CLONACIÓN

¿QUÉ ES CLONACIÓN?

Proceso por el que se consiguen copias idénticas de un organismo ya desarrollado, de forma asexual.

¿QUÉ ES UNA GENOTECA?Es una colección de DNA clonado, este puede contener al menos un gen de interés.

TÉCNICAS DE CLONAJEIn vivo: en la célula, en el proceso de clonación es frecuente el uso de células procariotas

In vitro (PCR): sin presencia de célula, esto permite hacer PCR en tubos de ensayo.

TÉCNICA DE CLONAJE (in vitro ó acelular)

LAS ENZIMAS MAS UTILIZADAS SON

DNA ligasa: me forma enlaces covalentes entre extremos 5´ fosfato de un polinucleótido con el extremo 3´ OH de otro polinucleótido.DNA polimerasa termostable: enzima capaz de transcribir y replicar DNA. Taq polimerasa, pfu polimerasa (3´exonucleasa)

ETAPAS PCR1- Desnaturalización del DNA por choque térmico. 2- TEMPLADO: Hibridación de la hebra de ADN con el cebador. Se reasociación el DNA con disminución de temperatura.3- ELONGACION: Replicación de la hebra por una DNA polimerasa.

ESQUEMA TEMPORAL DE UNA REACCIÓN DE PCR.

TERMOCICLADOR DE DNA

¿CÓMO SE HACE EL cDNA?

PCR PARA cDNA

¿CÓMO CALCULAR EL NUMERO DE COPIAS AL FINAL DE CADA

CICLO?El proceso de PCR aumenta exponencialmente, en unas se pueden replicar clones exactos y en otra solo DNA diana.

CARACTERISTICASEs especifica debido a la presencia de 2 cebadores en el DNA y se puede comprobar por electroforesis:

VECTOR DE CLONACIÓNEs aquella secuencia de DNA que se recombina con el DNA diana

LOS VECTORES SE PUEDEN DIVIDIR EN

Vectores de procariotas:Plásmidos, bacteriófagos, cosmidos

Vectores de eucariotas:Baculovirus, YACs, virus de mamíferos.

CLONACIÓN EN PLÁSMIDOS

Un vector plasmídico, es una pequeña secuencia de cDNA de doble cadena purificada, que se corta con una nucleasa de restricción para tener moléculas lineales2. transfeccion, inserción en bacterias permeables al ADN recombinado.

DIFERENCIA ENTRE CLON DE DNA GENÓMICO Y CDNA

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN o ENDONUCLEASAS DE

RESTRICCIÓN Nucleasa: Especificidad analizada en tres criterios:

3. Reconocimiento de nucleosidos, bien por la pentosa o bien por la base nitrogenada

CARACTERISTICAS GENERALESLas diversas enzimas de restricción se agrupan normalmente en tres familias, de acuerdo a sus propiedades:

CLONACIÓN CELULAR DE MOLÉCULAS DE DNA

PREPARACIÓN DEL DNA PARA SU CLONACIÓN

INSERTOS DE DNA: se parte de células nucleadas

INSERTOS DNA COMPLEMENTARIOS PROCEDENTE DE UN mRNA: en muchos casos interesa clonar la secuencia codificante de un gen para lo cual se parte de muestras de mRNA que debe ser convertido en cDNA

PREPARACION DEL VECTOR CLONACIÓN: en general un vector es una molécula de ADN de tamaño pequeño fácil de aislar y caracterizar

PREPARACIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN

Un vector es una molécula de DNA de tamaño pequeño, fácil de aislar y caracterizar, con secuencia y mapa de restricción conocido. De fácil introducción en la célula anfitriona y una vez allí con capacidad de replicación autónoma.

La misión del vector es unirse al fragmento de DNA que se quiere clonar (Inserto) para facilitar su entrada a la célula anfitriona y su replicación.

Existen dos tipos de vectores de clonación: Vectores de inserción o propagación vectores de expresión

FORMACION DE LA MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE

Unión in vitro del inserto de DNA al vector fragmentado, mediante la ligasa.

En la practica pueden ocurrir diversos tipos de asociación entre fragmentos de restricción con extremos compatibles, todas ellas catalizadas por la ligasa.

Para evitar la formación de estos productos secundarios, se acude a estrategias experimentales, previas a la mezcla del vector e inserto.

TIPOS DE VECTORES Su procedencia procariota o eucariota.El tipo de célula anfitriona.El gen de resistencia.El tamaño del DNA que admiten como

inserto. Su tipo de molécula a partir de la que se

preparan:

Plásmidos: Moléculas de DNA de doble hebra, de pequeño tamaño (2-5 kb) y forma circular, presentes en forma libre en el citosol de muchas bacterias.

Bacteriófagos: Virus que infectan bacterias, útiles para conseguir alta eficiencia de clonación. Se pueden utilizar bajo la técnica de Inserción o de sustitución.

Quimeras: Combinan características de plásmidos y fagos para combinar las ventajas de ambos tipos de vectores.

Cromosomas Artificiales: Diseñados especialmente para adaptarsen al gran tamaño de los insertos requeridos.

INCORPORACIÓN DEL DNA RECOMBINANTE A LA CÉLULA

ANFITRIONA

PROPAGACIÓN DEL CULTIVOReplicación del propio genoma y la formación de copias del rDNA que haya podido incorporar.

DETECCIÓN Y SELECCIÓN DE LOS CLONES RECOMBINANTES

ARTICULO CIENTÍFICO

Ligation Independent Cloning:Efficient Directional Cloning of PCR

Products

Clonaje Independiente De Ligación: Clonación En Dirección Eficiente

De Productos PCR

LIC“Clonaje Independiente De Ligación”

Creados por tratamiento de una columna vertebral linealizada con ADN polimerasa T4 en presencia de un solo dNTP. Se Realiza mediante la utilización de enzimas de restricción, y sin proteínas de ligación.