Cepas tipo_RMRibas

8/2/2019 Cepas tipo_RMRibas

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Para conta r con c arac terstic asfenotp ic as y geno tp icasnicas de la espec ie.

Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN

Es un ma terial biolgic o d e referenc iacertificado.La c olecc in d e d onde se ob tienen (p e j.ATCC) c ertific a q ue ha suministrad o unadete rminad a ce pa , que e s un cultivo puro,y que se ha c arac terizad o po r prueba smorfolgicas, bioqumicas y molecularesadecuadas.


Investiga cin c ientfic a y tec nolgica Estudios epid emiolg icos Estudios de diversidad microb iana Estudios de evoluc in Desarrollo tecnolgico

Obtenc in y co ntrol de p rod uctosfarmacuticos, incluyendo los biolgicos.

Control de c alidad en o tros tipo s deindustria (p ej. la industria a lime nta ria )

Control de c alidad en la clnica

entre o trasDra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN

Para demostrar trazabilidad.

El nmero y la elec c in del gne ro yespe c ie de los mismos de pe nde r delos ensayos que se e fec ta n y lasnec esida des particula res de stos.


Evaluac in de la c alidad de los med ios decultivo.

Rea lizac in de c ontrol de ca lida d internodurante la ejec ucin d e los ensayos.

Rea lizac in de c ontroles de c alidad d ereactivos.

Realizacin de pruebas confirmatorias.

Valida cin de mtod os.Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN


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Viabilidad

Pureza (lib re d e c ontam inante s).

Que no presente c am bios fenotpic os nigenotpicos

Recuperar:

En la misma c ond icin a la q uetena ante s de ser c onservado .Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN

Es e l p roceso de verif icac in dela identidad d e una c epatipo, a l c omparar lasc a ra c t erst ic a s d e la c e p a t ip oc o n a q ue lla s e sta ble cid as a lnivel d e esp ec ie y d e c ep a.


Es el someter una cepa auna serie de pruebas:

morfolgicas, fisiolgicas, moleculares, inmunolgicas, etc.

y que son caractersticaspara cada cepa en loparticular.


Plazo corto: Cultivo en me dio inclinado

Plazo med iano:

Cultivo en me dio inclinad o e inmerso en a ce itemineral

Cultivo en me dio lquido y ma ntenido a -20oC

Cultivo deseca do en un sopo rte de p ap el filtroPlazo largo :

Cultivo en me dio lquido y ma ntenido a -70oC a-196oC Cultivo liofilizad o

Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN


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Consideraciones:

Mtod o simple Cada pase aumenta la probabil idad de

mutacin.

Requiere espa cio de laboratorio

El tiempo de c onservacin vara dep endiendo

de la espec ie bac teriana

El tiempo d e estabilida d g entica vara

dependiendo d e la espec ie bacterianaDra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN

El med io:

Debe c onte ner nutrientes que pe rmitan el desarrollobac teriano a una velocidad ba ja

No de be ser restrict ivo en nutrientes, ya q ue p ued e

favorecer mutaciones adaptativas

Rico favorece el crecimiento y debe realizarse pases

ms frecuentem ente

Caldo soya tripticasena con c rioprotec tor es un buen

ejemplo.


El med io con el cultivo co nservado:

En una c aja d e Petri a tem peratura am biente sufre

desecacin.

En un tubo de rosca co n sello d e p arafilm, a

temp eratura am biente y lejos de la luz pued e

c onservarse po r me ses.

En un tubo de rosca co n sello d e p arafilm, a 4oC y

lejos de la luz pue de co nservarse po r ms meses

(excepto especies con enzimas autolticas)Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN

En un tub o d e rosc a c on sello d e

para film, a 4oC, lejos d e la luz einmerso en ac eite mineral p ued e

c onserva rse p or 2 o tres aos


En un c riotub o de rosc a, a -20oC

pued e c onserva rse p or 6 me ses a

2 aos



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En una bo lsa c on c ierre he rm tico ylas tiras de p ap el filtro imp reg nad as

c on la b ac teria y d esec ad as al vac o

pue de n c onservarse ha sta 4 aos

Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN


Ultracongelador, -

70oC

Nitrg eno lquido , -

196oC


Viales. Plstico o

vidrio


GLICEROL AL 25% +SUERO DE CABALLOCALDO SOYA TRIPTICASEINACALDO TOOD HEWITT YEMA DE HUEVO

DIMETIL SULFXIDO

ETILEN Y DIETILEN-GLICOL



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Entra a la c lula, glice rol 10%> d imetil

sulfxido (DMSO) 5%

Alred ed or de la c lula, lec he

descremada 20%> manitol> dextran>

po livinil pirrolido na> po liglic ol


Conge lac in del c ultivo:

Congelac in controlad a 1oC/min

Nitrgeno lquido primero en

ultracongelador

Ultrac ongelador direc tamente


Desc ong elac in de l c ultivo:

Punto c rtico -35oC a -5oC

Rp ida a 37oC


SUBLIMACIN DEL AGUA A

PRESIONES REDUCIDAS

EL AGUA ES SEPARADA DE

LA MUESTRA A PARTIRDE

CRISTALES DE HIELO PURO Y

ELIMIN NDO SE LENTAMENTE EN

FORMA DE VAPOR


En la ma yora d e los casos es el mejor m tod o

de c onservac in (no ag ua, no c ristales).

Hasta 30 aos para b ac terias

Daino para hongos, protozoarios y virus


Viales. vidrio



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Soportes

Lec he d escrem ad a a l 20% pa ra liofilizac in

en cma ra

Sac arosa a l 12% para liofilizac in d e

entradas mltiples


PENETRAN A LA CLULA

Son cap ace sd e difundirse en ella y diluirlos

electrolito internos.

NO PENETRAN A LA CLULA

La fun ci n e s p ro vo c a r la sa lid a d e l a g ua ,

aumentando la concentrac in in terna de los

solutos


Leche descremad a

Aminocidos

Azcares

Protenas


LAS CEPAS LIOFILIZADAS SE MANTIENEN VIABLES, PURASY CON SUS CARACTERSTICAS ESTABLES POR VARIOSAOS SIN REQUERIR ALMACENAJE EN CONDICIONESESPECIALES.

LOS CAMBIOS QUMICOS SON MNIMOS YA QUE SEPREVIENEN MEDIANTELA ADECUADA CONC ENTRACINDESOLUTOS Y EL USO DE BAJAS TEMPERATURAS, LO QUEDISMINUYELA VELOCIDAD DELAS REACCIN QUMICA


ALTO COSTO DEL EQUIPO

REQUIERE DE MAYOR ESPACIO

PERSONAL CAPACITADO

SE HA COMPROBADO QUE PUEDE INDUCIR

MUTACIONES


Mtodo deconservacin

Crioprotector Temperatura deconservacin (oC)

Tiempo deconservacin

(aos)

Subcultivo Ninguno Ambiente 0.3

Aceite mineral Ninguno 4 0.6-2

Co ng el ac i n Sac ar os a

Glicerol

-20 1-3

Ultracongelacin Leche descremada

Sacarosa

Glicerol

-70 -196 1-30

L iof i lizacin Leche descremada

Sacarosa

4 30



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Mtodo deconservacin

Crioprotector Temperatura deconservacin (oC)

Tiempo deconservacin

(aos)Subcultivo Ninguno Ambiente 0.1-0.3

Aceite mineral Ninguno 4 1-2

Co ng el ac i n Sac ar os a

lactosa

-20 1-2

Ult racongelacin Sacarosa,

Lactosa

Glicerol

-70 -196 2-30

Liofilizacin Leche descremada +

Sacarosa+ Lactosa

4 30


1 era op cin: Obtenc in direc ta a p artir de unacolecc in nacional o internacional reco nocida.

2 da opc in: Provee do res come rciales ce rtificad os.Come rcializan resiembras de ce pa s de referenciaad quiridas en una c oleccin reconocida.Gene ralmente e l 3o o 4o pa se. Debe n ma ntener susrecipientes originales. Requerimiento en la recepcin(com pra de insumo) : ce rtificad o de origen dond eco nste el nmero de p ase y el origen d e la ce pa , entreotros.


AOAC FDA

NCCLS

USP

FARMACOPEAS: CEU,JAPN, UK, MXICO

Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN America n Type Culture Collection

Dra.RosaMaraRibas,ENCB-IPN

ATCC- Ame rican Type

Culture Colle ctio n, EE.UU.

NCTC- National Collection

of Typ e Cultu res-Reino

Unido ENCB- Mxico

CECT- ColeccinEspaola de Cultivos Tipo


http:// www.atcc .org/CulturesandProducts/Mic robiology/ BacteriaandPhages/FeaturedCultures/tab id/1788/Default.aspx#co li

Dra.RosaMaraRibas,E

NCB-I

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NCB

-IPN

EL ABASTO O CULTIVO PARA DISTRIBUCI NSE DERIVA DE UN ABA STO SEMILLA Y ES ELQUE SE OFRECE A LOS LABORATORIOS

SOLICITANTES A MA NERA DE C ULTIVOMAESTRO.

SE DEBE DETERMINAR:

PUREZA, VIABILIDAD IDENTIDAD ESTABILIDAD DEL FENOTIPO


Esquemade cultivosdereferencia:

*Controlesde pureza ypruebasbioqumicas

de la cepa.

Sesubcultivauna solavez

Solo se acepta un pase

Sistema lote-semilla

Modificado de la FAODra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN

Adq uisicin de c epa de referenc ia (Cepade referencia):

- Req uisitos de co mp ra y registro de lacep a adq uirida.

Subcultivo de Cepa de referencia:- Control de p ureza y viabilida d (REGISTRO). Preparacin de la cep a d e reserva.- Control de p ureza y viabilida d peridicos

(REGISTRO) .- Registro de c ada frasco de la nueva c epa

de reserva incorporada al ce pario.

PROVEEDOR DE CEPA

LABORATORIO

LABORATORIO


Las c ep as de referencia ingresan a llaboratorio de microbiologa se registransegn procedimiento.

Se a lmac ena n entre 0-5 C hasta su uso. Se reconstituyen y se siembran utilizandoel med io de c ultivo, las c ond iciones deincub ac in y el proc edimiento indica doen las instrucc iones pa ra c ad a t ipo d emicroorganismo.

En paralelo, se les realiza un control deca lidad de p ureza y viab ilida d y seregistra.


Definicin: Cepas idnticas obtenidas mediante unnico subcultivo de una cepa d e referencia.[ISO 11133-1:2000].Las cep as de reserva son una serie de alcuota s decultivos idnticos obtenidas en el laboratorio porsubcultivo de la c epa de referencia.

Las obtenemos siguiendo el sistema lote semilla.CREF

Cres

Cres

Cres

Cres

Cres

Cres

PASE

UNICO

Las cep as de reserva las prep ara y c onserva el lab orato rio.

Dra.RosaMaraRibas,ENCB-I

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Dentro d el lab oratorio de be ha ber un lugardestinado p ara

almac enar las cepas de reserva.

Debe e star clarame nte sealad oque se trata de ce pa s potenc ialmente peligrosas

y su m anipula cin restringida

a persona l autorizado.


Identificac in del tipode cepa .

Gnero y espec ie delmicroorganismoTipo y N decoleccin.N de lote.Fecha de recep cin.Control de ca lidad dela cepa de referenciaConfo rme (SI/NO).Fecha de c aduc idadde la cepa.Personal responsable.

REGISTRO DECEPAS DE RESERVA:


En el ca so d e d esco ngelamiento d e las ce pa s dereserva, stas no de be n volverse a co nge lar.

El criovial co n cultivo vencido se elimina d elcep ario y se registra.

Cuand o se fracc ionan alcuota s en leche u o trosag ente s crioprote ctores, se usan, se d esco nge lany no se pueden volver a congelar ni a usar.

Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no sepued en vo lver a usar.


Subc ultivos de m icroorganismos obtenidos apa rtir de la s c epas de reserva para serutilizad os en los ensay os que lo prec isen.

Obtencin de ce pas de trabajo:Los c ultivos de traba jo se ob tienen a pa rtir de laCep as de reserva sob re un med io slido o lquido noselectivo adecuado utilizando un asa estril eincuba ndo en c ondiciones adec uadas.

Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.Dra. Rosa Mara Ribas, ENCB-IPN

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