Programa de Ps-Graduao em Biocincias e Biotecnologia Aplicadas

Farmcia

EFEITO DA INFLAMAO DO TORNOZELO SOBRE AS

CARACTERSTICAS HISTOLGICAS, A EXPRESSO

GNICA E NVEIS DA CREATINA CINASE NOS

MSCULOS SLEO E TIBIAL ANTERIOR DE RATOS

DIABTICOS

CLARA MARIA PINHEIRO

ARARAQUARA SP 2011

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

JLIO DE MESQUITA FILHO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

CMPUS DE ARARAQUARA

2

CLARA MARIA PINHEIRO

EFEITO DA INFLAMAO DO TORNOZELO SOBRE AS

CARACTERSTICAS HISTOLGICAS, A EXPRESSO GNICA E NVEIS

DA CREATINA CINASE NOS MSCULOS SLEO E TIBIAL ANTERIOR DE

RATOS DIABTICOS

Equipe de trabalho:

Orientador: Prof. Dr. Iguatemy Loureno Brunetti1

Co-Orientadora: Profa. Dra. Tania de Ftima Salvini2

Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP.

ARARAQUARA SP 2011

1 Prof. Dr., Departamento de Anlises Clnicas, UNESP Araraquara.

2 Profa. Titular, Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de So Carlos.

Dissertao de Mestrado no

Programa de Ps-Graduao de

Biocincias e Biotecnologia

Aplicadas Farmcia da Faculdade

de Cincias Farmacuticas da

Universidade Estadual Paulista

Julio de Mesquita Filho campus Araraquara como parte dos

requisitos para o ttulo de mestre

em Biocincias e Biotecnologia

Aplicadas Farmcia. rea de

concentrao: Bioqumica.

kl

3

4

EFEITO DA INFLAMAO DO TORNOZELO SOBRE AS

CARACTERSTICAS HISTOLGICAS, A EXPRESSO GNICA E NVEIS

DA CREATINA CINASE NOS MSCULOS SLEO E TIBIAL ANTERIOR DE

RATOS DIABTICOS

COMISSO EXAMINADORA

Prof. Dr. Iguatemy Loureno Brunetti

Orientador e Presidente da Comisso Examinadora - UNESP

Profa. Dra. Amanda Martins Baviera

Universidade Federal do Mato Grosso - UFMT

Prof. Dr. Thiago Luiz de Russo

Universidade Federal de So Carlos - UFSCar

5

Os teus sonhos foram muito mais alm do que os teus ps pisaram. Os teus sonhos iro muito mais alm de onde j chegaram. (Trecho da msica Dom Bosco dos Sonhos de Dalcides Biscalquin)

6

Dedico este trabalho minha famlia que

sempre me incentivou e apoiou na

realizao de mais um sonho.

7

AGRADECIMENTOS

A experincia vivenciada durante o perodo do mestrado, sempre esteve acompanhada

por muitas pessoas que me ajudaram e ofereceram sua colaborao, apoio e conselho

nos momentos mais difceis. Agradeo pela ajuda de todos, pessoas que foram e

continuam sendo muito importantes em minha vida, pois me ajudaram a realizar mais

um sonho. Nos momentos mais difceis que conhecemos a verdadeira amizade. Fico

muito lisonjeada em saber que sou rodeada de pessoas queridas e que me ajudaram

prontamente quando eu mais precisei.

Primeiramente agradeo a Deus, sempre presente em minha vida, dando-me coragem e

fora para seguir em frente na realizao dos meus sonhos. Sinto que estou sempre em

suas mos.

Agradeo imensamente a minha famlia, em especial meus pais, Noel e Beth, meu irmo

Guilherme, minha cunhada Karina, meu sobrinho Henrique (que me chama

carinhosamente de Tatinha) e minha madrinha Teresinha. A todos vocs obrigada de

corao por andarem comigo, pelo apoio e confiana em mim, por estarem sempre na

torcida e por me ensinarem o verdadeiro sentido do AMOR e de FAMLIA.

Ao meu orientador e professor Iguatemy Loureno Brunetti, por me aceitar em seu

laboratrio. Obrigada pela ateno, pacincia e calma, dignas de uma pessoa sria, mas

extrovertida. Obrigada pelo incentivo e apoio para a apresentao do meu trabalho em

um congresso internacional, que me acrescentou muitas experincias e permitiu

conhecer o estado da arte em msculos esquelticos. Momentos que guardarei para o

resto de minha vida, com a principal lio: nunca estamos sozinhos!

minha co-orientadora e professora Tania de Ftima Salvini pela parceria com o

Laboratrio de Plasticidade Muscular que contribuiu para a realizao dessa pesquisa,

sempre abrindo portas, pela ateno e aprendizado compartilhados.

amiga Sabrina Peviani Messa, que desde a minha iniciao cientifica sempre me

incentivou no caminho da cincia e me ajudou com tanto carinho, pacincia e

dedicao. Quanto deu devo a voc! Nunca me esquecerei que sempre acreditou em

mim. Obrigada pelas conversas e pelos momentos de descontrao durante a nossa

convivncia e principalmente na fase final desse trabalho e durante a deciso de viajar

ou no para o congresso. Que Deus continue te abenoando!

Ao Guilherme e ao Hugo por tantas caronas para Araraquara.

Aos amigos e colegas do Laboratrio de Bioqumica Vnia Ortega (Cabedal), Renata,

Juliana, Vanessa, Marciano, Ricardo, Andr e Tnia pela convivncia diria,

compreenso e auxilio, troca de experincias, aprendizado e amizade.

Vnia (Cabedal) obrigada por estar sempre disposta a me ajudar, pelas risadas,

conselhos e principalmente por me ajudar na realizao desse trabalho, com tantos

detalhes... Continue sendo essa pessoa animada e divertida! Obrigada por sempre me

acompanhar nos sorvetes do Chiquinho nas tardes quentes em Araraquara.

8

Ao pessoal do Laboratrio de Plasticidade Muscular Sabrina, Joo, Gabriel, Thiago,

Davilene, Fernanda, Rubia, Paula, Catarina, Mar, Marcela, Cris. Obrigada pela

pacincia e pela convivncia.

Ao Joo, Gabriel e Sabrina. Descobri em vocs verdadeiros amigos, sei que posso

confiar em vocs de olhos fechados, nos momentos fceis e principalmente nos difceis.

Obrigada pela pacincia e dedicao. Gostaria que soubessem que sem o apoio de

vocs, talvez eu no teria participado do congresso na Alemanha. Todas as vezes que

falava do meu medo, vocs sempre me lembravam que eu seria capaz. Obrigada pelo

incentivo e pelos pensamentos positivos para que tudo fosse maravilhoso, como

realmente aconteceu.

Aos tcnicos Marcos (Laboratrio de Bioqumica - UNESP e tambm Cabedal) e Teresa

(Laboratrio de Plasticidade Muscular), muito obrigada pela ajuda, conversas e risadas.

As minhas amigas Maria Luiza e Kamilla, tambm companheiras de ps-graduao em

outras instituies, mas que sempre se mostraram preocupadas, atenciosas e

compreensivas durante essa etapa da minha vida. Obrigada pela amizade verdadeira

durante todos esses anos. Vocs so muito especiais.

Aos meu primos, primas e familiares que me acompanharam nas fases e conquistas da

minha vida, sintam-se carinhosamente lembrados.

Rosemira pelas conversas e risadas, com um alto astral, contagiando todos ao seu

redor. Quantas histrias de tomates!!

s Professoras Maria Teresa Pepato e Regina Vendramini pelo apoio durante a

realizao desse estudo.

todos que direta ou indiretamente participaram para o desenvolvimento dessa

pesquisa.

Ao CNPq pela concesso da bolsa de estudos e a Fundao de Amparo a Pesquisa do

Estado de So Paulo - FAPESP - pelo financiamento dessa pesquisa.

9

RESUMO

O Diabetes Mellitus um dos mais importantes problemas de sade pblica,

ocasionando complicaes crnicas como a atrofia muscular e perda da qualidade de

vida do paciente. Quando ocorre uma leso articular, o msculo responde com um

processo de atrofia onde gerada uma modificao no tecido muscular funcionalmente

relacionado com essa articulao. Contudo, estudos experimentais que contribuam ao

esclarecimento da relao entre inflamao articular e as modificaes histolgicas e da

expresso gnica do msculo de animais diabticos no tm sido desenvolvidos. Outro

parmetro importante que deve ser estudado a atividade da enzima creatina cinase

(CK) uma vez que sua atividade pode ser alterada em funo de vrias causas como na

injria, distrofia, inflamao ou necrose da musculatura esqueltica ou cardaca. O

presente projeto teve por objetivo estudar o efeito da inflamao aguda do tornozelo

sobre os msculos Sleo (SO) e Tibial Anterior (TA), investigando a presena de

alteraes histolgicas, alteraes na expresso gnica dos atrogenes atrogina-1e

MuRF-1 e na atividade da creatina cinase em msculos de ratos no-diabticos e

diabticos com e sem tratamento insulnico. Foram estudados 54 ratos Wistar (150g). A

induo do diabetes foi por via intrapenitoneal com 50mg de estreptozotocina (STZ) por

Kg de peso corporal, dissolvida em tampo citrato pH 4,5. Para a inflamao a

articulao do tornozelo foi mantida em 90 localizando a fossa distal e posterior ao

malolo lateral, introduzindo nesta zona uma agulha de dimetro 26 com 0.03ml

carragenina a 3%. Os grupos de animais diabticos com terapia insulnica foram

tratados duas vezes ao dia (as 8h e 17h) com 2,5 U de insulina NPH durante 13 dias,

totalizando 5U/dia A insulina foi administrada por via subcutnea. Os animais foram

divididos em 9 grupos com 6 ratos/grupo: i) animais no diabticos: Controle (C);

Citrato (Ci); Salina (S); Inflamado (Ca); ii) animais diabticos: Diabtico (D); Diabtico

tratado com Insulina (DI); Diabtico Salina (DS); Diabtico e Inflamado (DCa);

Diabtico e Inflamado, tratado com insulina (DCaI). Os msculos TA e SO destes

animais foram avaliados aps 13 dias de diabetes e 3 dias de inflamao da articulao

tbio-tarsica direita. O diabetes juntamente com a articulao inflamada promove uma

maior expresso de genes relacionados atrofia, com diminuio de massa nos dois

msculos estudados, sendo que a insulina no foi capaz de reverter essa situao no

msculo TA. Demonstrando que a regulao diferente entre msculos de contrao

lenta (SO) e msculos de contrao rpida (TA). Houve menor atividade da CK

somente no SO do grupo DCa (p

10

ABSTRACT

Diabetes mellitus is one of the most serious public health problems, which diminishes

the quality of life of the patient and leads to many chronic complications, one of which

is muscle atrophy. When a joint is injured, the muscle responds with a process of

atrophy in which a change occurs in the muscle tissue functionally related to the

joint. However, no experimental studies have been carried out to clarify the relationship

between joint inflammation and changes in the histology and gene expression of

muscles in diabetic animals. Another important variable that should be studied is the

activity of the enzyme creatine kinase (CK), since it can be altered under various

conditions, such as injury, muscular dystrophy, inflammation or necrosis of skeletal or

heart muscle. The aim of this project was to study the effect of acute inflammation of

the ankle on the soleus (SO) and tibialis anterior (TA) muscles, by noting the

histological changes, changes in the expression of the atrophy-related genes (atrogenes)

atrogin-1 and MuRF-1 and activity of CK in muscles of non-diabetic and diabetic rats,

treated and untreated with insulin. We studied 54 Wistar rats (150g). Diabetes was

induced by intraperitoneal injection of 50mg streptozotocin (STZ) per kg body weight,

dissolved in citrate buffer (pH 4.5). To induce inflammation, the ankle joint was held at

90, with the fossa located distal and posterior to the lateral malleolus, and inserting a

26-gauge needle into this region, with 0.03mL of 3% carrageenan. The groups of

insulin-treated diabetic animals were treated twice a day (at 8 am and 5 pm) by

subcutaneous injection with 2.5 IU of NPH insulin, totaling 5 IU/day, for 13 days. The

animals were divided into 9 groups of 6 rats per group: i) non-diabetic animals: control

(C), citrate (Ci), saline (S), inflamed (Ca); ii) diabetic animals: diabetic (D),

diabetic treated with insulin (DI), diabetic saline (DS), diabetic inflamed (DCa) and

inflamed diabetic treated with insulin (DCaI). The TA and SO muscles of these animals

were assessed after 13 days of diabetes and 3 days of inflammation of the right tibio-

tarsal (ankle) joint. Diabetes combined with an inflamed joint promoted an increased

expression of genes related to atrophy, leading to a reduction in the mass of both

muscles. Insulin was unable to reverse this situation in the TA muscle, demonstrating

that the regulation is different between slow-twitch muscles (SO) and fast-twitch

muscles (TA). CK activity was lower only in the SO muscle of the DCa group (p

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Homeostase da glicose ............................................................................ 21

Figura 2. Reao da enzima creatina cinase ........................................................... 33

Figura 3. Fluxograma para diviso dos grupos de estudo....................................... 40

Figura 4. Fluxograma do experimento ................................................................... 41

Figura 5. Mecanismos propostos de toxicidade induzida pela STZ ....................... 43

Figura 6. Recipiente de vidro utilizado para medio do volume........................... 45

Figura 7. Medida de volume do tornozelo ............................................................. 45

Figura 8. Diviso do msculo TA aps sua retirada .............................................. 46

Figura 9. Variao da Massa Corporal ................................................................... 54

Figura 10. Glicemia dos ratos nos diferentes grupos experimentais 1 dia aps

aplicao de STZ .....................................................................................................

56

Figura 11. Massa do msculo TA dos diferentes grupos experimentais 3 dias

aps a administrao de carragenina na articulao do tornozelo direito e 10 dias

da injeo de STZ ....................................................................................................

58

Figura 12. Massa do msculo SO dos diferentes grupos experimentais 3 dias

aps a administrao de carragenina na articulao do tornozelo direito, e 10 dias

aps a injeo de STZ..............................................................................................

59

Figura 13. Cortes transversais das fibras musculares dos msculos TA corados

com azul de toluidina ..............................................................................................

60

Figura 14. rea de Seco Transversa das fibras do msculo TA dos diferentes

grupos experimentais, 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao

do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ..............................................

61

Figura 15. Expresso Gnica da atrogina-1 no msculo TA dos diferentes

grupos experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao

do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ .............................................

62

12

Figura 16. Expresso Gnica do MuRF-1 no msculo TA dos diferentes grupos

experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao do

tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ .................................................

63

Figura 17. Expresso Gnica da atrogina-1 no msculo SO dos diferentes grupos

experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao do

tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ ..................................................

64

Figura 18. Expresso Gnica do MuRF-1 no msculo SO dos diferentes grupos

experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao do

tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ ..................................................

65

Figura 19. Nveis musculares da atividade de CK do msculo TA dos diferentes

grupos experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao

do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ .............................................

67

Figura 20. Nveis musculares da atividade de CK do msculo SO dos diferentes

grupos experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na articulao

do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ .............................................

68

13

LISTA DE TABELAS

Tabela I. Primers construdos com senso e antisenso para atrogina-1 , MuRF-1 e

GAPDH ...................................................................................................................

49

Tabela II. Comparao do volume (mdia desvio padro) (ml) dos grupos ......... 66

14

LISTA DE ABREVIATURAS

ATP: trifosfato de adenosina

AST: rea de seco transversa

CK: creatina cinase

cDNA: fita de DNA complementar

DM: diabetes mellitus

DO: densitometria ptica

EDL: msculo extensor digital longo

E1: enzima de ativao

E2: enzima de conjugao transporte

E3: enzima de ligao ligases

GOD: glicose oxidase

H2O2: perxido de hidrognio

IGF-1: fator de crescimento semelhante insulina tipo 1

IMA: inibio muscular artrognica

LCA: ligamento cruzado anterior

MN : motoneurnio alfa.

MuRF-1: muscle Ring Finger-1

NO: xido ntrico

OMS: Organizao Mundial de Sade

PCR: amplificao por reao em cadeia de polimerase

POD: peroxidase

PT: protenas totais

RT: transcrio reversa

RMA: resposta muscular artrogncia

SO: msculo sleo

STZ: estreptozotocina

SOD: superxido dismutase

TA: msculo tibial anterior

TNF : fator de necrose tumoral alfa

15

SUMRIO

RESUMO

ABSTRACT

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS

1. INTRODUO................................................................................................. 18

1.1 Diabetes................................................................................................................ 20

1.2 Diabetes e Msculo Esqueltico.......................................................................... 23

1.3 Vias Proteolticas envolvidas na atrofia muscular............................................... 25

1.4 Processo Inflamatrio.......................................................................................... 28

1.5 Modelo Inflamatrio com carragenin................................................................. 29

1.6 Resposta Muscular frente s modificaes articulares........................................ 29

1.7 Atrofia Muscular por desuso................................................................................ 31

1.8 Creatina Cinase.................................................................................................... 33

2. OBJETIVOS....................................................................................................... 37

3. MATERIAIS E MTODOS............................................................................. 39

3.1 Animais ............................................................................................................... 39

3.2 Grupos Experimentais.......................................................................................... 39

3.3 Modelo de induo do diabetes por STZ............................................................. 41

3.4 Terapia insulnica................................................................................................. 43

3.5 Modelo inflamatrio............................................................................................ 43

3.6 Glicemia............................................................................................................... 44

3.7 Volume................................................................................................................. 44

3.8 Retirada dos Msculos......................................................................................... 45

3.9 Anlise Histolgica.............................................................................................. 46

3.10 Extrao de RNA total......................................................................................... 47

3.11 Transcrio Reversa............................................................................................. 47

3.12 Real Time PCR................................................................................................. 48

3.13 Oligonucleotdeos primers................................................................................... 49

16

3.14 Determinao de Protenas Totais....................................................................... 49

3.15 Determinao dos nveis de creatina cinase......................................................... 50

4. ANLISE ESTATSTICA DOS RESULTADOS.......................................... 52

5. RESULTADOS ................................................................................................. 54

5.1 Massa Corporal.................................................................................................... 54

5.2 Glicemia............................................................................................................... 55

5.3 Massa dos Msculos TA e SO............................................................................. 57

5.4 rea de seco Transversa................................................................................... 59

5.5 Expresso Gnica no msculo TA....................................................................... 61

5.6 Expresso Gnica no msculo SO....................................................................... 63

5.7 Volume................................................................................................................. 65

5.8 Creatina Cinase.................................................................................................... 67

6. DISCUSSO....................................................................................................... 70

7. CONCLUSO.................................................................................................... 78

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................. 80

17

Introduo

18

1.0 INTRODUO

O msculo esqueltico um dos tecidos que apresentam grande plasticidade no

corpo humano, sendo sua composio fundamental para a sua funo de prover

mobilidade ao sistema sseo, gerar calor em resposta ao frio, alm de captar parte da

glicose circulante no organismo. Sua funo pode ser modificada em resposta a

mudanas na carga, atividade ou condies patolgicas. Por isso perodos prolongados

de desuso, desnervao e imobilizao resultam em significativa atrofia muscular

(LIEBER, 2002; BRUTON, 2002; ZHANG et al., 2006; FERREIRA et al., 2006).

Assim os msculos esquelticos so tecidos dinmicos que podem alterar suas

caractersticas fenotpicas proporcionando uma melhor adaptao funcional frente a

estmulos variados.

O msculo esqueltico apresenta uma organizao anatmica muito bem

definida. Ele constitudo por fibras recobertas por uma bainha de tecido conjuntivo

fibroso, o endomisio. Essas fibras individuais so agrupadas por um segundo tecido

conjuntivo, o perimsio, para formar fascculos de fibras. Finalmente todos os fascculos

so agrupados para formar o msculo que rodeado por um denso tecido conjuntivo, o

epimsio. Diferente dos aspectos histolgicos e morfolgicos que so iguais para todas

as fibras do msculo esqueltico, as respostas fisiolgicas e bioqumicas podem ser

diferentes de acordo com o estmulo na qual as fibras so expostas (FLUCK;

HOPPELER, 2003).

A composio do msculo em relao aos diferentes tipos de fibras depende da

funo. As fibras musculares podem ser classificadas em dois tipos principais: I e II.

Isso se d por meio de caractersticas fisiolgicas e bioqumicas. As fibras tipo I so de

contrao lenta gerando energia atravs de processos aerbicos, com menor velocidade

de propagao do clcio, e apresentam grande nmero de mitocndrias, sendo muito

resistente fadiga; recebe maior vascularizao e contm altos nveis de mioglobina,

tem baixa velocidade de contrao, relaxamento e baixa capacidade de gerar fora. As

fibras do tipo II so de contrao rpida com maior velocidade de contrao e obtm

energia atravs de processos anaerbicos. Tem alta capacidade de conduo do

potencial de ao, rpida propagao de clcio, com alta velocidade de contrao e

relaxamento, grande capacidade de gerar fora, pouca resistncia e capilarizao, baixo

nmero de mitocndrias e reduzida quantidade de mioglobina. As fibras de contrao

19

rpida so classificadas em vrios subtipos, com base na imunohistoqumica com

anticorpos especficos para a cadeia pesada de miosina (MHC), podendo ser dos tipos

IIa, IIb, IIc e IId (BOFF, 2008). A fibra IIa uma fibra rpida intermediria, possuindo

potencial moderadamente desenvolvido para gerao de fora tanto por processos

aerbicos e anaerbicos, sendo portanto de contrao rpida porm com certa

resistncia a fadiga. A fibra IIb possui maior potencial anaerbico, sendo portanto de

contrao mais rpida porm mais fatigvel que a IIa. Existem tambm as fibras

hbridas, tipos IC, IIC, IIAC, IIAD, IIDA, IIBD e IIDB, formadas pela expresso de

duas ou mais isoformas da MHC. Elas resultam da coexpresso de pares especficos de

isoformas da MHC. Msculos posturais possuem uma maior proporo de fibras de

contrao lenta (tipo I) e resistente fadiga, enquanto que os msculos envolvidos na

locomoo so compostos predominantemente por fibras de contrao rpida (tipo II) e

menos fatigveis (LIEBER, 2002).

O principal tecido que mais utiliza a glicose o crebro, e de forma

independente da insulina; segue em importncia o msculo esqueltico que difere do

primeiro, uma vez que necessita da insulina para captao da glicose sangunea.

Indivduos diabticos apresentam ausncia ou deficincia na produo de insulina e/ou

resistncia ao hormnio, o que leva a alteraes no metabolismo dos carboidratos,

protenas e lipdeos, e a desordens musculares como a atrofia muscular e a neuropatia

perifrica. O hormnio anablico insulina sintetizado pelo pncreas mantido em nveis

plasmticos adequados devido a rigorosos mecanismos de regulao (CHONKAR et al.,

2006). H tambm mecanismos contra-reguladores, como a secreo dos hormnios:

adrenalina, nor-adrenalina, cortisol e hormnio do crescimento, cuja ao contrria

insulina para que ocorra a gliconeognese.

As fibras musculares tm capacidade de alterar suas propriedades fisiolgicas e

bioqumicas de acordo com os estmulos a que so submetidas, com o resultado

refletindo na quantidade ou tipo das protenas musculares. Esta capacidade adaptativa

envolvendo diferentes componentes da fibra reflete a plasticidade muscular

(BALDWIN; HADDAD, 2001; PILEGAARD et al., 2000; PETTE, 2002).

Alteraes nas articulaes tambm podem levar a atrofia muscular devido a

diminuio do uso da articulao afetada pelo edema e/ou por dor, sendo assim, torna-se

importante conhecer a resposta muscular esqueltica frente s diversas situaes como

as alteraes da fisiologia e biomecnica articular em msculo de ratos diabticos.

20

1.1 Diabetes

O Diabetes Mellitus (DM) um dos mais srios problemas de sade pblica,

devido ao aumento de sua prevalncia e de suas complicaes; afeta a populao de

pases em todos os estgios de desenvolvimento. De acordo com a Organizao

Mundial de Sade, o Brasil o sexto pas com maior nmero de pessoas com diabetes

(SACCO et al., 2007), sendo que no mundo 285 milhes de pessoas adultas (entre 20 e

79 anos) so diabticas e em 2030 previsto um aumento de 7,7% com 439 milhes de

adultos diabticos. Os fatores que levaro a esse aumento no nmero de pessoas

diabticas so o crescimento e envelhecimento populacional, assim como a urbanizao,

associados a mudanas no estilo de vida. Esse aumento ser maior em paises em

desenvolvimento, 69% de aumento de adultos diabticos, enquanto pases

desenvolvidos sofrero um aumento de 20% (SHAW et al., 2010).

O DM faz parte de um grupo de doenas metablicas caracterizadas por

hiperglicemia resultante de defeitos na secreo, produo e/ou resistncia tecidual a

insulina. A hiperglicemia crnica no diabetes est associada a danos de longo prazo

referente disfuno e falncia de vrios rgos e tecidos especialmente olhos, rins,

nervos, vasos sanguneos, msculos cardaco e esqueltico. Essas complicaes

crnicas contribuem para o aumento da morbidade e mortalidade, ocasionando perda da

qualidade de vida do diabtico (FERNANDES et al., 2001; COMMITTEE REPORT ,

2003; SACCO et al., 2007).

21

Figura 1. Homeostase da Glicose

(retirada de http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/diabetes/diabetes-mellitus-6.php)

Os processos de captao e liberao da glicose so regulados por hormnios. A

insulina o mais importante desses hormnios, uma vez que o nico hormnio capaz

de diminuir os nveis de glicose no sangue mantendo sua homeostasia, como

apresentado na Figura 1. A insulina sintetizada e secretada pelas clulas beta (clulas

) das ilhotas de Langerhans do pncreas de acordo com a demanda do organismo, e

consegue diminuir os nveis de glicose no sangue promovendo a sua captao por vrios

tipos de clulas, entre elas micitos, adipcitos e hepatcitos. No tecido adiposo, a

insulina facilita a converso de glicose em cidos graxos (lipognese) e inibe a quebra

de lipdeos (liplise). No fgado, a insulina estimula a converso de glicose em

glicognio e cidos graxos, alm de diminuir a formao de glicose a partir de outras

fontes como a converso de aminocidos em glicose pela neoglicognese. Outros

hormnios, entre eles o glucagon, tem efeito contrrio a insulina e aumentam os nveis

22

de glicose no sangue atravs da estimulao da quebra do glicognio para liberao de

glicose (glicogenlise) e aumento da velocidade da gliconeognese (CARVALHEIRA

et al., 2002).

Com base em sua etiologia o DM classificado em dois tipos principais, a

diabetes do tipo 1 (insulino-dependente), uma condio em que as clulas beta do

pncreas no produzem ou produzem muito pouco insulina; e a diabetes tipo 2 (no

insulino-dependente), considerada como uma condio na qual existe uma deficincia

das clulas e/ou resistncia insulina nos tecidos perifricos (SATO et al., 2006).

Indivduos com maior risco de desenvolver o diabetes tipo 1 podem, muitas vezes, ser

identificados atravs de prova sorolgica para auto-imunidade, devido ao processo

patolgico que ocorre nas ilhotas pancreticas.

O diabetes tipo 1 uma forma mais frequente entre crianas e adolescentes, e

resulta da incapacidade progressiva do pncreas em produzir insulina. A velocidade de

destruio das clulas bastante varivel, sendo rpida em algumas pessoas

(principalmente crianas) e lenta em outras (principalmente adultos). No diabetes tipo 1

os pacientes, especialmente crianas e adolescentes, podem apresentar cetoacidose

como a primeira manifestao da doena, que um quadro grave de descompensao

diabtica com risco de vida iminente. O DM tipo 2, com a hiperglicemia moderada,

pode rapidamente evoluir para hiperglicemia grave e/ou cetoacidose na presena de

infeco ou outra condio de estresse. Muitos desses indivduos com este ltimo tipo

de diabetes podem eventualmente se tornarem dependentes de insulina para a

sobrevivncia, a fim de promover reduo da glicemia e preveno da cetoacidose,

podendo a insulina exgena ser instituda assim que o diagnstico estiver estabelecido

(COMMITTEE REPORT, 2003; MANNA, 2007).

Para o diabetes tipo 2 o grau de hiperglicemia pode causar danos patolgicos e

mudanas funcionais em vrios tecidos-alvo, sem apresentar sintomas clnicos, podendo

o diabtico no detectar a doena por um longo perodo de tempo. Durante esse perodo

possvel demonstrar anormalidade no metabolismo de carboidratos, sendo detectado

pelos nveis de glicose no plasma, estando o indivduo em jejum e tambm aps uma

carga oral de glicose (COMMITTEE REPORT, 2003).

O diabetes tipo 2 de aparecimento lento, e frequentemente passa

desapercebido. Possui fator hereditrio e relao bem estabelecida com a obesidade e o

sedentarismo. Neste tipo de diabetes h uma alterao no metabolismo de glicose e

lipdios caracterizada por hiperglicemia crnica, resistncia insulina em msculo

23

esqueltico, fgado e tecido adiposo. O organismo inicialmente compensa a resistncia

insulina com uma hipersecreo do hormnio, mas com o tempo ocorre exausto das

clulas levando a deficincia insulnica, e aumento da glicemia. Assim, ao menos

inicialmente, e muitas vezes durante toda a sua vida, esses diabticos no necessitaro

de insulina para sobreviver (VIOLLET et al., 2009; SURAMPUDI et al., 2009;

COMMITTEE REPORT, 2003).

Os sintomas caractersticos do diabetes devido hiperglicemia so: poliria

(mico freqente), polidipsia (ingesto de grandes volumes de gua) e glicosria

(excreo de glicose na urina); alm de poliastenia (perda de peso), polifagia (fome

excessiva) e viso desfocada. Com a progresso da doena iniciam as complicaes

como retinopatia com perda potencial da viso; nefropatia levando insuficincia renal;

desenvolvimento da neuropatia perifrica; lceras nos ps, amputaes, e neuropatia

autonmica que causa sintomas gastrintestinais, geniturinrio, cardiovasculares e

disfuno sexual. Pacientes com diabetes tem maior incidncia de aterosclerose

cardiovascular, vascular perifrica e doena cerebrovascular, assim como hipertenso e

atrofia muscular esqueltica (COMMITTEE REPORT, 2003; CHONKAR et al., 2006).

1.2 Diabetes e Msculo esqueltico

As desordens metablicas que ocorrem no DM afetam vrios sistemas, o que

inclui os msculos esquelticos. Estas mudanas compreendem defeitos estruturais e

metablicos (PELIT et al., 2008). Os msculos esquelticos convertem energia qumica

em movimento e fora, variando de atividades rpidas e intensas a atividades de

trabalho contnuo e de baixa intensidade (BERCHTOLD et al. 2000; HOOD, 2001;

PETTE, 2002). Msculos como o sleo (SO) realizam atividades lentas, mas estveis,

como a tenso postural. J msculos como o tibial anterior (TA) realizam atividades

mais intensas e rpidas. A maioria dos msculos contm uma mistura de tipos de fibras,

mas alguns msculos possuem maior quantidade de um tipo em relao a outro. O

msculo SO, por exemplo, possui maior quantidade de fibras de miosina de cadeia leve

I e IIa, que confere a ele caractersticas ideais para a manuteno da tenso postural

(ARANY et al., 2007). A insulina um potente estimulador do transporte de glicose no

msculo (HIGAKI et al., 2001), sendo que as aes da insulina no msculo esqueltico

so influenciados pelo tipo de fibra (HICKEY et al., 1995). Os msculos diabticos com

predominncia de fibras lentas (tipo I) exibem maior sensibilidade a insulina e maior

24

captao de glicose do que msculos com predomnio de fibras rpidas (tipo II)

(SNOW; THOMPSON, 2009).

A captao da glicose mediada pela insulina difere nos grupos musculares, pois

dependente dos transportadores de glicose muscular conhecidos como GLUT-4. As

fibras musculares do tipo I expressam mais transportadores de glicose da membrana

(GLUT-4) (HARDIN, et al., 1993) uma vez que estas fibras utilizam preferencialmente

a glicose captada, do que aquela estocada na forma de glicognio dentro do msculo.

Tanto a insulina quanto o fator de crescimento semelhante insulina (IGF-1) so

determinantes importantes de massa muscular, por promoverem o crescimento por

conseqncia de estimulao da sntese protica e tambm a supresso da degradao

protica. IGF-1 promove o crescimento muscular por estmulo e diferenciao das

clulas satlites e mioncleos (HESZELE; PRICE, 2004). importante salientar que a

manuteno da massa muscular ocorre pelo equilbrio da sntese e degradao das

protenas musculares (GOLDSPINK, 1999). Portanto, qualquer estmulo que provoque

mudana na sntese e/ou degradao das protenas musculares pode levar a um

significativo impacto sobre a massa muscular. Desse modo, quando ocorre diminuio

da sntese e/ou aumento da degradao protica, ocorre a atrofia muscular. Esta pode ser

definida como a perda involuntria de 10% da massa muscular, como consequncia de

condies catablicas como o caso do DM e da sarcopenia, est associada reduo

da qualidade de vida e aumento da morbidade e mortalidade (HESZELE; PRICE,

2004). Nessas condies catablicas a perda de massa muscular notvel, seja ela pela

protelise muscular elevada ou pela apoptose dos mioncleos estar acelerada em idosos.

No DM a ausncia de insulina gera profundas alteraes metablicas no msculo

esqueltico, como reduo da captao de glicose e aminocidos, reduo da sntese de

protenas e aumento na protelise (COTTER et al., 1989). O processo de atrofia

caracterizado pela ativao de diferentes processos proteolticos, em particular um

sistema de degradao de protenas dependente de trifosfato de adenosina (ATP)

conhecido como a via ubiquitina-proteassoma. (PEPATO et al., 1996). Entre os

marcadores genticos da atrofia muscular dois genes se destacam: a atrogina-1/MAFbx

e MuRF-1, havendo aumento em suas expresses quando h perda da massa muscular.

Chonkar e colaboradores (2006) demonstraram que em ratos diabticos tipo 1,

induzidos por estreptozotocina (STZ), aps 6 a 8 semanas, ocorreu uma perda

significativa de peso e de massa muscular nos msculos extensor digital longo (EDL) e

SO. Alm disso, foi verificada a reduo da fora de contrao muscular nos mesmos

25

msculos de ratos diabticos, quando comparados ao grupo controle. Os autores

concluram que o diabetes induzida por STZ provoca atrofia muscular associada

reduo na fora de contrao dos msculos SO (fibras lentas) e EDL (fibras rpidas).

A atrofia muscular e a neuropatia so complicaes muito importantes do DM.

A neuropatia diabtica uma complicao preocupante e responsvel por graves

desabilidades (CHONKAR et al., 2006), atingindo o sistema nervoso perifrico o que

pode levar a transtornos trficos da pele e da estrutura osteoarticular do p, com

propenso a acarretar o chamado p diabtico. Os movimentos mais afetados so

flexo, inverso e everso do tornozelo e movimentos da primeira articulao

metatarsofalangeana. A atrofia muscular observada nos pacientes com neuropatia

diabtica pode causar deformidades, diminuio da amplitude de movimento do p e

tornozelo (SACCO et al., 2007).

Os nervos sural e o fibular so os primeiros a serem acometidos no decorrer da

progresso da neuropatia diabtica, sendo este o responsvel pela inervao do msculo

TA, motor primrio da flexo do tornozelo. Desse modo o TA um dos primeiros

msculos a serem comprometidos na neuropatia diabtica (SACCO et al., 2007).

Diabticos com mais de 50 anos podem apresentar a neuropatia proximal de

membros inferiores caracterizada por um grau varivel de dor e perda sensorial com

fraqueza muscular proximal e atrofia. O aparecimento da neuropatia agudo ou

subagudo. Os pacientes queixam-se de dormncia ou dores da face anterior da coxa,

muitas vezes do tipo queimao, havendo piora noite e por contato. Dificuldade em

andar e subir escadas so comuns, devido fraqueza dos msculos quadrceps e

iliopsoas (SAID, 2007).

1.3 Vias proteolticas envolvidas na atrofia muscular

Existem quatro vias proteolticas conhecidas que quando tem suas atividades

aumentadas podem contribuir para a atrofia muscular: a via das catepsinas ou

lisossomais, via das calpanas dependentes de clcio, via das caspases e via da

ubiquitina proteassoma ATP-dependente.

Na via proteoltica lisossomal, existem as proteases catepsinas B, D, H e L e

outras hidrolases cidas, presentes nos lisossomos. Essa via apresenta uma pequena

influncia sobre a protelise total, assim como ocorre com as vias dependentes de

26

clcio. As catepsinas no degradam protenas citoslicas, como as protenas

miofibrilares, seu papel maior est na degradao de protenas de membrana como

receptores, canais de ons e transportadores, protenas endocitadas e organelas.

(JACKMAN & KANDARIAN, 2004, MACHADO, 2009, POWERS et al., 2007).

Outra via de protelise a via das calpanas, que so proteases dependentes de

Ca2+

envolvidas na organizao do citoesqueleto, ciclo celular e apoptose. As fibras

msculo-esquelticas contm as calpanas-1, -2 e -3. O aumento das concentraes de

Ca2+

intracelulares pode ativar as calpanas presentes no disco Z do sarcmero capazes

de degradarem protenas importantes da arquitetura do sarcmero como a nebulina,

titina, protena-C, vinculina. Com a clivagem da titina ocorre a liberao das miofibrilas

para serem ubiquitinadas e degradadas pelo proteassoma (JACKMAN &

KANDARIAN, 2004, POWERS et al., 2007, ZHANG et al., 2007).

Outra via proteoltica importante a via das caspases, responsvel pela apoptose

ou morte celular programada, de modo que as caspases tornam as protenas

miofibrilares disponveis para a ubiquitinao, uma vez que o sistema proteoltico

ubiquitina proteassoma no capaz de degradar protenas intactas. (MACHADO, 2009,

POWERS et al., 2007).

Finalmente, a via ubiquitina-proteassoma, mediadora da degradao protica no

msculo esqueltico, e tem atividade especialmente aumentada em condies de atrofia

muscular. importante observar que para a atuao dessa via necessria a ao

primria da via das calpanas e/ou caspases. A via ubiquitina-proteassoma, principal via

de protelise muscular, promove a degradao de protenas miofibrilares atravs da

atividade do proteassoma, por meio da adio de uma cadeia de poliubiquitina na

protena a ser degradada (substrato), sendo esse processo altamente modulado. Isso se

d por meio da ao de trs enzimas, E1 (enzima de ativao), E2 (enzima de

conjugao-transporte) e E3 (enzima de ligao - ligases), sendo exemplo dessa enzima

a atrogina-1 e o MuRF-1. A ativao da ubiquitina pela E1 transferida a E2, que

formando um complexo ativado, se ligam a E3, que sua vez reconhece o substrato

(ubiquitinizao), devido ao domnio FBox das molculas. Assim as ligases E3

ubiquitinam tipos especficos de protenas determinando quais so alvos para a

degradao pelo proteossoma (GOMES et al., 2001, JACKMAN & KANDARIAN,

2004, ZHANG et al., 2006).

27

Duas ligases de ubiquitina (E3) especficas do msculo aumentam

significativamente em presena de atrofia: Muscle Ring Finger-1 (MuRF-1) e Muscle

Atrophy Fbx (MAFbx) ou atrogina-1. Os nveis de RNA mensageiro (RNAm) para

atrogina-1 aumentam rapidamente antes que a diminuio do peso seja detectada e

mantm sua elevao quando a protelise acelerada, sugerindo assim que os nveis

de RNAm da atrogina-1 so importantes na manuteno da protelise de diferentes

etiologias como desnervao, imobilizao e suspenso (SACHECK et al., 2007).

A atrogina-1 constituda por um domnio F-box, o qual caracteriza uma classe

de protenas ubiquitina-ligases (E3), chamadas de complexo SCF (protena Skp1,

protena Cal, protena Ring Fingers e protena F-Box) (GOMES et al., 2001). A

atrogina-1 um exemplo de protena F-box, e desempenha um papel primordial na

ligao da protena que ser ubiquitinada e degradada (LECKER et al., 2004).

Alm da via de degradao de mioprotenas pela atrogina-1, outra protena

ubiquitina-ligase E3 chamada MuRF-1 (Muscle RING Finger 1) tambm exerce papel

de destaque na quebra de protenas (BODINE et al., 2001; CAO et al., 2005). Os

membros da famlia MuRF-1 foram encontrados associados a componentes

miofibrilares, como a titina na linha M do sarcmero, sendo estes componentes

possveis alvos da degradao pela MuRF-1 no msculo atrfico.

Outro fato interessante a resistncia atrofia muscular demonstrada em

animais knockout para os genes da atrogina-1 e MuRF-1. Ratos normais apresentaram

atrofia nos msculos gastrocnmios, em 7 e 14 dias aps desnervao. J animais

geneticamente modificados, apresentam fentipo idntico aos normais, como

morfologia e peso normal dos msculos, quando submetidos desnervao

demonstrarando uma significativa atenuao do processo de atrofia muscular, durante

os mesmos 7 e 14 dias dos animais normais (BODINE, 2001). Sendo esses resultados

demonstrativos da importncia da via de ubiquitinao como mediadora da atrofia

muscular, possvel tambm utilizar ambos MuRF-1 e a atrogina-1 como marcadores

precoces da atrofia muscular.

Um fator de transcrio nuclear envolvidos em processos de atrofia durante

processos inflamatrios o NF-B (Nuclear Fator kappa B - dependente). Este fator

est associado perda de massa muscular na inflamao crnica, pela atividade de

citocinas como o TNF- ou a IL-1, e na ausncia dessas citocinas, ativado por

28

espcies reativas de oxignio (GUTTRIDGE, 2004; LADNER, 2003). Sua ativao se

d por meio da ubiquitinao e degradao de sua protena inibitria IkB, que em estado

normal encontra-se ligada ao NF-kB mantendo-o no citoplasma (GLASS, 2005,

SANDRI, 2008,

1.4 Processo Inflamatrio

A inflamao um processo que acompanha a maior parte das doenas

articulares e as complicaes em sua resoluo so uma limitao para o rpido retorno

do sujeito s atividades de vida diria.

Quando um estmulo endgeno ou exgeno causa uma alterao na fisiologia

normal de um tecido (COTRAN et al., 2000), inicia-se uma inflamao local. Esta

constitui uma resposta de proteo para livrar o organismo da causa inicial da agresso

tecidual e de suas consequncias (COTRAN et al., 2000). A inflamao se manifesta

clinicamente atravs de cinco sinais e sintomas dor, rubor, calor, tumor e alterao na

funo.

A resposta inicial ao agente agressor chamada de inflamao aguda ocorrendo

nesta fase alteraes no calibre vascular, com constrio arteriolar e posterior dilatao

das arterolas pr-capilares, abertura dos esfncteres capilares e dilatao das vnulas,

sendo esta seqncia responsvel pela hiperemia, o que leva a exsudao. Nesta etapa

tambm ocorre a liberao de mediadores pr-inflamatrios como a histamina,

serotonina e prostaglandinas. Devido a um aumento do fluxo sanguneo h calor e

rubor. J a resposta tardia chamada de inflamao crnica caracterizada por infiltrao

de clulas mononucleares, refletindo uma reao agresso persistente. Como a presso

osmtica intravascular diminui e aumenta a presso osmtica intersticial, juntamente

com o aumento da presso hidrosttica dos vasos, causa um desequilbrio das foras,

levando sada de clulas, macromolculas e fluidos do sistema vascular, para o tecido

intersticial, gerando o edema (COTRAN et al., 2000).

Esse acmulo de lquido piora o processo inflamatrio, resultando em um

ambiente txico, que leva a morte celular e necrose tecidual (MICHOLOVITZ, 1996),

isso pode dificultar ou interromper a troca de nutrientes, atrasando o processo de

cicatrizao e recuperao do tecido. Devido ao acmulo de lquido no interior do

interstcio celular, h o aparecimento da dor, levando a imobilizao da zona lesada.

29

Pode ocorrer fibrose, aderncias e rigidez da estrutura, trazendo sequelas e aumento do

perodo de recuperao do local inflamado (GRIFFIN et al.,1990; COTRAN et al.,

2000).

1.5 Modelo inflamatrio com carragenina

Neste estudo o modelo inflamatrio utilizado no experimento, foi o modelo da

carragenina. As carrageninas so conhecidas desde o sculo XIX, e eram extradas de

algas vermelhas e utilizadas como agente emulsificante em alimentos caseiros.

Carrageninas so classes de galactoses sulfatadas, biomolculas constituintes da parede

celular de diferentes espcies de algas marinhas vermelhas (FERREIRA, 2005).

As carrageninas so utilizadas em modelos de inflamao local aguda desde

1962. H trs tipos principais de carragenina: (kappa), (lambda) e (iota). Elas

ativam um grande nmero de mediadores inflamatrios tais como produtos do

metabolismo do cido araquidnico, principalmente prostaglandina I2, as bradicininas, o

fator de necrose tumoral alfa (TNF ), substncia P, neurocininas, citocinas, xido

ntrico, entre outros (FERREIRA, 2005).

Inicialmente na inflamao causada pela carragenina ocorre infiltrao de

neutrfilos no espao perivascular, acompanhado da liberao local de compostos como

o glutamato, aspartato, substncia P, histamina e serotonina. (SLUKA; WESTLUND,

1993, NANTEL et al., 1999; HONG, 2002; LAWANDA et al., 2000; TAN-NO et al.,

2006). Estas substncias geram edema e sensibilizam os aferentes primrios resultando

em hiperalgesia primria (HARGREAVES et al., 1988). Aps produo elevada de

xido ntrico, prostaglandinas, ERON e ciclo-oxigenases, os neurnios do corno dorsal

da medula so ativados gerando sensibilizao central, espinhal ou supra-espinhal, o

que junto com o aumento dos nociceptores perifricos, manifesta-se como hiperalgesia

secundria (SLUKA; WESTLUND, 1993; TAN-NO K. et al., 2006; SALVEMINI,

1996). Essa resposta pode ser encontrada nas reas adjacentes leso e algumas vezes

em localizaes distantes.

1.6 Resposta Muscular frente s modificaes articulares

Os resultados obtidos a partir de diversos estudos clnicos permitem associar a

presena de alteraes da estrutura e fisiologia articular, com modificaes nas

propriedades dos msculos funcionalmente relacionados articulao (PALMIERI et al,

30

2003 e 2004; HOPKINS et al., 2004; WILLIAMS et al., 2004; SUETTA et al., 2007;

PAP et al., 2004; FITZGERALD et al., 2004).

Em condies como a osteoartrite (OA), caracterizada pela degenerao crnica

da cartilagem articular, diversos trabalhos tm mostrado que alteraes na fora

muscular no esto relacionadas dor nem atrofia, o que sugere a presena de um

mecanismo muscular especfico causador da perda de fora (GR et al., 2003). Neste

tipo de pacientes no tem sido esclarecido se as mudanas musculares so produtos do

desuso gerado pela OA, ou se na realidade ocorrem por mecanismos musculares

especficos (HERZOG et al., 2003, PAP et al., 2004; SUETTA et al., 2007). Ainda em

indivduos com artrite reumatide tm sido observado mudanas musculares como

infiltrados de clulas mono-nucleares sem necrose, presena de clulas plasmticas

perto dos capilares, anormalidades mitocondriais (possivelmente por estresse oxidativo

secundrio inflamao) e expresso de MHC (Major Histocompatibility Complex) tipo

II. No entanto, nestes pacientes as mudanas musculares esto associadas miopatia

inflamatria secundria patologia ou miopatia inflamatria crnica em funo do

consumo crnico de corticoesteroides (MIR et al., 1996; LINDEHAMMAR et al.,

2004).

Outras condies articulares como meniscopatias e procedimentos como a

artroscopia de joelho, mostraram diminuio na rea de seco transversa do

quadrceps, enquanto as leses do ligamento cruzado anterior (LCA) evidenciaram

modificaes no padro de recrutamento do quadrceps em atividades estticas e

dinmicas (AKIMA; FURUKAWA, 2005; WILLIAMS et al., 2004; STOCKMAR et

al., 2006).

Uma das possveis explicaes para a diminuio de fora nas condies acima

mencionadas o mecanismo de Inibio Muscular Artrognica (IMA), embora segundo

a opinio de Palmieri e colaboradores (2004), um termo mais adequado deveria seria

Resposta Muscular Artrognica, levando em conta que alguns estudos tm mostrado

facilitao (aumento reflexo H) da musculatura analisada. A IMA pode ser definida

como inibio reflexa contnua da musculatura que rodeia uma articulao depois de

leso das estruturas dessa articulao (PALMIERI et al., 2004).

Outros autores tm mostrado tambm a relao entre a leso articular e a

alterao muscular. Stockmar e colaboradores (2006) analisaram as mudanas no

31

msculo vasto medial do quadrceps em indivduos que sofreram ruptura do LCA e

observaram que as fibras desse msculo sofreram mudanas estruturais e metablicas

importantes, mostrando atrofia, diminuio na atividade glicoltica, mudando para uma

atividade mais oxidativa com aumento da resistncia de modo a compensar a

instabilidade do joelho. Akima e Furukawa (2005) registraram que 5,2 meses (em

mdia) depois da artroscopia de joelho ou menisectomia, ocorre atrofia no quadrceps

femoral em geral, sem modificaes significativas nos msculos isquiotibiais e adutor

maior.

Considerando estes estudos fica evidente que as mudanas articulares podem

gerar alteraes na estrutura e funo dos msculos, sobressaindo a presena de atrofia,

porm, os fatores subjacentes de tais modificaes em ratos diabticos no tm sido at

hoje, suficientemente exploradas. Portanto, torna-se importante entender os mecanismos

e vias de sinalizao envolvida na atrofia muscular de ratos diabticos expostos

inflamao do tornozelo, uma vez que no conhecido se os animais diabticos,

tratados ou no com insulina, sofrem uma adaptao muscular diferente de animais

normais nas mesmas condies de estudo.

1.7 Atrofia Muscular por desuso

Conforme os resultados de modelos animais de suspenso da pata traseira em

ratos em imobilizao, a atrofia por desuso tem sido atribuda a alteraes na regulao

do metabolismo protico envolvendo diminuio na sntese e aumento na protelise no

msculo esqueltico (SIU et al., 2005; FERREIRA et al., 2006; GUILLOT et al., 2006;

ELEY et al., 2007); sendo iniciada pela reduo na tenso e na atividade contrtil do

msculo, e no por citocinas inflamatrias (ZHANG et al., 2006).

Entre os estudos que analisaram o efeito precoce do desuso sobre o msculo est

o trabalho de Ferreira e colaboradores (2006), onde estes autores investigaram o efeito

da suspenso da pata traseira de ratos sobre a resposta de seus micitos e outras clulas

no musculares como as endoteliais e fibroblastos, e a resposta apopttica. Os

resultados mostraram que a relao da expresso DNA/protenas mudou na primeira

semana, refletindo-se assim uma diminuio no contedo de protenas e do peso

muscular neste perodo. Tambm houve um aumento notvel (200%) na atividade

mittica de clulas no musculares nas primeiras 6 horas de suspenso. Este ltimo

dado foi relacionado com o aumento do tecido conjuntivo muscular que gera atrofia

32

adicional pela diminuio no fluxo sanguneo sobre a fibra muscular. Este trabalho

mostrou tambm aumento na quantidade de mono e oligonucleossomos do citosol 6

horas depois, sendo assim evidente a presena de apoptose celular.

O efeito agudo do desuso foi tambm estudado por Sacheck e colaboradores

(2007). Neste trabalho foram comparados os efeitos de dois modelos de desuso, a

desnervao e a isolamento da coluna vertebral (laminectomia parcial das razes T7 a

S1, com seco bilateral dessas razes), sobre a expresso de genes relacionados

atrofia, analisando tambm se os efeitos foram similares com os observados em

modelos de doenas sistmicas (como cncer e diabetes). Os resultados obtidos

mostraram que no terceiro dia do desuso ocorreu perda do peso muscular, refletindo

assim a habilidade do msculo para reagir de forma aguda ao estmulo. Um resultado

notvel deste estudo foi o aumento no RNAm de genes essenciais na atrofia rpida,

atrogina-1 e MuRF-1, no terceiro dia; este aumento na expresso ocorreu

concomitantemente a maior perda no peso muscular. Foi evidente tambm que 78%

dos genes expressos nas doenas sistmicas foram tambm expressos no modelo

experimental de desuso, dando suporte hiptese da existncia de um programa comum

final para mediar a atrofia, sem importar a origem ou a natureza dela.

Vrios estudos mostram que o aumento na expresso da atrogina-1 e MuRF-1

em grupos de ratos com articulao inflamada, pode ser explicado atravs da ao da

citocina TNF. Estudos anteriores mostraram que a injeo de carragenina em uma

articulao causa um processo inflamatrio complexo, que envolve um grande nmero

de mediadores, dentre eles o TNF, uma citocina inflamatria envolvida no estmulo de

processos proteolticos na musculatura esqueltica (REID; LI, 2001; RALL;

ROUBENOFF, 2004 e DOGRA et al., 2007). Estas explicaes derivam da observao

que os nveis sricos de TNF encontram-se bem elevados aps administrao de

carragenina na pata de ratos (NISHIKORI et al., 2002).

Estudos para analisar o efeito do desuso sobre o msculo tm sido realizados em

modelos de suspenso (imobilizao) por perodos de 2 4 semanas, existindo s

alguns trabalhos que analisaram o efeito precoce do desuso sobre o tecido muscular.

Siu e colaboradores (2005) encontraram que depois de 14 dias de suspenso, o

msculo gastrocnmio (GM) de ratos perdeu aproximadamente 30% do seu peso,

aumentando em 119% a fragmentao de DNA e em 73% o contedo de Bx (protena

apopttica). Os autores concluem que estes resultados sugerem que a apoptose pode ter

33

uma participao importante na atrofia nos msculos Tipo I e Tipo II, provavelmente

mediante a eliminao de mioncleos na fibra atrofiada.

Guillot e colaboradores (2006) mostraram que aps trs semanas de suspenso

da pata de ratos o msculo SO sofreu 50% de perda no seu peso enquanto que o

Extensor Digital Longo dos dedos (EDL) perdeu s 12% do peso; alm disso no SO foi

observada uma diminuio significativa (p

34

A CK um dmero composto por duas subunidades, a B (brain) e M (muscle).

Elas so produtos de dois genes estruturais diferentes, podendo existir trs pares de

diferentes dmeros: BB, MB e MM. As isoenzimas so encontradas no citosol da clula

ou associadas s estruturas miofibrilares. Existe uma quarta isoenzima que difere das

outras imunologicamente e na mobilidade eletrofortica, conhecida como CK Mt, esta

localiza-se entre as membranas mitocondriais. Tanto a CK B, quanto a CK M

existem como homo e heterodmeros no citosol, sendo sua funo evitar flutuaes dos

nveis de ATP durante os perodos de alta demanda energtica, como na contrao

cardaca e contrao do msculo esqueltico, atividade da bomba de Clcio e, excitao

neuronal. A forma mitocondrial (CK - Mt) geralmente encontrada como octamero,

com a funo de formar fosfocreatina, esta vai para o citosol onde o fosfato de alta

energia transferido de volta para ATP pela CK - M para o consumo energtico celular.

(LIN et al., 2008; BESSMAN; CARPENTER, 1985).

Nveis elevados da CK so utilizados no auxlio-diagnstico e no monitoramento

teraputico de vrias doenas como Distrofia Muscular de Duchenne, Infarto do

Miocrdio, Doenas musculares inflamatrias e degenerativas, Doenas do Sistema

Nervoso Central como Isquemia Cerebral (LIN et al., 2008; BESSMAN;

CARPENTER, 1985; BURTIS et al., 2006).

Considerando as alteraes que ocorrem no tecido muscular de ratos diabticos e

com inflamao articular, a hiptese deste trabalho que a inflamao do tornozelo em

ratos diabticos acarreta aumento na expresso gnica de genes relacionados atrofia

muscular, reduzindo tambm a rea de seco transversa das fibras e alterando os nveis

da CK muscular sendo este aumento mais acentuado que em animais normais. Para

testar esta hiptese os msculos SO e TA de ratos diabticos foram examinados aps 3

dias de induo de inflamao articular (fase aguda).

Considerando as alteraes da musculatura esqueltica no DM e a resposta

muscular devido inflamao articular, torna-se importante conhecer os mecanismos

envolvidos no incio da atrofia muscular nessa condio de diabetes agudo (13 dias da

injeo de STZ) sem e com tratamento insulnico. Alm de que, at o presente momento

no conhecemos estudos abordando a expresso de genes relacionados atrofia dos

msculos SO e TA concomitante inflamao aguda do tornozelo em ratos diabticos

agudos.

35

Os resultados deste estudo podem ser relevantes para a clnica e cincia da

reabilitao no sentido de que novas formas de tratamento ou aprimoramento das j

existentes possam ser elucidadas e contribuir com a minimizao das consequncias da

inflamao e com reduo do perodo de recuperao, acelerando o retorno do indivduo

s suas atividades funcionais e melhora da qualidade de vida de pessoas com diabetes.

36

Objetivos

37

2.0 OBJETIVOS

Avaliar o efeito da inflamao articular aguda (3 dias) sobre a expresso de

genes de atrofia, a morfologia das fibras musculares e os nveis musculares da creatina

cinase em ratos diabticos tratados ou no com insulina.

38

Materiais e Mtodos

39

3.0 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Animais

Para o desenvolvimento do projeto foram utilizados 54 ratos Wistar com peso

mdio de 150 gramas, os quais permaneceram em caixas (4 animais por caixa), com

livre acesso gua e a rao peletizada (Purina). Os animais foram provenientes do

Biotrio Central do Campus de Botucatu UNESP e foram mantidos em biotrio do

Laboratrio de Bioqumica Clnica do Departamento de Anlises Clnicas, UNESP -

Araraquara, com controle da luminosidade (ciclo claro/escuro de 12h), temperatura (22-

25C) e umidade de 50-55%.

O experimento foi conduzido segundo as normas internacionais de tica na

experimentao animal (National Research Council, 1996) e aps a aprovao do

Comit de tica Animal da Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Cincias

Farmacuticas Unesp, Campus Araraquara (Protocolo CEP/FCF/CAr n 31/2009).

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com os animais

anestesiados usando injeo intraperitonial de soluo de xilazina 12 mg/Kg/peso

corporal e quetamina 95 mg/Kg/peso por via intraperitoneal.

3.2 Grupos Experimentais

Os 54 animais foram distribudos em um dos nove grupos, aps pareamento,

utilizando como critrio a glicemia de cada animal (seis animais por grupo):

1) Controle - C: Animais normais (no-diabticos), no receberam qualquer tipo de

interveno.

2) Citrato - Ci: Animais normais (no-diabticos), receberam injeo intrapenitoneal de

tampo citrato.

3) Salina - S: Animais normais (no-diabticos), receberam somente administrao de

salina na articulao do tornozelo direito.

40

4) Inflamado - Ca: Animais normais (no-diabticos), receberam a administrao de -

carragenina na articulao do tornozelo direito.

5) Diabtico - D: Animais que receberam injeo intrapenitoneal de estreptozotocina

(STZ), e no receberam qualquer tipo de interveno no tornozelo.

6) Diabtico Insulina - DI: Animais que receberam injeo intrapenitoneal de STZ e

foram tratados com insulina e no receberam qualquer tipo de interveno no tornozelo.

7) Diabtico Salina DS: Animais que receberam injeo intrapenitoneal de STZ e

receberam a administrao de salina na articulao do tornozelo direito.

8) Diabtico e Inflamado - DCa: Animais que receberam injeo intrapenitoneal de

STZ e foram submetidos administrao de -carragenina na articulao do tornozelo

direito.

9) Diabtico e Inflamado, tratado com insulina - DCaI: Animais que receberam

injeo intrapenitoneal de STZ, foram tratados com insulina e submetidos

administrao de -carragenina na articulao do tornozelo direito.

Figura 3. Fluxograma para diviso dos grupos de estudo.

54 animais

Pareamento (glicemia)

30 animais 24 animais

Induo diabetes (STZ-50 mg/kg)

Diabticos

Normais (No - Diabticos)

Ci S Ca C DS DCaI DI DCa

D

41

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

A) B)

A) Administrao de STZ B) Inflamao ou efuso

Figura 4. Fluxograma do experimento

3.3 Modelo de induo do diabetes por STZ

Para a induo do diabetes os animais foram submetidos a jejum prvio de 14-16

horas para administrao por via intrapenitoneal de 50mg de STZ por Kg de peso

corporal, dissolvida em tampo citrato pH 4,5 (DELFINO et al., 2002).

A STZ um antibitico e agente alquilante que capaz de inibir a secreo de

insulina e causar um estado de Diabetes Mellitus (tipo I) cerca de uma hora aps sua

administrao por via endovenosa em ratos. Isso acontece devido a sua estrutura, que

destri seletivamente as clulas -pancreticas, promovendo sua degranulao

(GOODNER, 1973; ANDERSON et al., 1974).

A STZ possui, em sua estrutura (Figura 3), um grupo glicdico derivado da 2-

deoxi-D-glicose que reconhecido pelos transportadores de glicose das clulas ,

permitindo sua entrada destas clulas (HERR et al.,1967; SCHEIN; LOFTUS, 1968

ANDERSON et al., 1974; GOODNER, 1973) e um grupo N-metil-N-nitrosouria

ligado ao carbono 2 da hexose, sendo este citotxico para as clulas -pancreticas; a

hexose reconhecida pelos transportadores de glicose (GLUT-2), e faz com que a STZ

se acumule nas clulas pancreticas. Clulas produtoras de insulina que no

expressam GLUT2 em sua membrana plasmtica so resistentes STZ (ANDERSON et

al., 1974; SCHEIN; LOFTUS, 1968).

STZ

dias de tratamento

Inflamao ou Efuso

42

O grupo N-metil-N-nitrosouria inibe a atividade da enzima superxido

dismutase (SOD), permitindo o acmulo de ERON, espcies txicas s clulas

(FISCHER; HAMBURGUER, 1979; GRANKVIST et al., 1981; PAPACCIO et al.,

1986). O acmulo dessas espcies reativas promove a degradao do DNA nuclear

(SANDLER et al.,1983), havendo consequentemente a ativao de uma enzima

reparadora de DNA, a poli (ADP-ribose) sintetase (PARP) (YAMAMOTO et al., 1981),

que utiliza como substrato nicotinamida adenina dinucleotdeo (NAD+). A elevao da

atividade desta enzima provoca a depleo de NAD+ intracelular (SCHEIN &

LOFTUS, 1968), levando inibio da respirao celular, da produo de ATP e da

sntese protica (consequentemente queda na sntese de pr-insulina) (YAMAMOTO et

al., 1981; UCHIGATA et al., 1982), havendo perda do balano inico celular com

posterior apoptose (SANDLER et al., 1983).

Existem outros mecanismos pelos quais a STZ causa danos em clulas -

pancreticas, por exemplo, a STZ, como sendo um potente agente alquilante, promove a

alquilao direta do DNA atravs de radicais metil ou ctions metil, via sua

decomposio (BENNET; PEGG, 1981; JOHANSSON; TJALVA, 1978). Essa

metilao ocorre mais especificamente nas guaninas, induzindo a apoptose nas clulas

(MURATA et al., 1999). Outra hiptese a gerao de ERON (KWON et al., 1994;

BEDOYA et al., 1996; KANETO et al., 1995; KRONCKE et al., 1995; LENZEN,

2008), que podem participar da toxicidade da molcula na promoo para a

diabetognese.

43

Figura 5. Mecanismos propostos de toxicidade induzida pela STZ.

* Metilao do DNA induzida por CH3+ ou

CH3.

** Modificao do DNA induzida por espcies reativas de oxignio e/ou nitrognio.

3.4 Terapia insulnica

Os grupos de animais diabticos com terapia insulnica foram tratados duas

vezes ao dia (as 8h e 17h) com 2,5 U de insulina NPH (Humulin NPH U-100 Lilly) por

13 dias, totalizando 5U/dia A insulina foi administrada por via subcutnea.

3.5 Modelo inflamatrio

Aps serem pesados e anestesiados, os animais dos grupos Ca, DCa, DCaI e

receberam 0.03ml de carragenina a 3% (Sigma Chemical Company - St. Louis, USA)

na articulao tbio-tarsica direita, dissolvida em soluo salina, seguindo o mtodo

descrito por Omote e colaboradores (2002), e Wang e colaboradores (2000). O

procedimento consistiu em manter a articulao do tornozelo em 90, localizando a

fossa distal e posterior ao malolo lateral, introduzindo nesta zona uma agulha

(dimetro 26), a qual foi dirigida distalmente para a cpsula articular at a percepo da

perda de resistncia, injetando nesse momento a carragenina. Os animais dos grupos S e

DS receberam mediante o mesmo procedimento a injeo de 0.03ml de salina. Aps

tais procedimentos da injeo os animais permaneceram nas caixas sob condies j

decomposio

CH3+ ou

CH3

* metilao do DNA

decomposio e metabolizao

O2- e/ou

NO

** modificao do DNA

44

descritas sem restries na sua atividade e foram eutanaziados ao trmino do

experimento.

3.6 Glicemia

Para determinar a glicemia dos animais utilizamos o mtodo da glicose-oxidase.

Foi retirado da cauda aproximadamente 1ml de sangue obtido o plasma para a anlise.

A glicose-oxidase (GOD), presente no reagente catalisa a oxidao da glicose da

amostra, em presena de H2O, originando cido glucnico e perxido de hidrognio.

GOD

Glicose + O2 + H2O cido Glucnico + H2O2

Numa segunda etapa da reao o perxido de hidrognio reage com 4-

aminoantipirina e fenol, em reao catalizada por peroxidase (POD). Esta reao

oxidativa de acoplamento forma a antipirilquinonimina (com absoro mxima entre

490 e 520 nm) proporcional concentrao de glicose na amostra.

POD

antipirilquinonimina + 4H2O . 2H2O2 + fenol + 4-aminoantipirina

3.7 Volume

Os volumes dos tornozelos direitos foram avaliados por um mtodo baseado no

princpio de Arquimedes. Este mtodo considerado o padro-ouro e demonstrou alta

reprodutibilidade (CCI = 0,99) com um erro inferior a 1%. Um recipiente de vidro foi

especialmente produzido, com orifcio e ducto para dar vazamento ao excesso de gua e

para conter a pata e o tornozelo do animal (5 centmetros de altura e 4 centmetros de

dimetro). O recipiente foi previamente calibrado para garantir a reprodutibilidade das

medidas de volume (ICC = 0,93). Para padronizar a medida, uma marca foi feito no

tornozelo dos ratos, 1 centmetro a partir da base do calcanhar. O animal foi suspenso

por um dispositivo semelhante ao utilizado por Dolan e colaboradores (2003). O frasco

foi preenchido com gua at exceder um volume pr-estabelecido pelo orifcio com o

excesso de gua vertido at a estabilizao do fluxo. Em seguida, a pata direita do

45

animal foi colocada no recipiente at a marca no tornozelo. A gua deslocada foi

coletada e pesada, seu volume foi calculado considerando sua densidade como igual a

1g/ml. Esta medida foi realizada antes e 3 dias aps a induo da inflamao nos grupos

S, Ca, DS, DCa e DCaI (Figuras 5 e 6).

Figura 6. Recipiente de vidro utilizado para medio do volume.

Figura 7. Medida do volume do tornozelo.

3.8 Retirada dos msculos

Foram retirados os msculos SO e TA direitos com os animais vivos e

anestesiados, aps 13 dias da injeo de STZ e 3 dias aps a injeo de carragenina.

Aps a retirada, cada msculo foi pesado e dividido com um corte horizontal no seu

ventre deixando uma poro para a extrao de RNA total e determinao da atividade

da CK e outra parte foi utilizada para anlise histolgica da area de seco transversa

(AST).

Parte dos msculos TAs utilizados para anlise histolgica, foram congelados

em isopentano com nitrognio lquido e armazenados em freezer a 80C. A parte

46

destinada extrao do RNA total foi armazenada em microtubo (eppendorfe)

autoclavado e congelado em nitrognio lquido e posteriormente armazenado em freezer

a 80C at sua anlise. No foi realizada a anlise histologia no msculo SO devido a

falta de massa muscular para as outras anlises, que foram priorizadas. Para anlise da

CK o sobrenadante dos msculos triturados (0.040 gramas em 1 ml de tampo fosfato

pH 7.4) foram aliquotados em microtubos (eppendorf), congelados em nitrognio

lquido e armazenados em freezer a 80C para quantificao de protenas totais e da

enzima. Aps a retirada dos msculos, os animais foram eutanaziados com overdose de

anestesia.

Figura 8. Diviso do msculo TA aps sua retirada. Sendo AST rea de seco transversa; CK creatina cinase; PT protenas totais e RNA extrao de RNA para expresso gnica.

3.9 Anlise Histolgica

A partir de msculos TA de todos os ratos, foram obtidos cortes histolgicos

transversais e seriados (10 m), em micrtomo criostato, mantidos 25C. As lminas

Comprimento do Msculo

AST

CK + PT

RNA

47

com os cortes histolgicos foram coradas com azul de toluidina (TB) para avaliao

morfolgica e morfomtrica.

Uma vez os cortes corados com TB, foi realizada uma anlise morfolgica geral

sobre a estrutura muscular, comparando entre os diferentes grupos, atravs do corte

histolgico transversal da regio central do ventre de cada msculo TA. Para a

obteno das fotos dos cortes, um microscpio (Axiolab, Carl Zeiss, Jena, Alemanha)

equipado com uma cmera digital (Sony DSC S75, Tkio, Japo) foi usado. A rea de

seco transversal de cem fibras musculares, escolhidas aleatoriamente, de cada

msculo foram mensuradas a partir da imagem obtida da regio central do ventre

muscular usando o software ImageJ.

3.10 Extrao de RNA total

A extrao de RNA total de cada animal foi obtida a partir de 100 mg de

msculo, utilizando-se o reagente Trizol (Gibco) pelo mtodo descrito por

Chomczynski e Sacchi (1987). O trizol mantm a integridade do RNA enquanto rompe

as clulas e dissolve os componentes celulares. Em seguida foi adicionado o

clorofrmio, seguido de centrifugao, separando a soluo em fases aquosa onde o

RNA permanece exclusivamente e fase orgnica. Aps o isolamento da fase aquosa, o

RNA foi precipitado com isopropanol. O pellet foi lavado com etanol e

subsequentemente dissolvido em 30ul de gua livre de RNAses. A absorbncia das

amostras foi determinada em 260nm; para avaliar a qualidade do RNA isolado foi

determinada a razo entre as absorbncias a 260 e 280 nm (razo 1.8). Os estoques de

RNA foram mantidos a 80C. Tambm foi avaliada a qualidade do material por

eletroforese das amostras (2 g de RNA total) em gel denaturante de agarose-formamida

(1%), em tampo MOPS (40mM de cido morfolinopropanosulfnico). Posteriormente,

os gis foram observados com brometo de etdeo.

3.11 Transcrio Reversa (RT)

Aps o isolamento do RNA total, foram realizadas as transcries reversas (RT)

utilizando 1g de RNA total. A reao de RT foi realizada da seguinte forma:

48

Quantidades variadas de RNA total: 200 u de Transcriptase Reversa; 0,8 mM dNTPs; 1

mM MgC2; 0,02 ug/ul primer oligo dT; 4 mM DTT. A reao foi realizada em um

termociclador (Eppendorf Hamburgo, Alemanha) (10 minutos a 70C, 60 minutos a

42C e 10 minutos a 94C). A integridade do produto da RT (cDNAs) foi conferida

atravs da realizao de gel de agarose (1%) no desnaturante, corado com brometo de

etdeo.

3.12 Real Time-PCR

Em seguida, diferentes fraes das RTs foram utilizadas na amplificao em

cadeia por Polimerase (PCR) com monitoramento da gerao de amplicons em tempo

real (PCR real-time, Rotor Gene 3000, Cobert Research).

As amplificaes por PCR foram efetuadas utilizando-se 10-80ng/ l de cDNA

adicionado a uma reao contendo 25 l de SYBR Green PCR master misx, 50-900nM

dos primers (senso e antisenso) em uma soluo com volume final de 55 l , dividido em

duplicata. As condies de ciclagem ocorreram conforme a padronizao de cada

primer.

Aps a reao de PCR, foi possvel determinar o incio da fase de amplificao

exponencial (Ct, cycle threshold), sendo que os valores de cada amostra foram

utilizados como dados para a anlise da expresso gnica do GAPDH, atrogina-1 e

MuRF-1. Os dados foram analisados usando o mtodo de comparao absoluta por

meio da curva padro que possibilitou determinar a diferena entre os valores de Cts

das amostras.

A normalizao dos dados foi feita pelo gene constitutido GAPDH, usado como

controle interno. Outro gene constitutivo, o RPLPO tambm foi mensurado para

confirmao dos resultados, no entanto, no houve diferena entre as razes:

RPLPO/GAPDH ou GAPDH/RPLPO. Por este motivo o GAPDH foi escolhido como o

gene constitutivo deste estudo.

49

3.13 Oligonucleotdeos primers

Os oligonucleotdeos, que foram utilizados como primers, para as reaes de

polimerase em cadeia para atrogina-1 foram construdos utilizando-se o Primer Express

Software (Applied Biosystems, Foster City, CA), como mostrado na tabela. Os Primers

para MuRF-1 foram retirados de Granado e colaboradores (2005).

Tabela I: Primers construdos com senso e antisenso para atrogina-1, MuRF-1 e

GAPDH.

Primer Senso Antisenso

atrogina-1 TACTAAGGAGCGCCATGGATACT GTTGAATCTTCTGGATCCAGGAT

MuRF-1 TGTCTGGAGGTCGTTTCCG ATGCCGGTCCATGATCACTT

GAPDH GATGCTGGTGCTGAGTATGTCG GTGGTG-CAGGATGCATTGCTGA

Primers construdos com dados do GeneBank: atrogina-1 (AF441120) (J Physiol,

549(2), 409418, 2003); MuRF-1 Granado et al., 2005 (Am J Physiol Endocrinol

Metab. 289: 10071014); GAPDH (AF106860).

3.14 Determinao de Protenas Totais

Para determinao das protenas totais, foi utilizada uma alquota do

sobrenadante do extrato muscular, sendo o contedo proteco das amostras determinado

pelo mtodo descrito por Hartree (1972), usando soro de albumina bovina para

construo da curva analtica. Foram preparadas trs solues com os seguintes

reagentes:

i) Soluo A: a 2g de Tartarato de Sdio e potssio, foram misturados a 100g de

Na2CO3, dissolvidos em 500 mL de NaOH 1 mol/L e diludos com gua Milli-Q para 1

litro;

ii) Soluo B: a 2g de Tartarato de sdio e potssio, foi adicinado 1g de CuSO4.5 H2O,

dissolvidos em 90 mL de gua e 10 mL de NAOH 1mol/L;

iii) Soluo C: 1 volume do Folin-Ciocalteau diludos em 15 volumes de gua Milli-Q.

Esta soluo (preparada diariamente) esta entre 0,15 mol/L e 0,18 mol/L quando titulada

para pH 10 com NaOH 1 mol/L.

50

Em tubos de ensaio adicionou-se 200 l de amostra diluda adequadamente em

tampo fostato de sdio pH 7,4 e 180 l da soluo A, os tubos foram levados ao banho

em 50oC durante 10 minutos. Aps estabilizao em temperatura ambiente, foi

adicionado aos tubos 20 l da soluo B e deixados em temperatura ambiente por 10

minutos. Para finalizar, foi adicionado 600 l da soluo C e levados ao banho de 50C

por 10 minutos. Resfriados a temperatura ambiente, foram retirados 300 l da reao

final para a leitura no espectrofotmetro de placa a 650 nm.

A determinao de protenas totais foi realizada para normalizao dos dados da

CK muscular.

3.15 Determinao de nveis de Creatina Cinase (CK)

Para a determinao da atividade da CK foram obtidas amostras dos msculos

TA e SO coletadas aps 3 dias de inflamao do tornozelo.

Uma amostra de 0,040g de msculo foi retirada e colocada em um microtubo

com 1ml de tampo fosfato (0,01M e pH 7,4), triturada em homogenizador (modelo

Metabo), em banho de gelo, com velocidade de 27 mil rpm, durante 1 minuto e meio.

Aps a homogenizao o tubo foi centrfugado por trinta minutos a 4C e a 12.000 g.

Uma alquota do sobrenadante foi diluda adequadamente para a determinao

enzimtica (PEREIRA et al., 1998).

Foi utilizado o mtodo cintico CK_NAC (COMMITEE ENZYMES, 1976;

OLIVER, 1955). Este mtodo acopla reao da CK as reaes enzimticas

sequenciais, hexoquinase e glicose-6-fosfato desidrogenase, que levam a formao de

NADPH, o qual quantificado por espectrofotometria no UV.

51

Anlise Estatstica

52

4.0 ANLISE ESTATSTICA DOS RESULTADOS

Inicialmente foram aplicados os testes Shapiro Wilks e Levene para avaliar a

normalidade e homogeneidade dos dados, respectivamente. O ANOVA one-way

seguido pelo Teste de Tukey foi ento usado para detectar possveis diferenas entre os

grupos. O t de Student pareado foi utilizado para a comparao entre os volumes inicial

e final do tornozelo. O nvel de significncia mnimo estabelecido foi de 0,05. Para isto

utilizou-se o software GraphPad Instat (Verso 3.00, 32 bit para Windows 95).

53

Resultados

54

5.0 RESULTADOS

5.1 Massa Corporal

Houve variao no ganho de massa corporal entre os grupos experimentais

(Figura 9). Nos grupos de ratos diabticos D, DS, DCa o ganho de massa foi

significativamente menor, em relao aos grupos C, Ci, S e Ca, para o grupo DCa foi

observado o menor ganho de massa em relao aos demais grupos. Por outro lado, os

grupos diabticos tratados com insulina tiveram o ganho de massa igual aos grupos no-

diabticos (C, Ci, S e Ca), indicando eficincia do tratamento insulnico na variao da

massa corporal.

Figura 9. Variao da massa corporal. Valores apresentados em mdias DP, onde a representa diferena estatstica com o grupo C; b: diferena estatstica com Ci; c: diferena estatstica com S; d: diferena estatstica com Ca; e:

diferena estatstica com D; f: diferena estatstica com DI; g: diferena estatstica com DS e h: diferena estatstica com

DCa (*p

55

5.2 Glicemia

Observa-se que os nveis glicmicos dos grupos no-diabticos (C, Ci, S e Ca)

no apresentaram diferena estatstica entre os nveis glicmicos iniciais e finais. Por

outro lado, houve um aumento da glicemia nos grupos diabticos (DCa, DCaI, DI e DS)

comparado com os grupos no-diabticos (C, Ci, S e Ca) (p

56

Figura 10. Glicemia dos ratos nos diferentes grupos experimentais 1 dia aps a administrao de STZ (glicemia inicial)

e aps 13 dias aps a administrao de STZ (glicemia final). Valores apresentados em mdias DP, onde a representa diferena estatstica com o grupo C; b: diferena estatstica com Ci; c: diferena estatstica com S; d: diferena estatstica

com Ca; e: diferena estatstica com D; f: diferena estatstica com DI; g: diferena estatstica com DS e h: diferena

estatstica com DCa (*p

57

5.3 Massa dos msculos TA e SO

Em relao ao msculo TA, somente no grupo Ca houve perda de massa

quando comparado aos outros grupos no-diabticos (Figura 11). Todos os grupos

diabticos apresentaram perda de massa com exceo do grupo DI que manteve sua

massa igual as massas dos grupos C, Ci, S, mostrando que a insulina reverteu a perda de

massa muscular quando comparada ao grupo D. Os grupos diabticos que tiveram

interveno no tornozelo (DS, DCa, DCaI) mostraram perda de massa em relao aos

dos grupos C e Ci. Apenas o grupo DCa apresentou diminuio de massa em relao

aos grupos C, Ci, S e aos demais grupos diabticos (D, DI, DS, DCaI). Nesse caso, o

tratamento com insulina no grupo diabtico e inflamado (DCaI) amenizou a perda de

massa quando comparado ao grupo DCa, sugerindo que o tratamento com insulina

apesar de no ser capaz de manter a massa igual aos grupos C, Ci, S, capaz de

minimizar a sua perda em relao a inflamao na diabetes.

58

Figura 11. Massa do msculo Tibial Anterior dos diferentes grupos experimentais 3 dias aps a administrao de

carragenina na articulao do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ. Resultados normalizados pela massa

corporal final de cada animal. Valores apresentados em mdias DP, onde a representa diferena estatstica com o grupo

C; b: diferena estatstica com Ci; c: diferena estatstica com S; d: diferena estatstica com Ca; e: diferena estatstica com D; f: diferena estatstica com DI, g: diferena estatstica com DS (*p

59

a massa igual aos grupos C e Ci, capaz de minimizar a sua perda em relao a

inflamao na diabetes, assim como observado no msculo TA. Alm disso, a

inflamao com carragenina parece ter maiores efeitos sobre a perda de massa no

msculo de ratos diabticos quando comparado aos seus efeitos no msculo de ratos

no-diabticos.

Figura 12. Massa do msculo SO dos diferentes grupos experimentais 3 dias aps a administrao de carragenina na

articulao do tornozelo direito, e 10 dias aps a injeo de STZ. Resultados normalizados pela massa corporal final de

cada animal. Valores apresentados em mdias DP, onde a representa diferena estatstica com o grupo C; b: diferena estatstica com Ci; c: diferena estatstica com S; d: diferena estatstica com Ca; e: diferena estatstica com D; f:

diferena estatstica com DI; g: diferena estatstica com DS e h: diferena estatstica com DCa (*p

60

diabticos em relao a C e Ci (Figura 14). Nos grupos diabticos tambm foi

observada uma diminuio da AST em relao a C e Ci. O grupo D apresentou a mesma

diminuio que os grupos DS, DCa, DCaI. Torna-se importante observar que como no

houve diferena entre os grupos no-diabticos S e Ca, assim como entre os grupos

diabticos DS, DCa e DCaI, a diminuio na AST deve ser dependente da distenso da

cpsula articular tanto pela salina quanto pela carragenina.

Alm disso, o tratamento com insulina no foi capaz de influenciar a

recuperao da AST no grupo DI em relao ao grupo D, nem entre os grupos DCaI e

DCa.

Figura 13. Cortes transversais das fibras musculares dos msculos TA corados com azul de toluidina.

Observe a atrofia das fibras musculares dos msculos TA dos grupos diabticos (D, DS, DCa e DCaI),

principalmente dos grupos DS, DCa e