Cellule enterocromaffini e cellule basigranulose acidofile nei Vertebrati

(Istituto eli Anatomia e Fisiologia comparafe della R. Universifs di Pavia [Direttore Prof. ]~DOARDO Z~YATTARI].)

CELLULE ENTEROCROMAFFINI E CELLULE BASIGRANULOSE ACIDOFILE N E I VERTEBRATI.

(RICERCttE ISTOCHIMICHE.)

I )o t t . MAI~FO VIALLI e ViTTORIO ]~RSPAMER.

Con 12 figure nel testo.

(Eingegangen am 27. Juli 1933.)

La natura chimica delle granulazioni che si osservano nell'interno delle eellule enteroeromaffini 1 era stata gi~ presuntivamente, in base a considerazioni varie, the per5 non potevano avcre vatore assoluto, ritenuta come legata alla presenza di funzioni fenoliche libere. La dimostrazione precisa di questa constatazione fu data da Com)I~l~ e LISON ehe riuscirono a ottenere su queste celtul e istoehimicamente la diazoreazione. L'applicazione della diazoreaZione alia istochimica era del resto stata introdotta gi~ per i tessuti vegetali da RAcrBo~sX~ nel 1906.

LIso~ in un lavoro complessivo sui fenoli ha dato poi un ampio sviluppo alla comparazione tra i risultati istoeMmici della diazoreazione e fl significato della reazione cromaffine ed argentaffine, amplikndo precedenti considerazioni di Verne sulla natura chimiea del secreto delle ghiandole salivari posteriori di Octopus. Le ricerche di LISON, the hanno un significato de1 tutto generale riguardano sol0 in parte le cellule enterocromaffini e sono state condotte solamente sui Mammiferi.

Successivamente la diazoreazione e parallelamente la reazione cromaffine e argentica furono utilizzate da G L ~ nello studio delle enterocromaffini di Mammiferi, di Uccelli e di Ramarro. I risultati di queste prime ricerche di C r ~ hanno dimostrato come fosse necessaxia una messa a punto dello studio delle enteroeromaffini nei Vertebrati inferiori pr0vando contemporaneamente la re~zione eromaffine e argentaffine in guisa da peter est~ndere in modo comparativo a tutti i Vertebrati

1 E' stafa anche recentemente da CLARA sotlevata una questionc di nomenelatura a proposito di queste cellule. Noi eontinuiamo ad usare, come sempre stato fatto in questo Istituto, il home di cellule enterocromaffini e daremo di questo alla fine una giustifieazione in base ai risults dclle nostre osservaziohi.

Z. f. Zellforschung u. mikr. Anatomie. Bd. 19. 49

744 Maffo ViaUi e Vitf~rio Erspamer:

le cognizioni chimiche acquisite per i Mammiferi e i Sauropsidi, e quindi da rendere altresi possibile fl tracoiare un quadro istochimico del problema di ampiezza corrispondente a quello morfologico, quale si era venuto delineando anehe in base a studi compiuti nel nostro Is t i tuto da uno di noi (VIALLI), da CITTE~IO e da DE ~ L ~ r I .

Mentre le presenti ricercho erano in corse, C L ~ A ha portato un ulteriore contribute alla eonoscenza della diazoreazione nolle enterocromaffini dei Vertebrati studiandola in Salamandra mac, ulosa quale rappresentante degli Anfibi.

I1 quadro istoohimico comparative, cho in base a ques~e ultime ricerche sulla salamandra CLARA ha creduto di schizzare e the b poi anche quello manSenuto nolla sua recen$issima monografia, dimostrerebbe, riattaccandosi in parte a osservazioni di uno di noi (Vlxra~I) e di DE ~ r z r r i su una minore cromizzazione delle cellule nei Vertebrati inferiori, che in questi ultimi si manifesta una graduale diminuzione nella intensit~ della diazoreazione e di alcune altre reazioni, diminuzione the, per quanto riguard~ la diazo, porterebbe nei Rettili ad un diverse colore dei granuli e per gli Anfibi ad una totale scomparsa della reazione stessa.

Nell' insieme di ques$i studi non erano eonsiderati i Pesci che, come risulta da ricerche di alcuni autori e soprattutto da quelle sistematiehe di DE ~ L ~ P I , presentano riguardo alle cellule enteroeromaffini carat- teristiohe del tu t to particolari e perei6 a questo gruppo si crane in particolar mode rivolte le nostre indagini mentre in complesso minore attenzione avevamo creduto di porre nolle studio degli Anfibi e Rettili giaeeh6 fin dalle nostre prime ricerehe ci era apparso, the anohe negli Anfibi si avessero condizioni corrispondenti a quelle dei Vert~brati superiori. Poich6 le recenti ricerche di CLARA SU Salamandra mav~dosa non corrispondevano a quanto noi avevamo ritenuto di peter affermare, eosi abbiamo oompiuto ulteriori studl in proposito, che oi hanno portato a oonfermare le nostre primitive deduzioni.

I1 quadro anatomo comparative per quanto riguarda la preser~a di cellule enteroeromaffini nei Vertebrati 6 state, come abbiamo pre- cedentemente detto notevolmente ampliato, in base a studi fatti nel nosfro Isti tuto, e da essi o da ricerche anche di qualche altro autore risulta ehe le cellule enterocromaffini sono presenti nei Mammiferi, negli Ucoelli, nei Rettili e negli Anfibi. Nei Pesci la lore dimostrazione

riuscita a DE Frr,IPpI solo nei Selaci, in cui gi~ anohe ricerche precedenti di CO~DIE~ avevano dimostrato la presenza di cellule argenf~affini, limita- tamente perb a stadi embrionali.

A1 quadro tracoiato da DE FIL~pI si sono aggiunti in questi ultimi anni due ulteriori con~ributi. La RoGosr~x studiando l'epitelio dello s tomate di Aciloenser ruthenus, ha dimostrato colla reazione argentaffine la presenza di tipiohe cellule enterocromaffini, e CITTE~IO con la cromoreazione ha messo in evidenza questi stessi elementi nell'intestino di

Cellule enterocromaffini e cellule basigranu]oso, acidofile nei Vertebrati. 745

Chimaera monstrosa. I1 quadro di DE FILIPPI verrebbe quindi ad esser modificato nel sense che, almeno finora, gli unici gruppi in cui non stat~ dimostrata la presenza di enterocromaffini in sense stretto, cio~ di cellule eapaci di colorarsi in giallo pih o meno intense con liquidi contenenti sali di creme, sarebbero i Ciclostomi e i Teleostei. Nulla per era si sa di precise riguardo ai Dipnoi e qualsiaSi ricerca anche puramente morfologica avrebbe, come si vede da quanto sopra abbiamo detto, un notevole e importante significato. Le ricerehe ad esito negative di CO~DIER in Protopterus non hanno valore, poich6 CORDIEB non ha trovato neppure cromaffini nei l~ettili e negli Anfibi.

l~Iei Teleostei, in base alle osservazioni di KtrLL, sappiamo ehe esistono eellule, che non S'i colorano dope tratCamento con sali di creme, ma ehe contengono granuli di natura acidofila che si possono porre bene in

evidenza col metodo di ALT~-~N-KuLL. La natura delle granulazioni contenute in queste cellule ~ per5 oscura; esse furono dal K ~ considerate come del tu~to simili alle ce]/ule aeidofile ehe si osserv~no nella parte terminale dell'intestine del gatto; il che perb non ~ affatto dime- strafe.

Con il problema della natura istochimica della cellula enteroeromaffine, si riallaccia, sebbene alquanto indirettamente, quello del diverse significato che deve essere assegnato ai vari tipi di reazione argentica.

CO~DIE~ e LISO~ e, specialmente Hx~Pm~L in un sue recentissimo lavoro, hanno molto insistito sulla necessit~ di considerare due tipi di reazione argent/ca e in base alia posi~ivit~ per l'uno o per l 'altro ripe di reazione, distinguono elementi argentofili e elementi argentaffini. I1 termine argentaffine si applica alle formazioni capaci di ridurre direttamente la soluzione argento ammoniacale senza bisogno di una sostanza riduttrice; argentofili in~rece sono gli elementi che solo si possono met~ere in evidenza trattandole, oltre che colla immersione nella soluzione d'argento ammoniacale, anche con una sostanza ridueente. I1 significato chimico delle due reazioni ~ ben diverse, e naturalmente i ]imiti del l'argengaffinit~ sono assai pifi ristretti di quelli della argentofilia; e mentre per quest'ultima non si pus parlare di una specifica elettivit~ isto- ehimiea, per la reazione argentaffine tale spiccata elettivit~ appare ne~tamente dimostrata dalle gi~ ricordate rieerehe di LrsoN. A noi t~rso ehe fosse utile saggiare in diverse eondizioni anche i/significato che nei riguardi delle eeilule intestinali pu 5 avere la argentofilia.

Oltre che delle cellule enteroeromaffini vere e proprie noi in questo lavoro ci siamo anche oecupati della discussa questione delle eellule aeidofile.

Questione quest~ delle cellule acidofile dei Vertebrati superiori gi~ di per s~ assai complessa, ma ehe diviene ancor pifi intricata in conse- guenza del fatto che i vari Autori con la denominazione di cellula acidofila indicano elementi assai diversi. ILl pifi ample contribute alia risoluzione

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746 ]!~ffo Vialli e Vittorio Erspamer:

di questo problema ~ quello portato da T~,~VEa, con il quale in complesso, come diremo in segnito, possiamo in gran parte coneordare.

Anche C~ARA ha espresse alcune considerazioni nei riguardi della diazoreazione per le celiule acidofile, noi crediamo nulla di meno che quanto ~ state gi~ scritto non sia ancora bastevole e c h e l a questione meriti di essere t ra t ta ta in maniera pi~t completa.

Poich6 le presenti ricerche hanno soprattutto, come abbiamo accen- hate fin da principio, lo scope di es~endere le conoscenze istoehimiche sulle enterocromaffini, cosl noi tralasciamo quasi completamentc i da~i puramente morfologiei che nell~ recentissima monografia di - C ~ si trovano riassunti in maniera esauriente.

Nel corse di queste nostre ricerche, c~. siamo ripetutamente valsi per varie questioni chimiche del prezioso consiglio del Prof. Q u ~ N o M_~r delI'Istituto di Chimiea Farmaceutic~ della R. Universit~ di Pavia, ~ lni vadano qui i nostri ringrazi~menti pifi vivi.

Tecnica. Tra i numerosi metodi ehe ormai sono noti per lo studio delie cellule

enterocromaffini, noi abbiamo, date lo scope delle nostre ricerche, scelto solo quelli che hanno un valore istochimico ben netto e definite, sopratutto riport~ndoci ai lavori di CORDI~ e LIso~ e di LIso~, che bene hanno posto in ehiaro il significato che spetta Mle ~re reazioni principali: cromaffinitk, argentaffinit~ e diazoreazione.

Altre tecniche sussidiarie si offrono allo studioso per controllare e eonfermare il significato delle reazioni sopraccennate, ma, come hanno dimostrato LISON e C ~ A , che queste re~zioni hanno applicato, si t ra t ta di metodi che non possono come gli altri essere adottati abitualmen~e e a d essi deve quindi essere riserbato pinttosto il compile di convalidare i risultati ottenuti dalle reazioni principali. Intendiamo aliudere alla indacoreazione, alia reazione con il cloruro ferrico indicate dM LIsoN, alia reazione di Quas~el con acido acetico e molibdato di ammonio applicata da CLoacA alia istologia, e anche alia tecnica di eolorazione con ema~oss'flina molibdica, cni CLoacA, d~ un significato istochimico di reazione eotorante speeifica.

E' evidence, secondo noi, che la positivit~ delle tre reazioni principali basra a eaxatterizzaxe nettamente fl significato chirnico delle granulazioni. Questo essenzialmente perch6 helle cellule enterocromaffini, gik anche nei Mammiferi in eni pi~t facile ~ lo studio delie granulazioni, le reazioni secondarie danno risultati spesso assai dubbi, sia p~reh6 si ottengono colorazioni assai poco spiccate rispetto al colore di rondo, sia perch6, come nel case della indacoreazione, essa appare molto difficile a4 ottenersi e legata probabflmente ad un complesso di condizioni ehe non sono aneora ben definite, e quindi a maggior ragione tali diffieolt~ sarebbero eerto riuscito molto pifi gravi nello studio delle enterocromaffini dei

Cellule enterocromaffini e cellule basigranulose acidoffle nei Vertebrati. 747

Vertebrati inferiori gi~ difficile con ]e teeniehe pi~ eomuni s i a per la scarsR~ nttmerica con eui in molti casi ques~e cellule si presentano, sia per lo scarsissimo numero di granulazioni fenoliche ehe in molti casi contengono.

Per quanto riguarda i dettagli tecniei delle tre reazioni principali da noi adottate eercheremo di essere il pifi possibile brevi.

La reazione cromica ~u da noi sempre ottenuta valendoci del Iiquido di REGAUD poich6 ci ~ sembrato chela assenza completa di acidi dovesse dare a questa teenica una maggiore possibilit~ di fissazione delle sos~anze ossidabfli dal cromo. I1 t rat tamento con REGAUD ~ stato prolungato sempre almeno per sei-set~e giorni e la cromizzazione successiva ~ stata aneh'essa relativamente lunga, fino a circa dieci giorni. Oltre a eib, in aleuni casi particolari abbiam'o eseguito la postcromizzazione sulle sezioni. Come abbiamo accennato, per lo studio delle reazioni argentiche abbiamo voluto provare oltre ai metodi per le cellule argentaffini, anche quelli per le cellule argentofile. Poiehd helle ricerehe comparative ha grande importanza una eerta uniformit~ di tecnica, dopo numerose prove con i vari metodi, abbiamo seelto i due che pi~l ci sono sembrati adatt i allo scopo e precisamente: il me~odo MASSO~-HAMP~RL per la argen~affinits e quello di GRos-Se~VLTZE per l'argentofflia, metodi entrambi che abbiamo applicato seguendo le modalit~ tecniehe indicate con molta precisione da HAMP~L (1932). Per la MASSO~-HAM~E~L abbiamo sempre usato come fissativo la formalina al 10%, preferendola al liquido di B o v ~ , poieh6 ei ~ sembrato ehela notevole acidi~ di questo fissativo potesse in qualche modo nuocere alla completa conservazione delle granu|azioni delle enteroeromaffini. D'altra parte gi~ C ~ ha fatto osservare che il t ra t tamento con BowN non ~ il pifi adatto, e attri- buisce in parte a tale fissazione gli insuceessi di CO~DIE~ (1926) negli Anfibi.

Noi non abbiamo di norma proceduto al viraggio alForo, perch~ i preparati col semplice argento permettono di mettere in evidenza anche una minima quantit~ di sostanze argentaffini, ehe col suceessivo viraggio non possono apparire seeondo noi cosl nettamente identfficabili.

Per quanto riguarda la GRos-ScHvLTZE abbiamo provato anche a variare le coneentrazioni, ma non abbiamo ottenuto par~icolari vantaggi rispetto alla tecnica originale. Un tentativo di applieare questo metodo allo studio di materiale ineluso in pamffina, sia su fette libere sia gi~ applicate sui vetrini, metodo gi~ tentato con sueeesso da Scm~cx, ei ha dato risultati ~roppo incostanti per permettere di trarre sicure conclusioni. In ~lcuni casi abbiamo avuto figure molto belle ed evidentii ma in numerosi altri si sono formati abbondanti precipitati tall da rendere inservibili i preparati. Anche la impregnazione era del tu~to ineostante~ e spesso eompletamente nega~iva.

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I ~ diazoreazione quale fu introdotta nolla teenica istologica dal RACIBOI~SKI e da COI~DIEI~ O LISON eorrisponde alla reazione per la sintesi dei coloranti azoiei da un sale di diazonio e alla reaziono eolorante ehe vieno usata nella chimiea analitica per mettere in evidenza i eomposti di natura 'fenoli.ca. Poieh6 i sali di diazonio utilizzabili possono essere assai varl, i prodotti da eui si pub partire per ottenere quosto sale sono i pifi divorsi. LlSON ne ha usato un eerto numero e ha potuto vedere che. perb i pifi adat t i sono in eomplesso poehi e fra tut t i i migliori risult~ti dovrebbero dare la dianisidina e l'acido dianisidinsolfonico perch6 da essi si ottongono, a paritg di natura del fenolo, eomposti coloranti pifi seuri e minor eolorazione di rondo. L'uso di tall reatt ivi ha soprattut to importanza notevole per mettere in evidenza i propigmenti.

I~lello studio delle entoroeromaffini gih i toni di eolore che s'ottengono con i sali di diazonio meno eomplossi e pifi maneggevoli danno risultati soddisfaeonti. Noi abbiamo impiegato essenzialmente la benzidina usandone quantitativi tali d~ ottenere sia il diazo sia fl bisdiazo.

Abbiamo inoltre impiegato anehe la paranitroanilina perch6 il sale di diazonio che da essa s'ottiene eorrisponde al preparato eommereialo eho passa sotto fl nomo di Nitrazol C. F. Per Io studio dello eellule acidofile ei ~ in Meuni casi sembrato utile l 'uso di toluidina. Le modalitg tecniche.per ottonere i varii sali di diazonio sono assai semplici e vongono esaurien*emento doscritte nei lavori di LlSON 0931) e di CLARA ai quali rimandiamo.

I_~ reazione ha lo svantaggio the i reatt ivi non si mantengono anohe in soluzione ehe al di sotto di 5 gradi e pure in quoste condizioni quando siano alealinizzati, durano pochissimo. Ad owia re a questo inconveniento sono stati studiati 6ei sali di diazonio resi pifi stabili ed ossi furono intro- dotti nella teeniea istologica da CLAI~A. Si t ra t t~ di duo prodott i : il Nitrosaminroth in pasta e il Nitrazol C. F. in polvore, proparati messi in eommercio d~lla dit ta HOLLBOI~I~. Noi abbiamo utilizzato tanto l ' tmo quanto l 'altro dei due reattivi. I1 Nitrosaminroth ~ oerto un prodotto molto meno stabile ed infatti in a]cuni easi esso ci si ~ alterato, inoltre anche fresco non ci ha date risultati cosl brillanti come il Nitrazol C. F. Quosto prodotto da in eomplesso buone oolorazioni pureh6 sciolto al memento; perb se si paragonano i risultati ottenuti con questo preparato a quelli the si ottengono con la benzidina, si rode ehe essi, speeialmente per ricerohe un pb fini, sono notevolmonte inferiori.

Abbiamo notate un certo vantaggio nolle manipolazioni teeniche sorvendoci di una soluzione del sale di diazonio lievemente aoida aggiunt~ con pipet ta al memento della colorazione su vetrini tonuti previamento per almeno qualehe minute in soluzione alealina di idrato di potassio circa al 0,5 % rMfreddata anch'essa a mono di 5 gradi. Cosl si ha il vantaggio di avere per ogni vetrino una soluzione frosca ed estemporane~- monte prel~rat~. Speeialmente utflizzando la benzidina, ehe, come

Cellule enterocromaffini e cellule basigranulose acidoffle nei Ver~ebrati. 749

ha fatto osservare LIso~, colora facilmente anche il rondo, si hanno vantaggi ben evidenti da questi accorgimenti. LIsoN consiglia di utflizzare per la fissazione del materiale da sottoporsi alla diazoreazione la formalina M 10% o una miseela di formalina al 10% e acetate di piombo. Certo l'uso di una sostanza tampone ha notevole importanza nella conservazione dei fenoli in generale; in particolare per le enterocromaffini noi abbiamo prorate 1'use tanto di formalina al 10% quan~o de1 fissativo proposto da LIso~, ma non abbiamo riscontrato alcun particolare vantaggio da quest'ultimo, tantoch6 abbiamo fatto use corrente di una soluzione di formalina al 10 %, perch6 essa ci eonsentiva sugli stessi pezzi di eseguire rants) la diazoreazione quanto l'argenta~ione secondo M A S S O N - H ~ L .

Come colorazione di contrasto dope la diazoreazione noi abbiamo utflizzato il verde di metile, abbiamo pure ottenuto buoni risultati con una leggerissima colorazione con ematossflina CA~AzzL che laseia quasi completamente scolor~to fl eitoplasma.

Un l~rticolare di tecnica che, come avremo occasione di discutere in seguito, ei sembra assai importante, ~ quello relative alla inclusione. Noi abbiamo sempre fatto use dell'inclusione in paraffins, :mentre C ~ A si b servito invece di materiale incluso in eeltoidina.

Materiale. Da~o lo scope con cui abbiamo impestate queste aostre ricerche, ci

sembrato inutile estendere l'esame istochimico a un grande numero di specie per ciascuna el~sse di Vertebra~i, tanto pifi in considerazione del ratio che gi~ i primi nostri reperti si sono dimostrati eomplessivamente abbastanza uniformi.

Le specie da noi prese in esame sono le seguenti: Pesci. Ciclostomi : Petromyzon planeri (Ammocoaetes). Selaci : Scyllium

stellare, scyilium cardcula, Pristiuru.s melanostomus, Acanthias Blaiuvillei (embrione di 11 era). Oloce]ali: Chimaera monstrosa (larva di 16 cm). Ganoidi : A cipenser Naecarii. Teleostei : Scardinius eryt, hrophthalmus, Amiurus catus, Esox lucius, Trigla corax, Sargus annularis, Serranus scriba, Blennius gattorugine.

An]ibi. Triton cristatus, Rana esculenta. Rettil~. Chalcides ocellatus, Lacerta viridis, Tropidonotus natrix. Uccelli. Columba livia, Gallus domestlcus. Mammi]eri. Erinaeeus euroTaeus , Cavia cobaya, Canis /amiliaris,

Fells clomestica, Mus norvegicus (albino), Mus musculus (albino), Homo sapiens.

Pesei. La classe dei Pesci ~, come gi~ abbiamo aecennato, quella che nei

riguardi delle ricerehe comparative presenta earatteris~iche di notevole


interesse ed ~ anche la classe finora meno studiata sotto il punto di vista istochimico.

Nei vari gruppi che ad essa appartengono, comprendendovi anehe i Ciclostomi, .si osservano note assai diverse le une dalle altre per cui necessario prendere in considerazione separatamente ogni singolo gruppo.

Cidostomi. Pur avendo esaminato numerosi esemplari di Petromyzon ed osservato

attentamente varii tratti d'intestino non ci ~ rinscito in alcun modo con nessuna reazione di mettere in evidenza cellule enterocromaffini. Pure negativa ~ stata la ricerca di cellule acidofile col metodo di AT,T~A~- KVLL.

Pertanto anche queste nostre ulteriori investigazioni non fanno che convalidare i reperti negativi di DE FILIPPI.

La presenza di cellule argentaffini nei Selaci era stata segnalata da Cordier in un embrione di Spinax niger, mentre le rieerche in esemplari adulti di Seyllium, Rata e Mustelus avevano dato a questo autore esito negativo. Le osservazioni invece di DE FILre~I, fatte soprattutto con l'uso della reazione cromica, dimostrarono chiaramente che le cellule enteroeromaffini costituiscono un elemento costante ed anche abbastanza comune dell'epitelio intestinale dei Selaei, per6, DE FILIPPI non ha ottenuto col metodo di MASSON, risultati molto probativi. Anche TSR6 nel gattueeio accenna alla presenza di enteroeromaffini (Chemoregulator- zellen) senza perb indicarne alcuna particolarit~ istochimica. Per la �9 moffologia delle cellule, che come gi~ abbiamo aecennato non intendiamo considerare, rimandiamo alla dettagliata descrizione di D~ FILIPPI e alla monografia di CL~A.

In tutte le specie da noi esaminate abbiamo avuto risultato nettamente positivo con tugte e tre le reazioni usate. Gi~ DE F]~Pr i aveva fatto osservare che con la eromoreazione i granuli si colorano in giallo intenso con una tonalit~ del tutto eorrispondente a quclla che si riscontra nei Mammiferi, e noi pure possiamo confermare questa completa con- cordanza d'aspetto tra le cromaffini dei Selaci e quelle dei Mammiferi. Le reazioni argentiche sono positive tanto con la tecnica per la argentaffinit~, quanto con quella per la argentofilia.

I1 metodo di M~ssozc-H~r~RT, metre in evidenza cellule completamente eorrispondenti, per numero ed aspetto dei granuli, alle cromaffini. La reazione argentica awiene con tut ta facilit~ anche senza bisogno di prolungare a lungo il bagno nella soluzione di Fontana.

L'esame dei preparati ott~nuti con la GROS-SCHLrLTZE eomparativa- mente ai preparati con cromo e con la M_ASSoN-HAivIPERL dimostra ehe non esistono elementi argentofili extraepiteliali. Nell'epitelio appare impregnato un unico tipo cellulare e per quanto b dato vedere, in modo molto grossolano, da preparati che non possono avere uno stessso spessore,

CeUule e n t e r o e r o m a f f i n i e ce l lu ]e b a s i g r a n u l O s e a e i d o f f l e n e i V e r t e b r a t i . 7 5 1

ci pare che il numero degli elementi argentofili corrisponda eompletamente a quello degli elementi argentaffini. Anche i granuli argentofili corri- spondono abbastanza bene come numero a quel.li argentaffini, un pb diverse ne invece l'aspetto; poich6 essi appaiono un

Fig . l i Cellula en t e roe romaf f ine del l 'epi te l io duodena l e di Scyll ium stellare: I g r a n u l l (di u n i n t e n s a eoloraz ione gial lo b r u n a nel p re- parat~o) sono m o l t o f i t t i anehe neIIa porz ione s o p r a nue lea re del ia eellula. Fiss . ~EGAUD ;

p a r a f f i n a , ema tos s i l i na Carazz i . I n g r a n d i m e n t o : 1500 d i a m e t r i .

F ig . 2. Acanthias b~ainvillei. VaIvo la spi ra le . Cellula e n t e r o c r o m a f f i n e con n u m e r o s e g r anu l az ion i , l~iss, fo rmolo 10% ; p a r a f f i n a ; m e t o d o )/IASSON-HAMPFa~L. I n g r a n d i m e n t o :

1250 diame'~ri.

F ig . 3. Gellula en t e roe romaf f ine del l 'cpi te l io de l l ' i n tes t ine med io eli ScyUium stellare. 2~nehe in ques to elemenfio i g r a n u l i i n t e n - s e m e n , s ne r i o e c u p a n o t u t t o il c i t o p l a s m a . Sezione a l conge l a to r e ; m e t o d o GROS" SOHULTZE. I n g r a n d i m e n t o : 1200 d i a m e t r L

Fig . 4. Cellula e n t e r o c r o m a f f i n e del l 'epi te l io cluodenale di ~eyllium stellare. T u t t a l a eel- lu la 6 r i p i e n a di granu_lazioni rosso b r u n a @ r e ( r i p r o d o t t e in nero nel la f igure ) she laseiano a p p e n a l ibe ra u n a a r ea s o p r a n u e l e a r e eorri- s p o n d e n t e a l l ' i m m a g i n e n e g a t i v e de l l ' appa - r a t e r e , i so l a t e di GOLGI. Fiss. fo rmolo 10 % ; p a r a f f i n a ; reaz ione di: copu laz ione c o n fl sale di d iazonio del la benz id ina . I n g r a n d i m e n t o :

1500 d i ame t r i ,

p6 pifl oscuri, e di formu meno omogenea. Riteniamo probabile she si tratti di un' impregnazione a ripe di precipitate pih grossolano.

Per quanto riguarda la diazoreazione essa riesce molto facilmente in t u t t e le specie da noi esaminate. I granuli acquistano con benzidina una spiccata tonalit~ rosso brunastra del tutto corrispondente ai risultati che si ottengono con la diazoreazione nei Mammiferi.

752 Maffo ViaUi e Vi~torio Erspamer:

Anche per la diazo il ripe morfologico della cellula, l 'aspetto e numero dei granuli appaiono completamente concordan~i col risultati delie reazioni precedenti.

In eomplesso possiamo dire the nei Selaci le nosbre ricerche awalorano completamente le affemazioni di DE FILIPPI c i rca la rassomiglianza istochimiea con le cellule enterocromaffini dei Mammiferi.

Oloce/ali. In ques~o gruppo le cellule enterocromaffini furono descritte, del

tut to recentemente~ da ClrrERIO che ne ha studiato estesamente le caratteristiche morfologiche e la distribuzione in Chimaera monstrosa. Per quanto riguarda le particolarita istochimiehe di queste cellule CIT- TERIO non ha indicate che la posi~ivit~ in grade assai notevole della reazione cromaffine. Riprendendo il materiale larvale di Chimaera monstrosa fissato in formalina 10%, che gi~ aveva servito a CITTERIO, abbiamo avuto mode eli saggiaro la reazione argentaffine e la diazoreazione. La reazione argentaffine b posRiva: per5 il numero di granuli da noi riscon~rato ~ relativamente assai searso anche prolungando in mode notevole l'impregnazione. Nello stesso mode si eomporta la diazoreazione. I pochissimi granuli che si met~ono in evidenza non differiseono secondo noi per nulla nella tona l i~ di colore da quelli che si ottengono tipieamente nelle reazioni pifi fortement~ positive per i Mammiferi. Nella reazione argentaffine e nella diazoreazione pu6 rRenersi grossolana- men~e corrispondente il numero dei granuli messi in evidenza.

Non ei ~ possibile istituire un paragone tra i risultati ottenuti da CI~rERIO Con la reazione eromaffine e i nostri, perch4, come ci risulta da una comunicazione verbale dell 'A, la reazione cromaffine ~ stata eseguita su un esemplare adulto mentre il materiale da noi studiato s~ato esclusivamente quello larvale e inoltre la fissazione in formalina era stata probabilmente piuttosto prolungata. Certo la ricchezza dei granuli nella figura di CITTERIO, non b in alcun mode paragonabile con gli searsi risulta~i da noi ottenuti.

Coneludendo anche gli Olocefali hanno, a somiglianza dei Selaei, come earatteristica is~oehimica la positivit~ nett~ di tut te e tre le reazioni principali proposte da LlSON.

Ganoidi. DE FILirrI in Acipenser sturio non ha potuto riseontrare cellule entero-

cromaffini. ROGOSI~A in una prima serie di ricerehe sullo stomate di Aci~nser ruthenus ha messo in evidenza nella regione pflorica cellule acidofile the ha creduto di peter omologare completamente a quelle descrRte da KuI~ hell'intestine dei pesci. Si t ra t ta per6 di elementi the anche per la disposizione e la forma dei granuli di secrezione si allon- tanano completamente dana forma tipiea delle enterocromaffini e delle acidoffle. In una successiva serie di ricerehe RooosI~A, estendendo

Cellule enterocromaffini e cellule basigranulose acidofile nei VertebratL 758

le proprie osservazioni alia porzione caudale dello stomaeo, b riuscita a mettere in evidenza in un esemplare di Acipenser un certo numero di cellule a reazione argentaffine positiva col metodo di M~sso~- H ~ a L . In base a questi nuovi reperti R o c o s I ~ stacca nettamente le cellule a granuli aeidofi!i de1 primo lavoro dal gruppo delle eellule enterocromaffini nel quale include invece giustamente le cellule a granuli argentaffini. Morfologieamente helle figure di ROG0SINA le granulazioni argentaffini appaiono rela~ivamente searse e piuttosto grossolane.

Fig ; 5. Chimaera monstrosa.. Epi te l io del ia v a l v o l a spirale: Cellul �9 e n t e r o e r o m a f f i n e con sears i g r a n u l i rosso b r u n a s t r i i n f r anue l ea r i ( r i p r o d o t t i i n ne ro ne l l a f igu ra ) : Fiss . fo r - m o l e 10%, p a r a f f i n a ; e o p u l a z , con il sale di d iazon io de l la benz id ina . I n g r a n d i m e n t o :

1000 d i a m e t r i .

F ig . 6. Acipenser Naeearii. Epi te l io d u o - denale , L a cel lula e n t e r o e r o m a f f i n e eon t iene searse g r a n u l a z i o n i a m m a s s a t e quas i com- p l e t a m e n t e i n t e r n e a l nucleo . :Fiss. Fo r - m a l i n a 10%, p a r a f f i n a , m e t o d o lW_ASSON- H A ~ E R L . I n g r a n d i m e n t o : 2000 d i a m e t r i .

Poich6 la dimostrazione nei Ganoidi di enterocromaffini rappresen- t a r a un date d'interesse comparative assai notevole abbiamo creduto eonveniente di ristudiare la questione compiendo le nostre ricerche su AciTenser naccarii; inoltre poich@ i reperti di ROOOSI~A risultavano eselusivamente loealizzati alla porzione eardiale dello stomaco, abbiamo proeurato di studiare la distribuzione delle cellule enteroeromaffini nei vari segmenti dell'intestine.

Nello stomaco, tanto nella porzione cardiale quanto in quella pflorica, il numero di queste celtule ~ assai scarso; le poehissime ehe abbiamo potuto mettere in evidenza si riseontravano prevalentemente nei fondi ghiandolari. Nel punto di passaggio fra la porzione pflorica e l'intestino la quantitY, delle cellule aumenta bruscamente specialmenSe nell'epitelio a ripe intestinale eosiceh6 iI lore numero pub dirsi relativamente notevole. In segmenti intestinali successivi, specialmente in corrispondenza della valvola spirale, il numero di enterocromaffini ridiventa estremamente scarso. Per quanto riguarda la morfologia cellulare, la forma degli elementi da noi osservati non differisee da quella degli elementi descritti e figurati da ROGOSINA.

754 Maffo Viatli e Vittorio Erspamer:

L'osservazione di materiale fissato in REGARD consente di asserire sicuramente che queste cellule danno cromoreazione positiva. In molti casi perb la lore osservazione non riesce del tutto facile, in quanto ehe, date Io scarso numero dei granuli che esse contengono, la cellula, anche in sezioni non molto sottili, appare solo come soffusa di una lieve tinta giallastra. La reazione di MASSo~-HA~FERL ci ha dimostrato un contenuto in granuli pifi scarso di quello figurato da ROGOSINA. I granuli appaiono sparsi nel citoplasma e i l lore ~spetto & abbastanza regolare. Anche la

diazoreazione & nettamente positiva; il numero di granuli che essa metre in evidenza pub rite- nersi del tut to corrispondente a quello ottenuto con la reazione argentiea, e la tonalit~ di colore

al solito nettamente rossastra. Date la quantit~ relativamente piccola di granuli, specialmente in sezioni un pb sottfli e l~ dove le cellule sono in numero scarso, la lore osservazione dope la diazoreazione riesce molte volte assai difficile.

Abbiamo potuto osservare anche noile cellule descritte da ROGOSrSA nel sue primo lavoro sotto

Fig. 7. Acipenser Naceari i . il nome di acidofile. Esse non ci sono sembrate, Epite l io duodenale. Laeel- come del resto ammette ROGOSINA nel sue lula on te rocromaf f ine con- tiene searse granulazioni secondo lavoro, corrispondere affatto alle cellule infranuolear i di un colore acidofile figurate da KVLL nel luccio. Si pub perb n e t t a m e n t e rosso bru- nas t ro ( r ip rodo t t e in nero ritenere c o m e verosimile che questi elementi nena figura). Fiss. ~ormolo rappresentino particolari stadii funzionali nel 1 0 % ; p a r a f f i n a ; copulaz. con il sale di diazonio della c i e l o della cellula mucipara. benzidina. I n g r a n d i l n e n t o :

2500 d i ame t r i . Teleostei.

Per quanto abbiamo insistito, come si vede dal numero considerevole di specie da noi smdiato nella ricerca, non ci

riuscito in alcun mode, tanto con la reazione cromica quanto con la reazione argentaffine e con la diazoreazione, di mettere in evidenza nei Teleostei cellule riconducibili alle enterocromaffini. E questo tanto studiando il punto di passaggio tra lo stomaco e l'in~estino, che di norma ~ il tratto pifi ricco, quanto prendendo in osservazione numerosi tratti intestinali.

Noi siamo molto incer~i nella interpretazione di questi nostri risultati negativi e, pur avendo eseguito ricerche molto pifi numerose di quelle di KuLL e di DE FrLrePi, che pure ebbero risultati negativi, noi pensiamo ehe i] riscontro di cellule enterocromaffini possa esserci sfuggito sia per la lore estrema rarib~ sia anchc forse per una possibile grande scarsit~ di granuli e ci5 noi pensiamo soprattutto riportandoci alle osservazioni che abbiamo po~uto fare nolle storione dove solo dope indagini ripetute abbiamo potuto assuefarci a distinguere le scarse granulazioni presenti.

Cetlule enCerocromaffini e cellule basigranulose aeidoffle nei VerCebrati. 755

Anfibi. Per ia conoscenza delle ricerche antecedenti su le eromaffini deglJ

Anfibi rhnandiamo alle no~izie di DE FILIPPI e di CLA~,A, llmit~ndoei qui come al solito, a discu~ere la questione solo dal punto di vista istochimico. Nessun dubbio sussisteva sulla positivit~ della reazione cromaffine, che era gi~ stata osservat~ he1 rospo da CIAcclo. DE FILIPPI trat- tando dei granuli che si osservano nelle enterocromaffini messe in evidenza con i fissativi cromici nora come essi in alcuni casi siano ben net~i, in altri inveee poco distinti. Secondo DE FILIePI la cara~;teris~ica t inta giaUa delle eellule ~ negli Anfibi" un p5 sbiadita, rispe~to aUa ~inta pica vivace presen~ata dalle enteroeromaffini degli Uccelli e dei Mammiferi, affermazione questa confermata in seguito anche da ~ CLAa~.

Se tale fat~o ~ vero in via generale, noi abbiamo per5 potur ~rarre fl sicuro convincimento che in alcuni casi, 1~ dove il numero 4ei granuli

abbastanza forte, l'int~nsith di colore non b irderiore a quella ehe si osserva in varie specie di Mamrniferi e di Uccelli.

Per quanto poi riguarda la reazione argentaffine, CORDIER, DE F1x~IpPI e CLAR~ la rRengono negativa. Per i risultati negativi di CORDISa e DE FiLreei l'insuccesso pub essere probabilmente impu~ato ai metodi di fissazione usar come gi~ ha creduto di poter spiegare CLARA per i reperti di Co~DIEa. PuS d~rsi the l'esRo negativo della reazione ott~nuta da CLARA SU materiale fissato in formolo 10% sia invece da riferirsi alla inclusione in celloidina. Verso questa ipot~si ci ha falbto propendere una not~ di C ~ nel suo lavoro sui Sauropsidi. Secondo C L A ~ in materiale in celloidina gi~ incluso da parecchi anni, la d~azoreazione b negativa men, re le colorazioni con ematossflina ferrica e M'Ar.r,O~u danno risultati positivi, dimostrando ehe i granuli sono perfet~amente man- tenuti. Pub darsi ehe i t rat tamenti necessari per l'inelusione in celloidina possano in aleuni casi al~erare la natura chimica delle granulazioni.

Igoi in T~'iton erista~us e in Rana esculenta abbiamo ot~enuto una net- tissima reazione argenCaffine per cui abbiamo motivo di ritenere che ugualmente positiva debba essere anehe in qualsiasi altra specie. I1 numero e la natura dei granuli messi in evidenza dalla reazione di I~SSO~- Hii~rrEl~L ~ secondo noi eompletamente corrispondente a quello dei granuli cromizzati. Anche per gli Anfibi vale quindi l'asserzione di LISON che ogni elemento eromaffine ~ anche argentaffine, opinione non condivisa da CLARA.

Abbiamo anehe praticata sul nostro materlale la reazione per l'argentofilia (metodo G~os-SCHUL~ZE). Risul~ati positivi avevano gi~ ottenu~o nella rana TSR6 col metod0 H~s~.~Aw)~ e CLA~ nella s~lamandra col G~os-Scau~,TZ~,. Fa~te le debite riserve sulla incost~nza del metodo laossiamo dire che nei preparati da noi ot~enuti, come gi~ per i Selaci, la GRos-SCHULTZE ci ha messo in evidenza nell'epitelio intestinale solo

756 Maffo Vial l i e V i t t o r i o E r s p a m e r :

le cellule enterocromaffini tipiche con aspetto morfologico identico a quello della reazione argentaffine.

CLARA ha pure trova~a costan~emente negativa la diazoreazione in Salamandra maculosa. Sul nostro materiale noi abbiamo potuto ottenere col Nitrazol C. F., fl diazoico usato da CLARA, eancor meglio col diazoieo preparato dalla bdnzidina esito sicuramente positive, anche in questo caso. Morfologicamente i risultati della diazoreazione collimano nel modo pifi completo con quelli delle reazioni cromaffine e argentaffine. La tonalit~ di colore pifi o m e n o rosso brunastro a seconda ~lel diazoico utflizzato eorrisponde completa- monte a quella cho si ottiene nei Vertebrati superiori.

Fig. 8. Tri ton cristatus. Epitelio dello stomaco . Si osservano due cellule enteroeromaffini con searsi granul i ese lus ivamente infranueleari . Fiss. Formolo 10 %, paraf f ina ;

me todo di ]YIASSON-HA~PERL. I n g r a n d i m e n t o : 700 diametr i .

Fig. 9. R a n a esculenta. Epitelio duodenale. L a porzione sopranucleare della cellula enteroeromaff ine, con t n t t a probabll i t~ per l 'obl iquit~ della sezione, 6 pifi r icca in g ranu- lazioni rosso b runas t r e che non la porzione infranucleare (nella f igura sono r ip rodot te in nero). Fiss. Formolo 10%, paraf f ina ; eopulazione con il sale di diazonio delia benzidina. I n g r a n d i m e n t o : circa 1000 diametr i .

Dal complesso quindi di queste nostre osservazioni appare che il comportamento istochimico delle granulazioni contenute nelle cellule enterocromaffini degli Anfibi risul~a del tut to idcntico a qucllo indic~to da LIso~r e da CLARA nei Mammiferi.

Rettili. Uno di noi (VTAN~I) ha potuto mettere in evidenza in numero variabile

celhfle enterocromaffini in molte specie di Rettili, dimostrando la positivit~ non solo della cromoreazione ma anche della reazione argentaffine. Anehe in tale lavoro ~ segnalata rimpressione c h e l a reazione gialla de1 cromo non abbia in alcuni casi nell'intestino dei t~ettili in~ensits cosl marcata come quell~ che si nora in preparati di confronto con intestino

Cellule en te rocromaf f in i e cellule bas ig ranu lose acidoffle ne i Ve r t eb ra t i . 757

di Mammiferi. Tale affermazione b s tata convalidata da CLARA. Noi abbiamo preso in esame tanto i preparati ehe hanno serwito al lavoro di V I ~ L I quanto nuovi preparat i e non possiamo the confermare quello the abbiamo detto a questo proposito per gli Anfibi.

Per ci6 che riguarda la reazione cromaffine e la reazione argentaffine abbiamo riscontrato la piena esattezza dei dati ottenuti da VL~L~, dati sui quali recentemente pure CLARA si t rova in accordo perfetto. CL~A ha app l i ca ta t a diazoreazione anehe nei Rettili ottenendo risultati

Fig. 10. Chaleides ocellatus. Intest inomedio. Tutto fl eitoplasma 6 ripieno delle caratteri- s~icho granulazioni. Fiss. Formolo 10%,

paraffina; mel~odo ~[ASSON-HAlVIPERL. Ingrandimento : 1600 diametr].

Fig. 11. Chalcides ocellatus. Epitelio dell'intestino medio. Cellula en~eroeromaffine c o n

numerose granu/azioni rosso brunastre specialmente sopranucleari (riprodotte in nero nella figura). Fiss. Formolo 10 %, paraffina; eoplflazione con il sale di diazonio della benzidina. Ingrandimento: 1000 diametri.

positivi. Secondo questo A. l 'intensit~ delia colorazione che si ottiene col Nitrazol C. F. sarebbe molto meno spiccata e la tonalitfi, solo giallastra e non rossastra.

Noi abbiamo fat to osservazioni con la diazoreazione su Chalcldes ocellatus, Lacerta viridis e Tropidonotus natrix. In tut t i i casi abbiamo ottenuto reazione positiva, quant i ta t ivamente corrispondente a quella argentica e a quella cromica. I granuli ci sono sempre apparsi colorati net tamente con lo stesso tono rossastro, col quale li abbiamo osservati anche negli altri gruppi di Vertebrati.

Anche in questo caso crediamo che i risultati descritti e figurati da C ~ possano essere interpretati come dovuti alla inclusione in eelloi- dina anzicch6 in paraffina. Non ei pare quindi che sussista la deviazione rispetto alia norma della reazione descritta da CL~CaA e quindi seeondo n o i l e enterocromaffini dei Rettili si inquadrano perfct tamente per le loro caratteristiche istochimiche con quanto si osserva in tut t i gli altri Vertebrati.


Ueeelli e Mammiferi.

Le nostre osservazioni sulle enferoeromaffini degli Uccelli e dei Mammiferi collimano completamente con quelle di LlSO~ e di CLARA. In~endiamo qui altudere eselusivamente alle enteroeromaffini tipiehe, poieh6 riteniamo ehe il problema delle cellule acidofile, ehe seeondo noi permane ancora tu t t ' a l t ro ehe chiaro, meriti di esser tractate separatamente.

Tanto negli Uccelli quanto nei ]Ylammiferi di norma le cromaffini appaiono numerose e ricche di gmnulazioni. Ci5 spiega perch6 special- men~e sui Mammiferi esista una le t tera tum molto ricca che noi riteniamo

inutfle ricordare essendo riassunta in mode molto compieto nella monografia di CL~A.

La reazione eromaffine e quella argentaffine furono studiate da parecehi autori, mentre la diazoreazione per era b s~ata messa in evidenza solo da Llsozr e da CLARA.

Poieh6 parecchie questioni interes- santi ques te eeUule dovranno essere

Fig . 12. (Javi, a eobaya. Cellula en t e ro - s u c e e s s i v a m e n t e r i p r e s e n e l l a d i s c u s s i o n e c romaf f ine del l 'epi te l io duodena le . Fiss . F o r m o l o 10 %, p a r a f f i n a , eopu- s u l l e cellule aeidofile cosl riteniamo laz ione c o n i l sale di d iazonio del la benzidina (i granuIi sempre del so l i to inutile qui soffermarei a lunge su d i esse.

c o l o r e rosso b r u n a s t r o sono r a p p r e - Non ci risulta che la,diazoreazione sia s e n t a t i i n ne ro ne l la f i gu ra ) . In - " . . . . graudimento: c i r c a 1000 diametri~ mai s tata applieata a materiale umano :

noi abbiamo potuto eseguirla su materiale eLi appendice asportata chirurgicamente. Come era da aspettarsi abbiamo ottenuto esito positive della reazione; poich6 perb, come dimostrano anehe le recenti ricerehe di ScHAcx, neUa appendice patologica le eellule enfcrocromaffini appaiono in eondizioni del tu t to particolari, ci limitiamo a fame un semplice cenno, r imandando ad un lavoro speeiale ricerehe pi~ minute.

La questione delle eellule aeidofile. Data la complessit~r del problema noi ~bbiamo creduto utile per

peter giungere a risultati soddisfacenti limitarci almeno per era a trat- tarlo solamente per i Mammiferi.

lqelle pih antiehe descrizioni di cellule enteroeromaffini gig compaiono aecenni tall da peter far riferire seeondo noi parte delle cellule descritte a queUa varietg the fu in:seguito chiamata col nome di eellule acidofile. KULL ~ state il primo nel sue lavoro del 1913 a porre ne~tamente una distinzione tr~ due tipi cellulari, eio~ t ra eellule enterocromaffini tipiche eontenenti granuli colorantisi sotto l 'azione dei sali di creme e eellule con tenen t i granuli non eromi~,zabili, ma net tamente acidofili helle

Cellule enteroeromaff in i e eellule basigranulose aeidofile nei Ver tebra t i . 759

colorazioni di ALTMAI~lq-KuLL e di K ~ all'eosina-ematossilina-Viktoria- blau. Egli ha ritenuto i n questo sue lavoro i due tipi eellulari completamente indipendenti, opinione subito contraddetta da Cztccro, il quale, riportandosi alle proprie ricerche sulle celhfle enteroeromaffini, ritiene the si t ra t t i verosimilmente di stadi funzionali differen~i di u n a stessa variet~ eellulare. Dell'opinione di CzAccm furono poi tu t t i g l i au~ori the si oceuparono in seguito dell'argomen~o, ed anehe K~LL modific6 in questo sense le sue opinioni in una sua pubblieazione del 1925, nella quale inoltre si trovano dati ehe vanno ulteriormente analizzati.

Noi ei oeeuperemo, come preeedentemen~e, solo delle questioni ehe possono in~eressare il late istoehimieo de1 problema tralaseiando ogni discussione morfologiea.

Dunque, anche seeondo K v ~ (1925), le granulazioni aeidoffle sarebbero d i norma degli scadi di maturazione 4elle granulazioni cromaffini. Nella maggior parte 4el le specie animali esaminate si osserverebbero eontemporaneamente eellule dell'uno e dell'altro ripe: a quest0 comportamento generale farebbero eeeezione secondo quanr clesei~ve KULL la carla, il gaffe e i pesci. Nella cavia lo stadio di aeidofflia manea e quindi tu t te le cellule sono eselusivamente a granuli cromaffini. Nel gaffe ol~re alle eomuni qellule aeidoffle, destinate a ~rasformarsi in eellule eromaffini, sarebbero presenti, nella porzione ~erminale dell'flee e ne l crasso cellule aeidofile a granuli pifi grossi destinate a seeernere senza diVenire eromaffini. Questo reper~o he1 gatr si riallaeeia secondo K u ~ a quanto gli 6 stat~ date di osservare nei Pesci. L'A. non descrive in quale specie abbia ottenuto i suoi reperti, ma raffigura una bella cellula aeidofila he1 lueeio. Anehe questi elementi aeidofili sarebbero destinati a rimanere in questo stadio di sviluppo senza raggiungere la cromaffinitk. Pu t mancando la eromoreazione K~L~ sostiene ehe ques'~e eellule sono da aseriversi alle enteroeromaffini.

Parimen~i Cr,~Ri nei suoi lavori del 1926 e 1928 asserisce l 'apparte, nenza deUe cellule acidofile al cielo biologieo delle eromaffini.

Cellule basigranulose acidofile

1.~ Pre@en~-

2. ~ Es~ensione:

3. ~ Dis t r ibuzione nelle ghiandole di LI~BV, R- Kfi'H~":

4. ~ Granulazioni :

5. ~ Reazioni :

z. f. Zollforschung u. mikr. Anatomic. Bd. 19.

Cane - - ga f fe

Intes$ino (segmento distale)

Unfforme

Pi~ g o s s e e abbondan t i ehe nelle eellule entero-

cromaffini . C r o m a f f i n i ~ - -

Argen~af f in i~ - -

Cellue enterocromaffin

Tu t t i i mammife r i domest ic i

Stomaco, in tes t ine

Ammassa t~ neUe pih profonde parbi

Cromaff in i t~ ~ - - Argen~affinit~ -l-

50

760 Maffo Viatli e Vittorio Erspamer:

T~t[VER~in recenti ricerche ha portato secondo noi un buon chiarimento alla questione delle cellule acidofile dei Mammiferi e poich~ il lavoro esce dall ' Is t i tuto diretto da KvLL noi dobbiamo credere chele conclusioni eli TEI:v~R rispecch.iino anche l'opinione del suo Maestro. Secondo T~,n~r si devono distinguere net tamente due tipi cellulari: cellule enterocromaffini e cellule acidofile basigranulose. Poieh6 tale distinzione ei sembra di grande importanza riportiamo senz'altro lo schema dei caratteri distintivi dei due tipi cellulari secondo T~EvE~ (vedi tabella).

CLARA utilizzando la diazoreazione ha cercato di st~bilire il comportamento istochimico delle cellule acidofile granulose. Con questo home I'A. designa, a quanto ci b dato di capire, non le basigranutose acidofile di T E n v ~ , caratteristiche del cane e del gatto ma invece quel tipo di cellule enterocromaffini acidoffle comuni a tu t t i i Mammiferi che secondo T ~ v ~ non posseggono cromaffinitg.

E ' d a notarsi poi che C:~J~ non sembra toner molto conto della distin~ione delle acidofile risultante dalla tabella di T x ~ v ~ e confonde perci6 nel suo ragionamento i due tipi di cellule acidofile. Le argomenta- zioni di CLARA sono piuttosto complesse e possono essere cosi schematiz- zate. Nel maiale le collule granulose acidofile, elementi non cromaffini, darebbero diazore~zione positiva con tonalit~ diversa dalle cellule a eromaffinit~ positiva.

In materiale fissato in liquidi formol-bicromici, secondo CL~A, la diazoreazione nolle cromaffini tipiche ~ negativa e ci5 a motivo del l ' avvenuta t ras fomazione dei fenoli in composti chinonici. Pure negativa

la diazoreazione in questo easo nolle cellule acidoffle, ci5 the dimostra, secondo ~ che anch'osse hanno subito un processo di ossidazione che rondo impossibile la loro ulteriore copulazione con i sali di diazonio; i prodotti di ossidazione di queste cellule acidofile, a differenza di quanto avviene per te cromaffini, non sarebbero colorati. Non risulta che C ~ A abbia personalmen~e studiata l 'argentaffinits di queste cellule.

I risultati the siamo venuti cosl analiticamente esponendo, involvono un certo numero di problemi i quali appaiono risolvibfli in base alle considerazioni chlmiche di L:so~ e a d alcuni piccoli accorgimenti tec- nici che permettono di render pifi completo il piano d'analisi istochimica proposto da I~so~.

I problemi che si presentano riguardano: a) Le collule enterocromaffini a granuli acidofili di T~n~c]~R (cellule

basigranulose acidofile di CL~A). b) Le cellule acidofile basigranulose di T~]:v]m. Per ci5 the concerne il primo tipo di olementi: le cellute enterocrom-

affini a granuli acidofili, secondo TEn-VER possederebbero cromaffinits negativa e argentaffinit~ positiva, secondo C ~ A cromaffinits negativa e diazoreazione positiva.

Cellule enteroeromaffini e cellule basigranulose aeidoffle nei Vertebrati. 761

La caratteristiea cromaffinit~ negativa e argentaff~nit~ positiva denof~rebbe la presenza di elementi contenenti una sostanza chinonica o ehinidronica.

Noi crediamo che pi~ semplicemente l'osservazione di TEHVE~ trovi una spiegazione nel fat to ehe quando la eromoreazione ~ assai debole i prodotti colorati a cui essa d~r luogo possano sfuggire aIt'osservazione, mentre invece tale fat to non si avvera per la reazione di M_AssoN-H~r~.x~L in cui si ha anche un precipitate d 'argento ben visibile in eorrispondenza dei granuli riducenti.

Interprcf~ndo istoebimicamente i risultati di CL~mA possiamo dire ehe la presenza in una cellula di granulazioni a eromaffinits negativa c diazoreazione positiva in ambiente alealino significa ehe i granuli contengono dei monofenoli, ratio questo di importanza granclissima qualora ne riuscisse la dimostrazione.

Pertanto fl problema ehe noi ei siamo posti ~ dupliee: 1. ~ Esistono effettivamente hell 'intestine cellule a cromoreazionc

negativa e a argentaffinit~ positiva ? 2. ~ Esistono cellule a diazoreazione positiva e a cromaffinit~ negativa ~. Riguardo poi al secondo ripe di elementi ciob le eellule basigranulose

acidoffle di T ~ H v ~ de1 gatto e cane, dobbiamo osservare ehe i granuli per la lore argentaffinit~ e cromaffinit~ negativa non possono eontencre difenoli. I1 problema da pors i quindi in questo case b eselusivamente quello di vedere se esse presentino diazoreazione positiva o negativa dimostrando nel primo case un contenuto in monofenoli, no1 seeondo case assenza assbluta di fenoli di qualsiasi genere.

La questione della possibflit~ the eellule non cromizzabili possano dare la diazoreazione non pub essere risolta direttamente, in quantc come gi~ ha osservato ~ e come appare chiaro qualora s i pensi al meccanismo del la reazione cromica il materiale fissato in REGARD non d~ pih la diazoreazionc: abbiamo dovuto quindi risolvere il problema in via indiretta.

J_unanzi tu t to abbiamo, su matcriale fissato in I~EGAUD, cercato di stabilire, come gi~ ci appariva teoricamente, se la rcazionc cromica corrisponde esatCamente all'argentaffine. I1 fat to pu6 essere studiato sia per via numerica sia in base a osservazione sulla t inta assunta dai granuli cromizzati quando vengano sueeessivamente sottoposti alla rcazione argentica. Per r isolvere numericamcnte la questione oecorre ricorrere a maf~riale fl pi~t possibfle omogeneo perch6 troppo fermi sono le oseillazioni nnmeriche delle cellule enterocromaffini da individuo a individuo e da segmento a segmento inf~stinale. Perei6 noi abbiamo osscrvato fettc immediatamente contigue d 'una stessa serie le une semplicemente tolerate con ematossflina le altre sottoposte ad argentazione oppure siamo ricorsi all 'espcdiente gi~ usato da TEHW~ di eseguire conteggi su determinaf~ forte sempliecmcnto cromizzate, quindi smontato

50*

762 Maffo. Via]li e Vittorio Erspamer:

il preparato e sottopostolo ad argentazione eseguire un seeondo conteggio suIle stesse zone dapprima esaminate.

I risultati da noi ottenuti, ei dimostrano una completa corrispondenza i ra le due reazioni; D'altra parte ~ vero anche il fat to inverso, come dimostra l'osservazione da noi fat ta ehe in nessun easo su materiMe fissato in Regaud e sottoposto ad argentazione b dato osservare ]a presenza di granuli semplicemente cromizzati; ma tut te indistintamente le cellule eontengono granuli pifi o meno, ma sempre in modo evidente, imbruniti sot~o l'azione dell'argento. Si deve quindi coneludere ehe nelI'intestino si ha peffetta eorrispondenza ira le reazioni eromaffine ed argentaffine.

Su materiale poi fissato in formMina noi abbiamo proceduto per stabilire l'equivalenza fra reazione argentaffine e diazoreazione a varie prove. Innanzi tutto, valendoci Sempre di fette eontigue, t ra t ta te le une con la diazo, le altre con la MASSO~-HAMPn~L, abbiamo eseguito conteggi molto numerosi ottenendo risultati numerieamen~e assai vieini. Ma ancor pifi probativa ci ~ parsa una prova d'altro genere.

Valendoei de1 fatto che il materiale diazotato b aneora suscettibile di argentazione abbiamo proceduto a diazotazione di aleuni preparati e a l l a loro immediata successiva immersione in soluzione di Fontana. Se la diazoreazione b s~a?~a fauna con benzidina o Nitrazot C. F. i risultati o~tenu~i con la uI~eriore argentazione appaiono poeo ehiari in quanto avendo gi~ i granuli una ~onalit~ brunastra dopo la eopulazione non si distingue sempre nettamente l 'imbrunimento dovuto alla susseguente argentazione. Siamo perei6 ricorsi ad ammine aromatiehe pifi sempliei ehe danno, a parit~ di fenoli eopulati, t inte pifi chiare. Abbiamo trovato e he l a toluidina si presta bene allo seopo, in quanto eseguendo con essa la diazoreazione i granuli assumono un colore giallastro. La successiva argentazione introduce una modificazione nel tono di eolore sempre nettamente apprezzabfle.

L'esamo aecurato di preparati cosl trattati , non ei ha in nessun caso eoneesso di osservare anehe solo dubitativamente eellule, in eui il primitivo eolore della diazo non sia s~ato modifiea~o dalla sueeessiva argentaziono.

Da queste rieerche quindi ei pare in modo evidente dimostrato ehe tu t te le eellule a diazoreazione positiva sono anehe argentaffini. Com- parando questi risultati con queUi preeedenti appare ehiaro ehe, essendo la reazione cromaffine perfettamente corrispondente alla argentaffine, e quest' ultima a sua volta alia diazoreazione, anehe diazoreazione e eromoreazione debbono di neeessit~ coincidere. Quindi noi possiamo risolvere compIe~amente il primo in~errogativo postoei nel senso ehe nell'intestiao non esistono eellule a eromaffinit~ negativa e diazoreazione positiva.

Noi. pensiamo ehe in eomplesso le diseussioni ehe si sono verificate sull'argomento delle eellule aeidofile e ehe ormai appaiono abbas~anza

Cellule enCerocromaffini e cellulo basigranulose acidoffle nei Vertebrati. 763

chiarite siano s tate fin dai primi tempi magistralmente risoli;e da C~COlO, che, escludendo la diversa na~ura ammessa da KVLL per le cellule acidoffle e le enterocromaffini, cosl si esprimeva: , , . . . . le cellule en$erocromMfini si possono oresentare in st~dii funzionali differenti per cui alcune hanno una spieear affinitg, altre debole per il bicromato di potassa . . . . . sicch6 io penso che non si possano distinguere rigorosamen~e due varietg di eellule basigranulose, come crede KVLL, ma che si trat~i verosimilmente di s~adii funzionali differenti."

In complesso possiamo dire che nelle lore discussioni anehe T ~ v ~ e CLAn aderiscono in certo qual mode a queste conclusioni di CIACClO, SopraSutto inSeressanr b anche un alSro fat$o ricordar da CxncOlO che le granulazioni che meno denotano aver subita l 'azione del creme appaiono pifl intensamente colorabi]i con la fuxina e la saffranina.

Ci8 ei spinge a sostenere the in molti casi una debole cromizzazione, a eui eorrisponde una notevole aeidofilia, non possa in alcun mode essere apprezzata u$ilizzando il metodo di K v ~ o il MJu~ogy ( C ~ A ) . E ' appunto per questo ehe noi pensiamo the volendo rilevare anche le granulazioni mcno in~ensamente cromizzate si debbano utilizzare colorazioni s~re~tamente nueleari. O~tima ad esempio noi troviamo una lieve colorazione con ematossilina Caxazzi.

A queste eellule a debole oromaffinit~ e a for~e aeidofi/ia debbono a nostro parere certo essere ascrit~e quelle cellule granulose acidoffle the seeondo C ~ A danno diazore~ione posi~iva e cromoreaz:ione negativa. Del resto questa stessa spiegazione si pu6 dare per 1'asserzione di T~tV~R, che appare in oontraddizione col risultati da noi preeedentemenr esposti della eguaglianza t ra reazione cromica e argentica, asserzione, sec.ondo la quale le cellule enterocromaffini the posseggono tut te argentaffinit~ positiva, avrebbero invece talvolta cromaffinitk negativa.

Riguardo al!e eellule basigranulose acidoffle di TE~v~g i risulta~i da noi ottenuti sono assai netti per quan~o concerne le caratteristiche is~ooh/miche. Possiamo confermare completamente le conclusioni di TElt'VER circa la mancanza delle reazioni creme e argentaffine. Siamo rieorsi anche qui a conteggi su fe~te corrispondenti e inoltre a tut t i quegli accorgimen~i di cui si ~ valse TEHVER per la sua dimostrazione;

Per vedere se la diazoreazione ~ positiva o meno in q.ues~e eeIlule, abbiamo eseguita la diazore~zione su ma~eriale fissa~o in formalina e dope accurate conteggio di un certo numero di campi microseopioi abbiamo smonta~o i preparat i e l i abbiamo sottoposti ad una prolunga~a cromJzzazione dopodicch6 abbiamo colorato eel metodo di A~T~A~- K v ~ e abbiamo ripetuto i conteggi. Ques~i ci hanno dimostrato un notevol/ssimo aumento di cellule gramdose che in par~e avevano la tonalit~ di colore delle granulazioni rosso brunastra propria della diazoreazione in maggior numero invece la colorazione fosse violacea descritta gig da T]~Hv]~ per le sue basigranulose acidoffle.


In base a tale ricerca possiamo escludere in mode assoluto the alia eostituzione delle granulazioni di queste cellule possano partecipare monofenoli. Si deve quindi concludere ehe in queste cellule man ta qualsiasi sostanza di tipo fenolico con capacit~ di copulazione con i sali di diatonic in mezzo alcalino.

Anehe per ci5 the concerae il significato the queste particolari cellule possono avara rispetto alle enterocromaffini la questione ei sembra interessante, poich4 cellule acidofile basigranulose di questo ripe sono state da KULL descritte nel luccio in cui come in tut t i Teleostei manea finora la dimostrazione di cellule enterocromaffini tipiche.

KULL riferendosi alle eeliula acidoffle della parte terminale dall'ileo del gatto ritiene the esse rappresentino una sor~a di entarocromaffini the secernono senza peter mai diventare eromaffini. A noi non pare per5 ehe questa ipotesi risulti foadatamente impostata.

Innanzi tu t to se noi ricordiamo alcuni dati topografici e morfologici Sulla aellula basigranulosa acidofila noi vediamo the essa appare, come gi~ ha sostenuto TP~HVE~, assai ben distinta dalle callute enterocromaffini acidofile. La cellula basigranulosa acidoffla finora ~ s tata deseritta solo nei carnivori domestici, la sua distribuzione hell 'intestine b quasi essenzialmente l imltata alia porzione distale di esso contrariamente alle enterocromaffini; pure diversa b la distribuzione rispetto alle ghiandole e villosit~ intestinali in quanto le cellule basigranulose acidofile sono uniformemente distribuite su tu t t a la superfieia laddove inveee le enterocromaffini si addensano speciatmente in eorrispondenza dei fondi ghiandolari. Anche morfologicamente i due tipi eellulari si differenziano soprattutto, come ha notate TEHVER, per la diversa grandezza e tonalit~ di eolore dei granuli.

Tut to questo eomplesso di caratteri distintivi delle cellule acidofile tende, almeno in eerto qual mode, a farei ammettere con T]~HV~,R the esse siano un elemento cellulare diverse dalle enterocromaffini.

Troppo scarse del resto sono le nostre conoseenze riguardo a questi elementi poich6 noi pensiamo che uric studio comparative sistemati- camente ~ondotto dovrebbe mettere in evidenza i rapporti the possono esistere da tuna parte colla posizione tassonomica degli animali studiati e dall 'altra parte col regime nutritizio. CertamenCe i raparti di cellule di questo ripe dovrebbero moltipliearsi e noi pensiamo del resto ehe in alcuni casi, nei quali non b state fat to uric studio istoehimico accurate, aleuni A. A. abbiano potato interpretare cellule di questo ripe come cellule enterocromaffini aeidoffle.

E ' ban difficile peter vagliare allo state attuale della nostre eognizioni quali possano essere i rapporM di questi elementi eoi tipi cellulari a noi gi~ noti poich6 in complesso, se non b'soddisfaeente la lore classificazione vicino al ripe delle enterocromaffini, anche fl rawic inamento a particolari stadi della callula mucipara o della oellula di Pane~h trova almeno per

Cellule enterocromaffini e ceUule basigr~nulose acidofile nei Vertebrati. 765

era difficolt~ ancora pih gravi. L'inclusione di queste ceUule net eiclo delle enterocromaffini fat ta da K v u , trova una giustiflcazione nella presenza di cellule, che per molti caratteri si dimostrano con queste legate, nei Teleostei e qualora le ulteriori ricerche dovessero confermare questa ipotesi la spiegazione di KULn potrebbe essere ancora ampliata nel sense che queste cellule che non diventano mai cromaffini tipiche potrebbero essere interpretate come cellule ehe nella lore evoluzione hanno preso gi~ una via ben determinata ma ehe non giungono alia eromaffinit~ perch6 tale stadio non si rende necessario alia lore funzione. Certo una maggiore luce anche sperimentalmente potr~ venire alia risoluzione di questo problema quando si potr~ meglio caratterizzare il significato funzionale delle enterocromaffini, questione di cui noi stiamo gi~ occupandoci.

Considerazioni generali. Innanzi tutt~ noi erediamo che il significato eomplessivo da darsi

all'esito deHe nostre ricerche abbia u n c e r t o valore per dimostrare la possibfle importanza funzionale delle cellule enterocromaffini. Infat t i non solo noi abbiamo potuto allargare ed ampliare le precedenti eognizioni riguardo alla presenza di enCerocromaffini nella intera serie dei Vertebrati ma abbiamo po tu to stabilire la completa uniformit~ delle lore caratteristiche istoehimiehe. Per quanto riguarda la presenza nei

�9 vari gruppi di queste eellule le nostre rieerche sono rimaste negative, come gi& queUe degli AA. precedenti, soio per i Ciclostomi ed i Teleostei. Noi non annettiamo perb una particolare import~nza a questa assenza di cellule enteroeromaffini in detti due gruppi di Vertebrati e siamo piuttosto portati, come KurbL afferma per i Pesei in generale, a pensare che in questi gruppi le cellule siano straordinariamente rare e probabflmente ristrette a determinate porzione del tube gastroenterieo ehe noi, come abbiamo gis detto, non abbiamo avuto la fortuna di colpire. La presenza segnalata da K~rLn di cellule acidoffle nel lueeio non b secondo noi, come abbiamo spiegato, elemento tale da far escludere la possibile contemperanea presenza di cellule enterocromaffini vere e proprie.

Come nettamente in tu t ta la serie dei Vertebrati le eellule enteroeromaffini appaiono con determinate caratteristiche moffologiehe, che nella put grande variet~ di quadri che possono present , re permettono a prima vista di identificarle, eosl, anche per le lore caratteristiche istochimiche, le cellule enter0cromaffini risultano uniformi nella intera serie dei Vertebrati per eui noi possiamo asserire che chimleamente le lore granulazioni sono caratterizzate dalla presenza di un difenolo. E' questo un fatto della massima importarma sul quale erediamo sia utile insistere un poeo. I risultati di Cr~A~.A, da noi ampiamente esposti, e speeialmente quelli ottenuti negli Anfibl, parlano in favore di una grande variabilit~ istoehimica nelte icarat~eristiche dei granuli. Ad esempio la sola cromaffi. nit~ positiva negli Anfibi sarebbe di assai difficile interpretazione: o st

766 Maffo Via,lli e Vittorio Erspamer:

deve pensare a composti completamente diversi dai fenolici, da~o che pe r la regola di V~m, cE la cromoreazione b specifica per qualsiasi combi- nazione aromatica che contenga due gruppi OH oppure un gruppo OH ed un N H 2 o due NH~ in Pesizione orto o para, oppure si potrebbe Pensare ad un comportamento simile a quello dell'adrenalina, tic6 alia presenza di un eomposto fenolico the per6 non possa essere conservato durante le varie manipolazioni con fissativi non eromici.

Rimane da spiegare fl significatc the ha la minor intensit~ della cromizzazione gi~ nei Rettili e ancor pifi negli Anfibi e corrispondente- mente delle aRre reazioni the hanno lo stesso meccanismo di questa cio6 la iodica e in grado meno apprezzabile l 'argentica, in quanto in questa oltre the formazione di chinidrone si ha anche deposizione di argento metallico.

Secondo CLOACA la minor intensit~ delia cromoreazione sarebbe un indizio the la sostanza contenuta nei granuli ha una composizione pih semplice che non quella contenuta nei granuli pifi intensamente eromizza- bill dei Vertebrati superiori.

CLAX~ Pei rRiene non inverosimile che ,,tier an das Dioxybenzol- derivat gebundene Restkomplex dabei eino nieht unwesentliche Rolle spielt"; a noi non sembra the Ia cosa sia cosl facilmonte risolvibflo e d 'a l t ra parte, poich6 la questione ha importanza fondamentale anche per spiegare fl compor~amento delle cellule enterocromaffini a granuli aeidofili dei Ver~ebrati superiori, riteniamo cho qualsiasi induzione anche solo presuntiva in proposRo possa avere un certo valoro.

I1 problema ~ assai complesso poich6 esso risulta da un insieme di fat t i ciascuno dei quali separatamente pub influenzare il comportamento dei granuli.

Innanzi tut to sorge la questione: sono i granuli costituiti esclusivamente dal difenolo oppure rappresentano un substrato in cui si deposiSa o si forma il difenolo ~. Senz'altro noi, e quesf~ ~ anche l'opinione di CT,A~A, propendiamo per la seconda di queste spiegazioni. E ' evidente allora che nei granuli possa esserci una maggiore o minore eoncentrazione del difenolo e questo vale non solo come caratteristica dei vari gruppi, ma anche come caratteristica di singoli stadi del ciclo cellulare. Noi ci06 Pensiamo che sia applicabile alla istochimica comparata la osservazione di CL~ccIO sul variabile grado di cromaffinit~, the i granuli possono avere in singole cellule o in una stessa cellula. Naturalmente questo ratio dove avere valore generale, ciob dovrebbe verificarsi in, complesso per tu t te le reazioni; 6 solo Per difficolt/~ di apprezzamento, quando sussistono toni scuri come nolle argentiche o nelle diazo, ottenute con amine molto complesse, the il fat to non risulta cosl evidente. E cosi infatti stanno le cose come hanno gi~ osservato varii AA. Per le argentiche e ~ per le diazo.

Cellule enterocromaffini e ceUule basigranulose acidofile nei Vertebrati. 767

Ammessa questa costituzione del granule serge la questione se la sostanza contenuta nel granule sin sempre la stessa in t.utta la serie dei Vertebrati. Anohe qui oceorre, almeno in via teoriea, prospett~rci due possibflit~:

1. ~ E'presente sempre lo st.esso nucleo fenolico o meno ? 2. ~ Supposto che il nucleo fenolico sin cost.ant.e la cat.ena lat.erale

varia o meno ? I risultat.i degli Aut.ori precedent.i potevano laseiar il dubbio ohe

al primo in~rrogativo si dovesse rispondere affermando anche la variabilit~ del nucleo fenolico. I nostri risult.at.i invece non lasciano nessun dubbio in proposito e noi possiamo dire ehe, almeno ent.ro i limiti di sensibilit.~ delle reazioni attuate, ls sost.anza contenuta nei grsnuli b sempre ed esolusivament.e un difenolo.

Variabfle pub essere la eatena laterale in posizione para, specislmente se si tiene conto della gi~ soeennata possibilit~ oho le reazioni possano dare tonalit~ di oolore leggermente diverse.

A noi sembra dJffieile pot.or esoludere assolutamento man tale possi- bilitY, perb ci pare assai pifi facile ammet.t.ere una unica composizione cost~nt.e anohe della eatena laterale e spiegare le diverse tonalit~ di eoloro, apprezzabili speoialment.e con la cromoreazlone, con una divorsa conoentraziono del composto nei granuli: i granuli riechi della sostart~ difenolica daxanno nat.uralment.e una reazione assai pih int.onsa, i granuli poveri inveoe daranno una re~zione appena apprezzabilo; infatti in quest'ultimo case molto volte si rondo neeessaria una postoromizza~zione molto prolungat.a. D'altra par~e ci confort~ aneor pifi in quests sup- posiziono anehe il fat.to the nei Rettili, Anfibi e Ganoidi, in cu id i norton la eromoreazione appare pifi debole, si hanno tutt~via oellule, per quanto rare, the presentano una reazione alt.rettanto intensa the quella dolle cellule dei Vertebrati superiori. Noi possiamo ponsare ohe questa maggiore facflit~ a rinvenire una p i~ grande quantit~ di granuli a searsa con- cent.razione del difenolo nei Vertebrat.i inferiori possa essere spiegata colla minor vivaeit.~ del rioambio in quest.i gruppi animali, e ei5 qualunque sin la funzione" the possa venir dimostrata per le enterooromaffini.

In alcuni casi poi l'impressione di una pifi debo[e hxtensit~ di cromizzazione pub essere data dal minor numero di granuli contenuti nolle cellule.

Come legion conelusione di queste nest.re oonsiderazioni noi possiamo manf~nere la affermazione, da noi fat ta in una nostra not.a preventiva, che nella int.era serie dei Vert.ebrati sin sempre present.e nolle :granulazioni una stessa sostanza.

L'omogeneRs da noi dimostrata no1 comportamento istoohimieo delle enteroeromaffini nei Vertebrati ei sembra aut.orizzare a ritenere ehe queste cellule abbiano una not.evole impor~anza. Inoltre: dai nost.ri repert.i pub forse derivare qualehe fondato indizio circa la lore possibfle

768 Maffo Via]J1 e Vittorio Erspamer:

funzione; senza volere qui discutere la questione assai complessa e su cui abbiamo in eorso ricerehe sperimentali varie, ei pare non azzardato sostenere ehe esse pessano rappresentare un prodotto di secrezione a tipo ormonieo. E ' infatti assai suggestivo il comportamento ad esempio sempre omogeneo nella intera serie dei Vertebrati della adrenalina per fl sistema feoeromo, delia tiroxina per la tiroide, della insulina pe r il pancreas.

D'a l t ra parte ei cenfortano ancor pi~ in questa supposizione: 12 I1 fargo the le sostanze fenoliche sono in genere delle sostanze

a4 azione farmaeodinamiea assai intensa. 2. ~ I1 risul~ato di recentissime rieerche eompinte n~l nostro Is t i tuto

d~ RAV~TTA che dimostrano come non si possa attribuire alle cellule enterocromaffini una sempliee azione nell 'assorbimento o nella escrezione dei difenoli.

N6 queste sono le uniche considerazioni che ci indirizzano in questo senso in quanto numerose interrelazioni da noi intravviste anehe se non tall da poter essere considerate, singolarmente prese, prove valide debbono ~utt.avia essere ritenute nel loro complesso favorevoli ad una interpretazione in questo senso ehe noi crediamo di peter mantenere anche se essa appare in eontrasto eolle vedute espresse da OLA~A nella sua monografia.

Per la questione poi dell'acidefilia noi erediamo che i chiarimenti da noi portat i alla diseussione colla prova the alte cellule: enterocromaffini a granuli acidofili spe~ta il significato di stadi funzionali delle entero- Cromaffini tipiche siano di una certa importanza. Infat t i di fronte alle asserzioni di CLARA, come noi abbiamo detto, si poteva presumere per queste cellule una composizione chimica del tut t~ diversa delle granulazioni. La nostra dimostrazione qu ind i prova the anche per il eielo cellulare quale si ha nei Mammlferi sussiste quella completa uniformR~ nella cara~teris~ica istochimlea che noi abbiamo dimostrato essere insita helle eellule enteroeromaffini per l ' intera serie dei Vertebrati.

Un fat to gi~ nettamente, come abbiamo de,to in preeedenza, osservato da CrAccm pub seeondo noi perme~tere di avanzare, in via affatto ipotetica, e forse anche in modo ua pb azzardato, qualehe eonsiderazione t h e , pur non avendo in s6 valore assolutamente probativo, pub tu t tav ia rappresentare una valida base per indirizzare le rieerche sulla na tu r a ehimiea della catena laterale che si t rova in posizione para, problema ehe rimane de1 tu t to oseuro e ehe si pub dire sia un ' importante incognita nella istochimica delle enteroeromaffini.

C ~ c c m osserva: , , . . . . quando i granuli assumono una leggera t in ta gialla dope l'azione del eromo assumono faeilmente aleuni colori d'anilina come per es, la saffranina e la fuxina acida", e noi possiamo aggiungere the la aeidofilia del granulo diminuisce in proporzione alia intensit~ con cul si mostra cromlzzat0 i n modo che le eellule pi~ intensamente

Cellule enterocromaffini e cellule basigranulose acidofile nei Vertebrati. 769

eolorate in giallo in seguito a fissazione in Regaud dimostrano nella eolorazione secondo A L T M ~ - K U L L un'aeidofilia assai searss.

Come ~ ovvio la acidofilia di un granulo indica Is presenza in questo di sostanzs basics e i l grado maggior o minore di acidofilia pub venire in senso generale, considersto come espressione di vsriazionJi hells reazione slcalina.

Applisando questo concerto gener~le al nostro caso possiamo dire the varisndo la eoneentrazione della sostanza difenoliea nel granulo (tale b infatti la spiegazione she noi diamo de1 maggior o minor grado di eromaffini~) varia anehe ls basicit~ del granulo e poieh6 essa dimi- nnisee col crescere della sostanza difenolica noi possiamo ammettere the quests nel suo eomplesso, slmeno helle sondizioni d:i fissazione da noi sperimentute, abbia una funzione acids.

Noi erediamo the si possa attribnire sppunto s neutralizzszione pifi o meno spinta da parte del difenolo della sostanza basica granulate fonda- mentsle ls variazione dell'asidofilis de1 granulo.

La funzione acids della sostanza potrebbe esser dovuta oltrech6 sgH ossidrili fenolisi presenti nel nueleo piroestechinico anche alla satens laterale. Ors noi vediamo ad esempio the l 'adrenalina, put avendo anche essa i due OH del nucle0 piroeatschinieo, tut tavia, per la presenza del gruppo aminico delia Catena laterale, funziona come base. Queste considerazioni quindi si hanno portato s legittimamenVe ritenere ehe nella catens laterale seonosciuta de1 nostro difenolo non posss esistere un aggruppamento di ns tura basics tale da neutralizzare Is debole acidit~ de1 nude difenolico. Noi propendiamo piuttosto a rif~nere ehe la cstena latersle sis neutra o pi~ faeflmente contribnisca sneh'essa, forse in misura preponderante, a determinate il sarattere scido della sostanza difenolies sis perch6 diret tamente asida sis per il possibite eontenuto di gruppi a carattere negativo.

E ' evidente che qnesto nostro presupposto preso a base di ulteriori indagini potr~ portare a u n a pifi completa conoseenza della c\atena laterals, e d'al~rs parte permetter~ anehe di indagare in modo rszionale i dati gi~ numerosi, ma poco paragonabfli t ra loro e non bene anahzzabfli, circa l'azione dei vari fissativi sulle granulazioni.

Conclusioni. I risultati obbiettivi delle nostre ricerche si possono cosl brevement~

riassumere: 1. ~ Le cellule enterocromaffini sono presenti nells inters serie dei

Vertebra~i ad eccezione dei Cielostomi e dei Teleostei. I grannii di questi elementi datum in tu t te le specie considerate la eromo, t 'argento e la diazoreazione positive.

2. ~ Da tali risultati si pub dsdurre come sonssguenza che nelle granula, zioni ~ sempre presente una stessa sostanza chs anche nei, come Lmo~

M~ffo ViMli e Vitt~3rio Erspamer:

e CL~A, crediamo di potsr identifieare come un ortodifenolo avente in posizione para una catena laterale sconosciuta e probabi[mente non molto somplessa, ed una posizione erie libera.

32 In via di supposJzione noi slime portati ad ammetSere che 1~ sostanza abbia complessivamente carattere aside e quindi pensiamo the la catena latera!e non possa avere carattere Msalino, ma piuttosto neutro o fors'anche aeido.

4. ~ Nei Mammiferi possiamo distinguere due tipi di eellule a granuli basMi: a) cellule enterocromaffini; b) ssllule basigranulose acidofile dell'intestine poster/ore di gatto e cane.

5. ~ Del gruppo delle cetlule enterocromaffini fanno anehe parts le eellule da noi chiamate cellule enterocromaffini a granuli asidofili, da alsuni Autori erroneamente considerate in bloceo con le basigranulose a~idoffle. Esse rappresentano semplicemente uno stadio funzionale della eellula eromaffine caratterizzato da una minore concentrazione di difenolo nei gTanuli.

6. ~ Le cellule basigranulose acidoffle del gatto e del cane non darmo nessuna delle tre reazioni caratteristishe e quindi non possono sontenere sostanzo fenoliche copul~bili. I1 lore significato ci appare tuttora oscuro e degno di ulteriore indagine.

Appendice. La denominazione delle cellule enterocromaffini ~ certo resa assai

complicata dMla eMstenza di sinonimi numerosi spesso tra lore non del tutto corrispondenti. Anche recentemente CLarA ha suscitato la questione della nomenclatura sostsnendo che il nome da lui adottato di cellule basigranulose deve essere acsolto in contrap posto alle altre denominazioni usate dagli Autori e di ci6 ha cercato di dare una dimostrazione.

Noi sosteniamo ehe il termine enterocromaffine debba esser mantenuto almeno nella nomencla~ura italiana per le seguenti ragioni:

1.~ Esso b il termine adottato da CL~CCzo, il primo Autore ItMiano the delFargomento si 6 ocsupato e d'Mtra parte esso ~ il hOme ado~tato da molti degli Autori sussessivi.

Anche se la scoperta de1 meceanismo chimico delia cromoreazione ha dimostrato che fl solore ehe i granuli assumono non dipande diret- tamenfe dal creme ma da un processo di ossidazione the i sali di sromo ingenerano, non ei pare per questo che si debba scartare il home come non si b scartato, anchc dope the b state proposta la denominazione pi~ razSonMe di ,,feosrome", il nome di cellule sromaffini per le esllule ach'ena- linogene.

2. ~ CLARA d~ alia cromoreazione un vMore assai minore di quello the le spctta in base alle nostre ricerche. L'aver dimostrato che in tut ta la serie dei ~r la cosidetta cromaffinit~ ~ criterio, nesessario e sufficiente per stabilire l 'appartenenza di un elemento al sistema delle

Cellule enterocromaffi~fi e cellule basigranulose acidoffle nei Vertebrati. 771

cellule enterocromaffini rappresen~a seeondo noi la migliore giusti- ficazione del home.

3. ~ Esiste centre iI home proposto da C ~ A una possibilit~ di con- fusione generata dal fatto the col t e m i n e di cellule basigranulose acidofile vengono da T ~ v ~ designati elementi che noi, anche dope accurata analisi istochimica, non ci sentiamo di ritenere senz'altro come parte integrante del sistema.

Per questi elementi anche noi abbiamo mantenu~o il home di cellule basigranulose aeidofile, sebbene esso non ei appaia del tu t to soddisfaeente.

4. ~ La distinzione proposta da CLA~ in cellule basigranulose gialle e aeidofile non regge per fl sistema cellulare quale noi lo comprendiamo, poich6 noi abbiamo dimostrato che l 'ambito delle tre reazioni: cromiea- argentica e diazo coincide nell~ maniera pifl perfetta.

5. ~ Anebe dal punto di vista strettamente morfologieo il termine di basigranulose non risulto del tut to soddisfacente.

Si potrebbe pensare all'utflitk di eereare un home nuovo in base alia ns chimiea dei granuli ma noi in questo concordiamo con CL~_~A nel Voler rimandare 1~ scelta di tale nuova denominazione a quando la natura chimic~ dei granuli sar~ stata pifi esattamente stabilita.

ZusammenIassung. 1. Die enterochromaffinen Zellen kommen in der ganzen Wirbettier-

reihe vet, mit Ausnahme der Cyelostomen und der Teleostier. Die K6rnchen dieser Zellen geben bei allen erforsehten Arten einen positiven Ausfall der Chrom-Silber- und Diazoreaktion.

2. Aus solchen Ergebnissen kann man den Schlul~ ziehen, da~ in den Granula immer eine gleiche Substanz vorhanden ist, die wir, mit LIso~ und CL~A, als Ortho-diphenol ansehen zu kSnnen glauben, das in Parastellung eine unbekannte und vielleicht nicht sehr komplexe Seitenkette t r~gt und eine freie Orthostetlung hat.

3. Als Hypo~hese kSnneu wir vielleicht annehmen, da$ die Substanz insgesamt sauer wirk~, und denken also, dab die Seitenkette nich~ alkaliseh sein kann, sondern neutral oder gar sauer.

4. Bei den Stugetieren k5nnen wir zwei Typen yon Zellen mit basalen Granula unterscheiden: a) enterochromaffine Zellen, b) acidophile, ba~al- gek(irnte Zellen des distalen Damabsehni t tes der Katze und des Hundes.

5. Aueh die Elemente, die wit als enteroehromaffine ZeUen mi~ aeidophilen Granula bezeichnen, k(innen wit zu den enteroehromaffinen Zellen gruppieren; solche ZeUen werden yon einigen Autoren irrtiimlich als aeidophfl basalgek6rnte Zellen angesehen. Die enterochromaffinen ZeUen mit a~idophilen Granula stellen einfaeh ein funktioneIles Stadium der chromaffinen Zelle dar, das dutch eine geringere Diphenolkonzentra- tion eharak~erisiert ist.

772 Ma~o Vialli e Vittorio Erspamer:

61 Die a c i d o p h i l e n ba sa lgekTrn t en Ze l l en de r K a t z e u n d des H u n d e s

g e b e n k e i n e n p o s i t i v e n Ausfa l l t ier d re i c h a r a k t e r i s t i s c h e n R e a k t i o n e n u n d k S n n e n d a h e r ke ine k u p p e l b a r e pheno l i sche S u b s t a n z e n t h a l t e n . I h r e B e d e u t u n g b le ib t uns b i she r ganz ungek l i i r t u n d b e d a r f n o c h w e i t e r e r

UnSersuehungen .

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Cellule enterocromaffini e cellule basigranulose acidofile nei Vertebrati