Upload
leanne
View
58
Download
2
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Cilj nastave :. Principi LDg PGI : dlake nokta kože sluzokože oka uva. 2. Principi LDg IGI: aglutinacija , precipitacija , ELISA, PCR, PH invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija. 3. Metode identifikacije gljiva - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
1. Principi LDg PGI: dlake nokta kože sluzokože oka uva
1. Principi LDg PGI: dlake nokta kože sluzokože oka uva
Cilj nastave:
2. Principi LDg IGI:
aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH
invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija
2. Principi LDg IGI:
aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH
invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija
3. Metode identifikacije gljiva
Metode ispitivanja
osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest
3. Metode identifikacije gljiva
Metode ispitivanja
osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest
4. Epidemiologija GI
Rizične grupe pacijenata Endemske GI
(bifazne i subkutane mikoze)
Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze
4. Epidemiologija GI
Rizične grupe pacijenata Endemske GI
(bifazne i subkutane mikoze)
Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze
STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE (KONVENCIONALNE METODE)
1. MIKROSKOPSKI PREGLED BOLESNICKOG MATERIJALA
direkni mikroskopski preparat(DMP) patohistologija (PH)
2. IZOLACIJA GLJIVA IZ BOLESNICKOG MATERIJALA
m i k o l o š k a k u l t u r a (MK)
STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE (KONVENCIONALNE METODE)
1. MIKROSKOPSKI PREGLED BOLESNICKOG MATERIJALA
direkni mikroskopski preparat(DMP) patohistologija (PH)
2. IZOLACIJA GLJIVA IZ BOLESNICKOG MATERIJALA
m i k o l o š k a k u l t u r a (MK)
OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE DIJAGNOZE GI
IMUNOLOŠKE METODEDOKAZIVANJE ANTITELA (At)
DOKAZIVANJE ANTIGENA (Ag)
DOKAZIVANJE BIOMARKERA
IMUNOLOŠKE METODEDOKAZIVANJE ANTITELA (At)
DOKAZIVANJE ANTIGENA (Ag)
DOKAZIVANJE BIOMARKERA
MOLEKULARNE METODEDOKAZIVANJE DNK (PCR)
MOLEKULARNE METODEDOKAZIVANJE DNK (PCR)
DOKAZANA GIDOKAZANA GI VEROVATNA/MOGUĆA GIVEROVATNA/MOGUĆA GI
“z l a t n i s t a n d a r d”“z l a t n i s t a n d a r d”
STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE
(KONVENCIONALNE METODE)
• HEMOKULTURA NA GLJIVE
• BIOPSIJA
STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE
(KONVENCIONALNE METODE)
• HEMOKULTURA NA GLJIVE
• BIOPSIJA
OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE DIJAGNOZE IGI
“non culture” metode – izbor za LDg IGI
IMUNOLOŠKE METODE
DOKAZIVANJE At
DOKAZIVANJE Ag gljiva
DOKAZIVANJE BIOMARKERA
IMUNOLOŠKE METODE
DOKAZIVANJE At
DOKAZIVANJE Ag gljiva
DOKAZIVANJE BIOMARKERA
MOLEKULARNE METODE
DOKAZIVANJE DNK (PCR)
MOLEKULARNE METODE
DOKAZIVANJE DNK (PCR)
Problem: retko pozitivne, invazivna metoda uzorkovanja, spore
Problem: retko pozitivne, invazivna metoda uzorkovanja, spore
Prednost: Rana Dg IGI
Senzitivne
Brze
Prednost: Rana Dg IGI
Senzitivne
Brze
Prednost:Rana Dg IGI
Visoko senzitivne
Brze
Prednost:Rana Dg IGI
Visoko senzitivne
Brze
Prednost: DOKAZANA IGIPrednost: DOKAZANA IGI
Problem: interpretacija nalaza At kod imunodeficijentnih osoba
Problem: interpretacija nalaza At kod imunodeficijentnih osoba
Problem: lako moguća kontaminacija uzoraka
Nisu standardizovane
Problem: lako moguća kontaminacija uzoraka
Nisu standardizovane
MikologijaKlinička
slikaFaktori
domaćina + + Verovatna IGI=
= Dokazana IGI MikologijaKlinička
slikaFaktori
domaćina + +
tkivo
Mikologija+Faktori domaćina
Negativna
Klinička slika+Faktori
domaćina
NegativnaNije
radjena=
=
Moguća IGI
Nova strategija dijagnoze IGI*
*EORTC/MSG kriterijumi*EORTC/MSG kriterijumi
Idealan dijagnostički test
• Senzitivan i specifičan• Visoka pozitivna prediktivna vrednost (PPV)• Visoka negativna prediktivna vrednost (NPV)• Jednostavan• Jeftin• Brz
• Senzitivan i specifičan• Visoka pozitivna prediktivna vrednost (PPV)• Visoka negativna prediktivna vrednost (NPV)• Jednostavan• Jeftin• Brz
Zašto “non cultural” metode (detekcija biomarkera)???
Principi testova
• Antigeni and antitela se lakše otkrivaju nego same gljive
Zašto biomarkeri?
Antitela se produkuju u velikoj količini i cirkulišuAntitela se produkuju u velikoj količini i cirkulišu
Solublni Ag gljiva često prolaze iz tkiva u cirkulaciju
Solublni Ag gljiva se nalaze i u urinu
Solublni Ag gljiva se mogu detektovati i kada su male količine
Solublni Ag gljiva često prolaze iz tkiva u cirkulaciju
Solublni Ag gljiva se nalaze i u urinu
Solublni Ag gljiva se mogu detektovati i kada su male količine
Kultura na gljive ima nisku senzitivnos:zbog malog broja gljiva u tkivu ili krvi – neophodan veći broj uzoraka
Kultura na gljive ima nisku senzitivnos:zbog malog broja gljiva u tkivu ili krvi – neophodan veći broj uzoraka
Ćelijski zid
Citoplazmatska membrana
Metaboliti
DNK/RNK
Candida Aspergillus Metode
Mannans1,3--D-glucanschitin
EnolaseHSP-90
arabinitol
C-14 lanosterol demethylaseChitin synthaseActinAspartate proteinaseRibosomal RNA
Galactomannan1,3--D-glucanschitin
D-mannitol
C-14-lanosterol demethylaseAlkaline proteaseMitochondrial DNAHSP-90Ribosomal RNA genes
LAELISARIAAmebocid lizatSpectrofotometrija
PCR
GLCMas. spektroskop.
ELISAImmunoblot
Biomarkeri gljiva i “non culture” metode
Strukture gljiva
“Non cultural” metode (aglutinacija, imunodifuzija, ELISA)
Principi Ag-At testova
Antigen Test
+
Latex obložen At Uzorak
(+) Ag gljiva
Antibody Test
Latex obložen Ag Uzorak (+) At na gljiva
+
Lateks aglutinacija (LA) – princip testa
Aglutinat
Aglutinat
Lateks aglutinacija (LA) – primena
Primena testa – detekcija Ag: Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA*)
Manan – Candida Ag (IK**)
Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag
Primena testa – detekcija Ag: Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA*)
Manan – Candida Ag (IK**)
Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag
Primena testa – detekcija At: Anti-galaktomanan-At
Anti-manan-At
Anti-glukuroksilomanan-At
Primena testa – detekcija At: Anti-galaktomanan-At
Anti-manan-At
Anti-glukuroksilomanan-At
LA – interpretacija nalaza LA – interpretacija nalaza *Invazivna aspergiloza
** Invazivna kandidijaza
*Invazivna aspergiloza
** Invazivna kandidijaza
Immunobiology, 4th Edition
Imunodifuzija (ID) – princip testa
Con
cent
rati
on
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Con
cent
rati
on
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kub
y Im
mun
olog
y, 4
th E
diti
on
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kub
y Im
mun
olog
y, 4
th E
diti
on
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Kub
y Im
mun
olog
y, 4
th E
diti
on
Imunodifuzija (ID) - princip testa
Imunodifuzija (ID) – primena
Primena:
aspergiloza (Ag, IgG)
subkutane mikoze (Ag, IgG)
endemske mikoze (Ag, IgG)
Primena:
aspergiloza (Ag, IgG)
subkutane mikoze (Ag, IgG)
endemske mikoze (Ag, IgG)
Pozitivan nalaz - precipitacijaPozitivan nalaz - precipitacija
Sandwich ELISA
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva
Sandwich ELISA
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Add Specimen
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva
Sandwich ELISA
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Add Specimen
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva
Sandwich ELISA
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Add SpecimenContaining Ag
Primena testa: • Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA)• Manan – Candida Ag (IK)
• Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag
Primena testa: • Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA)• Manan – Candida Ag (IK)
• Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)princip testa - detekcija Ag
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
(Specimen)
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At
Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition
(Specimen)
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At
Primena testa: • anti-Aspergillus IgA, IgM, IgG, IgE (IA, aspergilom, ABPA, astma)
• anti-Candida (IK) IgA, IgM, IgG
• anti-Cryptococcus IgM, IgG
• Specifična At pri sumnji na endemske mikoze
Primena testa: • anti-Aspergillus IgA, IgM, IgG, IgE (IA, aspergilom, ABPA, astma)
• anti-Candida (IK) IgA, IgM, IgG
• anti-Cryptococcus IgM, IgG
• Specifična At pri sumnji na endemske mikoze
“Non cultural” metode (PCR)
Principi PCR testa
Primena: Aspergiloza Kandidijaza Pneumocistis pneumonija
PCR ZA DIJAGNOZU IGI NIJE STANDARDIZOVAN!!!
Uzorci:
• krv
• serum
• tkivo
• BAL
• CSF
Uzorci:
• krv
• serum
• tkivo
• BAL
• CSF
Protokoli
• DNK ekstrakcije
• PCR dizajn
• Amplifikacije
Protokoli
• DNK ekstrakcije
• PCR dizajn
• Amplifikacije
Species/genus
specifične sekvence• HSP 90 • Lanosterol• demethylase • chitin synthase • aspartic proteinase• actin
Species/genus
specifične sekvence• HSP 90 • Lanosterol• demethylase • chitin synthase • aspartic proteinase• actin
Automatizovan metod izdvajanja DNK gljiva iz krvi
Ekstrakcija DNK
• Automatizovana
• Trajanje testa 16 h - 4 h
• In vitro osetljivost (1cfu/ml)
Ekstrakcija DNK
• Automatizovana
• Trajanje testa 16 h - 4 h
• In vitro osetljivost (1cfu/ml)
Kontaminacija (problem)
• tokom ekstrakcija
• tokom izvođenje testa
• tokom priprema proba
• tokom priprema reagenasa
Okolina!!!
Kontaminacija (problem)
• tokom ekstrakcija
• tokom izvođenje testa
• tokom priprema proba
• tokom priprema reagenasa
Okolina!!!
Metode patohistologije u dijagnozi IGI
Specijalna bojenja na gljive
GLJIVE - specijalna bojenja (HP)
Gomori methenamin silver (GMS):
Prednost: dobra vizuelizacija gljiva
Gljive: tamno braon – osnova zelena
Gomori methenamin silver (GMS):
Prednost: dobra vizuelizacija gljiva
Gljive: tamno braon – osnova zelena
H&E:
Prednost: dobro detektuje zapaljenski odgovor
Nedostatak: loša vizuelizacija gljiva
H&E:
Prednost: dobro detektuje zapaljenski odgovor
Nedostatak: loša vizuelizacija gljiva
Periodic acid-Shiff (PAS):
Prednost: dobra vizuelizacija gljiva
Gljive: crvene ili ružičaste – osnova zelena
Periodic acid-Shiff (PAS):
Prednost: dobra vizuelizacija gljiva
Gljive: crvene ili ružičaste – osnova zelena
Mucin (mucicarmin):
Prednost: dobra vizuelizacija kapsule gljiva
Kapsula: ružičasta – osnova sivo-roze
Mucin (mucicarmin):
Prednost: dobra vizuelizacija kapsule gljiva
Kapsula: ružičasta – osnova sivo-roze
Fontana-Masson:
Prednost: dobra vizuelizacija ĆZ gljiva i melanina
Gljive/melanin: tamnobraon – osnova svetla
Fontana-Masson:
Prednost: dobra vizuelizacija ĆZ gljiva i melanina
Gljive/melanin: tamnobraon – osnova svetla
Gljive – histopatologija (HP)
Hope et al., Lancet Infectious Diseases 5: 609, 2005
H&EH&EGMSGMS
Pluća (mucikarmin) Pluća (mucikarmin)
Gljive – histopatologija (HP)
Pluća (PAS)Pluća (PAS)
Imunohistohemija (mAt)
WF-AF-1 (Dako)
EB-A1 (Dako)
Imunohistohemija (mAt)
WF-AF-1 (Dako)
EB-A1 (Dako)
Gljive – imunohistopatologija (IHP)
Choi JK, Am J Clin Pathol 121: 18, 2004
Pneumocystis jirovecii - Gimza
Mikroskopski nalaz oktetnih cisti (400X)
BAL, biopsija plućnog tkiva
Mikroskopski nalaz oktetnih cisti (400X)
BAL, biopsija plućnog tkiva