CME Einleitung (Turner-Syndrom) 47, XXX (Triple-X-Syndrom), 47, XXY (Klinefelter-Syndrom) und 47, XYY

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  • gynäkologische praxis 2016 Band 40 / 4 577

    Nichtinvasive Pränataldiagnostik – Aneuploidien – zellfreie fetale DNA – pränataler Ultraschall

    gynäkologische praxis 40, 577–585 (2016) Mediengruppe Oberfranken – Fachverlage GmbH & Co. KG

    Nichtinvasive Pränataldiagnostik –

    für jede Schwangere die Methode der Wahl?

    G. Manegold-Brauer1, W. Holzgreve2, A. Geipel2

    1Abteilung für Ultraschall in Gynäkologie und Geburtshilfe, Frauenklinik,

    Universitätsspital Basel,

    2Abteilung für Geburtshilfe und Pränatal- medizin, Universitätsklinikum Bonn

    CME cm

    e.mgo-fachv erl ag

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    Einleitung

    Die Grundlage für die heute klinisch etablierte nichtinvasive Pränataldiagnostik (NIPT) wurde durch die Detektion von zellfreier fetaler DNA im mütterlichen Blut gelegt [1]. Bis dahin be- stand die einzige Möglichkeit der genetischen Diagnostik in einer direkten Analyse von fetalen oder plazentaren Zellen durch eine Amniozen- tese oder Chorionzottenbiopsie. Beide Eingrif- fe sind mit einem Abortrisiko von 0,3 – 0,5 % assoziiert. Weltweit wurden bereits etwa 1,4 Millionen Analysen mittels NIPT zur Detektion der häufigsten Chromosomenstörungen (Triso- mie 21, 13 und 18) durchgeführt. Die Nachfrage ist steigend, im Jahr 2015 wurden über eine Million Analysen durchgeführt [2]. Bei der zell- freien DNA im mütterlichen Blut handelt es sich um extrazelluläre DNA-Fragmente, die man im Plasma und Serum findet. Der Hauptanteil der zellfreien DNA stammt von der Mutter selbst und nur ungefähr 10 % stammen vom Fetus. Sie wird aus Zellen der Plazenta ins mütter- liche Blut abgegeben, kann bereits sehr früh in der Schwangerschaft detektiert werden und ist wenige Stunden nach der Geburt nicht mehr nachweisbar [3].

    Mit der Technik des Next Generation Sequencings (NGS) kann man heute verlässlich spezifische DNA-Sequenzen quantifizieren und damit auch Aussagen über Sequenzen treffen, die sowohl im mütterlichen als auch im fetalen Genom vorhan- den sind. Dies wird durch einen Vergleich der gemessenen Anzahl an Fragmenten mit einem Referenzgenom erreicht, somit ist eine Aussage über die Anzahl von z. B. fetaler DNA des Chro- mosoms 21 möglich [4].

    Bei den heutigen NIPT-Verfahren handelt es sich um Screeningtests mit sehr hohen De- tektionsraten für Trisomie 21, 13 und 18. Eine Karyotypisierung mit Analyse aller Chromoso- men ist weiterhin nur mittels invasiver Dia- gnostik möglich und deckt ein viel breiteres Spektrum an chromosomalen Anomalien ab. Es muss deshalb klar von der NIPT unterschieden werden.

  • 2016 Band 40 / 4 gynäkologische praxis 578

    sequencing werden analyserelevante Regionen der Chromosomen gezielt sequenziert. Dies sind im Wesentlichen Regionen der Chromosomen 21, 13 und 18. Die zu sequenzierende Menge wird dadurch geringer und die Analyse zeit- und kosteneffektiver. Beim dritten Verfahren, der sogenannten SNP-basierten Sequenzierung, werden SNPs amplifiziert und sequenziert. SNPs treten etwa einmal pro 300 Basenpaare auf dem menschlichen Genom auf und werden dazu be- nutzt, einzelne Individuen voneinander zu unter- scheiden. SNPs werden auch beim »genetischen Fingerabdruck in der forensischen Medizin be- nutzt. Der Vorteil liegt darin, dass so maternale und fetale DNA unterschieden werden kann. Da dieses Verfahren nicht quantitativ die einzelnen Chromosomen untereinander vergleicht, kann mit der SNP-Technologie auch eine Triploidie, bei der eine zusätzliche Kopie aller Chromoso- men vorliegt, erkannt werden. Die durchschnitt- liche Bearbeitungszeit für die meisten Verfahren liegt zwischen 5 und 8 Werktagen.

    Diagnostische Sicherheit der NIPT

    Trisomie 21, 13 und 18

    Die Daten für die häufigen Chromosomenstörungen (Trisomie 21, 13 und 18) stammen aus verschie- denen großen Studien aus Hochrisikokollektiven. Insgesamt liegen die Daten von mehr als 60.000 analysierten Schwangerschaften vor. Nach einer aktuellen Metaanalyse liegt die Detektionsrate für Trisomie 21 bei 99,2 %. Für die Trisomie 18 sind die Verfahren ähnlich gut mit einer Sensi- tivität von 96,3 %. Für die Trisomie 13 ist die Detektionsrate etwas niedriger bei 91 %. Alle NIPT-Screening-Verfahren haben im Vergleich zum konventionellen Ersttrimesterscreening signifikant niedrigere falsch-positiv-Raten ( Tab. 1) [6].

    Gonosomale Aneuploidien

    Die Geschlechtserkennung mittels NIPT hat eine Sensitivität von über 95 %. Die Erkennung von

    Technische Aspekte der verschiedenen Verfahren

    Es gibt derzeit 3 verschiedene Ansätze zur Analy- se von zellfreier DNA: die Gesamtgenomsequen- zierung (whole genome sequencing), die ge- zielte Genomsequenzierung (targeted genome sequencing) und die single nucleotid poly- morphism (SNP)-basierte Sequenzierung. Alle Verfahren basieren auf der Technik des Massive Parallel Genomic Sequencing (MPS) oder auch des Next Generation Sequencing (NGS) bei der Millionen von DNA-Molekülen parallel sequen- ziert werden [4]. Sowohl maternale als auch fe- tale DNA-Fragmente werden dabei sequenziert und einem Referenzgenom zugeordnet. Da der fetale Anteil der DNA nur einen kleinen Bruch- teil (ca. 10 %) der gesamten sequenzierten DNA ausmacht, zeigt sich der Unterschied bei einer zusätzlichen fetalen Kopie eines Chromosoms (wie z. B. bei der Trisomie 21) nur durch einen marginalen Anstieg der gesamten DNA-Fragmen- te des Chromosoms 21. Damit die quantitative Analyse genau bleibt, ist ein minimaler Anteil an fetaler DNA von mindestens 4 % erforderlich. Der Anteil an fetalen Zellen im mütterlichen Blut wird als fetale Fraktion bezeichnet. Sie wird durch verschiedene mütterliche und fetale Faktoren beeinflusst. Der fetale Anteil steigt mit zunehmendem Gestationsalter und ist bei fetaler Trisomie 21 höher. Umgekehrt sinkt die fetale Fraktion, je höher das mütterliche Gewicht ist. Sie ist auch bei fetaler Trisomie 13 und 18 sowie bei plazentaren Mosaiken erniedrigt. Bei Mehr- lingen ist der Anteil pro Fet geringer [5]. Wenn die fetale Fraktion zu niedrig ist, kann die NIPT kein Ergebnis liefern. Dies ist bei ca. 2 – 3 % aller Proben initial der Fall. Mit einer Wiederholung der Blutentnahme kann ca. bei der Hälfte der primär nicht auswertbaren Tests noch eine valide Analyse erfolgen.

    Beim whole genome sequencing wird die gesam- te zellfreie DNA sequenziert und einem Referenz- chromosom zugeordnet. Um eine klare Differen- zierung zwischen aneuploiden und euploiden Feten sicherzustellen, werden 12 – 15 × 106 zugeordnete Chromosomenfragmente benötigt (»reads«). Beim sogenannten targeted genome

  • gynäkologische praxis 2016 Band 40 / 4 579

    mosom. Mit Ausnahme des Turner-Syndroms gibt es wenig publizierte Daten. Der Anteil an Fällen, in denen mittels NIPT kein auswertbares Tester- gebnis ermittelt wird, liegt im Vergleich zu den anderen Aneuploidien höher.

    Triploidien

    Das Vorliegen einer 3. Kopie von jedem Chro- mosom wird Triploidie genannt. Diese stammt entweder vom Vater (diandric triploidy) oder von der Mutter (digynic triploidy) und ist eine Herausforderung für die NIPT. Da bei den meis- ten Verfahren (whole genome sequencing, tar- geted sequencing) das Verhältnis der einzelnen Chromosomen zueinander betrachtet wird, sind Triploidien mittels dieser Verfahren nicht er- kennbar. Eine kleine Anzahl an Fällen wurde mit der SNP-Technologie untersucht [12]. Während die diandrische Triploidie nachgewiesen werden konnte, reichte aufgrund der schweren Wachs- tumsretardierung und der sehr kleinen Plazenta bei digyner Triploidie die fetale Fraktion nicht aus, um ein Ergebnis zu erhalten.

    Abweichungen der Geschlechtschromosomen ist deutlich anspruchsvoller und deren Bedeu- tung ist höchst umstritten. Die häufigsten go- nosomalen Chromosomenstörungen sind 45, X0 (Turner-Syndrom) 47, XXX (Triple-X-Syndrom), 47, XXY (Klinefelter-Syndrom) und 47, XYY (Ja- cob-Syndrom). Während das Turner-Syndrom meist bereits im pränatalen Ultraschall erkannt wird, wurden die anderen gonosomalen Aberra- tionen bisher meist als Zufallsbefund im Rah- men einer Karyotypisierung detektiert. Die zu erwartende klinische Bedeutung ist höchst vari- abel und eine pränatale Beratung entsprechend schwierig. Viele Betroffene haben keine oder nur geringe physische oder psychische Einschränkun- gen. Im Vergleich zu den häufigeren Trisomien sind die Detektionsraten deutlich schlechter und die Anzahl falsch positiver Befunde höher [7, 8], was die Vorteile der NIPT gegenüber dem Erst- trimesterscreening minimiert. Ursachen für die niedrigeren Detektionsraten sind der Guanin-Cy- tosin-Gehalt des X-Chromosoms, welcher die Zuverlässigkeit der Sequenzierung beeinflusst, die geringe Größe des Y-Chromosoms und die Ähnlichkeit zwischen dem X- und dem Y-Chro-

    Aneuploidie Anzahl

    betroffener Feten

    Anzahl gesunder

    Feten

    Detektions­ rate

    (95 % ­ CI)

    Falsch­ positiv­Rate (95 % ­ CI)

    Trisomie 21 1.051 21.608 99,2 % (98,5 – 99,6 %)

    0,09 % (0,05 – 0,14 %)

    Trisomie 18 389 21.306 96,3 % (94,3 – 97,9 %)

    0,13 % (0,07 – 0,20 %)

    Trisomie 13 139 18.059 91,0 % (85,0 – 95,6 %)

    0,13 % (0,05 – 0,26 %)

    Turner- Syndrom

    177 9.079 90,3 % (85,7 – 94,2 %)

    0,23 % (0,14 – 0,34 %)

    Andere gonosomale Aneuploidien

    56 6.699 93,0 % (85,8 – 97,8 %)

    0,14 % (0,06 – 0,24 %)

    Trisomie 21 bei Zwillingen

    31 399 93,7 % (83,6 – 99,2 %)

    0,23 % (0,00 – 0,92 %)

    Tab. 1 | Detektionsraten der NIPT für die häufigste