Chimie Analytique II–

Spectrophotometrie d’absorption moleculaireEtude et dosage de la vitamine B6

Daniel Abegg – Nicolas Calo – Emvuli Mazamay – Pedro Surriabre

Universite de Geneve, Science II, Laboratoire 144 – Groupe 4

29 decembre 2008

Resume

Dans cette experience, nous avons determine grace a des methodes graphiques et nume-riques que la constante de dissociation entre la forme neutre et acide de la pyridoxineest en moyenne 4.64. Nous avons aussi dose la concentration de cette molecule dans unepreparation commerciale pour trouver qu’elle etait d’environ 40 mg comme indique surla boite du medicament.

Introduction

L’absorbance d’un compose se definit comme le rapport entre l’intensite de la lumiereincidente et celle de la lumiere emise. Selon la loi de Lambert-Beer, elle est proportion-nelle a la concentration de la substance et a son cœfficient d’extinction molaire et varieen fonction de la longueur d’onde λ. A une certaine valeur de λ, cette absorbance estmaximale, il s’agit du pic d’absorption. La capacite a absorber la lumiere depend de lastructure du compose (type de liaison, cycle aromatique), ce qui permet de differencierla forme protonee de la forme neutre d’une espece.

La pyridoxine se presente sous trois formes : acide, neutre et basique (figure 1) qui ontdes spectres et des pics d’absorption differents. Le but de ce TP est de determiner leslongueurs d’onde des maximum d’absorption des formes acide et neutre. Ces valeurspermettront de calculer les coefficients d’extinction molaire des deux especes mentionneeset de determiner la constante acide-base du compose. Grace a ces donnees, un dosage dela pyridoxine dans des tablettes pharmaceutiques sera effectue.

1

K1K2

NH

HO

OH

OH

NH

OH

OHO

NH

OH

OHO

forme acide forme neutre forme basique

.

.

Fig. 1 – Les trois formes de la pyridoxine avec les constantes de dissociations

Methodologie et resultats

Les spectres (annexe 1) sont mesures, apres que calibrage du blanc (tampon pH 4.04)a ete fait, pour deux solutions de pyridoxine 9.97 10-5 M, l’une dans un tampon de pH1.56 et l’autre a pH 6.45. Ceci nous permet de determiner les deux longueurs d’ondes quiseront utilisee par la suite : 291 nm et 324 nm.

Cœfficients d’extinction molaire

ε =A

l c

AH+2 AH

λ [nm] 291 324 291 324Absorbance 0.8481 0.0017 0.2143 0.6866ε [l/(cm mol)] 8505.8 17.0 2149.3 6886.1

Tab. 1 – La forme acide est dans un tampon a pH 1.6 et la forme neutre a pH 6.45. Laconcentration de la pyridoxine est de 9.97 10-5 M.

Methodes de calculs de la constante de dissociation pK1

Des solutions de pyridoxine 9.95 10-5 M a pH different (entre 1.56-6.45) sont preparees(table 9) et leur spectre est mesures (table 2 et annexe 2).

2

Methode 1

Cette methode est basee sur l’additivite de la loi de Lambert-Beer.

A291 = l(ε291

AH [AH] + ε291AH+

2[AH+

2 ])

A324 = l(ε324

AH [AH] + ε324AH+

2[AH+

2 ])

A291 ε324AH [AH] + A291 ε324

AH+2

[AH+2 ] = A324 ε291

AH [AH] + A324 ε291AH+

2[AH+

2 ]

[AH] =A324 ε291

AH+2

− A291 ε324AH+

2

A291 ε324AH − A324 ε291

AH

[AH+2 ]

K1 =[AH] [H+]

[AH+2 ]

= 10−pHA324 ε291

AH+2

− A291 ε324AH+

2

A291 ε324AH − A324 ε291

AH

Methode 2

La deuxieme methode utilise la loi d’action de masse et l’approximation que seul l’especeneutre absorbe a la longueur d’onde 324 nm.

[AH] =A324

ε324AH l

K1 =[AH] [H+]

[AH+2 ]

=[H+] [AH]

(C0 − [AH])= 10−pH

A324

ε324AH l(C0 − A324

ε324AH

)pH Abs291 nm Abs324 nm pK1

methode 1 [AH] pK1methode 2

1.56 0.8481 0.0017 – 2.47 10−7 –2.50 0.8397 0.0139 4.24 2.02 10−6 4.183.15 0.8160 0.0342 4.45 4.97 10−6 4.444.04 0.7013 0.1619 4.56 2.35 10−5 4.664.78 0.6157 0.3863 4.80 5.61 10−5 5.025.46 0.3071 0.6010 4.67 8.73 10−5 5.516.45 0.2143 0.6866 – 9.97 10−5 –

Tab. 2 – Les valeurs de pK1 de la pyridoxine au differents pH selon deux methodes decalculs.

3

Methode 3

Il existe une troisieme methode pour determiner le pKa. Selon la formule suivant.

pK1 = pH− log[AH]

[AH+2 ]

Un graphique (figure 2) des concentrations des especes, calculees selon la methode 2, enfonction du pH est trace. Pour annuler le second terme de l’equation, on se place la ou lesconcentrations de la base et de l’acide sont egales soit au point d’intersection des courbes.Le pH a ce point sera donc le pKa cherche.

1e−05

2e−05

3e−05

4e−05

5e−05

6e−05

7e−05

8e−05

9e−05

0.0001

2 3 4 5 6

1e−05

2e−05

3e−05

4e−05

5e−05

6e−05

7e−05

8e−05

9e−05

0.0001

2 3 4 5 6

pHpH

Ci

Ci

AH

AH+2

Fig. 2 – Concentration de la forme acide et base de la pyridoxine en fonction du pH

Valeurs de pK1

methode 1 methode 2 methode 3 valeurliterature[2]moyenne 4.54 4.76 4.64 4.84ecart type 0.21 0.52 – 0.01intervalle 95% 0.19 0.45 – –

Tab. 3 – Les valeurs de pK1 de la pyridoxine selon 3 differentes methodes de calcul

Dosage quantitatif de la pyridoxine dans une preparation phar-maceutique

La concentration en pyridoxine (vitamine B6) d’une tablette de chez Streuli annoncee a40 mg sera analysee selon deux methodes : une courbe de calibrage externe et interne(methode des additions connus)

4

Droite de calibration externe

Des solutions a differente concentration de pyridoxine sont preparees (pH 1.56) et leurabsorbance est mesuree a la longueur d’onde de 291 nm.

Cpyridoxine [M] 10-5 2 10-5 4 10-5 6 10-5 8 10-5 10-4

Absorbance 0.0716 0.1459 0.3061 0.4523 0.6155 0.7606

Tab. 4 – Absorbance de la pyridoxine a differente concentration a λ =291 nm dans untampon pH 1.56

Trois tablettes sont broyees, solubilise dans le tampon a pH 1.56, filtrees et remplient a250 ml. Puis ces solutions sont diluees par un facteur de 10 et leur absorbance est mesureea la longueur d’onde de 291 nm

masse des tablettes [g]tablette 1 0.2032tablette 2 0.2002tablette 3 0.1986

Tab. 5 – Masse des trois tablettes de pyridoxines a analyser en g.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

1e−05 2e−05 3e−05 4e−05 5e−05 6e−05 7e−05 8e−05 9e−05 0.0001

Droite de calibration externe

C pyridoxine [M]

Abs

orba

nce

291

nm

f(x) = 7692.49x− 0.005R2 = 0.99

Fig. 3 – Droite de calibration externe de la pyridoxine

5

Absorbance Cpyridoxine [M] npyridoxine [mol] massepyridoxine [mg]tablette 1 0.6619 8.67 10−5 2.17 10−4 44.59tablette 2 0.6190 8.12 10−5 2.03 10−4 41.72tablette 3 0.6186 8.11 10−5 2.03 10−4 41.69moyenne 0.63 8.30 10−5 2.08 10−4 42.67ecart type 0.02 3.23 10−6 8.09 10−6 1.66intervalle 95% 0.03 3.66 10−6 9.15 10−6 1.88

Tab. 6 – Resultats de l’analyse de la pyridoxine dans les tablettes de Streuli selon lamethode dans la droite de calibration externe.

Methode des additions connues

Cette methode se base sur une droite de calibration interne. Les solutions contenant lapyridoxine des tablettes se verront ajouter une petite quantite (volume connu) de pyridox-ine de la solution stock (9.95 10-5 M). Le volume ajoute est considere comme negligeable.

Les solutions de pyridoxine dans les fioles des 250 ml sont diluees par dix, puis 400µlsont preleve et diluees dans 25 ml. de tampon pH 1.56 et finalement le differents volumesde solution stock sont ajoute.

najoute [mol] 0 1.00 10−7 2.00 10−7 3.00 10−7 4.00 10−7 4.75 10−7

Vajoute [L] 0 1.00 10−4 2.00 10−4 3.00 10−4 4.00 10−4 4.75 10−4

tablette 1 – 0.1361 0.1672 0.2109 0.2456 0.252tablette 2 0.1057 0.127 0.1664 0.2016 0.2236 –tablette 3 0.0988 0.1304 0.1627 0.1819 0.2173 0.2301

Tab. 7 – Volume ajoute de pyridoxine dans la solution de pyridoxine a analyser ainsi queles absorbances mesurees.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 1e−07 2e−07 3e−07 4e−07 5e−07 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 1e−07 2e−07 3e−07 4e−07 5e−07 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 1e−07 2e−07 3e−07 4e−07 5e−07

C pyridoxine [M]C pyridoxine [M]C pyridoxine [M]

Abs

orba

nce2

91

nm

Abs

orba

nce2

91

nm

Abs

orba

nce2

91

nm

pastille 1 pastille 2 pastille 3

Fig. 4 – Droites de calibration interne de la pyridoxine

pastille 1 f(x) = 3.290 106 x+ 0.105pastille 2 f(x) = 3.104 106 x+ 0.103pastille 3 f(x) = 2.995 106 x+ 0.105

6

Pour connaıtre la concentration de la pyridoxine il faut calculer le point ou l’absorbanceest egale a zero (y = 0). Ceci nous donnent la concentration, en valeur absolue, depyridoxine de l’echantillon.

npyridoxine diluee [mol] npyridoxine [mol] massepyridoxine [mg]tablette 1 3.20 10−7 2.00 10−4 41.12tablette 2 3.31 10−7 2.07 10−4 42.55tablette 3 3.51 10−7 2.19 10−4 45.09moyenne 3.34 10−7 2.09 10−4 42.92ecart type 1.57 10−8 9.79 10−6 2.01intervalle 95% 1.77 10−8 1.11 10−5 2.28

Tab. 8 – Concentration de pyridoxine dans les tablette de Streuli selon la methode desadditions connus

Discussion

Les deux longueurs d’onde choisies sont 291 et 324 nm car elles correspondent aux maxi-mums d’absorption des especes ce qui donnera une sensibilite opptimale.Lors des mesures, on se place a pH 1.56 car a celui-ci, seul la forme acide existe.

Un point isobestique correspond a une longueur d’onde ou les cœfficients d’extinctions mo-laires sont egaux pour toutes les especes en solution (maximum deux especes en equilibre).En travailant a cette longueur d’onde ont peut ainsi estimer plus facilement les concen-trations des solutes.

D’apres les resultats obtenus, on constate que la methode 2 est moins fiable que lamethode 1. En effet les erreurs pour celle-ci sont plus grandes (environ le double) et uneapproximation a ete faite car l’absorbance de l’acide a 324 nm a ete negligee (∼ 0.25% del’absorbance de l’espece neutre a cette longueur d’onde).La methode 3 est de loin la moins precise car cette derniere repose sur l’approximationde la methode 2 et sur des regressions lineaire entre deux points sur des courbes. Par cefait nous ne pouvons pas calculer l’erreur mais elle ne peut etre que plus importante.La methode 1 est la plus precise car elle ne fait intervenir aucune approximation.

Les pK obtenu sont plus ou moins proche de la valeur trouve dans la litterature (4.84),mais cette derniere n’a pas ete faite dans les memes conditions (force ionique 0.15 M).

Les valeurs trouvees de concentration en pyridoxine dans les tablettes Streuli, selon lesmethodes sont presque identiques. On trouve comme indique sur l’emballage environ40 mg. Les erreurs sont legerement plus grandes pour la methode de additions connuescar nous avions plus de manipulation (source d’erreur) et le volume de solution stocka ete neglige (environ 5% de volume en plus pour la solution la plus concentree). Lesdeux methodes se valent, la calibration externe est plus adaptee si l’on a au prealable

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une estimation de la concentration. D’un autre cote la methode des additions connuespermet de determiner la concentration d’un echantillon inconnu.

Conclusion

Dans cette experience nous avons dans un premier temps determine le pK de la pyridox-ine selon differentes methodes et avons trouve des valeurs aux environs de la valeur dereference.Par la suite sa concentration a ete determinee par une droite de calibration externe puisinterne (additions connues) et les resultats obtenus sont en accord avec la valeurs indiqueesur la preparation pharmaceutique. Les deux methodes ayant donnes les memes resultats,elles sont toutes deux utilisables pour un tel dosage.

Annexe

pH X ml Na2HPO4 Y ml acide citrique2.2 0.40 19.603.0 4.11 15.893.6 6.44 13.564.4 8.82 11.185.0 10.30 9.705.6 11.60 8.406.6 14.55 5.45

Tab. 9 – Valeur pour la preparation des tampons. 20 ml d’un melange de X ml deNa2HPO4 a 0.2 M et de Y ml d’acide citrique a 0.1 M.[1]

References

[1] M. Borkovec. Lab journal of analytical chemistry II : Spectrophotometrie d’absorptionmoleculaire. Etude et dosage de la vitamine B6, 2008.

[2] R.I. Allen, K.J. Box, J.E.A. Comer, C. Peake, K.Y. Tam. Multiwavelength spectropho-tometric determination of acid dissociation constants of ionizable drugs. Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis, 17 :699–712, 1998.

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