te m - c el l c u l t u re a n d c o n t r o l l e d h e m a t o p o i e s i s ,

s h o u l d p r o v e i m p o r t a n t .

A n o t h e r a p p l i c a t i o n o f t i ss u e e n g i n e e r in g is i n th e d e v e l o p m e n t o f a n a r t i f ic i a l

b l o o d v e s s e l f o r u s e i n t h e b y p a s s a n d r e p l a c e m e n t o f d i s e a s e d a r t e r i e s ( 2 4 , 4 2 ) . A

n u m b e r o f g r o u p s h a v e b e e n i n t e r e st e d i n a p p l y i n g c el l c u l t u r e t e c h n o l o g y t o t h e d e -

v e l o p m e n t o f s u c h t i ss u e - e n g in e e r e d v a s c u l a r p r o st h e s e s . M u c h o f t h is e f f o r t h a s b e e n

f o c u s e d o n h y b r i d v a s c u l a r g r a f t s , i . e ., a g r a f t c o n s t r u c t e d o u t o f s y n t h e t ic m a t e r i a l

s u c h a s d a c r o n o r p o l y t e t r a f l u o r o e t h y l e n e ( P T F E ) , b u t s e e d e d w i th c u l t u re d e n d o t h e -

l ia l c e ll s p r i o r t o i m p l a n t a t i o n , i n o r d e r t o p r o v i d e a n a t u r a l i n t e r f a c e w i t h f l o w i n g

b l o o d ( 4 7) . A l t h o u g h i n i t ia l r e su l t s i n te r m s o f i n c r e a s e d g r a f t p a t e n c y a r e p r o m i s i n g ,

i t i s c l e a r t h a t t h is o n l y p a r t i a l l y s i m u l a t e s a n a c t u a l , l i v in g b l o o d v e s se l .

O t h e r s h a v e a t t e m p t e d t o u s e t h e c o - c u l t u r e o f e n d o t h e l i a l c el ls a n d s m o o t h m u s -

c l e c e ll s i n t h e c o n s t r u c t i o n o f a n a r t if i c i a l b l o o d v e s se l . M o s t n o t a b l e i s t h e e f f o r t o f

W e i n b e r g

et al

( 42 ) w h o c o n s t r u c t e d a n a r t if i c ia l b l o o d v e s se l u si n g b o v i n e a o r t i c e n -

d o t h e l i a l c e ll s, b o v i n e a o r t i c s m o o t h m u s c l e ce ll s a n d a d v e n t i a l f i b r o b l a s t s . T h i s w a s

c o m p o s e d o f t h r e e l a y e rs , o n e o f e n d o t h e l i a l c e ll s, o n e o f s m o o t h m u s c l e c el ls t o g e t h e r


11/17

Cel lular Eng ineer ing 539

w i t h c o ll a g e n , a n d o n e o f f i b r o b l a s t s a n d c o l la g e n . T h e e n d o t h e l i a l c e ll s w e r e s h o w n

t o f o r m a f l a t te n e d m o n o l a y e r c o v e r i n g m o r e t h a n 9 0 p e r c e n t o f th e s u r f a c e a n d a c t -

i n g as a p e r m e a b i l i t y b a r r i e r f o r l a rg e m o l e c u l e s , e . g . , a l b u m i n . E n d o t h e l i a l c e l ls a l s o

w e r e s h o w n to r e le a s e p r o s t a c y c l i n P G I 2 ) a n d p r o d u c e v o n W i l l i b r a n d f a c t o r .

T h e d e v e l o p m e n t o f a n a r t if i c ia l b l o o d v e ss e l is a n e x a m p l e o f b o t h p a r t s o f t h e

d e f i n i ti o n g i v en in t h e i n t r o d u c t o r y p a r a g r a p h o f t h is s e c t io n . B e f o r e o n e c a n a c h i e v e

t h e g o a l o f a b i o l o g i c a l s u b s t it u t e , i n th i s c a s e a n a r t i f i c i a l b l o o d v e s se l m a d e a t l e a s t

i n p a r t f r o m l i v in g ce ll s, o n e m u s t d e v e l o p a f u n d a m e n t a l u n d e r s t a n d i n g o f t h e s t ru c -

t u r e - f u n c t i o n r e l a t io n s h i p s i n t ri n s ic t o v a s c u l a r b i o l o g y . T h i s i n v o l v e s th e s t u d y o f t h e

s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f b o t h v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c el ls a n d v a s c u l a r s m o o t h m u s -

c le ce ll s, t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h e a c h o t h e r , t h e r o l e o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , a n d t h e i n -

f l u e n c e o f t h e e n v i r o n m e n t i n w h i c h t h e s e t w o d i f f e r e n t c e l l t y p e s e a c h r e s i d e ,

i n c l u d in g t h e m e c h a n i c a l s t re s se s t o w h i c h t h e y a r e e x p o s e d .

A n i l l u s t r a t i o n o f th i s i s a s f o l lo w s . A s n o t e d e a r l i e r , o n e o f t h e m a j o r d i f f e r e n c e s

b e t w e e n e n d o t h e l i a l c el ls

i n v i v o

a n d

i n v i t r o

i s t h a t

i n v i v o

v a s c u l a r e n d o t h e l i u m h a s

a v e r y l o w c e ll t u r n o v e r r a t e , w h i l e i n v i t r o f o r a c o n f l u e n t e n d o th e l i a l m o n o l a y e r

i n s t a ti c c u l t u r e , t h e t u r n o v e r r a t e is s e v e r a l o r d e r s o f m a g n i t u d e h i g h e r . I t is p o s s i -

b l e t o r e d u c e t h e c e ll t u r n o v e r r a t e o b s e r v e d

i n v i t ro .

F o r e x a m p l e , a s i n d i c a t e d i n t h e

p r e v i o u s s e c t io n , b y p la c i n g a c o n f l u e n t e n d o t h e l i a l m o n o l a y e r in a l a m i n a r f l o w

w h e r e t h e s h e a r s t re s s is 3 0 d y n e s / c m 2 o r h i g h e r , o u r s t u d ie s s h o w t h a t t h e r a t e o f

c e ll t u r n o v e r c a n b e s i g n if i c a n tl y r e d u c e d 3 0 ). I t a l so h a s b e e n s h o w n t h a t e n d o t h e -

l i a l c e l l s i n c o n t a c t w i t h s m o o t h m u s c l e c e l l s , i . e . , a n e n d o t h e l i a l - s m o o t h m u s c l e c e l l

c o - c u l t u r e , r e s u l t s i n a f i f t y p e r c e n t r e d u c t i o n i n c e ll t u r n o v e r 1 4 ) . T h e s e t w o r e s u l t s

t o g e t h e r s ug g e st th a t , i n o r d e r t o a c h ie v e a lo w c e ll t u r n o v e r r a t e - o n e c o m p a r a b l e

t o t h a t o b s e r v e d

i n v i v o

i t m a y b e n e c e s s a r y to h a v e c u l t u r e d e n d o t h e l i a l c e ll s b o t h

i n c o n t a c t w i t h n e i g h b o r i n g s m o o t h m u s c l e c e l l s a n d i n a f l o w e n v i r o n m e n t .

T h e s e r e s u l ts a l s o h a v e i m p l i c a t i o n s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a t i s su e - e n g i n e e r e d va s -

c u l a r g r a f t . I f a lo w e n d o t h e l i a l ce ll t u r n o v e r r a t e i s a r e q u i s it e , i . e . , o n e c o m p a r a -

b l e t o t h a t f o u n d

i n v i v o

i n v a s c u l a r e n d o t h e l i u m , t h i s w i ll n o t b e r e a l iz e d s i m p l y w i t h

e n d o t h e l i a l c el ls p r e - s e e d e d o n a s y n t h e t i c m a t e r i a l ; i t w i ll t a k e a n e n d o t h e l i a l - s m o o t h

m u s c l e c e ll c o - c u l t u r e , i . e ., t h e r e c o n s t i t u t i o n o f a c o m p l e t e b l o o d v e s s el in c u l t u r e .

I t s h o u l d b e n o t e d t h a t i n t h e t r e a t m e n t o f c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e , a n a l t e r n a t i v e

a p p r o a c h t o t h e s u rg i ca l i m p l a n t a t i o n o f a v a s c u l a r p r o s t h e s is is g e n e t h e r a p y 3 4 ).

I n g e n e t h e r a p y , c e ll s, g e n e t i c a ll y m o d i f i e d s o a s t o e n h a n c e t h e s e c r e t i o n o f a d e s i r e d

s u b s t a n c e , e . g . , t h e t h r o m b o l y t i c a g e n t ti ss u e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r t P A ) , w i ll b e

i m p l a n te d i n t o t h e b o d y . A l t h o u g h t h e u se o f r e c o m b i n a n t D N A t e c h n o l o g y m a y a p -

p e a r t o b e p r i m a r i l y a m o l e c u l a r b i o l o g y e f f o r t , a n i m p o r t a n t a s p e c t is t h e d e v e l o p -

m e n t o f v e h ic l es f o r i n t r o d u c i n g t h e c e l ls i n to t h e c a r d i o v a s c u l a r s y s t e m . O n e

a p p r o a c h w o u l d b e t h r o u g h t h e u s e o f a v a s c u l a r g r a f t l in e d w i t h g e n e t i c a ll y - m o d i f i e d

e n d o t h e l i a l c e l ls 4 3 ) . T h i s b r i n g s u s f u l l c i r c le , i . e ., b a c k t o t h e n e e d t o d e v e l o p t is -

s u e - e n g i n e e r e d v a s c u l a r p r o s t h e s e s .

T h e r e a r e m a n y o t h e r a r e a s o f t is s ue e n g i n e e r i n g w h i c h a r e c u r r e n t l y r e c e iv i n g a t-

t e n t i o n . T h e s e in c l u d e b o t h o r t h o p e d i c im p l a n t s a n d n e u r a l p r o s t h e se s . A n e x t r e m e l y

i m p o r t a n t a r e a , i n g e n e r a l , is i n th e i n t e r a c t i o n o f c el ls w i t h s u r f a c e s a n d i n h o w t o

m o d i f y s u c h s u r fa c e s to p r o m o t e a c e r t a i n ty p e o f c e l lu l a r b e h a v i o r . A n o t h e r a r e a o f

i m p o r t a n c e i s t h a t o f d r u g d e l i v e r y , w i t h o n e n e w a p p r o a c h b e i n g c o n t r o l l e d r e l e as e

s y s te m s , i .e . , t h e d e li v e r y o f a d r u g a t a p r e d e t e r m i n e d r a t e t h r o u g h t h e p l a c e m e n t

o f th e d r u g i n a p o l y m e r i c m a t e r i a l 2 5 ).


12/17

540 R M Nerem

I n A p r i l , 1 9 90 a t th e K e y s t o n e , C o l o r a d o w o r k s h o p o n t i ss u e e n g i n e e ri n g , a f in a l

d i s c u ss i o n w a s h e l d t o a d d r e s s t h e p r io r it ie s f o r f u t u r e w o r k . T h e l is t o f to p i c s , s h o w n

i n T a b l e 1 , w e r e p r o v i d e d a s a s e t o f r e c o m m e n d a t i o n s t o t h e N a t i o n a l S c ie n c e F o u n -

d a t i o n . T h e s e t o p i c s a r e g e n e ri c t o m a n y o f t h e t i s s u e -e n g i n e e r i n g a p p l i c a t io n s d is -

c u s s e d h e r e . F u r t h e r m o r e , t h e i s s u e o f g r o w i n g c e l ls , i . e . , c e ll c u l t u r e t e c h n o l o g y , is

a n e s s e n t ia l p a r t o f a n u m b e r o f t h e a re a s i d e n t i fi e d .

I O P R O C E S S E N G I N E E R I N G

B i o p r o c e s s i n g is th e p r o d u c t i o n o f b i o c h e m i c a l s f r o m l iv i n g ce ll s. T h e c e ll m a y b e

e u k a r y o t i c , i .e . , h a v i n g a n u c l e u s l ik e a m a m m a l i a n c e ll , o r p r o k a r y o t i c , i. e . w i t h o u t

a n u c l eu s , l i k e b ac t e r i a . I n 1 9 7 3 , t h e f i r s t g en e w as c l o n ed i n

E coli

b a c t e r i a , a n d t h e

c o m m e r c i a l i z a t i o n o f th i s sc i e n ti f ic a c h i e v e m e n t s t a r te d a l m o s t i m m e d i a t e l y . T h e s e

c o m m e r c i a l i z a t i o n e f fo r t s w e r e b a s e d p r i m a r i l y o n t h e u s e o f p r o k a r y o t i c o r g a n i s m s ,

w i t h o n e e x a m p l e b e in g h u m a n i n su l in , t h e fi rs t p r o d u c t b a s e d o n r e c o m b i n a n t D N A

t e c h n o l o g y a n d m a n u f a c t u r e d b y E l i L il ly . T h e r e a r e m a n y o t h e r p r o d u c t s w h i c h h a v e

b e e n u n d e r d e v e l o p m e n t , w i th s o m e o f t h es e n o w b e g i n n i n g t o r e a c h t h e m a r k e t .

I t is in c r e a s in g l y c l e ar th a t m a n y c o m p l e x m o l e c u l e s o f c o m m e r c i a l i n t e re s t ( e .g . ,

g l y c o s y l a te d p r o te i n s ) c a n o n l y b e s y n t h e si z e d b y e u k a r y o t i c o r g a n i sm s s u c h a s m a m -

malian c e ll s. T h e r e a r e m a n y d i s a d v a n t a g e s to t h e u s e o f mammalian ce l ls . T hes e ce l ls

a r e s l o w i n g r o w t h , h a v e c o m p l e x n u t r i t i o n r e q u i r e m e n t s ( a s n o t e d e a r l ie r ), a r e e a s-

i ly c o n t a m i n a t e d , a r e m e c h a n i c a l l y f ra g i le , a n d p o s se s s c o m p l e x p h y s i o l o g i c a l a n d g e -

n e t ic c h a ra c t e ri s ti c s . H o w e v e r , i n a d d i ti o n , m a m m a l i a n c e ll s a r e v e r y t a l e n te d T h e y

h a v e a n a b i l it y t o d o t h e t y p e o f i n t r a c e ll u l a r p r o c e s s in g , e . g . , p o s t - t r a n s l a ti o n a l m o d -

i f i c a ti o n s , r e q u i r e d i n t h e p r o d u c t i o n o f c o m p l e x m o l e c u l e s .

T o e f f e c t i v e l y u s e s u c h c e ll s t o p r o d u c e u s e f u l p r o d u c t s , r e q u i r e s t h e c a r e f u l e n -

g i n e e r i n g d e s ig n o f t h e m a n u f a c t u r i n g s y s t em . T h i s is p a r t i c u l a r l y t r u e i f o n e m o v e s

f r o m b a t c h p r o c e s si n g u si n g a f e r m e n t o r to a c o n t i n u o u s f l o w p r o c e s s i n g sy s te m . I n

g e n e r a l , s u c h a s y s t e m c a n b e d i v i d e d i n t o t w o p a r t s , o n e a s s o c i a te d w i t h t h e u p s t r e a m

p r o c e s s in g , a n d t h e o t h e r w i t h th e d o w n s t r e a m p r o c e s si n g . T h e u p s t r e a m p a r t o f th e

p r o c e s s i n v o l v e s th e l a r g e - s c a le c u l t u r e o f c el ls w h i c h h a v e b e e n g e n e t i c a l l y m o d i f i e d

s o a s to b e a s t a b l e , h i g h p r o d u c e r o f t h e p r o d u c t o f in t e r e s t. T h i s c e ll c u l t u r e p a r t

T A B L E 1 . A t t h e U C L A S y m p o s i u m o n T is s u e E n g i n e e r i n g h e ld

a t K e y s t o n e C o l o r a d o in A p r il 1 9 9 0 , t h e f o l l o w i n g l i s t o f

r e s ea r c h a r e a s w a s r e c o m m e n d e d t o th e N a t i o n a l

S c i e n c e F o u n d a t i o n a s g e n e r ic t e c h n o l o g i e s

in n e e d o f f u r t h e r d e v e l o p m e n t .

G e n e r i c A r e a s f o r T e c h n o l o g y D e v e l o p m e n t

9 C e l l G r o w t h i n T h r e e D i m e n s i o n s

9 P o l y m e r i c S y s t e m s f o r D e l i v e r i n g B i o l o g i c s

9 C u l t i v a t i n g R e c a l c i tr a n t C e l ls

9 E x p r e s s i o n o f P r o t e in s i n I m p l a n t e d C e l l s / O r g a n o i d s

9 V e h i c l e s f o r C e l l I n t r o d u c t i o n

9 A n t i g e n s / M C A b s

9 B i o s e n s o r s


13/17

Cellular Engineering 54

o f t h e p r o c e s s t a k e s p l ac e in a b i o r e a c t o r w h i c h h a s b e e n d e s i g n e d b y ta k i n g i n t o a c -

c o u n t t h e c h a ra c t e ri s ti c s o f m a m m a l i a n c e lls (n o t e d i n th e p r e v i o u s p a r a g r a p h ) . T h e

p r o d u c t o f th i s b i o r e a c t o r is t h e n h a r v e s t e d , a n d t h is m i x t u r e m o v e s i n t o th e d o w n -

s t r e a m p a r t o f t h e p r o c e s s . H e r e r e s i d u a l c el ls a re r e m o v e d , a n d t h e p r o d u c t is p u r i -

f ie d th r o u g h a se r ie s o f s t ep s in v o l v i n g c o n c e n t r a t i o n , s e p a r a t i o n , a n d u l t i m a t e l y

u l t r a - p u r i f i c a t i o n .

A l t h o u g h t h e d o w n s t r e a m p r o c e s si n g a c c o u n t s f o r a b o u t 8 0 o f t h e c o s t o f p r o -

d u c i n g a b i o c h e m i c a l m e d i c a l p r o d u c t , e . g ., a p r o t e i n o r a n a n t i b o d y , o u r f o c u s h e r e

is o n t h e u p s t r e a m p r o c e s s i n g , i .e . , t h e c el l c u l t u r e p a r t o f t h e p r o c e s s . W h e t h e r o n e

i s c u l t u r i n g c e l l s f o r b a s i c r e s e a r c h i n a l a b o r a t o r y , f o r a t i s s u e - e n g i n e e r e d b i o l o g i c a l

s u b s ti tu t e , o r f o r t h e p u r p o s e o f m a n u f a c t u r i n g a p r o t e i n u s in g r e c o m b i n a n t D N A

t e c h n o l o g y , t h e i n t e ll e c tu a l i s su e s in m a n y w a y s a r e t h e s a m e , w i th o n e o f t h e se b e -

i n g c el l g r o w t h . I n s p i te o f a c o m m o n a l i t y o f i s s u es , h o w e v e r , t h e r e i s a m a j o r d i f -

f e r e n c e i n g r o w i n g c e l l s i n a r e s e a r c h l a b o r a t o r y u s i n g t i s s u e c u l t u r e d i s h e s , o r e v e n

a r o l l e r b o t t l e , a s c o m p a r e d t o a l a r g e - s c a l e b i o r e a c t o r ( 5 , 1 8 ) . I n th e l a t t e r c a s e , i m -

p o r t a n t i s s ue s in c l u d e s t e ri li ty o f o p e r a t i o n a n d e a s y c l e a n in g , a p r e d i c t a b l e h y d r o -

d y n a m i c e n v i r o n m e n t w h i c h as a m i n i m u m w i ll n o t d a m a g e t h e c el ls , a n d r e l i a b le

c o n t r o l b a s e d o n o n - l i n e s a m p l i n g . I n p r in c i p l e , th e c o n t i n u o u s p e r f u s i o n o f a b i o -

r e a c t o r a l lo w s m a m m a l i a n c ei ls to g r o w t o d e n s it ie s 1 0 t im e s h i g h e r t h a n t h a t a t t a i n -

a b l e in a b a t c h f e r m e n t o r . T h i s h i g h e r d e n s i t y is d u e t o t h e f a c t t h a t t h e r e i s a

c o n t i n u o u s s u p p l y o f n u t r i e n t s t o t h e c e l l s . A s s o c i a t e d w i t h a h i g h e r d e n s i t y i s a

p r o p o r t i o n a t e i n c r ea s e i n p r o d u c t a n d a r e d u c t i o n i n th e n e e d f o r s e r u m . W h e n c el ls

g r o w c l o se r t o g e t h e r , l e ss s e r u m is r e q u i r e d . O f c o u r s e , t h e r e d u c t i o n o f s e r u m n e e d

t r a n s l a t e s i n t o l o w e r o p e r a t i n g a n d p u r i f i c a t i o n c o s t s . H o w e v e r , a m a j o r t e c h n i c a l

p r o b l e m w i t h b i o r e a c t o r s is t h a t t h e y a r e n o t n e c e s s a r i l y re a d i l y s ca l e a b le . T h u s , a

c o n t i n u i n g c h a l l en g e i n b i o p r o c e s s e n g i n e e r i n g i s i n th e i s su e o f s c a l e - u p , i . e. , H o w

c a n o n e s c al e a b i o r e a c t o r f r o m a b e n c h - t o p r e s e a r c h s y s t e m to t h e s iz e n e c e s s a r y f o r

t h e l a r g e sc a le , h i g h d e n s i t y g r o w t h o f c el ls , a n d f o r t h e c r e a t i o n o f a c o s t - e f f e c t i v e

p r o d u c t i o n o f a p r o t e i n w h i c h c a n b e c o m m e r c i a l ly m a r k e t e d ? I n s u ch a l a rg e - sc a le

s y s te m , o n e m u s t e n s u r e t h e s u p p l y o f n u t r i en t s a n d t h e r e m o v a l o f w a s t e p r o d u c t s ,

w h i l e a v o i d i n g d a m a g e t o t h e c e l l s .

J u s t a s m a m m a l i a n c ells in t h e h u m a n b o d y a r e i n f l u en c e d b y t h e m e c h a n i c a l s tr e ss

c o m p o n e n t o f t h e e n v i r o n m e n t in w h i c h t h e y r es id e , m a m m a l i a n c el ls i n a b i o r e a c -

t o r a r e s im i l a r ly in f l u e n c e d ( 1 0 ,1 3 ) . W h e t h e r i t is a n c h o r a g e - d e p e n d e n t c el ls g r o w n

o n m i c r o c a r r i e r b e a d s o r c ell s g r o w n i n s u s p e n s i o n , c ell s g r o w n i n a c o n t i n u o u s f l o w

b i o r e a c t o r s y s t e m r e si d e i n a h y d r o d y n a m i c e n v i r o n m e n t w h i c h c a n i n f lu e n c e t h e ir

s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . H o w e v e r , h y d r o d y n a m i c e f f ec t s o n c e ll s g r o w n i n a b i o r e a c -

t o r w il l n o t n e c e s s a r il y b e t h e s a m e a s t h o s e o b s e r v e d

in vivo

i n t h e v a s c u l a r s y s t e m

o r i n r e l a t e d c e l l c u l t u r e s t u d i e s . I n v a s c u l a r b i o l o g y r e s e a r c h o n e i s i n t e r e s t e d i n t h e

i n f l u e n c e o f a l a m i n a r f l o w o n e n d o t h e l i a l c e ll f u n c t i o n , a c el l t y p e w h i c h in vivo

e x p e r i e n c e s a f l o w e n v i r o n m e n t . B y c o n t r a s t , i n a b i o r e a c t o r t h e f l o w is g e n e r a l l y t u r -

b u l e n t , a n d t h e c e ll t y p e s a r e t h o s e w h i c h d o n o t n a t u r a l l y r e s i d e in a f l o w e n v i r o n -

m e n t . T h e f e w st u d ie s o n t u r b u l e n t f l o w w h i c h h a v e b e e n c o n d u c t e d s u g g e s t t h a t t h e

i n f lu e n c e o f t u r b u l e n c e i s f a r d i ff e r e n t f r o m t h a t o f a l a m i n a r f l o w ( 1 5) . F u r t h e r m o r e ,

t h e r e a r e o n l y a l im i t e d n u m b e r o f s t u d ie s o n t h e i n f lu e n c e o f a w e l l -d e f i n e d f l o w o n

t h e t y p e s o f m a m m a l i a n c e lls w h i c h a r e o f m o r e i n t er e s t to t h e b i o t e c h n o l o g y i n d u s -

t ry . H o w e v e r , t he s e sh o w t h a t a l t h o u g h t h e r e m a y b e a n in f lu e n c e o f h y d r o d y n a m i c

e n v i r o n m e n t o n t h e s e c el l t y p e s , i t w i ll n o t n e c e s s a r i ly b e t h e s a m e a s t h a t e v i d e n c e d


14/17

542 R M Nerem

i n t h e r e s p o n s e o f a n e n d o t h e l i a l c e ll t o f l o w 4 1 ). P r o v i d i n g a b i o r e a c t o r , w i t h a h y -

d r o d y n a m i c e n v i r o n m e n t w h i c h w i ll n o t d a m a g e t h e c e ll s, is n o t t h e o n l y is su e t o a d -

d r e ss . A n i m p o r t a n t e n g i n e e r i n g is su e m u s t b e t o d e si g n t h e h y d r o d y n a m i c

c h a r a c t e r i st i c s o f t h e b i o r e a c t o r s o a s t o o p t i m i z e p r o d u c t s y n t h es i s a n d s e c r e t i o n .

I t s h o u l d b e n o t e d t h a t i t i s p r i m a r i l y th e c h e m i c a l e n g i n e e r w h o h a s b e c o m e i n-

v o l v e d i n t h e s e i ss u e s, a n d i n s o m e c a s e s t h e t e r m b i o c h e m i c a l e n g i n e e r i n g i s u s e d i n

p l a c e o f b i o p r o c e s s e n g i n e e r in g . H o w e v e r , i t is e q u a l ly i m p o r t a n t t o r e c o g n i z e t h a t

t h e d i s c i pl in e s r e q u i r e d i n b i o p r o c e s s e n g i n e e r i n g g o b e y o n d t h o s e n o r m a l l y a s s oc i-

a t e d w i t h c h e m i c a l e n g in e e r in g , a n d h e r e t h e b r o a d e r t e r m , i .e . , b i o p r o c e s s e n g in e e r -

i n g , is u s e d . A s a n e x a m p l e , t h e m e c h a n i c a l e n g i n e e r , in a d d i t i o n t o a k n o w l e d g e o f

f lu i d d y n a m i c s a n d t h e m e a s u r e m e n t o f f lo w , h a s a c o n t r i b u t i o n t o m a k e i n m a n y

o t h e r a r e a s , e . g . , t h e d e s i g n o f p r e s s u r e ve s se l s, p u m p i n g m a c h i n e r y , s e a ls , a n d a s e p -

t i c t e c h n o l o g i e s 1 6 ) .

F i n a l l y , i t h o p e f u l l y is o b v i o u s t h a t t h e i n t e r e st i n m a m m a l i a n c e ll s is s h a r e d b y t h e

b i o m e d i c a l e n g i n e e r a n d t h e b i o p r o c e s s e n g i n e e r a n d t h a t t h e r e a r e i n t e ll e c t u a l i ss u e s

w h i c h a r e c o m m o n t o t h e s e t w o a r e a s o f e n g i n e e r i n g a c ti v i ty , p r e v i o u s l y v i e w e d as

s e p a r a t e . A s i l l u s t ra t e d i n F i g. 3 , t h e r e h a s b e e n a c o m i n g t o g e t h e r o f t h e s e t w o f i e ld s

i n t h e l a s t f iv e y ea r s . B o t h t h e b i o m ed i ca l en g i n ee r w h o i s w o r k i n g a t t h e c e l l u la r lev e l

i o m e d i c a l

E n g i n e e r i n g

i o p r o c e s s

E n g i n e e r i n g

Organ

physiology

Tissue

behavior

icrobial

organisms

ammalian

cell biolog y

C e llu la r n g i n e e r in g

FIGURE 3 A s b i o m e d i c a l e n g i n e e r i n g h a s m o v e d t o i n c l u d e a f o c u s o n c e l l u l a r a n d s u b - c e l l u l a r p h e -

n o m e n a a n d a s b i o p r o c e s s e n g i n e e r in g h a s m o v e d f r o m m i c r o b i a l o r g a n i s m s t o a n i n t e re s t in m a m -

m a l i a n c e ll s t h e r e h a s b e e n a b ri d g i n g o f t h e s e t w o f i e l d s p r e v i o u s l y v i e w e d a s s e p a r a t e .


15/17

Cellular Engineering 54

a n d t h e b i o p r o c e s s e n g i n e e r w h o is w o r k i n g i n t h e t ~ io t e c h n o lo g y i n d u s t r y a r e i n f a c t

c e l l u l a r e n g i n e e r s , i . e . , t h e y a r e e n g i n e e r s a p p l y i n g t h e p r i n c i p l e s a n d m e t h o d s o f e n -

g i n e e r in g t o p r o b l e m s a r i s in g o u t o f c e ll a n d m o l e c u l a r b i o l o g y .

C O N C L U D I N G D I S C U S S I O N

T h e p r e c e d i n g d i s c u ss i o n h a s b r i e f l y d e s c r i b e d t h e e m e r g e n c e o f c e l lu l a r e n g in e e r -

i n g . T h i s f ie l d is i n t h e p r o c e s s o f r a p i d l y g r o w i n g , a n d m u c h o f i t h a s b e n e f i t e d f r o m

r e c e n t d e v e l o p m e n t s in c e ll c u l t u r e t e c h n o l o g y . C e l l u l a r e n g i n e e r i n g in c l u d e s b o t h b a -

s ic r e s e a r c h a n d m o r e a p p l i e d e f f o r t s w h i c h a r e i n t h e p r o c e s s o f l ea d i n g t o c o m m e r -

c ia l p r o d u c t s . I n r e g a r d t o b a s ic r e s e a r c h , v a s c u l a r b i o l o g y is o b v i o u s l y o n l y o n e o f

m a n y a r e a s w h e r e t h e r e is a n i n v o l v e m e n t o f e n g i n e e r s in c e ll b i o l o g y . A t t h e o t h e r

e n d o f t h e s p e c t r u m , a l t h o u g h t i ss u e e n g i n e e r i n g a n d b i o p r o c e s s e n g i n e e r in g r e p r e -

s e n t p r i m a r y a r e a s f o r t h e a p p l i c a t i o n o f c e l lu l a r e n g i n e e r i n g , t h e r e a r e o t h e r a r e a s

as wel l .

O n e o f t h es e ar is es f r o m t h e h u m a n g e n o m e p r o j e c t . A m a j o r t h r u s t o f m o l e c u -

l a r b i o lo g i s t s w i ll i n v o l v e m a p p i n g t h e 1 0 0 , 0 0 0 g e n e s w h i c h c o m p r i s e t h e 2 3 p a i rs o f

c h r o m o s o m e s t h a t a r e th e h u m a n g e n o m e . I n a h u m a n c el l t h e r e a re 3 b il li o n n u c le -

o t i d e s w h i c h w i l l n e e d t o b e s e q u e n c e d . A p r i m a r y c h a l l e n g e f a c i n g t h e h u m a n g e -

n o m e p r o j e c t is o n e o f e n g i n e e r i n g t h o s e a n a l y t i c a l d e v i ce s n e c e s s a r y t o d o t h e

m a p p i n g a n d s e q u e n c i n g o f g e n e t ic m a t e r i a l o n a m a s s i v e sc a le .

A n o t h e r e x a m p l e is t h a t o f b i o s e n s o r s, a t o p i c w h i c h o v e r th e l a st d e c a d e h a s a t -

t r a c t e d n o t o n l y a c a d e m i c , b u t a l s o in d u s t r i a l in t e r e st . A l t h o u g h s i m p l e c h e m i c a ls c a n

b e r e c o g n i z e d r e la t iv e l y e a s il y w i t h e l e c t r o c h e m i c a l o r o p t i c a l m e t h o d s , m o r e c o m p l e x

s p ec i e s r eq u i r e a d i f f e r en t ap p r o ach . O n e p o s s i b i l i t y i s t o u s e b i o l o g i ca l s y s t em s w h i ch

h a v e h i g h l y sp e c i fi c m e c h a n i s m s f o r t h e r e c o g n i t i o n o f v e r y c o m p l e x b i o c h e m i c a l s p e-

c ie s . T h i s c a n b e a c h i e v e d w i t h e n z y m e s o r a n t i b o d i e s , i n v o l v e t h e u t i l iz a t i o n o f w h o l e

c e ll s o r c e l l f r a g m e n t s , a n d w i ll le a d t o b i o s e n s o r s w h i c h a r e t r u l y b i o l o g i c a l . T h e t o p i c

o f b i o s e n s o r s w a s i n f a c t i d e n t if i e d a t t h e 1 99 0 K e y s t o n e , C o l o r a d o t is s u e e n g i n e e r-

i n g w o r k s h o p a s a g e n e ri c t e c h n o l o g y r e q u ir i n g f u r t h e r d e v e l o p m e n t T a b l e 1 ). H o w -

e v e r , b i o s e n s o r s h a v e a m u c h b r o a d e r a p p l i c a t i o n t h a n j u s t t i s s u e e n g i n e e r i n g .

F i n a ll y , a n o t h e r q u e s t i o n i s, W h a t t y p e o f t r a i n in g i s r e q u i r e d t o w o r k i n th e a r e a

o f c e l l u la r e n g in e e r i n g ? W h a t e v e r t h e a p p l i c a t i o n , b e i t in b a

Documents

Cellular Enginering