CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN

1. Định nghĩa

Protein là những đại phân tử được tạo thành từ các đơn phân axít amin, chúng kết hợp với

nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptit (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể

xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của

protein. Protein có thể gồm l hay nhiều chuỗi polypeptit cùng loại hay khác loại. Tính đặc thù và

đa dạng của protein được thể hiện ở số lượng axit amin, thành phần và trình tự sắp xếp các axit

amin trong chuỗi polypeptit và cấu trúc không gian của protein.

Protein đơn bào là thuật ngữ gọi theo quy ước dùng để chỉ nguồn protein thu được từ vi

sinh vật. Phân biệt với protein đa bào thu được từ động vật và thực vật.

2. Cấu trúc của protein

Cấu trúc bậc một: Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi

polypepetit. Đầu mạch polypeptit là nhóm amin của axit amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm

cacboxyl của axit amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của

các axit amin trên chuỗi polypeptit. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì

trình tự các axit amin trên chuỗi polypeptit sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi

polypeptit, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như

vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin có thể dẫn đến sự biến

đổi cấu trúc và tính chất của protein.

Cấu trúc bậc 1

Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptit trong không gian. Chuỗi

polypeptit thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp

β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau. Các protein sợi như

Trang 1

keratin, colagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu

có nhiều nếp gấp β hơn.

Cấu trúc bậc 2

Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi

có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết

định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính

chất của gốc -R trong các mạch polypeptit. Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu

disunphua (-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ

xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị

nước thì chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trị

có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu.

Cấu trúc bậc 3

Trang 2

Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptit phối hợp với nhau thì tạo nên

cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptit liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như

liên kết hyđro. Chi khi hình thành cấu trúc bậc 4 thì protein mới có hoạt tính sinh học.

Cấu trúc bậc 4

3. Chức năng của protein

Loại protein Chức năng Ví dụ

Protein cấu

trúc thường

có dạng sợi

Cấu trúc, nâng đỡ

Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền, mềm dẻo của

mô liên kết, dây chằng, gân, mô xương. Keratin tạo nên cấu

trúc chắc của da, lông, móng. Fibroin của tơ nhện, tơ tằm tạo

nên độ bền vững của tơ nhện, vỏ kén. Sclerotin tạo sự bền vững

cho lớp vỏ ngoài của sâu bọ.

Protein

Enzyme

Xúc tác sinh học:

tăng vận tốc phản

ứng, chọn lọc các

phản ứng sinh hóa

Xúc tác hầu hết các phản ứng sinh học từ đơn giản đến phức

tạp. Các enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức ăn,

amylase trong nước bọt phân giải tinh bột chín, protease phân

giải protein, lipase phân giải lipid

Protein điều

hòa

Điều hòa quá trình

truyền thông tin di

Insulin và Glucagon do tuyến tụy tiết ra có tác dụng điều hòa

hàm lượng đường glucose trong máu động vật có xương sống.

Trang 3

truyền, quá trình

trao đổi chất

Thyroglobulin từ tuyến giáp điều hòa các quá trình chuyển hóa

nói chung. Calcithonin có tác dụng hạ thấp nồng độ canxi trong

máu.

Protein vận

tải

Vận chuyển các

chất trong cơ thể

Hemoglobin, mioglobin (ở động vật có xương sống),

hemoxianin (ở động vật ko xương sống) có vai trò vận chuyển

oxy từ phổi theo máu tới khắp các mô và cơ quan trong cơ thể.

Protein vận

động

Tham gia vào chức

năng vận động của

tế bào và cơ thể

Actin và myosin có vai trò vận động cơ ở tế bào nhân thật.

Tubulin có vai trò vận động lông, roi của các sinh vật đơn bào

Protein thụ

quan

Cảm nhận, đáp

ứng các kích thích

của môi trường

Một số protein có vai trò trung gian cho phản ứng trả lời của tế

bào thần kinh với các kích thích đặc hiệu. VD. Vai trò của sắc

tố thị giác rodopxin ở màng lưới mắt.

Protein dự

trữ

Dự trữ chất dinh

dưỡng

Albumin lòng trắng trứng là nguồn cung cấp axit amin cho

phôi phát triển. Casein trong sữa mẹ là nguồn cung cấp acid

amin cho con. Trong hạt cây có chứa nguồn protein dự trữ cần

cho hạt nảy mầm như gliadin trong lúa mì, zein trong ngô.

Protein bảo

vệ

Bảo vệ cơ thể khỏi

sự tấn công của

những vật thể lạ

Các kháng thể (antibodies) còn được gọi là immunoglobulin

tạo ra hàng ngàn protein khác nhau để phản ứng lại các kháng

nguyên (antigens), bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các

vật thể lạ.

4. Cơ chế sinh tổng hợp protein trong tế bào

Trang 4

Sao mã: Là quá trình tổng hợp mARN. mARN sau khi được tổng hợp sẽ rời khỏi nhân

đến tế bào chất để tham gia giai đoạn giải mã.

Giải mã: gồm 2 bước

- Bước 1: Hoạt hóa axit amin

Axit amin + ATP Enzym Axit amin hoạt hóa

Axit amin hoạt hóa + tARN Enzym Phức axit amin – tARN

- Bước 2: Tổng hợp chuỗi poly peptit: Tại mã mở đầu AUG, riboxom tiếp xúc với

mARN, aa mở đầu-tARN tiến vào riboxom khớp bổ sung đối mã với mã mở đầu, sau đó aa1-

tARN tiếp tục tiến vào riboxom khớp bổ sung đối mã với mã sau 1. Sau đó liên kết peptit được

thành lập giữa aa mở đầu với aa1. Riboxom dịch chuyển 1 bộ 3 trên mARN, tARN mở đầu rời

riboxom. Cứ như vậy khi riboxom dịch chuyển đến mã kết thúc, không giải mã mà rời khỏi

mARN, đồng thời chuỗi polypeptit được giải phóng. Sau đó aa mở đầu được tách khỏi mạch

polypeptit nhờ enzym đặc hiệu. Chuỗi polypeptit tại thành những cấu trúc bậc cao hơn để tạo

thành protein hoàn chỉnh. Một mARN có thể liên kết nhiều riboxom cùng lúc để tổng hợp nhiều

protein cùng loại.

5. Tại sao phải sản xuất protein đơn bào

5.1. Vai trò của protein trong cuộc sống

Cơ thể người và động vật thường xuyên đòi hỏi cung cấp các chất dinh dưỡng có trong

thức ăn để tiến hành trao đổi chất, duy trì sự sống, tăng cường sinh trưởng và phát triển. Thức ăn

ngoài nước còn bao gồm các nhóm chất: protein, lipit, gluxit, vitamin, muối khoáng,... trong đó

protein là quan trọng nhất.

Trang 5

Protein là nguồn nitơ duy nhất cung cấp cho con người và động vật, nó không phải là

nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu (sau glucid và lipid) mà trong quá trình cơ thể đồng hóa

protein được phân giải thành 20 acid amine cần thiết cho cơ thể. Trong đó có các acid amine

không thay thế rất cần thiết cho con người và động vật là Isoleucine, leucine, lysine, methionine,

phenylalanine, treonine, tryptophan và valin. Nếu không nhận được các aa này cơ thể sẽ bị bệnh

tật và chết.

5.2. Tính cấp thiết của CNSX protein đơn bào

Hiện nay nhân loại đang đứng trước vấn đề bùng nổ dân số, mỗi năm tăng khoảng gần

100 triệu người. Năm 1996 có 5,7 tỉ người, năm 2000 lên đến trên 6 tỉ người, Dự kiến đến năm

2020 là 8,5 tỉ và nếu không có sự kiểm soát chặt chẽ của mỗi quốc gia thì đến năm 2050 có thể

lên tới con số 10 tỉ dân. Trong đó gần 50 % là trẻ em, đòi hỏi trong khẩu phần ăn hàm lượng

protein cao nhưng lại chưa có khả năng lao động. Hiện nay lượng lương thực, thực phẩm trên

thế giới chỉ đủ cung cấp gần 2/3 nhu cầu protein cho con người. Ở Việt Nam, tính trung bình

hiện nay chỉ cung cấp được khoảng 40g Pr/ ngày/người, thậm trí có các quốc gia hiện nay có

hàm lượng protein trung bình là 3 – 20 g/người/ngày.

Vì vậy, công nghệ sản xuất protein đơn bào giải quyết vấn đề thiếu hụt protein trên thế

giới. Cơ sở khoa học của giải pháp này là lợi dụng sự phát triển nhanh chóng của vi sinh vật và

sự phong phú về protein, axit amin trong tế bào vi sinh vật làm nguồn thức ăn cho người và gia

súc.

Hiệu suất sinh tổng hợp protein ở các đối tượng khác nhau

Các loài (1000 kg) Sản lượng protein/ngày (kg) Hiệu suất/ngày (%)

Bò 1 0,1

Đậu tương 10 1

Nấm men 105 104

Vi khuẩn 1011 1010

Trang 6

5.3. Giá trị dinh dưỡng của protein vi sinh vật

Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật (% khối lượng khô)

Thành phần Nấm sợi Tảo Nấm men Vi khuẩn

Nitơ 5-8 7,5-10 7,5-8,5 11,5-12,5

Lipit 2-8 7-20 2-6 1,5-3

Chất tro 9-14 8-10 5-9,5 3-7

Axit nucleic - 3-8 6-12 8-16

Trong thành phần nitơ của vi sinh vật có mặt các axit amin không thay thế mà hàm lượng

có thể so sánh với protein của trứng và thịt bò.

Hàm lượng axit amin không thay thế của một số nguồn protein (mg/100g chất khô)

Axit amin Lúa mỳ Trứng Spirulina

maxima

S. cerevisiae Candida

lipolytica

Pseudomonas

Lysine 2,8 6,5 4,6 7,7 7,8 5,3

Threonin 1,9 5,1 4,6 4,8 5,4 4,5

Methionin 1,5 3,2 1,4 1,7 1,6 1,8

Cystein 2,5 2,4 0,4 - 0,9 0,3

Tryptophan 1,1 1,6 1,4 1,0 1,3 -

Izolơxin 3,3 6,7 6,0 4,6 5,3 3,9

Lơxin 6,7 8,9 8,0 7,0 7,8 7,0

Valin 4,4 7,3 6,5 5,3 5,8 5,9

Phenylalanin 4,5 5,8 5,0 4,1 4,8 4,2

Tế bào vi sinh vật chứa nhiều loại vitamin. Nấm men giàu vitamin nhóm B, vi khuẩn

chiếm ưu thế về VTM B12, tảo chứa nhiều β-caroten (tiền VTM A) và tocopherol, nấm mốc chứa

ít VTM nhất.

Trang 7

Hàm lượng vitamin (mg/100g chất khô)

Vitamin Candida utilis S. cerevisiae Pseudomonas

methanica

Thiamine (B1) 0,53 5-36 1,81

Riboflavin (B2) 4,50 3,6-4,2 4,82

Niacin (B3) 41,73 32-100 15,9

Pyridocyn (B6) 3,34 2,5-10 14,3

Axit pantothenic (B5) 3,72 10 2,42

Choline (hỗn hợp VTMB) - - 968

Axit folic (dạng hòa tan của B9) 2,15 1,5-8 -

Inositol (Bh) - - -

Biotin (VTM H) 0,23 0,5-1,8 -

VTM B12 0 0 0,96

Axit p-amineobenzoic (BX) 1,7 0,9-10 -

Do cơ thể không tự tổng hợp đựợc các axit amin không thay thế nên phải bổ sung qua

thức ăn. Nếu bị thiếu một trong số các axit amin này hoặc không đủ về lượng thì không thể đồng

hóa hết lượng protein có trong thức ăn. Hầu hết các loại thức ăn đều thiếu 1 hay nhiều loại axit

amin nên thông thường trong bữa ăn hàng ngày nên ăn nhiều loại thức ăn khác nhau để cung cấp

đầy đủ axit amin không thay thế cho cơ thể.

Các loại aa không thay thế thiếu hụt trong các sản phẩm thực phẩm khác nhau

Thực phẩm Loại axit amin thiếu hụt Phần trăm thiếu

Trứng Không 0

Thịt bò Cystein, Methionin 29

Sữa bò Cystein, Methionin 32

Gạo, lúa mì, ngô Lyzin 61-72

Nấm men bánh mì Cystein, Methionin 55

Trang 8

Vì vậy nguồn protein vi sinh vật là vô cùng quan trọng bổ sung đầy đủ các thiếu hụt về

protein nói chung và axit amin không thay thế nói riêng cho con người và động vật.

6. Các nguồn thu protein

Protein động vật:

Protein động vật là nguồn protein phổ biến nhất bao gồm hệ thống protein của thịt, cá,

trứng, sữa... Protein cá thường ít tan trong nước nếu chưa được khử lipit tốt. Trong công nghệ

protein thường Protein sữa bao gồm cazein, cazeinat và lactoserum. Cazein là một protein có

tính chất tạo nhũ được sử dụng nhiều trong thực phẩm. Protein của máu và nội tạng động vật là

nguồn protein có thể thu hồi cho sản phẩm giá trị cao như globin, chất tạo nhũ sử dụng trong

công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp khác.

Protein thực vật

Do đặc trưng cấu tạo loài, thực vật được xem là nguồn protein ít phổ biến nhất ngoại trừ

một số nguồn protein kinh điển như đậu tương. Gần đây protein từ các nguồn đậu khác như đậu

Hà Lan, đậu đỏ, các loại hạt như hạt hướng dương, hạt cải cũng được khai thác và sử dụng. Các

loại lá thực vật là một nguồn protein phong phú, tuy nhiên do cấu trúc và thành phần phức tạp,

protein thường nằm trong hỗn hợp các thành phần khác nhau của lá thực vật, liên kết với các

thành phần không có giá trị dinh dưỡng, giá trị sinh học, vì thế nguồn protein lá thực vật được

khai thác rất ít. Gần đây một số protein lá thực vật được khai thác chủ yếu để thu hồi các enzym

có hoạt tính sinh học.

Protein vi sinh vật

Protein vi sinh vật được xem là nguồn protein hấp dẫn do chứa khá đầy đủ và cân đối

thành phần các axit amin cũng như hàm lượng protein của tế bào vi sinh vật. Nguồn protein vi

sinh vật có lợi thế như tốc độ sinh trưởng nhanh, thức ăn rẻ, nâng cấp sản xuất dễ dàng, chủ

động thiết kế và xây dựng dây chuyền công nghệ tổng hợp protein, không phụ thuộc vào thời

tiết hay khí hậu, có khả năng kiểm soát quá trình chặt chẽ.

Protein tái tổ hợp

Bên cạch các protein khai thác từ các nguồn tự nhiên, một nguồn protein rất quan trọng là

protein thu được từ các vi sinh vật cải biến gen. Tiến bộ trong kỹ thuật gen trong vài thập kỷ gần

đây cho phép tạo ra các protein mới dựa vào việc tạo ra các gen tái tổ hợp. Hiện nay các protein

Trang 9

tái tổ hợp có đặc tính quý được biểu hiện trong các vật chủ là động vật, thực vật hoặc vi sinh vật

càng làm phong phú thêm nguồn protein và khả năng sử dụng chúng.

CHƯƠNG II: NGUỒN DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT

1. Dinh dưỡng cacbon

Nguồn cacbon trong tự nhiên rất phong phú. Tất cả các hợp chất cacbon nào (trừ kim

cương và than chì) đều được VSV sử dụng. Đây là nguồn dinh dưỡng chủ yếu có trong môi

trường có giá thành tương đối rẻ như CO2, hydratcacbon (rỉ đường, bã mía, bã bia, dịch kiềm

sunfit...), cacbua hydro (n-parafin, khí metal...). Dinh dưỡng cacbon xảy ra ở cả ngoại bào và nội

bào.

- Ngoại bào: Tinh bột -amilase Dextrin β-amilase maltose và saccharose

Maltose Maltase 2 glucose (mono saccharid)

Saccharose Saccharase và investase glucose + fructose (mono saccharid)

- Nội bào:

Maltase glucose Có oxy Protein, aa, a.acetic, các sán phẩm LM hiếu khí

Không oxy

Các sản phẩm LM yếm khí CO2, H2O, rượu, acid lactic ...

Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào:

- Thành phần và cấu tạo hóa học, đặc biệt là mức độ ôxi hóa của nguyên tử cacbon.

- Đặc điểm sinh lý của vi sinh vật

+ Với các chất có phân tử lượng thấp thì VSV có thể đồng hóa trực tiếp

+ Với các hợp chất hữu có cao phân tử sẽ được phân hủy nhờ các enzym để tạo thành các

hợp chất thấp phân tử hơn mà VSV có thể đồng hóa được.

+ Với các hợp chất không tan trong nước (xenluloza, parafin...) thì vi sinh vật hấp thụ

quanh bề mặt của chúng và phân giải dần dần.

Các nguồn cacbon thường được sử dụng là các loại đường sacaroza, maltoza, glucoza,

hexoza và các loại bột ngũ cốc như bột gạo, bột ngô, bột đại mạch... chứa chủ yếu là tinh bột. Để

đồng hóa được tinh bột VSV phải tiết ra môi trường enzym amilaza như -amilaza, β-amilaza

Trang 10

và -glucosidaza. Hệ enzym này được sinh ra trong tế bào rồi được tiết ra môi trường để phân

hủy tinh bột.

2. Dinh dưỡng nitơ

Vi sinh vật cũng như các cơ thể sống khác cần nitơ để xây dựng tế bào, tất cả các thành

phần quan trọng của tế bào đều chứa nitơ.

Nguồn nitơ

- Nitơ trong không khí: lượng nitơ này rất phong phú nhưng nó rất bền vững về mặt hóa

học, rất khó bị ôxi hóa hoặc khử. Chỉ có một số VSV có khả năng cố định nitơ mới có khả năng

đồng hóa nitơ không khí.

- Nitơ hữu cơ: cấu trúc chủ yếu là aa. Các aa có mặt trong môi trường thường không được

VSV sử dụng trực tiếp mà phải tiến hành 2 loại phản ứng khử amin và khử cacboxyl. Nitơ hữu

cơ thường sử dụng: cao ngô, khô đậu tương, khô lạc, pepton, cao thịt, cao nấm men ... Muốn

đồng hóa được các chất này VSV phải tiết vào môi trường hệ enzym protease để thủy phân

protein thành aa.

- Nitơ vô cơ: thường sử dụng các muối amon: (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4,

NH4H2PO4, NH4NO3 là nguồn nitơ mà tất cả các VSV đều có khả năng đồng hóa.

Ure được dùng bổ sung nguồn nitơ và điều chỉnh pH môi trường, dưới tác dụng của

urease, ure phân huỷ thành CO2 và NH3.

(NH2)2CO + H2 Urease 2NH3 + CO2

Nguồn nitrat VSV cũng không thể đồng hóa được mà phải trải qua quá trình biến đổi

dưới tác dụng của enzym nitratreductase để tạo thành sản phẩm cuối cùng là NH3.

3. Dinh dưỡng khoáng

- Các hợp chất phospho: có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất trong tế bào

VSV. Liên kết cao năng là nguồn cung cấp năng lượng sống khá lớn cho tế bào VSV (dạng

ADP, ATP). Ngoài ra phospho trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzym

đồng hóa nguồn cacbon.

Nguồn phospho thường là các hợp chất phospho hữu cơ trong bột đậu, cao ngô, bã rượu,

khô dầu... và các hợp chất phospho vô cơ, các muối phospho... Nhu cầu phospho của vi sinh vật

Trang 11

phụ thuộc vào từng chủng VSV, vào tỉ lệ thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Thông

thường tỉ lệ C : N : P trong môi trường phải cân đối thường = 100 : 10 : 1.

- Các chất khoáng khác: Trong tế bào vi sinh vật có hàng loạt các chất khoáng khác

nhau như magie, natri, sắt, nhôm, kali, liti, rumidi, mangan, chì... Vi sinh vật lấy chất khoáng từ

môi trường dinh dưỡng, những chất khoáng này có thể có sẵn trong nước, trong các hợp chất có

chứa cacbon, nitơ nhưng cũng có khi phải bổ sung thêm vào môi trường.

4. Các chất kích thích sinh trưởng

Biotin, penicilin, acid béo và các chất hoạt động bề mặt, các aa như cystein, xistin,

histidin, leuxin, VTM B1, các loại axit hưu cơ như acid citric, oxalic, tri hoặc tetra-polyphosphat

để ức chế sự phát triển của thực khuẩn thể. ..

5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống của VSV

- Nước là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến tế bào VSV. Nó hòa tan các nguồn

dinh dưỡng để đưa vào cơ thể VSV. Nước chiếm 80-85% trọng lượng cơ thể.

- Chất khô: Cao trên 60% hầu hết VSV không sinh trưởng và sinh sản được

- Nhiệt độ: Các VSV thích nghi ở các điều kiện nhiệt độ tương đối đa dạng. Có chủng thì

thích hợp ở nhiệt độ thấp 0 – 15oC, đại đa số nhiệt độ tối thích ở khoảng trung bình 25-37OC còn

lại thích nghi ở nhiệt độ cao 50-75OC.

Bảng nhiệt độ tối thích, tối thiểu, tối đa của VSV (oC)

VSV Nhiệt độ tối thiểu Nhiệt độ tối thích Nhiệt độ tối đa

Vi khuẩn 8-10 30-35 40-45

Nấm mốc 7-10 33-37 40-43

Nấm men 0,5-5 20-30 40-50

- pH: có ảnh hưởng rất lớn đến VSV

Bảng pH tối thích, tối thiểu, tối đa của VSV

Trang 12

VSV pH tối thiểu pH tối thích pH tối đa

Vi khuẩn 4,0-4,7 6,0-6,5 7,9-8,5

Nấm mốc 1,5 4,0-6,0 9,0-11,0

Nấm men 3,0-3,5 4,5-6,0 8,5

- Oxy: là nguyên tố không thể thiếu đối với hoạt động sống. Trong công nghệ vi sinh

chúng ta quan tâm đến nồng độ oxy tới hạn. Trong điều kiện sinh trưởng lượng oxy cần nhiều

hơn nồng độ oxy tới hạn. Khi nhiệt độ tăng hàm lượng oxy hòa tan giảm.

Bảng qua hệ giữa nhiệt độ và nồng độ oxy hòa tan

Nhiệt độ (OC) [O2] mg/l H2O

0 14,6

6 12,5

10 11,3

16 10

20 9,2

26 8,2

30 7,6

Nhu cầu về oxi của VSV và ảnh hưởng của nó đến quá trình lên men:

- Oxi là một trong những yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất. Oxi hòa

tan trong nước được 9-10mg/l. Vì tế bào cần oxi để hô hấp nên cần cung cấp đều đặn,

nếu thiếu oxi nhất thời hoặc ở khu vực nào đó sẽ phá vỡ sự trao đổi chất trong tế bào

và phải cung cấp oxi sao cho tốc độ hòa tan oxi bằng tốc độ sử dụng oxi. Việc sục khí

đảm bảo cung cấp oxi cho môi trường và cân bằng nhiệt độ lên men

- Khi sử dụng cánh khuấy, oxi tiếp xúc với màng tế bào do đó cần sục khí sao cho áp

suất bên ngoài lớn hơn áp suất bên trong tế bào.

- Trong quá trình nuôi cấy không khí được nén vào thùng lên men, tốc độ cánh khuấy

tăng dần làm thay đổi tốc độ hòa tan và có thể trộn đều các chất giúp VSV đồng hóa

tốt hơn, có thể tách nhanh các sản phẩm trao đổi chất của tế bào vào môi trường

Trang 13

- Tuy nhiên nếu khuấy quá mạnh sẽ phá vỡ tế bào. Thông thường phải tính toán chiều

cao của cánh khuấy phù hợp với thùng lên men

- Trong thời kỳ sinh trưởng, VSV cần oxi, cường độ bão hòa oxi trong môi trường phụ

thuộc vào áp suất và nhiệt độ. Áp suất tăng đến 50KPa thì độ hòa tan của oxi tăng 10-

15%, khi nhiệt độ tăng thì độ hòa tan của oxi giảm. Độ hòa tan của oxi giảm khi trong

môi trường có các chất dạng huyền phù. Trong môi trường có xác tế bào sẽ làm giảm

độ hòa tan của oxi 85-90%. Nếu trong môi trường có những chất có khả năng khuếch

tán bọt thì độ hòa tan oxi tăng. Nước biển (3-4% NaCl) hòa tan oxi kém nước ngọt

20%.

CHƯƠNG III. CÁC VI SINH VẬT SỬ DỤNG TRONG CNSX

PROTEIN, AXIT AMIN

1. Tảo

Trong tự nhiên có nhiều loại tảo có hàm lượng protein cao nhưng ko sử dụng được cho

người và gia súc vì chúng có độc tố. Ở Châu Phi người ta vớt tảo lam Spirulina maxima ở các ao

hồ giàu muối canxi làm thức ăn bồi bổ và dùng làm thuốc chữa một số bệnh như phù chân, đau

răng và các bệnh về đường tiêu hóa. Cho đến nay có 3 loại tảo đơn bào đuợc sản xuất trên quy

mô lớn và có hiệu quả kinh tế cao là: Chlorella, Spirulina và Scenedesmus.

Ưu điểm của tảo đơn bào:

- Giá trị dinh dưỡng cao và có khả năng ứng dụng rộng rãi

+ Tảo đơn bào có hàm lượng protein rất cao (chiếm khoảng 40-55% chất khô), riêng tảo

Spirulina chiếm tới 70% chất khô.

+ Protein của tảo thuộc loại protein hoàn hảo. Hàm lượng protein trong tảo gần với quy

định protein tiêu chuẩn. Lượng aa không thay thế rất cao, có thể chiếm tới 42% tổng số

aa.

+ Tảo chứa nhiều VTM như VTM A, B, C, K (đặc biệt là VTM A, B12 và VTM C) và

chất lượng các VTM này rất tốt. Ngoài ra còn có axit aconitic, axit pantotenic, biotin,

lecophorin.

Trang 14

- Cho đến nay chưa tìm thấy độc tố nào nguy hiểm trong các loại tảo trên.

- Tảo có diệp lục nên chúng là loài tự dưỡng do chúng có khả năng quang hợp khác với

các loài vi sinh vật khác.

- Tảo có kích thước tế bào lớn, thuận lợi cho quá trình thu nhận cũng như số lượng sinh

khối.

- Không bị virus tấn công, môi trường nuôi cấy đơn giản.

- Tảo có khả năng làm sạch các nguồn nước bẩn, giữ vệ sinh môi trường. Tảo lam còn

tham gia quá trình cố định nitơ của không khí nhờ những tính chất đặc biệt của mình.

3. Mấm men

Trong các nguồn protein sản xuất bằng VSV, nấm men được nghiên cứu sớm nhất và

được ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Con người đã sử dụng nấm men hoặc các sản phẩm của

chúng từ hàng ngàn năm nay.

Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản bằng cách nảy chồi.

Nấm men không có diệp lục nên không có khả năng tự dưỡng mà phải sử dụng các nguồn dinh

dưỡng từ môi trường.

Trong tế bào nấm men có chứa hầu hết các chất cần thiết cho sự sống (protein, gluxit,

lipit, các enzym, các VTM, axit nucleic và các chất khoáng).

Nấm men được chú ý nhiều không chỉ vì giá trị dinh dưỡng mà còn vì khả năng tăng sinh

khối và các đặc điểm sinh lý phù hợp với điều kiện sản xuất công nghiệp.

Giá trị dinh dưỡng của nấm men:

- Giàu protein và VTM đặc biệt là VTM nhóm B.

- Sinh khối nấm men chứa khoảng 20-25% chất khô, trong đó cacbon chiếm 45-50%, nitơ

7-10%, hydro 5-7%, oxy 25-30%, các nguyên tố vô cơ 5-10%, ngoài ra còn một số

nguyên tố vi lượng khác.

- Hàm lượng protein tùy thuộc vào từng chủng nấm men và thành phần, điều kiện nuôi

cấy dao động trong khoảng 40 - 60%.

Trang 15

- Protein của nấm men gần giống protein của động vật, chứa khoảng 20aa cần thiết, thành

phần aa của nấm men cân đối hơn so với lúa mì và các hạt ngũ cốc khác, kém chute ít so

với sữa và bột cá, bột xương thịt và các sản phẩm động vật nói chung.

- Các chủng nấm men thường được sử dụng cho người và gia súc là: Endomyces vernalis,

Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Turolopsis utilis, Monilia candia…

- Các chủng nấm men dùng để sản xuất protein từ các nguồn hydrat cacbon cần có các

tiêu chuẩn sau:

+ Có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khac nhau

+ Có thể phát triển tốt trên môi trường có nồng độ chất khử cao

+ Có khả năng phát triển nhanh, có sức đề khàng cao đối với nồng độ CO2

+ Sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao, có nhiều aa

không thay thế, có nhiều VTM quý…)

+ Kích thước tế bào tương đối lớn để dễ dàng tách bằng ly tâm

+ Chịu được nhiệt độ cao, ít làm biến đổi pH môi trường.

+ Trong sản xuất công nghiệp các giống nấm men thường được sử dụng là

Saccharomyces, Candida, và Turolopsis vì khả năng chuyển hóa của 3 chủng này rất cao

và đa dạng, quy trình công nghệ tương đối đơn giản.

3. Vi khuẩn

Vi khuẩn để sản xuất protein thường được nuôi trên cacbua hydro. Các giống thường

được sử dụng là: Pseudomonas, Flavobacterium, Mycobacterium và Nocardia.

Các giống vi khuẩn này có khả năng đồng hóa các ankal (C6 – C18), cacbua hydro béo

và thơn khác.

Đối với nguyên liệu là metan, sử dụng giống Methylamonas, Methyllococens capsulatus.

Đặc điểm của các chủng vi khuẩn này:

- Tốc độ sinh trưởng nhanh

- Sử dụng được nhiều loại cơ chất

- pH luôn giữ ở 5-7 để tránh nguy cơ nhiễm các vi khuẩn gây bệnh

- Thành phần các aa cân đối

Trang 16

- Khi dùng các vi khuẩn Gram âm để sản xuất protein cần lưu ý khả năng sinh độc tố của

chúng.

4. Nấm mốc và xạ khuẩn

Nói chung nấm mốc và xạ khuẩn ít được dùng để sản xuất protein. Về mặt dinh dưỡng

protein của các VSV này kém hơn của tảo, nấm men và vi khuẩn. Về mặt kỹ thuật do hệ sợi phát

triển thành từng búi nên rất khó khăn cho quá trình khuấy trộn và sục khí.

Nấm mốc là những cơ thể đa bào giàu VTM nhóm B, chứa khoảng 30-60% protein, hàm

lượng methionin và tryptophan thấp, có các aa khác tương tự tiêu chuẩn của FAO. Các giống

nấm mốc có hàm lượng protein cao là: Fusarium, Rhizopus, Penicillium, Apspegillus.

Cho đến nay xạ khuẩn chưa được dùng trong sản xuất protein. Tuy vậy người ta vẫn

thường thu hệ sợi của xạ khuẩn và nấm mốc trong quá trình sản xuất thuốc kháng sinh

(Penicillium), các enzym và axit xitric… dưới dạng sản phẩm phụ của nhà máy nhằm sử dụng

protein, VTM, enzym trong đó vào các mục đích khác nhau. Nhược điểm của sinh khối xạ

khuẩn và nấm mốc thu theo phương pháp này là nhanh bị hư hỏng. Vì vậy phải chú ý khâu sấy

ngay sau khi tách sinh khối ra khỏi dây chuyền công nghệ. Trong công nghiệp kháng sinh người

ta có thể thu được từ sinh khối hệ sợi gần 17% các chất chứa nitơ trong số đó các chất chứa nitơ

đồng hóa khoảng 14%, gần 10% protein tiêu hóa, 2% chất béo, 2,5% chất xơ… để sử dụng trong

chăn nuôi.

CHƯƠNG IV: CÁC GIAI ĐOẠN CHÍNH CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN

SX PROTEIN, AXIT AMIN

1. Giống sản xuất

1.1. Tuyển chọn chủng

- Phân lập: Để chọn được giồng VSV thuần chủng bước đầu phải tiến hành phân lập từ tự

nhiên như đất, nước, không khí, các mô động, thực vật, các vật liệu vô cơ, hữu cơ đã bị phân

hủy ít nhiều.

- Tuyển chọn: Các chủng phân lập được gọi là chủng nguyên thủy, thường những chủng

này chưa đáp ứng được các yêu cầu cho sản xuất công nghiệp mà nó phải được tuyển chọn để

xác định các tính chất sinh lý, sinh hóa và các điều kiện lên men thích hợp để nó có hoạt tính cao

Trang 17

và thực hiện được một quá trình lên men có ý nghĩa kinh tế Mục đích cuối cùng của quá trình

phân lập và tuyển chọn là tìm được chủng giống tốt mang đi sản xuất trên quy mô công nghiệp

gọi là giống VSV công nghiệp. VSV công nghiệp phải đạt được các yêu cầu sau:

+ Có khả năng tạo thành sản phẩm với năng suất cao trong quá trình lên men.

+ Khả năng sử dụng nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền tức là trên những cơ chất này VSV vẫn

phát triển nhanh, sản sinh một lượng lớn sinh khối một cách ổn định.

+ Cùng với thời gian chủng sản xuất phải bảo toàn được các đặc tính sinh hóa ban đầu.

+ Không độc với người, động vật, thực vật, môi trường (nếu có thì phải rất thấp và mất

nhanh ở môi trường ngoài)

+ Chủng phải thuần khiết

+ Dễ tách khỏi môi trường khi xử lý, thu sản phẩm

+ Có khả năng tạo biến chủng với hoạt lực cao hơn

1.2. Bảo quản giống

1.2.1. Phương pháp cấy truyền định kỳ (giữ giống VSV trên môi trường thạch)

- Nguyên lý: Nuôi VSV trên môi trường thạch dinh dưỡng sau đó một thời gian lại cấy

truyền sang môi trường mới để đảm bảo luôn cung cấp dinh dưỡng cho VSV.

- Phương pháp này phải định kỳ cấy truyền trên môi trường mới, mất nhiều công sức,

thời gian và rất dễ dẫn đến thoái hóa giống hoặc mất hẳn tính chất ban đầu. Chất lượng môi

trường thạch dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng phát triển của VSV.

- Trong quá trình cấy truyền trên các môi trường giàu dinh dưỡng rất dễ bị nhiễm tạp vào

chủng giống làm giống bị giảm hoặc mất hẳn hoạt lực, khả năng sinh trưởng kém hoặc có thể bị

tiêu diệt hoàn toàn gây ra tình trang mất giống.

1.2.2. Giữ giống trên môi trường thách dưới lớp dầu khoáng

Giống được nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc lỏng ở điều kiện tối ưu để thu được VSV

đang ở giai đoạn phát triển logarit hoặc thu được nhiều bào tử đã đạt tới thời kỳ chín (đối với

loại có bào tử). Những ống nghiệm đó được phủ một lớp dầu parafin dày khoảng 10mm. Lớp

dầu này làm cho nước không bị bay hơi nên nồng độ các chất hòa tan không thay đổi dẫn đến áp

lực thẩm thấu cũng không thay đổi, không gây ảnh hưởng đến đời sống của VSV. Mặt khác lớp

dầu chỉ cho phép oxy xủa không khí thấm rất chậm vào môi trường nên VSV trong môi trường

Trang 18

phát triển rất chậm nên khi cấy truyền chủng giống không kéo theo sự phá hủy chủng nguyên

thủy. Sau khi xử lý như trên chủng được giữ ở 5oC có thể bảo quản được nhiều năm.

1.2.3. Giữ giống trên môi trường đất, cát

Đây là phương pháp bảo quản bào tử trong cát khô. Cát sông, rử sạch, sấy khô, sàng qua

rây lỗ nhỏ ssể loại bỏ đất và rác bẩn. Có thể dùng HCl đặc để loại bảo các chất hữu cơ. Đổ axit

ngập cát, đun nóng ở 100oC rồi rửa bằng nước. Nếu chưa sạch axit thì phải trung hòa bằng kiềm

hoặc Na2CO3. Sau khi trung hòa rửa lại bằng nước. Sấy khô ở 120oC trong 3 – 4 giờ. Chia cát

vào các ống nghiệm thủy tình đã sấy tiệt trùng ở 160 – 180oC trong 2 – 3 giờ. Dùng que cấy cào

bào tử vào cát, lắc đều. Chỉ bảo quản các ống cáct chứa bào tử khô, không bị ướt, không bị vón

cục. Tiếp tục sấy khô trong các bình CaCl2 hoặc silicagen khoảng 1 tuần hoặc sấy ở 37oC trong 2

ngày. Đậy các ống giống này bằng nút bông tráng parafin và giữ ở nhiệt độ phòng hoặc 4 – 6 oC.

Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống cấy vào các ống thạch nghiêng sau đó

chọn lại và cấy truyền tiếp.

1.2.4. Phương pháp lạnh đông

Tiến hành làm lạnh các môi trường có giống phát triển và giữ ở nhiệt độ lạnh sâu (-15

đến -20oC), (-20 đến -30oC), (-30 ddeens -40oC) ... Trong qúa trình làm lạnh sâu tế bào VSV có

thể bị chết. Để khắc phục trạng thái này người ta phải tiến hànhnhũ hóa môi trường và chú ý tốc

độ làm lạnh. Trong quá trình lạnh đông cần chú ý các điểm sau:

- Trước khi làm lạnh cần nhũ hóa VSV

- Cho 1 – 2 % nhũ dịch VSV vào mỗi ống nghiệm để đảm bảo làmlạnh đều

- Khi làm lạnh tới -20oC hoặc thấp hơn phải giữ tốc độ làm lạnh không lớn hơn 1 –

2oC/phút.

- Giữ các chủng lạnh đông phải quy định thời gian cấy truyền. Ở -15 đến -20 oC: 6 tháng,

ở -30oC: 6 – 9 tháng, ở -40oC: 1 năm, ở -50 đến -60oC: 3 năm.

- Khi làm tan băng để phục hồi giống cần phải rất nhanh bằng cách đặt ống giống trong

nồi cách thủy 37oC. Không nên làm đông lạnh hoặc làm tan băng quá nhiều lần vì nó làm giảm

khả năng sống của chủng đã bảo quản. Để tăng khả năng sông sót của chunge bảo quản, trong

quá trình thao tác người ta thêm những keo bảo vệ và các hỗn dịch như sữa, huyết thanh, lòng

trắng trứng, pepton, muxin hay các loại đường.

Trang 19

1.2.5. Phương pháp đông khô

Bảo quản đông khô: làm mất hơi nước của môi trường nuôi cấy. Thường VSV được nuôi

trên môi trường lỏng, sau đó đưa vào thiết bị đông khô làm mất dần hơi nước của môi trường.

Quá trình diễn ra cho đến khi toàn bộ môi trường chứa VSV tạo thành rạng bột khô thì mang đi

bảo quản trong tủ lạnh từ -20 đến -80oC. Đây là phương pháp tốt nhất bảo quản được rất lâu mà

không làm chết VSV.

1.2.6. Bảo quản siêu lạnh

Giữ giống trong hydro lỏng, nitơ lỏng (hay sử dụng bảo quản tế bào động, thực vật)

1.3. Nhân giống

Mục đích của quá trình này là đủ giống cho sản xuất (cả về lượng và chất), giống phải có

hoạt tính, khỏ mạnh, thuần khiết và có đúng thời điểm ta cần.

Các bước nhân giống thường qua 3 giai đoạn:

- Giống bảo quản được mang nhân trong ống nghiệm. Đây là giai đoạn phục hồi lại

giống, yêu cầu môi trường thuần khiết để giống có thể hoạt động trao đổi chất tốt nhất.

- Nhân giống cấp 2: đây là giai đoạn trung gian, giống làm quen dần với môi trường sản

xuất và đạt được mức độ nhân nhanh.

- Nhân giống sản xuất: giống quen với môi trường sản xuất, số lượng và chất lượng giống

đảm bảo để khi đưa vào sản xuất rút ngắn tối đa làm quen mà đi ngay vào pha phát triển để rút

ngắn thời gian lên men đảm bảo chất lượng sản phẩm cũng như hiệu quả kinh tế.

Thường sử dụng tỉ lệ cấp giống 5 – 10%.

2. Chuẩn bị môi trường và thiết bị lên men

2.1. Môi trường

2.1.1. Chuẩn bị môi trường

- Phải phù hợp với sự phát triển và yêu cầu sinh lý của chủng VSV. Môi trường phải có

đầy đủ các nguồn thức ăn: C, N, K, S, P, các nguyên tố vi lượng, các chất kích thích sinh

trưởng ...

- Phải đảm bảo các chỉ tiêu về kinh tế

- Đảm bảo cho sự phát triển ổn định của chủng (vô khuẩn)

Trang 20

- Tùy thuộc môi trường lên men rắn hay lỏng, thành phần môi trường lên men mà tiến

hành pha chế môi trường sao cho phù hợp với từng loại VSV.

2.1.2. Thanh trùng môi trường

Có một số phương pháp thanh trùng môi trường như: dùng hóa chất diệt khuẩn, sử dụng

tia năng lượng (cực tím) khả năng đâm xuyên kém nên khi gặp môi trường huyền phù khả năng

bị hạn chế, sử dụng nhiệt độ cao và phương pháp lọc. Thông thường người ta hay sử dụng 2

phương pháp cuối.

- Phương pháp nhiệt độ cao:

+ Phương pháp gián đoạn: 110 – 121oC (chủ yếu ở 121oC) trong 15 phút, Pa = 1 at, gia

nhiệt từng giai đoạn. Thường sử dụng cho thể tích nhỏ.

+ Phương pháp liên tục: 137 – 145oC, Pa = 5 – 6 at trong 3 – 5 phút, có ưu điểm tiết kiệm

thời gian, bảo đảm được tính chất của sản phẩm do giảm thời gian tiếp xúc với nhiệt độ cao, có

thể tự động hóa và độ thuần nhất của môi trường cao. Sử dụng cho thể tích lớn.

Khi thanh trùng ở nhiệt độ cao chất lượng môi trường bị biến đổi như: làm biến tính

protein và ức chế enzym, phá hủy một số VTM và một số tác nhân khác, trong quá trình gia

nhiệt kéo theo sự trùng hợp của một số thành phần làm môi trường có màu nâu (do caramen hóa

các loại đường, oxi hóa các fenol và VTM C, trùng hợp các aldehyt chưa no, phản ứng giữa

nhóm aldehyt của đường và nhóm amin của aa trong các peptit và protein nên người ta có xu

hướng thanh trùng riêng rẽ sau đó phối trộn lại sau.

2.2. Thiết bị lên men

Thiết bị lên men gồm thùng lên men (hoặc phòng nuôi) và các thiết bị phụ trợ. Trước khi

lên men tất cả đều phải được khử khuẩn với tiêu chuẩn phụ thuộc vào yêu cầu sản xuất và yêu

cầu công nghệ.

* Phòng nuôi: Sử dụng hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn mạnh như CaCl2, ... đặc biệt các

phương pháp có khả năng bay hơi như phương pháp xông hơi (ethylen dioxit), đối với những

phòng nuôi hẹp có thể xử lý bằng tia tử ngoại (trong điều kiện công nghiệp không thể sử dung

phương pháp này).

* Các thiết bị lên men:

Trang 21

- Các quá trình lên men đòi hỏi rất nghiêm ngặt độ vô khuẩn, số VK < 10 -3 đến 10-4

TB/ml. Thường sử dụng hơi quá nhiệt 3 – 4 at, 2- 3 giờ.

- Các quá trình lên men không đòi hỏi quá nghiêm ngặt người ta có thể sử dụng 2 phương

pháp:

+ Các chất có khả năng oxi hóa + các chất sát khuẩn (CIP-Thanh trùng tại chỗ) tiến hành

như sau: Rửa nước, khô, rửa bằng axit hoặc bazơ 2,5 – 4%, 70oC, 25 – 30 phút, khô 5 phút, rử

lại bằng axit 2 – 4%, khô tự nhiên, tráng lại bằng nước để chảy tự nhiên, rử bằng chất sát khuẩn,

để khô, sử dụng

+ Phương pháp xông hơi: đốt lưu huỳnh tạo ra hơi SO2

* Thiết bị phụ trợ: Khi thanh trùng các thiết bị phụ trợ cũng phải đạt chất lượng tương

ứng với thiết bị lên men. Vô khuẩn các thiết bị này khó hơn thùng lên men vì vậy người ta

thường sử dung kết hợp phương pháp xông hơi và hơi quá nhiệt.

2.3. Khử khuẩn không khí

Do hàm lượng oxi trong không khí và nước rất thấp mà hàm lượng oxi cần cung cấp cho

VSV rất nhiều nên cần sục một lượng không khí rất lớn cho quá trình lên men. Vì vậy phải tiến

hành khử khuẩn không khí để sử dụng. Người ta thường dùng phương pháp nén cao áp bằng nén

2 cấp đoạn nhiệt với áp suất 8 – 9 at/210 – 230oC/2-3 giây. Với phương pháp này hầu như tất cả

VSV bị tiêu diệt nhưng sau đó chứa vào thùng chứa nên khi sử dụng phải kết hợp lọc bằng các

vật liệu lọc tạo ra những khe hẹp (mao quản) chịu rất nhiều tác đọng khác nhau nếu giữ được

VSV gọi là cơ chế chắn cản. Trong công nghiệp thường dùng bông thủy tinh (đường kính sợi 5

– 10 µm) hoặc sứ xốp (đường kính sợi > 10 µm). Nếu quãng đường đi đủ lớn (700 – 1000 mm)

và vận tốc nhỏ (<200 m/s) có khả năng chắn cản hầu hết VSV. Ngoài ra người ta còn có thể sử

dụng đồng xốp hoặc vật liệu siêu lọc (giá thành đắt) nên chỉ sử dụng được cho thiết bị lên men

nhỏ. Điều cần chú ý là các vật liệu lọc phụ thuộc rất nhiều vào môi trường nên không được phép

để phên lọc bị ẩm, nếu ẩm sẽ bị bết khối lọc dẫn đến phá hỏng phên lọc tạo ra những dòng chảy.

Vì vậy nếu xảy ra hiện tượng giảm áp đột ngột phải thay toàn bộ thiết bị lọc.

3. Quá trình lên men

Là giai đoạn nuôi VSV tạo sinh khối, đây là giai đoạn quyết định hiệu quả của cả quá

trình sản xuất.

Trang 22

3.1. Lên men bề mặt

- Phương pháp lên men bề mặt: là phương pháp nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường

lỏng hoặc rắn

+ Thiết bị lên men là những khay dày 2-5 cm (tăng diện tích bề mặt)

+ Vi sinh vật hiếu khí (môi trường lỏng), VSV hiếu khí hoặc kỵ khí (MT rắn)

+ Môi trường lỏng là những nguồn dinh dưỡng khác nhau phù hợp với từng loài VSV

(dịch đường hóa, nước bã rượu, dịch kiềm sunfit, bổ sung các muối khoáng...). Môi trường rắn

thường là các loại hạt như gạo, đậu tương, mảnh sắn, ngô, bã mía, bã rượu, trấu, rơm... Đối với

môi trường rắn yêu cầu độ ẩm 55-70%, chiều dày môi trường 2-3cm, có hệ thống quạt thổi khí

vô trùng. Buồng lên men cần điều hòa không khí, làm ẩm và loại CO2.

+ Ưu điểm: Đơn giản, dễ loại bỏ phần nhiễm cục bộ, ít tốn kém đầu tư thiết bị

+ Nhược điểm: Tốn diện tích nhà xưởng, tốn nhân công, khó cơ giới hóa, tự động hóa,

hiệu suất thấp.

3.2. Lên men chìm

- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trên môi trường dịch thể, chúng phát triển

theo chiều sâu môi trường.

+ Sử dụng cho VSV hiếu khí và kỵ khí

+ Trong quá trình lên men phải khuấy đảo và sục khí (đối với VSV hiếu khí) nhằm tăng

cường diện tích tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng, ngăn cản sự kết lắng của tế bào.

+ Trong quá trình lên men phải theo dõi sự tạo bọt khi tiến hành khuấy và sục khí mạnh

sẽ tạo nhiều bọt có khuynh hướng trào ra ngoài gây hỏng thiết bị và nhiễm VSV ko mong muốn

cho quá trình lên men. Bọt còn cản trở sự tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng.

Thường sử dụng các loại dầu thực vật để phá bọt. Trong quá trình lên men luôn phải theo dõi và

điều chỉnh pH, nhiệt độ của thùng lên men.

+ Ưu điểm: Hiệu suất cao, ít tốn diện tích, dễ cơ giới hóa, ít tốn nhân công.

+ Nhược điểm: Đòi hỏi đầu tư thiết bị chất lượng cao, dễ bị nhiễm hàng loạt, đòi hỏi đảm

bảo vo trùng nghiêm ngặt, cần sục khí liên tục nên tốn năng lượng, tốn nhiều hơi vô trùng thiết

bị, cần nguồn nhân lực có trình độ cao.

Trang 23

4. Quá trình lên men chìm

4.1. Lên men gián đoạn

- Ưu điểm: Thông dụng, dễ vận hành và duy trì, giá thành lắp đặt thấp, sử dụng một môi

trường, khả năng nhiễm thấp.

- Nhược điểm: Thời gian làm quen lớn, hiệu suất thấp, giá thành cao, sản phẩm phụ ức chế

sản phẩm tạo thành, khó đáp ứng cấp oxy 1 cách tuyệt đối

2.2. Lên men liên tục

- Ưu điểm: Hiệu suất cao do bỏ qua được giai đoạn làm quen, giảm nhiều công vận hành,

môi trường duy trì ở tốc độ phát triển ổn định, phát triển cân bằng: thành phần môi trường

không đổi, hiệu suất ổn định.

- Nhược điểm: Khả năng bị nhiểm cao, đòi hỏi các thiết bị xác định nồng độ oxy, pH nhậy,

điều khiển quá trình khó.

2.3. Lên men bán liên tục (lên men 2 pha)

- Pha 1: Sinh trưởng và phát triển

+ Giai đoạn 1: Tiềm ẩn

+ Giai đoạn 2: Thích ứng

+ Giai đoạn 3: Phát triển lũy tiến

Pha 2: Tích tụ sản phẩm trao đổi chất

+ Giai đoạn 4: Phát triển chậm dần

+ Giai đoạn 5: Cân bằng

+ Giai đoạn 6: Suy thoái (ở giai đoạn này VSV tự phân (chết) ảnh hưởng đến kết quả quá

trình thu sản phẩm

Để quá trình lên men xảy ra nhanh cần làm tăng vận tốc giai đoạn 1 và 2 bằng cách đảm

bảo khả năng sẵn sàng sinh trưởng, sinh sản, phát triển và đảm bảo điều kiện môi trường dinh

dưỡng pH, nhiệt độ, nồng độ chất tan. VSV đưa vào lên men phải ở giai đoạn lũy tiến của pha

nhân giống. Đồng thời kéo dài gian đoạn 3 bằng cách bổ sung thường xuyên chất dinh dưỡng

(lên men liên tục).

5. Khuấy trộn, sục khí

Trang 24

Trong quá trình lên men hiếu khí nhất thiết phải có khuấy trộn và sục khí giúp trao đổi

nhiệt, cấp oxi và tạo sự tiếp xúc tốt giữa VSV và nguồn thức ăn. Khi khuấy tạo đối lưu cưỡng

bức giúp quá trình trao đổi nhiệt tốt hơn

Khi dùng cách khuấy nghiêng ngoài dòng tiếp tuyến còn có dòng hướng trục cắt nhau tạo

chảy rối nên tăng cường tiếp xúc pha và trao đổi nhiệt. Thời gian trao đổi nhiệt ngắn dẫn đến

năng suất và hiệu suất sử dụng thiết bị tăng, tăng cường tiếp xúc pha tức là các enzym , β, γ –

amilase hòa tan trong nước tiếp xúc với cơ chất mạnh, đồng thời VSV cũng tiếp xúc rất tốt với

nguồn thức ăn.

Đối với sinh khối người ta lại dùng khuấy tuốc bin, dòng chính là dòng hướng tâm, dòng

phụ là dòng hướng trục, lưu lượng của 2 dòng bằng nhau. Do sinh khối luôn cần một lượng oxi

mà khuấy cánh khả năng khuếch tán oxi kém trong khi khuấy tuốc bin khi chất lỏng văng ra áp

suất bên trong thấp, khí đi vào rất dễ hòa tan với nhau. Chiều cao của thiết bị sinh khối rất cao

nên dễ bị hỏng trục. Khuấy tuốc bin rất mạnh và dễ dàng làm nhiều tầng khuấy. Ngoài ra, chất

khí có xu hướng đi từ dưới lên nếu khuấy cánh khí sẽ đi thẳng lên trên nhưng nếu dùng khuấy

tuốc bin nhiều tầng thì tầng này sẽ hút khí của tầng dưới nó. Tuy nhiên khuấy tuốc bin có nhược

điểm là nếu khuấy quá mạnh dịch lên men sẽ trào ra ngoài hết nên phải tính toán tốc độ khuấy

sao cho phù hợp với từng thiết bị lên men khác nhau.

Trong quá trình lên men tạo sinh khối luôn cần sục khí do khi VSV phát triển thì thức ăn

xung quanh nó giảm mà dinh dưỡng phải khuếch tán vào tự nhiên rất chậm nên phải tạo chảy rối

để tế bào VSv di chuyển để tiếp xúc pha. Bọt khí chỉ chảy từ dưới lên trên tạo chảy rối, tạo

đường đi rích rắc nên tiếp xúc tốt hơn, các chất dinh dưỡng hòa tan nhanh hơn.

5. Kiểm tra và giám sát quá trình lên men

Trong quá trình lên men cần kiểm tra, giám sát các chỉ tiêu sau:

- Cường độ khuấy

- Cấp khí:nồng độ oxi, nhiệt lượng Q của quá trình cấp khí

- Giám sát quá trình tạo bọt: Nếu lượng bọt tăng thể tích hiệu dụng của thiết bị giảm gây

tràn làm tổn hao và bịt kín hệ thống làm tắc đường ống và tạo cầu nối từ bên ngoài vào bên

trong nên rất dễ bị nhiễm. Giải pháp khống chế là dùng dầu phá bọt (thường sử dụng các loại

dầu thực vật), có thể giảm cường độ khuấy hoặc chọn chủng không phụ thuộc nghiêm ngặt vào

Trang 25

nồng độ oxi. Chất phá bọt là chất không tham gia quá trình lên men, không đưavào lượng dư vì

sẽ ức chế chủng và làm thay đổi quá trình lên men. Đồng thời nếu đưa dư lượng dầu phá bọt thì

quá trình tinh chế sẽ vô cùng phức tạp.

- Thể tích lên men (phụ thuộc vào nồng độ thông khí)

- Thành phần dịch vào gồm tất cả các cấu tử, kiểm tra nồng độ vf sự biến thiên nồng độ

oxi, CO2, pH, thế oxi hóa khử.

- Kiểm tra đầu ra: sản phẩm, thành phần của khí thải ...

6. Chiết tách, tinh chế các sản phẩm lên men

Hòa tan protein trong dung dịch:

Khả năng hòa tan protein trong dung dịch có thể được hỗ trợ bằng cách thay đổi các yếu

tố hóa học hoặc sử dụng enzym. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng hòa tan của enzym bao

gồm: lực ion, pH, nhiệt độ và nồng độ ion Ca2+. Tại pI, protein trung hòa về điện tích nên độ hòa

tan của chúng nhỏ nhất. Để hòa tan thông thường giá trị pH được chọn là kiềm nhẹ do tại đó độ

hòa tan của protein lớn nhất và môi trường gần trung tính nên nguy cơ biến tính protein nhỏ

nhất. Lực ion thông thường được thay đổi tại pH trung tính hoặc xung quanh pI nhờ việc sử

dụng các muối tan. Tại các lực ion quá cao hoặc quá thấp độ tan của protein giảm. Việc hòa tan

protein nên thực hiện ở nhiệt độ thấp để giảm nguy cơ biến tính protein và nguy cơ mẫu bị phá

hủy bởi VSV. Tuy nhiên nếu protein cần tách có khả năng chịu nhiệt tốt thì nên chiết chúng ở

nhiệt độ cao để hạn chế các chất không mong muốn hòa tan trong dung dịch và nâng cao hiệu

quả thu nhận protein. Việc lựa chọn các yếu tố này luôn gắn liền với phương pháp thu nhận

protein tương ứng. Việc sử dụng các enzym trong quá trình hòa tan protein khá hạn chế do

enzym phá vỡ các liên kết ngoại phân tử của protein tạo ra sự hòa tan khá dễ của protein và

thường kèm theo việc hòa tan trong dung dịch nhiều hợp chất khác gây khó khăn cho quá trình

chiết tách sau này.

6.1. Tách protein:

- Kết tủa protein trong pha lỏng và tách kết tủa khỏi pha lỏng

+ Kết tủa nhờ muối: là phương pháp thông thường nhất trong các phương pháp kết tủa.

Thông thường nồng độ muối thấp làm tăng mức độ hòa tan protein do protein được bao bọc bởi

lớp vỏ ion trái dấu với muối, năng lượng tĩnh điện tự do của protein giảm, hoạt tính dung môi

Trang 26

tăng. Ngược lại khi tăng nồng độ muối làm giảm lực hydrat hóa các ion làm giảm độ hòa tan của

protein dẫn tới kết tủa protein. Ở cùng một nồng độ muối các protein khác nhau có độ hòa tan

khác nhau vì vậy với mỗi một protein phải sử dụng nồng độ muối khác nhau để kết tủa (phương

pháp kết tủa phân đoạn).

+ Kết tủa nhờ dung môi: Dung môi hữu cơ trung tính khi trộn lẫn với dung dịch enzym

làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, vì vậy làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử

protein làm các phân tử protein kết hợp lại tạo thành kết tủa. Cần chú ý dung môi là tác nhân

gây biến tính protein do chúng có ái lực với bề mặt kỵ nước của protein vì vậy cần giữ nồng độ

dung môi thấp. Các dung môi thường sử dụng là ethanol, aceton.

+ Kết tủa đẳng điện: Protein bị biến tính bởi các tác nhân như acid, nhiệt độ, ethanol... có

thể kết tủa hoàn toàn tại giá trị pI của chúng. Việc lựa chọn tác nhân biến tính protein cần tính

đến khả năng biến tính thuận nghịch hay không của protein cần thu nhận. Đặc biệt trong trường

hợp protein cần thu nhận là protein có hoạt tính sinh học, không áp dụng được các tác nhân biến

tính không thuận nghịch như nhiệt độ do sự biến tính làm mất hoạt tính của chúng.

+ Kết tủa bằng enzym: Các enzym có thể sử dụng kết tủa protein có khả năng tạo cầu

ngoại phân tử giữa chúng làm kết tụ các khối protein. (Ví dụ như enzym đông tụ sữa)

6.2. Tinh sạch protein

Dựa vào các tính chất của protein như tính phân ly đẳng điện, tính chất bề mặt (protein có

thể hấp thụ, hấp phụ trên các chất mang khác nhau nhờ đó protein có thể được phân tách nhờ sắc

ký ái lực), kích thước phân tử . Thông thường sử dụng các kỹ thuật sau:

6.3.1. Kỹ thuật lọc:

Protein là cao phân tử, do vậy các phương pháp phân tách protein sử dụng màng lọc phân

tử khá hữu hiệu. Tuy nhiên các phương pháp này chỉ sử dụng được đối với các nguồn protein

động vật trong dung dịch sinh lý như sữa, máu, huyết thanh mà không áp dụng được với các

protein thực vật do chúng thường nằm trong phức hợp polyme khác. Kỹ thuật này được thực

hiện nhờ một màng bán thấm hoặc màng lọc phân tử. Dung dịch protein được phân làm 2 pha,

một pha không đi qua màng lọc chứa các cao phân tử trong đó có protein, pha còn lại đi qua

màng lọc chứa các phân tử có kích thước nhỏ hơn như glucid đơn giản, peptid, muối...

Trang 27

6.3.2. Kỹ thuật sắc ký

Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích

hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định

lượng và định danh. Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là

sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổi

ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của

phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích

thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid

chromagraphy).

- Sắc ký lọc gel: Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước

phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan

nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay

polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có

sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả

bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì

vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có

kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa;

còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng.

- Sắc ký trao đổi ion: Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có

mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm

pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký

trao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định,

những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể,

nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là

sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại,

nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là

sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng

dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích

những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein

Trang 28

tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri

clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các

protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra

ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.

- Sắc ký ái lực: Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong

việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa

học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho

qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi

vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A có

thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong

dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột.

Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những

protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự ADN. Hỗn hợp

protein thấm qua cột có chứa những trình tự ADN đặc hiệu được gắn vào thể mang; những

protein có ái lực cao với trình tự ADN sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này,

yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoài

ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng

nguyên hay kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có

khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của

nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại

bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X

với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháp

tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có

độ chuyên biệt cao.

- Sắc ký lỏng cao áp: Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc

ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có

sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được

tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên

cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh.

Trang 29

6.3. Đánh giá quá trình tinh sạch protein

Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt

tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các

protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di.

Một phân tử có mang điện tích sẽ di chuyển trong điện trường. Hiện tượng này, được đặt

tên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để phân tách protein và các đại phân tử khác

như ADN và ARN. Vận tốc di chuyển (v) của một protein (hay bất kỳ phân tử nào) trong điện

trường phụ thuộc vào lực điện trường (E), điện tích thực của protein (z) và hệ số ma sát (f)

Lực điện Ez kéo phân tử mang điện tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi lực kéo của độ

nhớt fv tăng lên do sự ma sát giữa phân tử đang chuyển động với môi trường. Lực ma sát phụ

thuộc vào cả khối lượng, hình dạng của phân tử đang di chuyển lẫn độ nhớt (η) của môi trường.

Với một khối cầu có bán kính là r, ta có

Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gel giống như

một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể

di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di

chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khác

nhau. điện di được thực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Hướng của dòng

điện từ trên xuống

CHƯƠNG V: CNSX MỘT SỐ PROTEIN ĐƠN BÀO

1. CNSX protein nấm men từ rỉ đường

1.1. Giống nấm men

Nấm men bánh mì là một trong những sản phẩm lâu đời nhất của ngành công nghệ lên

men. Cho đến nay nấm men bánh mì vẫn là sản phẩm quan trọng của ngành công nghệ sinh học

cả về số lượng và chất lượng. Nấm men bánh mì thuộc họ Endomycetaceae, giống

Sacharomyces, loài cereviciae.

Sacharomyces cerevisiae là loài nấm men có hình cầu hay hình trứng, kích thước nhỏ từ

5 – 14 µm. Thành phần tế bào nấm men thường chứa 70 – 75% nước, còn lại là chất khô. Đây là

loài chủ yếu sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, trong quá trình sinh sản chồi mới phát triển từ

Trang 30

man mẹ khi có các điều kiện thích hợp, khi chồi đạt kích thước của men trưởng thành thì nó tách

ra khỏi nem mẹ để tạo thành một tế bào mới hoàn chỉnh.

Ngoài nấm men Sacharomyces cerevisiae thì hiện nay trên thế giới còn sử dụng phổ biến

2 loài nấm men nữa để sản xuất protein từ rỉ đường là Turolopsis utilis và Candida tropicalis.

Đặc điểm của nấm men dùng trong sản xuất:

- Tế bào lớn, có dạng hình cầu hay hình trứng

- Hoạt lực maltase: biểu thị thời gian 1g nấm men ép phóng thích ra 10 ml CO2 khi lên

men 20 ml dung dịch đường maltose 5%: ≤ 70 phút.

- Hoạt lực làm dậy bột: biểu thị thời gian 5g nấm mrn ép làm nở khối bột 280g đến chiều

cao 1,5 cm theo khuôn có kích thước xác định: ≤ 45 phút.

- Bền vững với rỉ đường: chủng nấm men được đánh giá là bền vững với rỉ đường nếu

chúng tồn tại 6 – 7 thế hệ mà không bị chết trong môi trường có nồng độ rỉ đường cao.

- Khả năng sinh sản nhanh, ít bị thay đổi trong quá trình bảo quản.

- Có khả năng lên men được đường sacharose, glucose, maltose.

Có hàm lượng zimase và maltase cao (hoạt lực maltase và hoạt lực làm dậy bột nhanh).

- Sản lượng cao, sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao,

có nhiều aa không thay thế, có nhiều VTM quý…)

- Chịu được nhiệt độ cao, ít làm biến đổi pH môi trường.

1.2. Nguyên liệu

1.2.1. Rỉ đường

Rỉ đường là phế thải của nhà máy đường, được dùng làm nguồn nguyên liệu sản xuất trên

90% số lượng nấm men. Rỉ đường là phần không thể kết tinh sau khi đường saccaroza đã được

kết tinh. Có 2 loại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Rỉ đường mía là chất lỏng màu đen

có độ nhớt cao, chiếm 3,5% lượng mía, được sử dụng nhiều (90% protein từ nấm men được sản

xuất bằng nguyên liệu rỉ đường) do:

- Giá thành rẻ

- Ngoài đường saccharoza, glucoza, fructoza rỉ đường còn chứa một số chất hữu cơ, vô

cơ và VTM có giá trị.

Trang 31

Thành phần của rỉ đường

Thành phần Rỉ đường mía Rỉ đường củ cải

Đường tổng (%) 48-56 48-52

Đường khử (%) 25-30 0,8-1

Các hợp chất hữu cơ không

phải đường (%)

9-12 12-17

Protein (%) 2-4 6-10

Kali (%) 1,5-5 2-7

Canxi (%) 0,4-0,8 0,1-0,5

Magie (%) 0,06 0,09

Phospho (%) 0,6-2 0,02-0,7

Biotin (mg/kg) 1-3 0,02-0,15

Axit pantothenic (mg/kg) 15-55 50-110

Inositol (mg/kg) 2.500-6.000 5.000-8.000

Thiamin (mg/kg) 1,8 1,3

Vi sinh vật trong rỉ đường:

- Nguy hiểm nhất là vi khuẩn lactic, axetic: độ nhiẽm được đánh giá bằng độ chua của

rỉ đường.

- Rỉ đường tự lên men sau 24 giờ có thể làm tăng độ axit lên 0,2-0,3 độ

- Trong 1g mật rỉ có chứa 100.000 VSV không có bào tử và 15.000 VSV có bào tử.

- Nếu mật rỉ loãng VSV có thể hoạt động, cần hạn chế nhiễm khuẩn để giảm tổn thất

Xử lý rỉ đường:

Mục đích: Loại bỏ tạp chất, tạp khuẩn, nâng cao độ thuần khiết (giảm 20% các tạp chất

phi đường, giảm 40-60% chất keo) và tạo pH thích hợp.

Pha loãng sơ bộ: Có thể pha loãng đến 55-60 độ Bx (tương ứng tỉ lệ khoảng 1:1 đến 1:4).

Hệ số pha loãng càng lớn càng dễ dàng loại cặn.

Có 3 phương pháp xử lý:

Trang 32

Phương pháp hóa học: dùng axit H2SO4 kết hợp với vôi tôi có khả năng làm đông tụ chất

keo, đồng thời H2 SO4 còn liên kết với muối có trong rỉ đường cạnh tranh với axit hữu cơ làm

giảm một số muối bằng cách điều chỉnh pH xuống 3,5-5 rồi để lắng từ 4-8 giờ. Pha loãng rỉ

đường (0,73m3 nước cho 1 tấn rỉ đường), thêm CaCl2 (0,9 kg vôi/1 tấn rỉ đường), khuấy trộn

trong 30 phút, để yên 30 phút. Thêm 6 lít H2SO4/1 tấn rỉ đường, tiếp tục khuấy 30 phút sau đó để

lắng từ 6 – 12 giờ. Dùng bơm hút dịch trong bên trên, thêm 1% vôi tôi (tính theo nồng độ rỉ

đường), khuấy đều, đun sôi 10 phút, để lắng 7 giờ, loại bỏ lớp màu đen ở đáy bồn, bơm phần

trên vào bồn chứa khác.

Phương pháp vật lý (gia nhiệt): phương pháp này tiết kiệm được axit nhưng tốn điện

năng. Sau khi pha loãng sơ bộ tiến hành thổi hơi nước để dịch sôi từ 0,5-1 giờ. Sau đó để lắng 4-

8 giờ rồi gạn lấy dịch đường trong. Chú ý thông thường sử dụng nhiệt độ 85-90oC trong 45 phút

vì nếu xử lý ở nhiệt độ cao 120-130oC thì dễ tạo melenoidin

Phương pháp cơ học: Dùng máy ly tâm loại chất bẩn, chất keo có ưu điểm hơn phương

pháp hóa học về phương diện kinh tế và thời gian, giảm thất thoát so với phương pháp hóa học

khoảng gần 2% (từ 2% xuống còn 0,14%). Trước khi ly tâm pha loãng rỉ đường với nước theo tỉ

lệ 1:1, 1:2, 1:4 tùy thuộc thành phần muối canxi trong rỉ đường. Nếu lượng muối canxi trong rỉ

đường < 0,5% thì pha loãng 1:1, nếu bằng 0,6% thì pha loãng 1:2, hơn 1% thì pha loãng 1:4.

Xử lý rỉ đường xấu: Đối với rỉ đường xấu tùy yếu tố ảnh hưởng mà đưa ra các phương pháp xử

lý như sau:

Yếu tố ảnh hưởng Phương pháp và thời gian xử lý

Rỉ đường chứa vi

khuẩn tạo acid nitric

Bổ sung chlotetracylin 1-5g/m3 dung dịch rỉ đường pha loãng để

làm trong, thời gian 1 giờ

Rỉ đường có SO2 Bổ sung clo 11g/110g SO2 trong 1 giờ

Acid bay hơi cao Dùng H3PO4 thay vì H2SO4 để làm trong rỉ đường

Độ màu cao Pha loãng ít nhất 20 lần

Canxi cao ≥ 1% Pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:3, hạ pH đến 4,5, để lắng 4 giờ,

ly tâm loại tủa.

Trang 33

1.2.2. Một số nguyên liệu khác

- Sunphat amon (NH4)2SO4: Là nguồn đạm cho tế bào nấm men, chứa ít nhất 21% nitơ, độ ẩm

không quá 1,5%. Vì sunphat amon thường được sản xuất từ acid sunfuric có thể còn lẫn FeS và

Fe2(SO4)3 độc đối với tế bào nấm men nên trước khi đưa vào sản xuất thì để trong không khí khô

4 giờ.

- Dung dịch amoniac: Dùng để chỉnh pH và cung cấp nguồn nitơ cho nấm men (chứa 25%

nitơ)

- Axid phosphoric: Cung cấp nguồn phospho, nồng độ không ít hơn 70%, có thể thay thế DAP

(chứa P2O5 hơn 50,5%)

- MgSO4: Loại kỹ thuật, dễ tan trong nước, lượng MgO < 16,3%

- H2SO4: Dùng để acid hóa môi trường

- Các hóa chất chống nhiễm: CaCl2, formalin, NaOH Để khử trùng thiết bị và đường ống

- Nước: Nước dùng để nuôi nấm men thường là nước mềm, sạch, trong, không màu, không mùi

hàm lượng các muối không cao hơn Cl- = 0,5, SO42- = 80, As = 0,05, Pb = 0,1, Zn = 5, Cu = 3,

FeO = 3.

- Dầu phá bọt: Có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt dung dịch. Có thể dùng acid oleic, dầu

lạc, dầu cám, dầu thầu dầu nồng độ 0,005 – 0,01%.

- Không khí: Lượng không khí dùng trong các nhà máy sản xuất nấm men rất lớn. Tuy nhiên

cần làm sạch không khí trước khi đưa vào sản xuất.

Trang 34

1.3. Qui trình công nghệ

1.3.1. Nhân giống nấm men

- Giai đoạn phòng thí nghiệm: tỉ lệ 1:10, từ 4 ống nghiệm giống hòa ra 100ml môi

trường, rồi tiếp tục từ 100ml lại được nuôi trong 1 lít môi trường nước chiết malt 12%

đã khử trùng 20 phút, 0,5 at. Thời gian 18-24 giờ mỗi cấp, nhiệt độ 28-30oC.

Trang 35

Rỉ đường

Xử lý Thải bỏ

Nhân giống

Thanh trùng

Môi trường dinh dưỡng

Nuôi thu sinh khối

Ly tâm

Sữa men đặc

Sấy khô

Thành phẩm

Men giốngCác muối

vô cơ

Oxi

Thùng tạm chứa

Axit hóa = H2SO4, 60oC, pH = 4,5-4,8

Pha loãng

- Giai đoạn nhân giống nhỏ trong phân xưởng: tỉ lệ 1:6 (5L đến 30L rồi đến 180L), thời

gian 14-18 giờ mỗi cấp, nhiệt độ 28-30oC, môi trường là 50% rỉ đường 12%, 50%

mước chiết malt 12%

- Giai đoạn nhân giống sản xuất: Môi trường là rỉ đường nồng độ 12% có bổ sung muối

khoáng, thể tích các thùng lên men có thể lên tới 3-4 m3, tỉ lệ tiếp giống là 1:10, trong

quá trình nhân giống cần thổi khí liên tục, nếu qui mô sản xuất lớn có thể chuyển tiếp

sang thùng nhân giống 12-15m3, thời gian mỗi cấp là 12-14 giờ.

Đánh giá tiêu chuẩn: trong giai đoạn nhân giống nấm men từ phòng thí nghiệm đến 180L

cần đạt:

- Không nhiễm nấm men dại, vi khuẩn

- Tế bào đồng nhất: không nhỏ, không lớn

- Lực nở bột: 45 - 50 phút

- Hoạt lực zymase: nhỏ hơn 45 phút

- Hoạt lực maltase: nhỏ hơn 60 phút

Xác định lực nở bột: xác định lực -glucosidase (maltase) và zymase. Hoạt lực zymase

biểu thị tốc độ lên men đường glucose và saccarose còn hoạt lực maltase biểu thị tốc độ

lên men đường maltose của nấm men.

Tiêu chuẩn giai đoạn nhân giống sản xuất: nấm men cần đạt yêu cầu hình tròn, ovan đều,

hàm lượng nitơ 2,2-2,4%, phospho 0,9-1,1%, lực nở bột: 45-50 phút, hoạt lực maltase ít hơn 60

phút, hệ số sinh sản 0,11-0,14.

1.3.2. Môi trường dinh dưỡng:

- Nồng độ rỉ đường: 10-12%

- (NH4)2SO4: 0,1-0,3%

- Ure: 0,1-0,15%

- (NH4)2HPO4: 0,1%

- MgSO4: 0,05%

- pH: 4,2-5,5

Thanh trùng: Môi trường sau khi được xử lý được bổ sung các muối vô cơ để tạo môi trường

lên men rồi thanh trùng ở 121oC/1atm/phút.

Trang 36

1.3.3. Nuôi thu sinh khối

Thể tích môi trường lên men khoảng 100m3, thời gian lên men từ 12-20 giờ tạo ra được

20-30 tấn nấm men tươi, nhiệt độ 28-30oC, hệ số sinh sản: 0,15-0,16, mật độ tế bào 60-100g/l,

hiệu suất 75-95%, có thể lên men liên tục hoặc gián đoạn.

1.3.4. Quá trình men lắng

Quá trình men lắng: quá trình này rất quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng thương phẩm,

trong quá trình lắng không còn chất dinh dưỡng trong môi trường, hệ enzym trong nấm men

chuyển từ quá trình sinh tổng hợp sang quá trình trao đổi chất nhằm duy trì các chức năng bình

thường của tế bào. Trong quá trình này còn tế bào non đang nảy chồi, tỉ lệ giữa số tế bào non và

tế bào trưởng thành tùy thuộc vào qui trình kỹ thuật và môi trường dinh dưỡng lúc đầu. Số tế

bào trưởng thành càng cao thì nấm men thành phẩm càng giữ được chất lượng tốt. Điều kiện

lắng tốt nhất là 27oC, giảm lượng không khí 40 – 60% so với giai đoạn nuôi chính, thời gian

lắng 1,5 – 2 giờ.

1.3.5. Thu sản phẩm

- Ly tâm sau men lắng: Bơm dịch lên men vào máy ly tâm, thời gian ly tâm càng nhanh càng tốt

(không quá 2 giờ), rửa nấm men bằng nước lạnh 2oC thu được sinh khối nấm men.

- Lọc ép, quạt khô: Sau khi ly tâm, thu nấm men và đưa vào thiết bị lọc chân không hoặc lọc ép.

Nấm men được giữ lại trên tấm vải lọc có độ ẩm 75%. Nếu lọc ép hiệu quả thì không cần quá

trình quạt khô, nếu lọc ép không hiệu quá thì có thể sử dụng quạt gió để xử lý tiếp 0,5 – 1 giờ.

- Tạo hình, đóng gói men ép: Ở các nước giai đoạn này được thực hiện bằng máy và có bổ sung

dầu thực vật 0,1% và lơxitin để đảm bảo độ chắc và màu cho sản phẩm ép bằng máy. Men ép

được bảo quản ở 2-4oC. Khâu tạo hình, đóng gói men thực hiện càng nhanh càng tốt vì trong

điều kiện nhiệt độ thường tế bào nấm men đang ở trạng thái nghỉ có thể tiếp tục hoạt động ảnh

hưởng đến chất lượng nấm men hoặc sinh khối nấm men bị nhiễm khuẩn tạo những chất độc và

làm giảm hàm lượng dinh dưỡng của nấm men. Ở nước ta giai đoạn này vẫn chủ yếu được thực

hiện thủ công nên ít nhiều cũng ảnh hưởng đến chất lượng nấm men.

Quá trình sấy khô được chia làm 3 giai đoạn

Gđ1: Tách nước ở bên ngoài tế bào, quá trình diễn ra nhanh cho đến khi độ ẩm còn 52-

53%. Lực nở của nấm men không đổi, không có tế bào chết nếu nhiệt độ sấy thấp hơn 38oC.

Trang 37

Gđ2: Tách nước ở bên trong tế bào, cần nhiều thời gian hơn so với giai đoạn trên. Tốc độ

sấy trong giai đoạn này giảm, độ ẩm cuối giai đoạn đạt 16-20%

Gđ3: Tách nước liên kết, khó tách nên cần nhiều thời gian, độ ẩm đạt 7-8%

Có 2 phương pháp sấy:

Sấy liên tục: thời gian 2-4 giờ, nhiệt độ không khí 42, 37, 32, 28oC, tốc độ sấy phụ thuộc

nhiệt độ. Thường nhiệt độ đầu vào là 50oC, nhiệt độ đầu ra là 35oC.

Sấy thùng quay: thời gian 10-20 giờ, tốc độ 4 vòng/phút, vận tốc không khí

1,5-2,5m/giây, nhiệt độ không khí 50-60oC trong 6-7 giờ, độ ẩm còn 15-22%, nhiệt độ không

khí 40oC 1,5-3,0 giờ, độ ẩm còn 7-8%.

Đánh giá chất lượng men khô:

- Độ ẩm: không quá 8 %

- Lực nở bột: không quá 75 phút

- Độ axit: ngày đầu sản xuất nhỏ hơn 120mg, sau 12 ngày nhỏ hơn 360 mg

- Hoạt lực maltase: nhỏ hơn 100 phút (loại tốt), nhỏ hơn 160 phút (loại trung bình)

- Hoạt lực zymase: nhỏ hơn 60 phút (loại tốt), nhỏ hơn 80 phút (loại trung bình).

1.3.6. Yêu cầu thành phẩm

Màu sắc: xám sáng, trứng sữa cho đến nâu tối

Mùi vị: Đặc trưng của nấm men, không có mùi lạ

Có đầy đủ các VTM: B1 ≥ 10 mg/kg, B2 ≥ 30 mg/kg, B3 ≥ 300 mg/kg

Tỷ lệ tiêu hóa protein ≥ 75 – 80%

Giá trị sinh học của protein ≥ 55%

Thành phần Hàm lượng (% chất khô)

Protein 50

Lipid 6

Độ ẩm 8

Các acid amin không thay thế Hàm lượng (% protein tổng)

Trang 38

Lysine 8,2

Valin 5,5

Leuxin 7,9

Isoleuxin 5,5

Threonine 4,8

Methionine 2,5

Phenylalanine 4,5

Tryptophan 1,2

Histidine 4,0

Arginine 5,0

1.4. Ứng dụng

Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Ứng dụng trong y học

Ứng dụng trong mỹ phẩm

2. CNSX protein từ dịch thủy phân các nguyên liệu thực vật và dịch kiềm sunfit

2.1. Các nguồn nguyên liệu

- Các loại thực vật như rơm, rạ, bã mía, lõi ngô, trấu ... sử dụng axit H 2SO4 0,4 – 0,6%

cho đến 5% hoặc enzym cellulase để thủy phân. Trong môi trường axit có khả năng

thủy phân tốt cellulose và hemicellulose.

- Dịch kiềm sunfit thu được từ các nhà máy sản xuất giấy. Cứ 5 tấn bột cellulose dùng

để sản xuất giấy thải ra lượng dịch có chứa 180 kg đường, trong đó chủ yếu là đường

pentose là loại đường chỉ nấm men mới chuyển hóa tốt..

- Nước chiết ngô, ngước chiết lúa mì, nước chiết từ bã khoai tây thu được từ các nhà

máy sản xuất tinh bột ...

2.2. Nguồn vi sinh vật được sử dụng

Trang 39

Từ dịch thủy phân nguyên liệu thực vật: candida utilis, candida tropicalis, candida scotti,

candida humicola. Từ dịch kiềm sunfit: candida utilis, candida tropicalis. Đây là những chủng

nấm men có khả năng lên men được nhiều loại đường đặc biệt là có khả năng lên men tốt đường

pentose có nhiều trong dịch kiềm sunfit. Ít sử dụng nấm men S. cerevisiae vì loài này không có

khả năng lên men đường pentose như các loài Candida.

2.3. Quy trình sản xuất nấm men từ dịch thủy phân nguyên liệu thực vật và dịch kiềm

sunfit

Muốn thu được dịch thủy phân cần xử lý cơ học (nghiền, xay, cắt, loại bỏ tạp chất). Thủy

phân ở nhiệt độ 179-190oC, chiều cao thùng 2-3m. Quá trình thủy phân diễn ra trong một

thời gian dài sau đó chuyển sang thiết bị khác, chuyển đường nghịch đảo (nhiệt độ 100 –

Trang 40

Nguyên liệu, nghiền

Thủy phân

Sấy

Nghiền

Men giống cấp III

Dịch thủy phân, Trung

hòa=Ca(OH)2

Lọc và làm sạch

Làm nguội (30-32oC)

Lên men sinh khối

Tách sinh khối

Đóng gói, thành phẩm

Tách CaSO4

KCl, super phosphat, (NH4)2SO4,

dầu phá bọt, chất điều chỉnh pH

Fucfurol và các chất bay

hơi khác

Hơi nóng (179-190oC), áp suất 9-13kg/cm3

Nước + H2SO4 (0,5-0,6%)Bột xenlulo

105oC) bằng enzym investasse và sacharase. Sau quá trình chuyển đường nghịch đảo,

lượng đường đơn có thể tăng 5-10%, dịch này có thành phần chủ yếu là hexose (70-80%)

và pentose (20-30%), ngoài ra còn có khoảng 5% các axit hữu cơ, fucfurol, oxymethyl

fucfurol là 2 thành phần không có lợi cho quá trình lên men nên phải loại bỏ. Sau khi

thủy phân thường có pH axit nên sử dụng nước vôi, nước amoniac để trung hòa và cung

cấp nitơ. Sau khi trung hòa nhiệt độ khoảng 80 – 85oC có chứa nhiều thành phần lơ lửng

và tạo kết tủa. Vì vậy phải loại tủa bằng cách lắng xoáy. Thông thường sau khi loại tủa

chỉ còn lại khoảng 0,5-0,8% là các hợp chất huyền phù chủ yếu là các chất vô cơ. Quá

trình làm nguội có thể làm lạnh trong các thiết bị ống lồng ống, dạng tấm, tự bay hơi ...

Thông thường sử dụng phương pháp tự bay hơi để loại bớt 5-7% nước, 5-7% fucfurol và

oxymethyl fucfurol. Chiều cao của thiết bị có thể lên tới 17m, có thể sử dụng thiết bị làm

lạnh phụ khi tháp không đủ độ cao.

Dịch kiềm sunfit là dịch thu được sau khi nấu cellulose có chứa thành phần chủ yếu là

lignin, hemicellulose, các chất keo tụ dạng nhựa, chất béo, muối khoáng và các

monosacharid. Do quá trình nấu cellulose với H2SO3 và Ca(HCO3)2 nên trong dịch còn rất

nhiều SO2 và SO3 không có lợi cho VSV cần loại bỏ bằng cách tăng nhiệt độ lên quá

80oC, sử dụng thiết bị dạng tháp. Có rất nhiều muối sunfit ở dạng hòa tan cần phải

chuyển về dạng sunfat không hòa tan. Mức độ oxi hóa không chỉ phụ thuộc nhiệt độ mà

còn phụ thuộc pH. pH cần tạo ra trong quá trình này không quá 3,5, nhiệt độ 80-85oC.

Hàm lượng sợi cellulose cần loại bỏ bớt vì không có lợi cho VSV, lượng sợi này cho

phép không quá 0,05 g/l. Quá trình trung hòa nhằm tạo pH cho nấm men hoạt động. Để

tăng khả năng tiếp xúc người ta sử dụng thiết bị phun mù tạo tiếp xúc giọt rồi bơm sang

thùng ổn định có hệ thống khuấy hoặc sục khí, rất nhiều cặn tạo thành nên cần tách cặn

bằng phương pháp lắng xoáy. Làm nguội đến 28-30oC cho nấm men hoạt động.

Tùy từng loại nguyên liệu và chủng VSV nuôi cấy mà thành phần môi trường khác nhau. Nói

chung trong môi trường ngoài cacbon, nitơ cần có các chất khoáng...Các thành phần môi

trường được hòa tan lọc bỏ cặn, điều chỉnh pH đến 4,8-5,2 .

Để sản xuất sinh khối nấm men giàu protein các dạng nguyên liệu trên cần đảm bảo các

điều kiện kỹ thuật sau:

Trang 41

- Nồng độ đường trong dịch nuôi cấy từ 2-4%

- Muối ure: 3 g/l

- Super phosphat: 4 g/l

- Không khí vô trùng

- Thời gian nuôi 18-36 giờ

- Nhiệt độ nuôi: 28 – 30oC

- pH môi trường 4,5-5,5

Nồng độ đường trong quá trình nuôi cấy không nên quá cao, nếu quá cao sẽ ức chế sự

tăng trưởng của tế bào tạo ra nhiều sản phẩm phụ không cần thiết. Nồng độ đường luôn khống

chế trong khoảng 2-4%.

Thành phần nấm men gia súc: protein 45-58%, chất béo 0,3-4%, gluxit 11-23%, chất tro

10-11%, độ ẩm 6-10%.

Trong tế bào nấm men có nhiều VTM nhóm B: thiamin, riboflavin, axit niconitic, axit

folic, đặc biệt giàu tiến VTM D2 (ergosterin) dưới ánh sáng tử ngoại (tia cực tím) ergosterin sẽ

chuyển thành VTM D2. Vì vậy trước khi đóng gói thành phẩm, sinh khối nấm men được chiếu

tia tử ngoại để VTM hóa, thời gian chiếu không quá 2 giờ, nhiệt độ không quá 30 oC. Hàm lượng

VTM D2 1000-12.000 UI/g men khô.

Bảng thành phần aa của protein nấm men gia súc

Thành phần aa (g/100g Pr) Môi trường nuôi cấy nấm men

Trang 42

Dịch thủy phân thực vật Dịch kiềm sunfit

Tryptophan 1,5 1,3

Lysine 6,8 6,1

Methionine 1,7 0,9

Arginin 5,6 4,1

Histidine 2,4 1,5

Valin 5,1 5,6

Isoleusin 5,0 5,8

Leusin 7,6 8,6

Phenylalanin 4,2 4,4

Xistein 1,3 0,9

2.4. Ứng dụng

- Làm thức ăn gia súc

- Xử lý môi trường

3. Quy trình sản xuất sinh khối nấm men từ bã rượu

Trang 43

Chủng giống: Thường sử dụng chủng C. tropicalis và C. utilis. Nhân giống 3 gian đoạn:

- Giai đoạn 1: Môi trường nhân giống là rỉ đường nồng độ 2,5% có bổ sung 1% super

phosphat. Điều chỉnh pH = 5 - 5,2 bằng H2SO4. Nuôi 200ml men giống trong bình

500 ml trong 24 giờ, nhiệt độ 30 – 32oC, có sục khí.

Trang 44

Bã rượu

Lọc thùng quay

Oxi

Thành phẩm

Giống

Dịch bã

Thanh trùng

Lên men

Thùng phá bọt

Sàng rung

Huyền phù

H2SO4, super phosphat, (NH4)2SO4,

dầu phá bọt, chất điều chỉnh pH

Bã chăn nuôi

Ly tâm

Sữa men đặc

Sấy, nghiền

Sấy, nghiền

- Giai đoạn 2: Lần lượt tiến hành nhân giống trong 3 thiết bị 15, 120 và 1200 lít với tỉ lệ

tiếp giống là 1:10, môi trường lên men 50% rỉ đường, 50% dịch bã rượu có bổ sung

phosphat amon, nhiệt độ 30 – 32oC, pH 5, thời gian lên men lần lượt mỗi cấp là 24,

18 và 16 giờ.

- Giai đoạn 3: Nuôi nấm men trong thùng có dung tích 32.000 lít, môi trường lên men

100% dịch bã rượu có bổ sung dinh dưỡng phù hợp. Nuôi cấy bằng phương pháp lên

men liên tục, có sục khí để từ đó chuyển sang giai đoạn lên men công nghiệp.

Nguyên liệu: Là sản phẩm phụ của nhà máy sản xuất ethanol công nghiệp. Hiện nay số

lượng bã rượu thải ra hàng ngày là rất lớn song lượng bã được sử dụng lại không đáng kể.

Nếu không được xử lý đúng mức, bã rượu phân hủy không hoàn toàn gây ô nhiễm môi

trường rất nghiêm trọng. Việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất các sản phẩm

thực phẩm hoặc sinh học trên nguồn nguyên liệu bã rượu có ý nghĩa quan trọng về kinh tế

và bảo vệ môi trường. Bã rượu có thể được chế biến thành glycerin, than cốc, sản xuất

nấm men bánh mì và sản xuất nấm men cho gia súc. Trong bã rượu còn rất nhiều thành

phần mà VSV có thể sử dụng được. Có 2 nguồn bã rượu có thể dùng nuôi cấy nấm men

với những thành phần tương đối khác nhau.

- Bã rượu từ rỉ đường có thành phần

Thành phần Tỉ lệ (%chất khô)

Protein 11 - 12

Đường không lên men 4 - 7

Glycerin 7 – 9

Acid hữu cơ 13 – 20

Glutamat 6 – 9

Acid amin 1 – 3

Lipid 10 – 15

Betain 8 – 10

Trang 45

Thành phần các VTM có trong bã rượu cô đặc

Vitamin Hàm lượng (mg/g)

PP 21

B2 8

B5 30

B3 39

B7 1,5

Acid folic 0,3

- Bã rượu từ tinh bột có các thành phần

Thành phần Tỉ lệ (%chất khô)

Đường khử 0,4 – 0,5

Tinh bột 0,3 – 0,4

Pentozan 0,3 – 0,5

Hemicellulose 1,5 – 1,7

Cellulose 0,3 – 0,5

Nitơ tổng 0,3

Chất tro 0,4

Bã rượu được lọc thùng quay (kích thước lỗ lưới có đường kính 0,75 mm) thu dịch bã.

Dịch bã được thanh trùng ở 80 – 90oC rồi làm nguội môi trường đến 30 – 32oC. Trong

trường hợp bã rượu có chứa CaO > 0,8% phải bổ sung acid để pH = 4 – 4,5, giữ ở 80 –

85oC/1 giờ rồi tách cặn.

Bổ sung các muối NH4+, P2O5 tạo môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nấm men phát

triển. (Ca(H2PO4 có 15% P2O5), KH2PO4 có 20% P2O5.

Có thể bổ sung 1% rỉ đường vào môi trường nuôi cấy để làm tăng hiệu suất tuy nhiên như

vậy sẽ làm giảm khả năng sử dụng glucid trong bã rượu

Thành phần Hàm lượng

Trang 46

Nồng độ chất khô 7,5 – 8,1 (%)

P2O5 + (Bổ sung

Ca(HPO4)2, KH2PO4)

4 - 7 (g/l)

Ure 2 - 3 (g/l)

- Thời gian: 14 – 16 giờ

- Nhiệt độ: 28 – 32oC

- pH: 4,5 – 5,5 (*)

- Hệ số sinh sản: 0,15 – 0,16

- Mật độ tế bào: 60 – 69 g/l

- Hiệu suất: 50– 55 %

Lượng oxi cần cung cấp cho môi trường tùy thuộc thành phần cụ thể của môi trường. Ví dụ:

đồng hóa 1 kg glucose cần 0,77 kg oxi trong khi đồng hóa 1 kg acid acetic cần 1,57 kg oxi.

Thành phần nấm men gia súc: có hàm lượng protein rất cao. Sữa người 1,4%, sữa bò tươi

3%, trứng 12,4%, thịt nạc 17,5%, sữa bột 30%, bột đậu nành 35 – 38%, nấm nen khô 48 –

56%.

Thành phần nấm men gia súc

Thành phần (% chất khô) Bã rượu từ khoai tây Bã rượu từ rỉ đường

Độ ẩm 6-10 6-10

Protein 48-56 47-55

Gluxit 22-25 14-17

Lipit 2-5 2-5

Chất tro 7-9 8-10

Thành phần các Vitamin

Các VTM Hàm lượng

Trang 47

(mg/kg nấm men)

B1 18,3

B2 48,6

B3 (PP) 326

B4 2.600

B5 100

B6 26,4

Acid folic 18

Biotin 2,7

B12 0,08

D2 (sau khi chiếu tia tử ngoại) 250

Trung bình từ 1 m3 bã rượu có nồng độ chất khô tối thiểu có thể thu được 18 – 22 kg nấm men

có độ ẩm 10%

Ứng dụng: Bổ sung vào thức ăn gia súc

4. CNSX protein vi khuẩn từ bã thải xenllulose

Trang 48

Vi sinh vật:

- Cellulomonas là trực khuânr Gram (+), không sinh bào tử, hình dạng thay đổi khá nhiều.

- Alcaligenes là trực khuẩn Gram (-), một số loài có khả năng gây bệnh, có mặt ở khắp mọi

nơi như trong đất, nước ...

- Bản thân Alcaligenes trong môi trường cellulase hầu như không phát triển được,

Cellulomonas thì phát triển tốt. Năm 1969 Srinivan và Han đã phát hiện 2 loài này có khả

năng cộng sinh và phát triển rất tốt trên môi trường cellulose. Từ đây mở ra một hường

rất quan trọng trong việc sử dụng nguồn phế liệu cellulose để sản xuất protein đơn bào.

- Protein từ VK có hàm lượng trung bình 60 – 70 % (trọng lượng khô), thậm trí có loài còn

đạt đến 87%. Đồng thời thành phần các aa cũng cân đối hơn nấm men. Tuy nhiên có

nhược điểm là kích thước quá nhỏ. Người ta tính trung bình cứ 100 kg bã mía thu được

16 – 17 kg protein.

Trang 49

Nguồn xenllulo

Xử lý cơ học

Oxi

Thành phẩm

Nhân giống

Xử lý hóa học

Dịch chiết, bổ sung dinh dưỡng, khoáng

Thanh trùng

Lên men

Tách sinh khối

Sấy phun, thùng quay

Kiềm

- Ngoài 2 loài trên trong tự nhiên còn có nhiều loài VSv sinh enzym xúc tác trong quá trình

phân giải cellulose như: Cytophaga, Bacillus, Clostridium, Aspergillus, Penicilium

- Nguyên liệu: Hàng năm từ quá trình sản xuất công nghiệp và nông nghiệp một lượng

cellulose khổng lồ đã được thải ra. Riêng bã mía có thể lên đến 300 – 400 triệu tấn/năm.

Các nguyên liệu bao gồm bã mía, cỏ, rơm, rạ, mùn cưa, phoi bào, lõi ngô ... Hiện nay

người ta cũng đã tìm đủ mọi cách để sử dụng các nguồn phế thải này như: muối chua

thực vật để bảo quản làm nguồn thức ăn lâu dài cho trâu bò đồng thời bổ sung một lượng

lớn VK lactic rất thuận lợi cho quá trình tiêu hóa, tăng chất lượng dinh dưỡng cho vật

nuôi. Riêng bã mía đã có rất nhiều công trình nghiên cứu xử lý như: sử dụng làm vật liệu

trồng nấm, xử lý nước thải trong chăn nuôi, sản xuất giấy bìa, làm than mùn cưa bã mía.

Sử dụng mùn cư, phoi bào, lõi ngô nuôi VSV bằng khí thiên nhiên ... Tuy nhiên với khối

lượng cellulose thải ra quá lớn người ta vẫn sử dụng phương pháp đốt là chủ yếu.

Thành phần hóa học của bã mía, rơm, rạ

Thành phần Bã mía (% chất khô) Rơm, rạ (% chất khô)

Protein 2,92 5,05

Chất béo 1,78 2,41

Cellulose 40,6 (H.C) 34,39

Chất tro 4,68 4,06

Lignin 7,6 7,36

* Xử lý nguyên liệu

- Nghiền

- Kiềm hóa bằng NaOH 2 – 4%, đồng thời thổi hơi nóng có nhiệt độ 71oC trong 30-60 phút,

khuấy đảo liên tục. Quá trình này cắt bớt 1 phần cấu trúc của lignin để VSV dễ dàng sử dụng

hơn.

- Qua lò oxi hóa với chất xúc tác là cobalt clorit, thổi không khí vào với hàm ẩm 20-40%,

133 – 260oC trong 2 – 6 phút.

- Làm nguội, bổ sung các chất dinh dưỡng, nước rồi thanh trùng bằng hơi nóng ở 126 –

160oC, khuấy đảo liên tục.

Trang 50

Thành phần môi trường lên men

Thành phần g/l

Bã mía đã chế biến (trong lượng khô) 6

Sulphat amon 3

Muối phosphat (Na2HPO4 và NaH2PO4) 1

MgSO4 (kích thích sinh trưởng) 0,1

CaCl2 0,1

NaCl 3

Nước chiết nấm men 0,5

Muối khoáng 1 ml

Polyglycol P-2000 0,1 ml

Nước Đủ 1 lít

* Quá trình lên men ở nhiệt độ 30 – 32oC, thời gian 60 - 72 giờ ở pH 6 – 7. Sau khi lên men thu

được 2 loại huyền phù, phần nổi chứa tế bào vi khuẩn, tiến hành lắng lần 1 loại bã mía không

hòa tan, lắng lần 2 và ly tâm thu sinh khối. Sinh khối vi sinh vật được sấy thùng quay hoặc sấy

băng tải rồi đóng gói sản phẩm.

Thành phần các acid amin từ Cellulomonas

Các acid amine Cellunomonas (%) Trứng (%)

Arginin 9,21 6,43

Histidine 2,3 2,52

Isoleucine 4,74 6,0

Leucine 11,2 8,0

Lysine 6,84 4,6

Methionine 1,86 1,4

Phenylalanin 4,36 5,0

Tyrosine 2,67 2,76

Treonine 5,37 4,6

Valin 10,71 6,5

Trang 51

Bảng so sánh thành phần dinh dưỡng

Thành phần Protein Chất béo Cellulose Tro Lignin

Bã mía 2,92 1,87 40,6 4,68 7,6

Bã mía đã chế biến 1,66 1,59 39,2 8,32 3,07

TB vi khuẩn đã ly tâm 57,8 2,53 2,83 9,0 1,37

Cellulose còn sau lên men 7,7 2,67 18 2,88 7,6

5. CNSX protein từ nguồn cacbua hydro dầu mỏ và khí đốt

5.1. CNSX protein từ dầu mỏ

5.1.1. Nguyên liệu

Chỉ những phần dầu mỏ nhất định mới được VSV đồng hóa như alkan (parafin) với chiều

dài chuỗi cacbon từ C10-C20, các alkin, alken, hydrocacbon thơm, các parafin chuỗi ngắn còn lại

trong phần dầu mỏ có nhiệt độ nóng chảy thấp. sử dụng n-parafin tinh khiết được tách từ dầu mỏ

có ưu điểm là nguồn cacbon được sử dụng hoàn toàn không để lại các cacbua hydro độc.

- Nấm men đồng hóa dễ dàng nhất các parafin có độ dài mạch C11 – C14, đối với mạch C15 –

C19 đồng hóa khó khăn hơn, C19 – C21 rất khó đồng hóa, > C25 thì nấm men gần như không

có khả năng đồng hóa. Các loại cacbua hydro mạch nhánh, mạch vòng và cacbua hydro nhẹ từ

C2 – C8 ít có lợi cho nấm men.

- Đối với vi khuẩn có thể nuôi trên môi trường n-parafin có chiều dài mạch C11 – C30.

- Yêu cầu về nguyên liệu parafin tinh khiết: Nhiệt độ sôi khoảng 200 - 320oC, hàm lượng

parafin: 99%, hàm lượng cacbua hydro thơm không quá 0,01%. Nguồn nguyên liệu ảnh hưởng

nhiều đến sản phẩm:

+ Độ sạch của nguồn nguyên liệu ảnh hưởng đến hiệu suất thu sản phẩm.

+ Đặc tính lý học của nguyên liệu như độ nhớt, độ nóng chảy ảnh hưởng đến khả năng khuếch

tán vào môi trường lỏng nên ảnh hưởng đến khả năng hình thành sinh khối của VSV.

+ Thường phải nuôi ở điều kiện nhiệt độ cao làm nóng chảy nguồn cacbua hydro nên rất cần các

VSV chịu được nhiệt độ > 40oC

Trang 52

5.1.2. Vi sinh vật

Có khoảng 26 giống và 75 loài có khả năng phân hủy hydro cacbya mạch thẳng, 25 loài

có thể phân hủy cacbua hydro mạch vòng.

- Nấm men: Candida, Torulopsis, Endomyces, Hansenula, Monilia. Chỉ đồng hóa cacbua

hydro mạch thẳng.

- Vi khuẩn: Acromobacter, Bacillus, Bacterium, Pseudomonas,… Có khả năng đồng hóa

cacbua hydro mạch thẳng, nhánh và mạch vòng

- Xạ khuẩn: Streptomyces, Actinomyces có khả năng sử dụng gần như vi khuẩn

- Nấm mốc: Penicillium, Fumarium, Acrenomium, Aspergillus … Sử dụng mạch thẳng và

mạch nhánh nhưng sử dụng mạch nhánh kém.

Một số chủng nấm men có hoạt lực cao: Candida lipolytica, C. intermedia, C. tropicalis, C.

parasilopsis. Ngoài nấm men thì còn sử dụng nhiều loài vi khuẩn phân hủy cacbua hydro.

Các VSV này có đặc điểm nổi bật:

- Đồng hóa cacbua hydro tốt tức là hydro cacbua có khả năng thâm nhập dễ dàng vào

trong tế bào của vi sinh vật, đồng thời các VSV này có hệ thống enzym cần thiết để

chuyển hóa nguồn C-H (đặc biệt đối với giai đoạn đầu của sự oxi hóa).

- VSV phải bền vững với độc tố của hydro cacbua nồng độ cao.

- Có hoạt lực sinh tổng hợp protein cao, sinh trưởng nhanh thu sinh khối cao, hàm lượng

protein cao, có đầy đủ các acid amine không thay thế, người và động vật dễ đồng hóa,

không có độc tố.

Trang 53

5.1.3. Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy nấm men

Thành phần Kg

n-parafin 12,5

Surper phosphat 2,7

Amon sulphat 0,45

Nước amoniac (25%) 4

KCl 0,56

MgSO4 0,28

Nước Vừa đủ 1000 lít

Kỹ thuật nuôi cấy: Hiện nay để nâng cao hiệu suất sử dụng cơ chất và tận dụng triệt để thiết bị

nuôi cấy, nhiều nước đã ứng dụng kỹ thuật nuôi liên tục trong công nghiệp sản xuất sinh khối

nấm men với quy trình như sau:

- Parafin nóng (50-60oC) được liên tục cho vào thùng lên men, nồng độ parafin ban đầu

là 1,5-2% thể tích

- Sự tích tụ sinh khối nấm men trong thời gian nuôi có thể thực hiện 2 nồi lên men. Lên

men chính ở nồi thứ nhất được thổi khí mạnh, lên men phụ có thổi khí nhưng yếu hơn.

Trang 54

5.1.4. Quy trình nuôi cấy

Trang 55

Dầu thô

Lên men

Thành phẩm

Bao gói

Dầu đã hết parafin

Rửa bằng nước

Làm khô

Xử lý bằng dung môi

Sinh khối

Sấy khô

Tách nấm men

Parafin

Lên men

Thành phẩm

Bao gói

Tách nấm men

Rửa bằng nước

Làm khôDầu thô

Xử lý

Dịch lên men

Thu hồi dung môi

Xử lý 50 – 60oC

Dịch lên men

Hiệu suất các giống nấm men khi nuôi cấy trên parafin:

Giống nấm men Hiệu suất nấm

men khô (%)

Hàm lượng Pr trong

nấm men khô (%)

Candida tropicalis 94,4 58,8

Candida robusta 85,0 53,4

Candida intermedia 87,1 51,0

Turolopsis famata 97,3 50,0

Đặc điểm của nấm men gia súc trên parafin: dạng bột màu vàng nhạt đến nâu xám, mùi

đặc trưng, không cho phép nhiễm Salmonela.

Thành phần Hàm lượng

(% chất khô)

Protein 56 - 60

Lipid 16

Gluxit 1,6 – 2,2

Lysine 4,6

Độ ẩm <10

Chì < 5 µg/g

Asen < 2 µg/g

Thủy ngân < 0,1 µg/g

5.2. CNSX protein từ khí đốt

Nguyên liệu:

- Chủ yếu sử dụng khí metan lấy được từ nguồn khí tự nhiên trong lòng đất và khí trong

sản xuất, chế biến dầu mỏ. Khí tự nhiên hàm lượng khí metan < 98%, etan: 0,07 – 3,5%, propan:

0,03 – 0,9%, butan: 0,01 – 0,3%, còn lại là các khí khác. Khí trong sản xuất dầu mỏ: thu được từ

30 – 200 kg khí khi sản xuất được 1 tấn dầu mỏ. Trong đó metan chiếm 30 – 40%, etan: 9 –

Trang 56

10%, propan: 4-14%, propylen: 7 – 15%, butan: 2 – 8%, butylen: 8 – 10%, hydro: 6 – 8%. Tuy

nhiên metan không chỉ là nguyên liệu trong lòng đất mà còn được tạo thành qua con đường VSV

nhờ sự lên men metan được sinh ra trong các bể chứa bùn mục nát.

Ưu điểm: Khí thiên nhiên rẻ hơn dầu mỏ nhiều lần, phần khí không được VSV đồng hóa

loại bỏ dễ dàng vì vậy sản phẩm rất tinh khiết và không tốn kém dung môi cho việc rửa tế bào,

khi sử dụng khí không gặp những cản triử kỹ thuật như mầu của nguyên liệu hay độ nhớt của

môi trường.

Nhược điểm: VSV đồng hóa khí thiên nhiên đều là VSV hiếu khí. Do đó môi trường dinh

dưỡng phải thường xuyên thổi hỗn hợp khí metan và oxi hoặc không khí rất dễ gây nổ. Nồng độ

khí cao rất dễ bắt lửa và nổ còn nồng độ khí thấp thì VSV không đủ hô hấp nên hiệu suất nuôi

cấy thấp. Để thực hiện được quá trình sinh tổng hợp protein thì oxi và metan phải được chuyển

sang thể lỏng để bọt khí mang nhiên liệu và chất oxi hóa đến các tế báo VSV nhanh chóng và

thực hiện quá trình đồng hóa. Tuy nhiên độ hòa tan của metan và oxi trong nước thấp phải khắc

phục bằng cách tăng áp suất dẫn đến thiết bị phải có khả năng chịu áp cao rất phức tạp và đắt

tiến. Nếu đưa một dung môi hữu cơ nào đó vào môi trường dinh dưỡng để tăng độ hòa tan của

metan nhưng sẽ làm VSV thích sử dụng dung môi đó hơn metan thì việc dùng khí thiên nhiên

không còn ý nghĩa.

Chủng vi khuẩn: Microbacterium methanicum, Pseudomonas, Methanomonas, Bacilus,

Corynebacterium, Brevibacterium …

Phương pháp sản xuất: có 2 phương pháp

Phương pháp 1: Tạo môi trường dinh dưỡng gồm muối amon và chất khoáng rồi đưa môi

trường này vào các bình lên men. Tiến hành nuôi VSV có khả năng sủ dụng khí thiên nhiên

trong bình lên men này. Thổi khí thiên nhiên và không khí vào bình lên men đã có sẵn VSV. Oxi

và khí thiên nhiên sẽ tiếp xúc với VSV. Khi đó VSV sẽ đồng hóa khí thiên nhiên và các chất

dinh dưỡng tạo thành sinh khối.

Phương pháp 2: Thiết kế những bình phản ứng có chứa đầy chất mang, chất mang này

chứa đầy VSV trong đó. Đưa không khí và khí thiên nhiên từ dưới lên tiếp xúc với VSV, VSv sẽ

đồng hóa tạo sinh khối, sinh khối tạo thành nhiều sẽ tách khỏi chất mang rơi xuống dưới. Thu

nhận sinh khối từ đáy thiết bị. Phương pháp này hiệu suất không cao nhưng có ý nghĩa khi xử lý

Trang 57

CH4 trong môi trường không khí. CH4 có ảnh hưởng cao nhất đến sự tạo thành hiện tượng hiệu

ứng nhà kính (CH4 làm tăng hiệu ứng nhà kính gấp 21 lần so với CO2). Phương pháp này vừa

loại được CH4 vừa thu được sinh khối. Đây là một phương pháp khá lý tưởng trong lĩnh vực xử

lý môi trường.

Đặc điểm của sản phẩm vi khuẩn từ khí đốt: Dạng bột hoặc hạt màu vàng đến nâu xám, không có mùi lạ

Thành phần Hàm lượng

Độ ẩm < 10 %

Tro < 10 %

Protein > 70%

Lipit < 15%

Chì < 5 µg/g

Asen < 2 µg/g

Số VSV (không cho phép có Salmonella) 105 TB/g

6. CNSX tảo Spirulina

6.1. Giới thiệu về tảo Spirulina

6.2. Tình hình sản xuất tảo Spirulina trên thế giới và ở Việt Nam

6.3. Công nghệ sản xuất tảo Spirulina

6.3.1. Giống

Spirulina là một chi gồm một số loài được sủ dụng phổ biến trong công nghệ nuôi trồng

tảo như: S. platensis, S. maxima

Chọn giống: Tảo giống phải đạt độ thuần khiết cao. Giống nếu không thể tự phân lập và

tuyển chọn thì nên đặt mua những giống dùng cho sản xuất ở những nơi uy tín. Yêu cầu: Giống

ch năng suất cao, dễ thu hoạch, dễ thích nghi, sức chống chịu tốt, ít hấp phụ, tích tụ các chất độc

của môi trường nuôi cấy.

Nhân giống: Bất kỳ một cơ sở sản xuất nào cũng phải có phòng thí nghiệm để cất giữ và

nhân giống tảo phục vụ sản xuất. Đồng thời phòng thí nghiệm còn có nhiệm vụ kiểm soát hệ

thống nuôi và phân tích chất lượng thành phẩm, lai tạo và tuyển chọn những giống cũng như

môi trường nuôi cấy để đạt hiệu quả cao hơn.

Trang 58

Từ giống gốc ban đầu cấy sang bình tam giác 200 ml, nuôi tảo ở điều kiện ánh sáng thích

hợp sau đó tiếp tục cấy sang môi trường có thể tích 1 lit. Quá trình cứ tiếp tục cho đến 100 lít

với tỉ lệ cấp giống là 10%. Thời gian nhân giống phụ thuộc vào tỉ lệ tiếp giống và thể tích môi

trường, thường nuôi trong 24 giờ đảm bảo cho tảo sinh trưởng và phân chia cho đủ lượng tế bào

cần giúp cho quá trình sản xuất được chủ động và đạt năng suất cao nhất.

6.3.2. Các điều kiện kỹ thuật

Nguồn cacbon: Là CO2 và các muối cacbonat. Nồng độ cacbon ở dạng muối cacbonat tối

đa là 16-17 g/l, thực chất chúng có thể sống ở nồng độ 200 g/l. Ngoài ra còn cung cấp bằng cách

sục khí CO2 với hàm lượng 1-3%. Vừa cung cấp nguồn cacbon vừa điều chỉnh pH môi trường

sao cho phù hợp với tảo. Đây là sinh vật dị dưỡng, nó có thể vừa sử dụng nguồn cacbon vô cơ,

vừa sử dụng được nguồn cacbon hữu cơ như glucose. Tuy nhiên nguồn glucose < 2%, nếu

glucose > 2% thì tảo không phát triển được. Có thể cung cấp CO2 trực tiếp từ các quá trình lên

men khác như rượu ethanol, bia, sục khí chứa CO2,… Để đảm bảo nguồn CO2 cung cấp cho quá

trình nuôi tảo khi xây dựng nhà máy nên lựa chọn các vị trí như gần nhà máy rượu, bia… để đạt

giá trị kinh tế cao nhất.

Nitơ: Nguồn nitơ hay sử dụng đối với tảo là Natri nitrat, hàm lượng nitơ tối thiểu là 30

mg/l, nếu sử dụng sunfat amon cần giới hạn sao cho nồng độ không quá 100 mg/l, ure không

phải là nguồn nitơ thích hợp cho tảo.

Phospho: Nếu không đủ phospho tảo bị giãn vòng xoắn và bị vàng. Lượng phospho tối

thiểu là 10 mg/l. Muốn có hàm lượng protein tối đa trong tảo cần cung cấp 300 mg/l phospho.

Tuy nhiên năng suất thu nhận tảo tối đa khi hàm lượng phospho là 90 – 180 mg/l. Vì vậy phải

lựa chọn hàm lượng phospho tùy từng giai đoạn và mục đích.

Một số nguyên tố khoáng: Nếu thiếu kali tảo bị vàng, hàm lượng kali cung cấp cho môi

trường tính theo muối KCl khoảng 10 g/l. Natri cần bổ sung sao cho K/Na < 5/1. Caxi, Mg, Clo,

sắt… đều ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo, biểu hiện giống như khi thiếu phospho. Riêng

thiếu clo các vòng xoắn bị thắt chặt lại và cấu trúc bị phá hủy. Nồng độ clo cao không gây độc

cho tảo. Sắt đặc biệt quan trọng vì nó làm giảm rất nhanh khả năng sinh trưởng, phải cung cấp

cho tảo dưới dạng muối hữu cơ chelat vì muối vô cơ dễ bị kết tủa.

Trang 59

Ánh sáng:Ánh sáng tự nhiên: thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng vừa phải để giúp

tảo phát triển tốt (lượng chiếu sáng trong ngày bằng 30% lượng chiếu sáng ở vùng nhiệt đới là

tốt nhất). Cường độ bão hòa với tảo là 45 klux, cường độ tốt cho tảo phát triển là 25 – 30 klux (ở

VN cường độ ánh sáng có lúc lên tới 80klux nên phải làm mái che). Nếu thời gian chiếu sáng

dài, cường độ gây gắt sẽ làm giảm sinh khối tảo. Đồng thời ánh sáng cũng làm thất thoát

oxygen trong ao. Hơn nữa thời gian trong bóng tối là thời gian tảo hô hấp và đặc biệt tổng hợp

protein. Ánh sáng nhân tạo (hệ thống nuôi spirulina kín): có thể điều chỉnh đúng với nhu cầu

của tảo, giúp nó phát triển tốt, nhưng chi phí tốn kém.

Quản lý: đối với hệ thống hở, nếu lượng chiếu sáng nhiều quá có thể che mát cho ao bằng cách

trồng cây xung quanh ao hoặc xây mái che cho ao. Đối hệ thống kín: kiểm tra để điều chỉnh

lượng chiếu sáng phù hợp bằng cách điều chỉnh hệ thống đèn.

Nhiệt độ : Ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tảo. Nhiệt độ dưới

20oC tảo không chết nhưng phát triển chậm. Nhiệt độ trên 41oC tảo bắt đầu bị tổn hại và không

thể phục hồi nếu duy trì nhiệt độ đó trong 4 ngày. Ở 44oC tảo bị chết sau 6 – 9 giờ. Ở 50oC tảo

châe sau 5 phút. Tảo bị đứt đoạn ở nhiệt độ cao, phồng lên, tế bào bị phá hủy tạo thành 1 dịch

huyền phù màu vàng đến nâu. Tảo Spirulina phát triển tối ưu ở 35oC.

pH môi trường phải duy trì 8,5 – 9, pH>11 và pH<7 tảo giảm khả năng sinh trưởng, pH

> 11 tảo không có khả năng quang hợp. Trong môi trường có khi pH cũng có khi lên tới 12 khi

tảo hô hấp mạnh nhưng ngay khi có ánh sáng phải bổ sung môi trường để giảm pH giúp tảo có

khả năng quang hợp.

Mưa: ở những nơi có lượng chiếu sáng trong ngày cao ,mưa sẽ tốt cho sự phát triển của

tảo. Nhưng nó có thể làm tràn bể nuôi tảo ra môi trường ngoài. Do đó ta nên xây thành bể cao.

Gió: giúp hòa tan lượng oxygen trong không khí vào bể. Nhưng nó cũng có thể mang vật

lạ vào bể, có thể ảnh hưởng không tốt cho tảo. Do đó xây mái che cho bể cũng giúp hạn chế vật

chất lạ theo gió rơi vào bể.

Bể nuôi tảo: Bể nuôi tảo thường có hình chữ nhật (cũng có khi là dạng bể tròn) góc

được vê tròn kết hợp với hệ thống cánh khuấy. Bể có thể lớn (hoặc nhỏ) về diện tích, thể tích có

thể lên tới 1 ha x 0,3 m3, thậm chí đến 200ha x 0,3 m3. Bể nên xây cao 50 – 55 cm để đảm bảo

độ sâu mực nước từ 20 – 30 cm. Bể được xây dựng bằng vật liệu xây dựng thông thường (xi

Trang 60

măng, plastic, gạch cement hay gạch beton cement chịu kiềm). Bể có xây 1 bức tường ngăn hụt

ở giữa tạo dòng chảy lưu thông khí khi khuấy trộn. Có thể đặt 1 hay 2 máy khuấy ở các đầu để

lưu thông nước.

Khuấy, xục khí: Hệ thống nuôi tảo với qui mô lớn phải có hệ thống khuấy trộn, sục khí

nhằm thu lượng sinh khối nhiều nhất. Bể cần được khuấy và sục khí CO2 liên tục nhằm:

- Tạo sự tiếp xúc tốt hơn của tế bào tảo với dinh dưỡng, ánh sáng, CO2.

- Giữ ổn định nhiệt độ trong nước giúp tảo phát triển tốt.

- Tạo ra tốc độ dòng chảy 5 cm/s giúp tảo không bị lắng xuống đáy hoặc ở góc bể.

Mái che: Mái che là một kiểu nhà kính đơn giản có thể thiết kế với 2 mái, nóc nhọn.

Khung mái bằng thép, nhựa plastic hay bằng kính để ánh sáng đi qua được. Mái di động theo

hướng một nửa mái có thể kéo nằm song song phía dưới phần mái cố định kế bên. Mái che được

nằm ở vị trí chiếu sáng tốt nhất, thường hướng Đông-Tây có tác dụng:

- Chống sự xâm nhiễm của bụi đất, cát theo gió đưa vào.

- Bụi khói do nhiên liệu bị đốt cháy.

- Tránh các loài động vật, côn trùng rơi vào bể nuôi.

6.3.3. Các hình thức nuôi tảo

Hiện nay trên thế giới có 3 hình thức nuôi Spirulina tùy theo khả năng kinh tế và điều

kiện kỹ thuật của môi nơi.

Nuôi ở qui mô thủ công đơn giản: nuôi ở các ao tự nhiên hay ở các bể xây bằng xi

măng, thùng gỗ, nhựa. Trong trường hợp này thường không có khuấy đảo và sục khí CO2

Nuôi ở qui mô bán công nghiệp: Nuôi tảo trong các ống chất dẻo trong suốt hình chữ U,

dài hơn 20, đường kính 1,2m. Cho môi trường vào trong ống với chiều cao (khi ống nằm ngang)

khoảng 0,625m. Khí CO2 được bơm vào trong môi trường, đồng thời khối môi trường luôn được

vận chuyển tuần hoàn trong ống nhờ một máy bơm khác. Nhiệt độ môi trường 25-26oC (nhờ

năng lượng ánh sáng mặt trời)

Nuôi ở qui mô công nghiệp: sử dụng 2 hệ thống cơ bản là hệ thống kín và hệ thống hở

- Hệ kín: Tảo được nuôi trong các bể lên men bằng vật liệu là màng polyethylen trong

suốt với chiều dày khoảng 0.3 mm, chủ yếu dùng ánh sáng nhân tạo có cường độ cao và hệ

thống sục khí CO2 với cường độ tùy thuộc theo yêu cầu của quy trình công nghệ. Ưu điểm của

Trang 61

phương pháp này là không phụ thuộc vào khí hậu, thời tiết, giữ nhiệt tốt, giảm cường độ bức xạ,

điều kiện nuôi cấy được kiểm tra, khống chế chủ động do vậy năng suất cao. Nhược điểm: tốn

năng lượng nên giá thành cao (thường tăng giá thành khoảng 15%).

- Hệ hở: Hệ thống bể dài, nông hoặc bể hình tròn có guồng quay khuấy đảo không khí,

thường có 2 loại:

+ Bể với các đường chảy làm bằng bê tông

+ Đường hầm bằng đất lót bằng nhựa PVC, diện tích 0.1-0.5 ha, độ sâu từ 15-148 cm. Có

thể dùng guồng quay hoặc bơm để tạo dòng chảy thay cho guồng quay. Cần có các biện pháp

khuấy đảo thích hợp để tảo luôn được tiếp xúc với ánh sáng và không bị lắng xuống đáy. Ngày

nay nuôi tảo trong ống được ứng dụng ở một số nước trên thế giới như Đức, Mỹ. Hệ thống ống

có thể làm bằng nhựa hoặc thủy tinh, đường kính 7-10 cm.

Đối với hệ hở quá trình quang hợp của tảo gắn liền với việc sử dụng ánh sáng mặt trời.

Khi nuôi tảo trong các ống nhựa vừa đảm bảo điều chỉnh được nhiệt độ và cường độ chiếu sáng

vừa tiết kiệm diện tích.

So sánh hệ thống nuôi tảo spirulina hở và kín:

Hệ thống nuôi tảo spirulina hở Hệ thống nuôi tảo spirulina kín

- Chi phí đầu tư thấp hơn hệ thống kín

nên phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới

- Diện tích nuôi trồng lớn, chỉ nuôi

được tảo trong không gian 2 chiều.

- Nuôi trong bể dinh dưỡng không phải

bể lên men vi sinh khối (bioreactor).

- Tảo quang hợp chỉ dựa vào nguồn ánh

sáng mặt trời.

- Hệ thống chịu nhiều tác động bởi thời

tiết khí hậu, do đó việc quản lý các yếu

tố vật lý, hóa học thụ động.

- Ít trang thiết bị hiện đại hơn. Thông số

không được ấn định tự động.

- Chi phí đầu tư cao nên ít phổ biến.

-Diện tích nuôi nhỏ, có thể nuôi được tảo trong

không gian 3 chiều.

Nuôi trong bể lên men vi sinh khối, vận động

bằng máy khuấy trộn theo 3 chiều.

- Tảo quang hợp dựa vào nguồn ánh sáng nhân

tạo và tự nhiên.

- Hệ thống không chịu tác động bởi thời tiết.

Việc quản lý các yếu tố vật lý chủ động.

- Nhiều trang thiết bị hiện đại giúp quản lý chủ

động tất cả các yếu tố vật lý(ánh sáng, nhiệt

độ…), hóa học (hóa chất dùng nuôi trồng tảo),

Trang 62

- Cho năng suất thấp hơn hệ thống kín

sinh học (kiểm soát diệt những sinh gây hại cho

spirulina). Tất cả các thông số(nhiệt độ, ánh

sáng,…) đều được ấn định tự động.

- Cho năng suất cao.

6.4. Thu hồi sinh khối

Khi sinh khối đạt > 750 mg/L thì thu hoạch, và nên để sinh khối tảo đang sinh trưởng còn

lại >= 300 mg/L. Thời gian bắt đầu thu hoạch thường sau xuống giống 7 – 10 ngày, và quá trình

nuôi thu hoạch liên tục dài 3 – 4 tháng thì thu toàn bộ, làm vệ sinh hồ, nuôi mẻ mới.

Nên thu hoạch tảo vào sáng sớm vì:

+ Nhiệt độ buổi sáng mát nên việc thu hoạch dễ dàng, đỡ mệt nhọc.

+ Có nhiều thời gian để phơi khô sản phẩm.

+ Lượng protein của Spirulina thu được vào buổi sáng cao hơn những thời điểm khác

trong ngày.

+ Nên thu hoạch vào những ngày nhiều nắng để đảm bảo sinh khối tảo được phơi khô.

Có nhiều phương pháp thu sinh khối khác nhau như ly tâm, vớt, lắng kết hóa học, lắng

kết bằng điện trường, tự lắng kết… Tảo Spirulina có kích thước tương đối lớn nên thường sử

dụng phương pháp lọc. Sử dụng màng lọc nghiêng có kích thước lỗ 30-50µm được làm bằng

polyamide kết hợp với hút chân không. Có thể lọc tại ao nuôi để phục hồi nước lọc. Đây là

phương pháp lọc hiện đại cho hiệu quả thu hồi sản phẩm cao. Sau khi tách khỏi môi trường sinh

khối phải được cô đặc sơ bộ và sấy khô ngay bằng nhiều phương pháp khác nhau như sấy phun,

đông khô, sấy chân không… Vì khi tảo tươi chứa nhiều protein nên dễ bị vi khuẩn tấn công tạo

ra các sản phẩm không mong muốn trong vài giờ.

Trang 63

Quy trình công nghệ sản xuất tảo Spirulina

Sau khi thu hoặc sinh khối cần bổ sung môi trường dinh dưỡng để tiếp tục sản xuất. Bổ

sung nguồn cacbon từ không khí như CO2, thêm CO2 tinh khiết, thêm HCO3-, rỉ đường. Đường

có thể gây ra một số biến đổi của môi trường dinh dưỡng vì vậy chỉ nên sử dụng một lượng nhỏ

hơn 0,3 kg/kg và cung cấp càng đều đặn càng tốt. Ngoài ra còn cần cung cấp các chất dinh

dưỡng thiết yếu như N, P, K, S, Mg, Ca, Fe và một số nguyên tố vi lượng khác. Trong một số

trường hợp các nguyên tố vi lượng và canxi có thể không cần cung cấp vì có sẵn trong nước và

có trong thức ăn. Nếu sử dụng phân bón hóa học thì phải hòa tan được để đề phòng việc có các

kim loại nặng như thủy ngân, chì… tảo Spirulina dễ dàng hấp thụ nhưng lại bị kết dính lại.

Trang 64

CO2 hoặc

HCO3-

Chất

khoáng

Thành phẩm

Bao gói

Bể nuôi tảo chứa môi trường, pH 5,5-9Tảo

giống

Lọc

Ly tâm loại bớt nước

Sấy sinh khối

Nước Ánh

sáng

Thu hồi chất khoáng

còn lại

Nhiệt độ

(20-40oC)

Môi trường

6.5. Ứng dụng của tảo

6.6.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Spirulina được coi là nguồn dinh dưỡng số 1 của tự nhiên. Nó cung cấp đầy đủ dưỡng

chất thiết yếu cho cơ thể protein, lipid, glucid cùng với khoảng 30 nguyên tố vi lượng và hầu hết

các vitamin cần thiết. Các thành phần aa trong tảo rất cân đối, các acid béo hòa tan được các

VTM như VTM A, D làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu, hàm lượng acid linoleic

khoảng 1%. Hàm lượng VTM trong tảo rất lớn. VTM A trong tảo lớn hơn 26 lần so với cà rốt,

VTM B12 có trong tảo cao hơn 1-6 lần trong gan bò. VTM E đa số có trong hạt nảy mầm song

trong tảo cao gấp 3 lần so với lúa mì nảy mầm. Trong tảo có đầy đủ các yếu tố khoáng như Ca,

Mg, Fe, Na… đặc biệt có selenium và gemanium. Hầu hết axit béo trong tảo là axit béo không

no, đây là điều rất hiếm trong các thực phẩm tự nhiên khác. Chính nhờ giá trị dinh dưỡng cao

nên tảo được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm.

Tảo được sử dụng làm thực phẩm cho những người suy dinh dưỡng bằng cách tạo dạng

lỏng hoặc dạng hạt đưa trực tiếp vào dạ dày. Sử dụng làm thức ăn cho người cần chú ý đến cảm

quan, nên phối trộn với thực phẩm để nâng cao giá trị dinh dưỡng. Các sản phẩm của Nestle, các

loại bánh, kẹo, kem caramen, mứt nhừ, socola, mứt quả, sữa chua, thịt bằm, nước sốt …

Đối với thức ăn gia súc: Nếu sử dụng 12% tảo, lợn tăng trọng 18 – 20% sau 2 tháng sử

dụng. Nuôi gà với hàm lượng 1%, Xantophyl có trong tảo làm tăng sắc tố đỏ của lòng đỏ trứng

(tăng 1,5-2,5 lần VTM A trong đó), tăng chất lượng thịt gà, tăng tỉ lệ đẻ trứng 15-18%, tăng

trọng 10%. Spirulina như 1 chất kích thích sinh học làm tăng tỉ lệ sống, làm tốt phần sinh học

của gan và trứng gà. Nuôi cá bổ sung 5 – 10% tảo tăng tỉ lệ sống của cá bột 20 – 30%.

6.6.2. Ứng dụng trong y học

Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng Spirulina có tác dụng trong 5 vần đề sức khỏe

như sau:

- Tăng cường hệ miễn dịch

- Hỗ trợ hệ tim mạch, giảm cholesterol và hỗ trợ điều trị tiểu đường

- Chống lão hóa và ngừa ung thư

- Tăng cường khả năng tiêu hóa

- Tăng khả năng làm sạch và tiêu độc cho cơ thể

Trang 65

6.6.3. Ứng dụng trong mỹ phẩm

Spirilina có khả năng điều hòa hormon, điều hòa đường huyết giúp cơ thể khỏe mạnh, làn

da mịn màng. Đồng thời kết hợp với việc uống Spirulina, còn sử dụng làm mặt nạ cho phụ nữ

do hàm lượng các chất chống oxy hóa và vitamin cao nên rất có hiệu quả trong việc cải thiện làn

da.

Đa phần những chất chiết xuất từ tảo Spirulina phải nhập ngoại và có giá thành rất cao,

chẳng hạn bột acide amin có giá 70 UDS/kg, chất phycocyanin tinh chế dùng trong chẩn đoán

bệnh có giá 50 USD/1mg, chất provitamin A có giá thành khoảng 200 USD/kg, chất

phycocyanin thô dùng nhuộm màu dược phẩm và mỹ phẩm có giá 150 USD/kg...

CHƯƠNG VI: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN MỘT SỐ LOẠI

AXIT AMIN TỪ VSV

I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT AMIN

1. Lịch sử phát triển và tình hình sản xuất axit amin trên thế giới

Công nghệ sản xuất aa bắt đầu ở Nhật vào năm 1908. Công ty Ajinomoto đã sản xuất mì

chính từ nguyên liệu thực vật. Công nghệ sản xuất mì chính chuyển sang một giai đoạn mới khi

2 nhà khoa học người Nhật là Udaka và Kinoshita phân lập được loại vi khuẩn có khả năng sinh

tổng hợp aa vào năm 1957. Năm 1985, sản lượng aa trên thế giới là 460.000 tấn trong đó

370.000 tấn là glutamat natri và 7.000 tấn L-Lysine. Năm 1996 sản lượng aa là 1.650.000 tấn

trong đó 1.000.000 tấn là glutamat natri và 250.000 tấn là L-Lysine. Năm 2003 sản lượng aa hơn

2.448.000 tấn trong đó 1.200.000 tấn L-glutmic và 600.000 tấn L-Lysine.

Trong 3 thập kỷ qua, tổng sản lượng aa tăng lên đáng kể, tốc độ tăng bình quân hàng năm

là 5-10%. Trong vòng 10 năm sản lượng tăng gấp gần 2 lần, riêng L-Lysine tăng gấp gần 20 lần.

Sự gia tăng liên tục các sản phẩm aa là do:

- Phân lập được các chủng có khả năng tổng hợp aa, đưa kỹ thuật ADN tái tổ hợp, kỹ

thuật dung hợp tế bào trần và các phương pháp gây đột biến để tạo những chủng VSV

có hoạt tính cao.

- Kết hợp phương pháp tổng hợp hóa học, các phản ứng enzym và VSV

Trang 66

- Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền

- Tối ưu hóa các điều kiện ở quy mô công nghiệp.

2. Ứng dụng các axit amin

Con người cần aa để tồn tại và phát triển. Nhu cầu các aa không thay thế đối với con

người tính theo g/ngày

Axit amin được ứng dụng rộng rãi nhất là acid glutamic, muối của nó là Mono Sodium

Glutamat (Mì chính) là chất tăng vị cho thức ăn.

Axit amin có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, khoảng 65% các aa được ứng dụng

trong công nghiệp thực phẩm, 31% trong chăn nuôi, 4% trong y tế và mỹ phẩm và là nguyên

liệu cho công nghiệp hóa học. Trong công nghiệp thực phẩm aa được sử dụng riêng hoặc kết

hợp để tăng vị. Khả năng làm tăng vị của glutamat natri đã được ứng dụng trong nhiều sản phẩm

thực phẩm hay khi kết hợp L-histidin với L-tryptophan có tác dụng chống oxi hóa được dùng

giữ cho sữa bột không hỏng. Bổ sung aa trực tiếp vào thức ăn cho người có ý nghĩa rất quan

trọng về mặt dinh dưỡng.

Aspartame là sản phẩm chính trong công nghiệp sản xuất đồ uống. Loại chất tạo ngọt này

có độ ngọt cao gấp 200 lần so với đường saccarose nhưng lại chứa ít năng lượng. Nguyên liệu

để sản xuất aspartame là L-phenylalanin và -aspartyl đều là sản phẩm của công nghệ vi sinh.

Nhiều aa được sử dụng trong y học đặc biệt để chế thuốc điều trị sau phẫu thuật.

Trong công nghiệp hóa học aa được sử dụng như nguyên liệu sản xuất polymer như sợi

polyalanine và nhựa lysine-isocyanate. Poly-γ-metyl glutamat được sử dụng như lớp tráng bề

mặt trong công nghiệp sản xuất da, còn các dẫn xuất N-acyl của một số aa được sử dụng để sản

xuất đồ gỗ mỹ nghệ và làm các chất hoạt động bề mặt

3. Các phương pháp sản xuất axit amin

3.1. Phương pháp thủy phân bằng axit, kiềm hoặc enzym

Phương pháp này có thể sử dụng phế thải của công nghiệp chế biến thịt, cá, lòng trắng

trứng, casein, khô đậu tương, khô lạc, nấm men…

Đầu tiên người ta thủy phân nguồn nguyên liệu có chứa protein sau đó làm sạch nhiều

bước để thu aa. Nguồn nghuyên liệu này không nhiều cho nên hướng sản xuất này bị hạn chế

Trang 67

Có 2 phương pháp thủy phân: Thủy phân bằng hóa chất, nếu sử dụng axit thì phần lớn

tryptophan bị phá hủy cystein bị oxi hóa thành xistin, xerin và treonin thì giảm đáng kể. Khi sử

dụng kiềm thì xerin và acginin bị phá hủy hoàn toàn. Thủy phân bằng enzym thì các aa không bị

phá hủy nhưng trước hết cần chuyển protein sang dạng hòa tan tuy nhiên các phản ứng không

triệt để nên thu được sản phẩm thủy phân là hỗn hợp các aa và peptid. Hiệu suất thủy phân đạt

50%. Thường sử dụng phương pháp này để thu Cystein, xistin, lơxin, asparagin và tyrosin.

3.2. Phương pháp tổng hợp hóa học

Phương pháp này rẻ hơn so với phương pháp sử dụng VSV nhưng có hạn chế là tạo ra

hỗn hợp đồng phân quang học dạng D- và dạng L-aa tuy nhiên chỉ có dạng L-aa là có giá trị

dinh dưỡng đối với người và động vật (trừ methionin).

Trong các phương pháp hóa học phổ biến nhất là xianit hóa aldehyt. Từ aldehyt tương

ứng có thể thu được các aa quan trọng như glycine, alanin, lơxin, acid glutamic, methionin

3.3. Phương pháp sử dụng VSV

Phương pháp 1: Bằng con đường lên men trực tiếp có sử dụng nguồn cacbon khác nhau

như glucose, fructose, rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột. Đây là phương pháp nhiều ưu thế nhất

hiện nay vì nguyên liệu đơn giản, rẻ tiền, thiết bị đơn giản.

Phương pháp 2: Sử dụng enzym như enzym axylase của A. oryzae để cắt lựa chọn các aa

dạng D, L đã được tổng hợp bằng phương pháp hóa học để giải phóng các aa dạng D và L

3.4. Chủng vi sinh vật sinh axit amin

Rất dễ thu được các VSV sản sinh ra aa trong tự nhiên nhưng rất khó phân lập được

những chủng tiết ra nhiều aa để sản xuất trên quy mô công nghiệp. Hiện nay các nhà khoa học

phải tạo các chủng đột biến để sản xuất thừa aa.

II. CNSX L-LYSINE1. Tình hình sản xuất Lysine trên thế giới

Lysine là aa không thay thể cần thiết bổ sung vào thức ăn cho người và vật nuôi đáp ứng

nhu cầu của cơ thể. Đặc biệt các loại thức ăn từ ngô, lúa mì hay đại mạch nghèo lysine. Năm

1983 sản lượng lysine trên toàn thế giới là 70.000 tấn, đến năm 2000 đã tăng lên 600.000 tấn,

Trang 68

sản lượng này tăng 7-10% mỗi năm chủ yếu được sản xuất bởi công ty ADM (Mỹ), Ajinomoto

và Kyowa Hakko (Nhật), BASF (Đức), CJ (Hàn quốc), Eurolysine (Pháp) và Degussa (Đức)

Lysine được sản xuất bằng con đường lên men sử dụng vi khuẩn Corynebacterium

glutamicum trong vòng 40 năm nay. Việc sản xuất nhờ loại vi khuẩn này bắt đầu từ năm 1958 ở

Nhật, đây là loai vi khuẩn hiếu khí, gram dương, trực khuẩn, không chuyển động, không sinh

bào tử

Ở VN nhu cầu sử dụng lysine cho người và gia súc gia tăng nhanh chóng, tuy nhiên hàng

năm chúng ta vẫn phải nhập khẩu 100% lysine với số lượng lớn. Điều này khiến giá thành các

sản phẩm chứa lysine rất cao. Vì vậy việc nghiên cứu và triển khai công nghệ sản xuất lysine

đang là một trong những vấn đề cấp bách ở nước ta nhằm giảm thiểu sự thiếu hụt lysien trong

khẩu phần ăn và hạ giá thành sản phẩm.

2. Tính chất và vai trò ứng dụng của Lysine

Lysine có công thức phân tử là C6H14N2O2 (2,6-diminohexanoic acid) là aa thuộc họ

aspartat có 2 nhóm amin và 1 nhóm carboxyl. Lysine dễ tan trong nước, trong acid và kiềm, khó

tan trong cồn và không tan trong ete. Bị phân hủy ở 224-225oC. Giống như những aa không thay

thế khác, lysine có thể tham gia phản ứng chuyển amin để tạo thành các aa khác nhưng không có

khả năng tự tái sinh nghĩa là khi bị phân hủy thì không có khả năng tổng hợp trở lại. Vì vậy loại

aa này phải cung cấp cho người và động vật dưới dạng thức ăn.

Trong cơ thể, lysine góp phần xây dựng tế bào, có vai trò quan trọng trong quá trình

chuyển hóa các chất. Lysine giữ vai trò sống còn trong quá trình tổng hợp protein. Nó là chìa

khóa trong việc sản xuất các enzym, hoocmon và các kháng thể.

Lysine giúp ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hóa hấp thu tối đa chất dinh dưỡng. Giúp cơ

thể tăng cường hấp thu canxi giúp tăng cường chiều cao, ngăn ngừa còi xương ở trẻ và chống

loãng xương ở người lớn tuổi.

Không chỉ có giá trị sinh học mà lysine còn thực hiện nhiều chức năng sinh hóa khác: có

tác dụng điều khiển tiết enzym dịch vị, góp phần vận chuyển canxi trong tế bào, làm cân bằng

nitơ trong cơ thể. Thiếu lysine có thể sẽ không hoạt động bình thường dẫn đến bệnh tật, đặc biệt

đối với trẻ em. Nhu cầu của người lớn: 4g/ngày tương đương 1,5 kg gạo, 2 kg ngô, 14 kg khoai

lang tươi. Ở Nhật người ta đưa lysine vào gạo dạng hạt (gạo giàu lysine) cho trẻ em từ năm 1965

Trang 69

và nhận thấy đưa 0.2% lysine vào thức ăn tốt hơn đưa 6% bột cá vào thức ăn. Trong y học lysine

rất cần thiết vì nó ảnh hưởng đến việc tổng hợp hemoglobin, nó đặc biệt quan trọng khi trong

khẩu phần ăn thiếu kali vì khi đó lysine trở thành cation duy trì sự cân bằng ion trong tế bào của

bắp thịt, lysine cần thiết để duy trì trạng thái bình thường của hệ thần kinh, nếu thiếu lysine gây

buồn nôn và chóng mặt. Nhu cầu về lysine đối với gia súc và gia cầm rất cao. Trong chăn nuôi

bổ sung lysine có tác dụng tăng trọng, hiệu quả kinh tế cao.Nếu khẩu phần thức ăn có 0.9%

lysine thì tăng 28.9% trọng lượng gà, lysine đạt 0.72% thì trọng lượng bê tăng 13.6%. Đưa 2kg

lysine vào 1 tấn thức ăn thì giảm chi phí thức ăn 7.6%. Đối với lợn nếu thêm 1 kg lysine vào 1

tấn thức ăn sẽ tăng trung bình 22%. Trung bình đối với gà và lợn cần 4,2-4,5% tổng số protein

trong khẩu phần ăn. Nếu thiếu lysine hiệu suất chuyển hóa thức ăn thấp, lợn bị giảm khối lượng,

lười ăn, da khô, rụng lông. Việc sử dụng lysine trong công nghiệp bánh mỳ làm tăng giá trị sinh

học của sản phẩm và làm tăng giá trị chất lượng. Trong chăn nuôi, sử dụng lysine thô có lợi hơn

lysine tinh khiết vì có chứa các VTM B1, B2, PP.

Hàm lượng lysine trong một số sản phẩm thực phẩm

Thực phẩm Hàm lượng lysine (%) Thực phẩm Hàm lượng lysine (%)

Ngô 0,21 Bột đậu tương 2,90

Lúa mạch 0,50 Nấm men khô 3,40

Đại mạch 0,40 Bột sữa gầy 2,50

Lúa mỳ 0,60 Thịt 2,60

3. Công nghệ sản xuất lysine từ rỉ đường

3.1. Chủng Corynebacterium glutamicum

Chủng Corynebacterium glutamicum tế bào hình cầu, ovan hay trực khuẩn ngắn, hiếu

khí, gram dương, không chuyển động và không sinh bào tử, cần biotin để sinh trưởng và phát

triển. Thông thường đây là những chủng tổng hợp acid glutamic đã được đột biến hay những

chủng khuyết dưỡng homoserine, methionine-threonine. Những chủng vi khuẩn này có khả năng

phát triển tốt trong môi trường chứa nhiều cacbon và ít nitơ. Trong môi trường này nó phá vỡ sự

cân bằng trao đổi chất là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành aa với số lượng lớn, vượt xa so với

Trang 70

nhu cầu nội tại của tế bào và tích lũy ở tế bào hay thoát ra ngoài môi trường. Hiện tượng này

được gọi là siêu tổng hợp aa của VSV.

3.2. Nguyên liệu

- Rỉ đường (giống phần CNSX nấm men từ rỉ đường)

- Nguồn nitơ: Thường sử dụng các loại muối chứa NH4+ hay NH3 hoặc ure làm nguồn

cung cấp nitơ. Trong công nghiệp thường sử dụng dung dịch NH3 hoặc ure.

- Muối khoáng: Thường sử dụng nhiều nhất là các loại muối phospho với nồng độ

phospho thích hợp khoảng 0,008 – 0,02 mg/l. Ngoài ra còn bổ sung một số muối khác và các

chất kích thích sinh trưởng như biotin, VTM B1... Trong quá trình tổng hợp lysine cần biotin để

kích thích vi khuẩn sinh trưởng và tích lũy lysine. Lượng biotin thích hợp là 15 – 20 µg/l, nếu

nồng độ giảm xuống 1 - 4 µg/l thì VSV tổng hợp acid glutamic, nếu tăng đến 25 µg/l thì tạo

thành nhiều acid lactic.

Thành phần môi trường lên men:

Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng

Rỉ đường 12-20 % Thiamine 200 µg/l

(NH4)2SO4 24 g/l Treonine 0.2-0.8 g/l

KH2PO4 0.5 g/l Methionin 0.15-0.25 g/l

MgSO4 0.4 g/l Biotin 15-20 µg/l

Trang 71

3.3. Quy trình công nghệ

Trang 72

3.3.1. Nhân giống

Trang 73

Rỉ đường Acid hóa

Lysine đặc

Lysine bột

Pha dịch lên men

Lên men pH, 7.4, thời

gian 72h, 30-32oC

Cô đặc

Sấy phun

Đóng gói

Tách cặn

Trộn phụ gia

Thanh trùng

Ly tâmCô đặc

Tạo hạt

Nghiền

Kết tinh

Lysine có chất

phụ gia

Cô chân không

80-90%

Lysin tinh khiết

97-98%, hàm

ẩm 0.5%Đóng gói Nghiền

Sấy

Đóng gói

Sấy

Phần hấp phụ

Trao đổi ion

Acid hóa

Giống

Tẩy mầu bằng

than hoạt tính

- Giống cấp 1: Glucose 20g, pepton 10g, cao thịt 5g, NaCl 2,5g, nước 1 lit.

- Giống cấp 2: Rỉ đường 50g, (NH4)2SO4 20g, cao ngô 50g, CaCO3 10g, 1L nước

- Giống sản xuất: Rỉ đường 200g, dịch thủy phân protein đậu tương 18g, 1L nước

3.3.2. Lên men

Thời gian lên men 60-72 giờ, tốc độ khuấy 200 v/p, nhiệt độ 28oC – 30oC, tỉ lệ tiếp giống

5%, pH tối thích 7.0-7.6, thể tích thùng lên men 50-100 m3, hệ số sử dụng 0.65-0.75.

3.3.3. Tách và thu sản phẩm

Sau khi lên men nồng độ chất khô trong dung dịch lên men khoảng 10 – 13%. Dung dịch

này rất dễ bị hỏng do quá trình tự phân của vi khuẩn và bị các vi sinhh vật khác xâm nhiễm. Vì

vậy phải đem dịch lên men đi xử lý ngay, tuyd theo yêu cầu sử dụng người ta sẽ sản xuất ra các

chế phẩm lysine khác nhau.

- Lysine đặc: Bơm dịch lên men vào nồi cô đặc chân không tiến hành cô dịch lên men

có cả tế bào cho đến khi nồng độ chất khô trong dịch đạt 35-40% (dạng sệt). Sản phẩm có màu

đen, có mùi thơm đặc trưng, bảo quản được 3-4 tháng. Thành phần: lysine 15-20%, protein 15-

17%, betain 10-13%, tro 20-25% và các thành phần dinh dưỡng khác.

- Lysine bột: cần cô đặc dịch lên men có cả tế bào sau đó sấy phun bằng khí nóng

250oC tạo sản phẩm dang bột. Sản phẩm này có thành phần: lysine 15-20%, protein 15-17%, aa

khác 14%, sản phẩm dễ hút ẩm.

- Lysine có chất phụ gia: Có thể sử dung chất phụ gia là cám mỳ hoặc cám gạo với mục

đích làm giảm hao hụt trong quá trình sấy và giảm khả năng hút ẩm của sản phẩm. Sau khi cô

đặc đến độ ẩm 40%, trộn thêm chất phụ gia để có độ ẩm 30%, tạo hạt rồi sấy trong không khí

nóng ở 110-120oC, vận tốc 6-7 m/s, sau khi sấy làm nguội đến 40oC trong 3 phút sau đó nghiền

tạo sản phẩm bột. Hàm lượng lysine đạt 7-10%.

- Lysine tinh khiết: thường sử dụng phương pháp trao đổi ion với các hạt nhựa dạng

cationit. Dịch lên men sau khi ly tâm 16.000 v/p để loại tế bào VSV và các thành phần không

tan. Axit hóa toàn bộ khối dịch bằng HCl hoặc H2SO4 sau đó cho qua cột trao đổi ion. Lysine

được giữ lại trên cột và được tách ra bằng phản ứng rửa giải bằng dung dịch hydroxit amon.

Dịch sau rửa giải chứa 80-90% lysine được đun ở 80oC để đuổi NH3. Dùng HCl điều chỉnh pH

về 4.5-5.0 rồi cô đặc ở 60oC, nồng độ lysine đạt 30-50%. Dưới tác dụng của HCl lysine chuyển

Trang 74

sang dạng monochlohydrat lysine. Tiến hành làm lạnh đến nhiệt độ 10-12oC khi đó xuất hiện

những tinh thể màu vàng nhạt chính là lysine.HCl kết tinh. Ly tâm thu tinh thể, các tinh thể này

được rửa sạch bằng ethanol và đem sấy đến khi độ ẩm đạt 0.5-1% bằng không khí nóng ở 120oC

không quá 80 giây hoặc 100oC không quá 100 giây. Đặc điểm của sản phẩm tinh khiết là: 97%

lysine.HCl, độ ẩm nhỏ hơn 0.5%, khối lượng riêng 525-650 g/l và độ hòa tan 642 g/l.

4. Ứng dụng của lysine

4.1. Ứng dụng bổ sung vào thực phẩm dinh dưỡng

Lysine tinh khiết được ứng dụng rộng rãi trong nhiều loại thực phẩm để bổ sung nguồn

lysine thiếu hụt cho con người. Ở Nhật từ lâu người ta đã sản xuất gạo bổ sung lysine àm thức

ăn cho trẻ em. Ngày nay hàng loạt các loại thực phẩm được bổ sung lysine như bột dinh dưỡng,

cháo dinh dưỡng, các loại nước uống, sữa ... có bổ sung lysine được sử dụng rộng rãi đặc biệt

cho người già và trẻ em.

4.2. Ứng dụng lysine trong y học

Lysine là thành phần của nhiều loại protein, là yếu tố quan trọng duy trì hệ miễn dịch,

kích thích tiết dịch vị. Ngoài ra lysine còn có chức năng ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây

bệnh mụn rộp nên thường được ứng dụng hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến mụn rộp

(herpes) và sử dụng kích thích cơ thể sản sinh hoormon tăng trưởng giúp trẻ phát triển bình

thường ...

Lysine được chỉ định dùng cho trẻ em và thanh thiều niên thời kỳ tăng trưởng, suy dinh

dưỡng, những người ăn kiêng, người bệnh, sau phẫu thuật, trong giai đoạn dưỡng bệnh, bà mẹ

có thai và cho con bú ...

4.3. Ứng dụng lysine trong dược học

Lysine giúp trẻ ăn ngon, gia tăng chuyển hóa, hấp thu tối đa các chất dinh dưỡng nên

thường được bổ sung vào các loại thuốc hoặc siro cho trẻ. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều

thuốc điều trị biếng ăn tuy nhiên phải được sử dụng một cách hợp lý và đúng chỉ định.

Lysine kết hợp với một số chất như Glycoprotein, menthol, biotin, khoáng chất đa, vi

lượng ... giúp cân bằng độ ẩm tự nhiên. Bổ sung vào dầu gội đầu có tác dụng cân bằng độ ẩm tự

nhiên, nuôi dưỡng bảo vệ giúp năng tóc hoạt động hiệu quả, tạo điều kiện cho tóc mọc trở lại,

phục hồi tóc khỏe mạnh.

Trang 75

Lysine còn được bổ sung vào thuốc giúp cân bằng nội tiết cho phụ nữ đặc biệt là phụ nữ

tiền mãn kinh.

4.4. Ứng dụng lysine trong hóa mỹ phẩm

Lysine tham gia vào thành phần các mỹ phẩm làm đẹp da giúp duy trì độ ẩm tự nhiên,

làm chậm xuất hiện nếp nhăn, làm mờ nếp nhăn, cải thiện sẹo thâm, sẹo lõm, hạn chế sự xuất

hiện các sắc tố trên da. Duy trì độ pH của da, phục hồi da sau các tổn thương do nắng, dị ứng

thuốc, tăng khả năng chống lại tác dụng bất lợi của ngoại cảnh của da, đặc biệt là bức xạ.

4.5. Ứng dụng lysine trong thức ăn chăn nuôi

Các loại lysine đặc, lysine bột và lysine có chất phụ gia được bổ sung vào thức ăn cho gia

súc, gia cầm để tăng cường khả năng hấp thụ thức ăn cũng như tăng trưởng của chúng mang lại

hiệu quả kinh tế cao.

III. CNSX AXIT GLUTAMIC1. Tính chất, vai trò và ứng dụng của axit glutamic

Acid glutamic (Glu) là 1 aa gồm 2 nhóm cacboxyl và một nhóm amin, có công thức tổng

quát C5H9O4N, tan tốt trong nước, không tan trong cồn và một số dung môi, nhiệt độ phân hủy

247-249oC.

Acid glutamic tuy không phải là aa không thay thế nhưng nó lại có vai trò hết sức quan

trọng cho sự sống. Nó tham gia vào quá trình trao đổi chất của người và động vật. Nó đảm

nhiệm chức năng tổng hợp lên các aa khác như alanin, leuxin, cystein, prolin, ... tham gia phản

ứng chuyển amin giúp cơ thể tiêu hóa nhóm amin và tách NH3 ra khỏi cơ thể (giải độc cho cơ

thể). Nó chiếm phần lớn thành phần protid và phần xám của vỏ não đóng vai trò quan trọng

trong các biến đổi sinh hóa ở hệ thần kinh trung ương.

Trong y học sử dụng acid glutamic trong trường hợp suy nhược hệ thần kinh nặng, mỏi

mệt, mất trí nhớ, bệnh teo cơ vì nó có mặt trong thành phần của mọi sợi cơ, chữa bệnh chậm

phát triển trí óc ở trẻ em, bệnh bại liệt ... Ngoài ra acid glutamic còn làm nguyên liệu khởi đầu

cho việc tổng hợp một số hóa chất quan trọng: N-acetyl glutamat là chất hoạt động bề mặt, vi

sinh vật có thể phân giải được (ít ô nhiễm môi trường), ít ăn da, được dùng rộng rãi trong công

nghiệp mỹ phẩm, xà phòng và dầu gội đầu.

Trang 76

Muối của acid glutamic là glutamat natri là một gia vị an toàn. Tại Mỹ, mì chính được

xem như một hành phần thực phẩm phổ biến. Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ

(FDA) đã xếp mì chính vào anh sách các chất an toàn. Mì chính được chính phủ các nước trên

khắp thế giới cho phép sử dụng. Năm 1987 hội đồng chuyên gia Phụ gia thực phẩm (JECFA)

của tổ chức lương thực thế giới (FAO) và tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã xác nhận mì chính an

toàn và quyết định không cần thiết phải quy định cụ thể lượng mì chính sử dụng hàng ngày. Đến

năm 1991 hội đồng các nhà khoa học về thực phẩm Châu Âu (SCF) đã tái xác nhận tính an toàn

của mì chính. Trong báo cáo gửi FDA năm 1995 dựa trên việc xem xét toàn diện các tư liệu về

mì chính, Hội đồng thực nghiệm sinh học liên bang Mỹ (FASEB) đã kết luận rằng không có sự

khác biệt nào giữa glutamat tự do có trong tự nhiên với glutamat sản xuất công nghiệp như trong

mì chính.

Tại Việt Nam, từ mấy chục năm qua, mì chính là gia vị được sử dụng rộng rãi trong hầu

hết mọi gia đình nằm trong danh mục đã được Bộ y tế cho phép sử dụng.

Một nhà khoa học người Nhật là Ikeda trong một lần tình cờ ăn rong biển nhận thấy vị

thức ăn ngon hơn. Ông tiến hành nghiên cứu các hoạt chất trong rong biển và đã tách được axit

glutamic rồi chuyển thành glutamat natri. Ikeda đã gọi bạn hùn vốn lập công ty sản xuất

glutamat natri với tên gọi là Ajinomoto (theo tiếng Nhật là tính chất của vị ngọt). Năm 1908 axit

glutamic lần đầu tiên được sản xuất ở Nhật bởi công ty Ajinomoto. ) bằng phương pháp hóa học

với giá thành khi đó khoảng 3,5 usd/kg. Năm 1956 các quy trình lên men dùng tinh bột làm

nguyên liệu ban đầu phát triển và đến năm 1964 người ta sử dụng rỉ đường để sản xuất mì chính

nên giá thành chỉ còn khoảng 0,9 usd/kg. Ngày nay hầu hết các nước sản xuất mì chính đều sử

dụng phương pháp lên men từ vi sinh vật với nguồn nguyên liệu rẻ tiền trên quy mô công nghiệp

khiến giá thành mì chính rẻ đi rất nhiều.

2. Các phương pháp sản xuất axit glutamic

Phương pháp tổng hợp hóa học: Ứng dụng các phản ứng hóa học để tổng hợp ra acid

glutamic và các aa khác từ khí thải của các ngành công nghiệp dầu hỏa hay các ngành khác. Ưu

điểm là có thể sử dụng nguồn nguyên liệu không phải thực phẩm và tận dụng được các phế liệu

của công nghiệp dầu hỏa. Nhược điểm: Chỉ thực hiện được ở các nước có công nghiệp dầu hỏa

Trang 77

phát triển và yêu cầu kỹ thuật cao. Mặt khác sản phẩm tạo thành cả dạng D và dạng L acid

glutamic nên quá trình tách rất phức tạp dẫn đến giá thành cao.

Phương pháp hóa giải: dùng acid để thủy phân các nguồn giàu protein thành hỗn hợp các

aa, sau đó tách acid glutamic ra khỏi hỗn hợp đó. Gluten của bột mì được thủy phân bằng HCl

để giải phòng ra tất cả các aa ở 150oC. Các chất cặn bã sẽ được lọc, dịch lọc được cô đặc và giữ

ở nhiệt độ thấp để giảm độ hòa tan của chất tan, từ đó các hạt tinh thể hydroclorat glutamat quá

bão hòa dần dần sẽ được tạo thành. Những hạt tinh thể này sẽ được lọc, tách riêng và sau đó

được hòa tan trong nước. Dung dịch này sẽ được trung hòa bằng Na2CO3 cho tới khi pH = 3,2

(pH đẳng điện). Ở pH này tinh thể acid glutamic được kết tinh và tách ra khỏi dung dịch bằng

phương pháp li tâm. Sau đó có thể hòa tan và kết tinh lần 2 đồng thời xử lý mầu bằng than hoạt

tính. Hiệu suất thu hồi mì chính khoảng 15 – 25% khi sử dụng bột mì. Ưu điểm là khống chế

được quy trình sản xuất ổn định. Nhược điểm là cần nguồn nguyên liệu có hàm lượng protein

cao, giá sản phẩm thường cao cần dùng thiết bị chịu nhiệt và hóa chất để thủy phân nên ảnh

hưởng đến sức khỏe người lao động (hơi clo độc hại với công nhân và phá hủy nhà xưởng), hiệu

suất thấp.

Phương pháp lên men nhờ vi sinh vật: Ưu điểm là hiệu quả kinh tế cao hơn do sử dụng

được nguồn nguyên liệu rẻ tiền và hiệu suất cao. Từ 100 kg bột mỳ thủy phân bằng HCl cho ra

được 3-3,5 kg mỳ chính trong khi từ 100 kg bột (mỳ, ngô, khoai, sắn) sản xuất bằng phương

pháp lên men thu được 40-50 kg mỳ chính.

3. Công nghệ sản xuất axit glutamic

a. Chủng giống

Những chủng đầu tiên được sử dụng tại Nhật thuộc loài Micrococcus glutamicus với hiệu

suất lên men 30 g/l, ngày nay đạt 40-50 g/l, cao nhất là 100 g/l, hiệu suất chuyển hóa 40-60%.

Sau nhiều năm liên tục nghiên cứu các nhà khoa học đã tạo ra hàng loạt chủng VSV quan

trọng có khả năng sinh tiổng hợp lượng lớn axit glutamic từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ

kiếm. Ngày nay nhiều chủng đột biến có lợi đã được tạo ra như những chủng kháng kháng sinh

(không cần phải thanh trùng môi trường quá cần thận vì chỉ có 1 chủng duy nhất tồn tại trên môi

trường có kháng sinh, dễ dàng tách chiết sản phẩm), các chủng đột biến có khả năng chống chịu

Trang 78

với phage, các chủng có khả năng sinh trưởng trên môi trường giàu biotin mà không cần bổ sung

chất kháng biotin ...

Kinoshita và cộng sự đã thử nghiệm trên 175 chủng nấm mốc, 468 chủng nấm men, 372

chủng xạ khuẩn, 650 chủng vi khuẩn để lên men acid glutamic trong đó nấm mốc có 10%, vi

khuẩn 20%, xạ khuẩn 30%.

Các chủng vi sinh vật thường được sử dụng sản xuất acid glutamic là: Corynebacterium

glutamicum (được sử dụng phổ biến nhất), C. lilium, Brevibacterium lactofermemtum, B.

flavum, B. glutamicum, Bacillus mesenterium, Bacillus circulans ...

Đặc điểm của các giống VSV sinh axit glutamic: Tế bào hình cầu, ovan hoặc hình que và

không có tiêm mao (chuyển động bằng cách khi đồng hóa đường tạo thành CO2 bám quanh mình

làm nổi lên, khi nổi lên CO2 bị phá hủy lại chìm xuống). pH thích hợp 7-8, luôn luôn phải sục

khí oxi, cần cung cấp oxi 40-80 mg/l.phút. Nếu thừa oxi thì sinh nhiều tiền chất -cetoglutaric

nên hiệu suất lên men kém. Nếu thiếu oxi thì tốc độ sinh trưởng chậm, tạo thành ít acid glutamic

mà tạo nhiều acid lactic. Chất kích thích sinh trưởng như biotin có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu

suất sinh tổng hợp axit glutamic. Nếu thiếu biotin VSV phát triển kém, sản phẩm tạo ra ít. Nếu

thừa biotin VSV phat triển quá nhanh nhưng lại không tích tụ acid glutamic.

Hiện nay người ta thường sử dụng các chủng đột biến để nâng cao hiệu suất sinh tổng

hợp axit glutamic. Đa phần các chủng VSV này có nhiệt độ tối ưu ở 30-30oC

b. Nguyên liệu

- Nguồn cacbon: cung cấp vật chất cho VSV sinh trưởng và hình thành bộ khung Axit

glutamic. Có nhiều nguồn cacbon có thể sử dụng để lên men. Trong số các loại đường

thì glucose và saccharose được sử dụng nhiều nhất. Trong số các nguồn nguyên liệu

không tinh khiết thường sử dụng rỉ dường mía, rỉ đường củ cải và dịch thủy phân tinh

bột. Tùy thuộc vào nguồn cacbon, chủng VSV người ta thu được hàm lượng axit

glutamic khác nhau.

Trang 79

Nguồn cacbon và khả năng tổng hợp acid glutamic của một số chủng VSV

Nguồn cacbon Vi sinh vật Hàm lượng A. Glutamic (g/l)

Rỉ đường củ cải Corynebacterium glutamicum > 100

Glucose Brevibacterium divaricatum 100

Acetat Brevibacterium flavum 80-98

Ethanol Bacillus sp 59

n-alcan Arthrobacter parafineus 62

Methanol Methylomonas methylovora M12-4 7

- Nồng độ cacbon ảnh hưởng lớn đến hiệu suất sinh tổng hợp axit glutamic. Nồng độ

cacbon thích hợp là 10 – 21%, nếu vượt nồng độ cho phép thì hiệu suất lên men giảm.

Ngoài ra có thể kết hợp 2 nguồn cacbon khác nhau tùy thuộc vào chủng giống. Khi sử

dụng rỉ đường làm nguồn nguyên liệu thì thường phải bổ dung thêm các chất kháng

biotin như penicilin, các chất béo no từ C14 – C18 vì trong rỉ đường rất giàu biotin làm

VSV phát triển mạnh làm thành tế bào VSV dày lên khiến axit glutamic không thể

thấm ra ngoài. Penicilin ức chế quá trình tổng hợp màng làm cho màng tế bào phát

triển không trọn vẹn giúp axit glutamic thấm ra ngoài.

- Nguồn nitơ: Nitơ cần thiết cho quá trình tổng hợp protein trong tế bào và chiếm tới

9,5% trọng lượng phân tử axit glutamic. Chủ yếu sử dụng các loại muối NH4+ như:

NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4H2SO4, (NH4)2HPO4, NH4OH, hay khí NH3 hoặc ure làm

nguồn cung cấp nitơ. Trong công nghiệp người ta thường dùng NH3 dưới dạng nước

hoặc khí ure tuy nhiên phải chú ý nồng độ ban đầu nếu quá cao sẽ ức chế sự phát triển

của VSV nên thường phải bổ sung nguồn nitơ từ từ vào môi trường.

- Các muối vô cơ khác: Các ion vô cơ cần cho quá trình sinh trưởng, tích lũy axit

glutamic, làm tăng khả năng phosphoryl hóa hiếu khí, tăng sự đồng hóa axetat và làm

tăng hiệu suất lên men: K+, Mg2+, Fe2+, Mn2+, PO43-, SO4

2-, Cu2+.

- Các chất kích thích sinh trưởng: chất quan trọng nhất là biotin, nồng độ tùy thuộc vào

từng giống, hàm lượng phổ biến khoảng 2-5 µg/l. Khi đủ biotin vi khuẩn sinh trưởng

vừa phải, diễn biến lên men êm dịu và lượng axit glutamic tạo thành nhiều, thừa

Trang 80

biotin vi khuẩn sinh trưởng mạnh mẽ, tiêu hao đường nhanh, sinh rất ít axit glutamic

mà chủ yếu là sinh axit lactic, succinic, aspactic. Ngoài biotin còn phải bổ sung acid

béo và các chất hoạt động bề mặt có tác dụng kích thích sự tiết acid glutamic vào môi

trường. Aa như cystein, xistin, histidin, leuxin trong đó ảnh hưởng nhiều nhất là

cystein và xistin do có chứa nhóm –SH là nhóm hoạt hóa của enzym glutamat

dehydrogenase. VTM B1 là nhân tố tác động lên sự hình thành tiền chất của acid

glutamic.

c. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

- pH: pH tối ưu cho vi khuẩn sinh tổng hợp axit glutamic là trung tình hoặc hơi kiềm,

tốt nhất từ 6 đến 8. Trong quá trình lên men pH của dịch lên men thường giảm do

lương axit glutamic sinh ra. Vì vậy phải bổ sung các muối NH4 liên tục để ổn định pH

môi trường và cung cấp nguồn nitơ cho VSV.

- Nhiệt độ: Đa số vi khuẩn sinh tổng hợp axit glutamic sinh trưởng tốt ở 30 – 30oC

- Thông gió và khuấy trộn: duy trì nồng độ oxy hòa tan, khống chế nồng độ CO 2 sinh

ra, tạo sự tiếp xúc tốt giữa VSV và môi trường, điều hòa nhiệt độ môi trường nuôi

cấy. Cần cung cấp oxy 40-80 mg/l.phút. Nếu thừa oxi thì sự sinh trưởng và tiêu hao

đường bị ức chế nên chỉ một lượng nhỏ axit glutamic được tạo thành mà thay vào đó

là tiền chất -cetoglutaric nên hiệu suất lên men kém. Nếu thiếu oxi thì tốc độ sinh

trưởng chậm, thời gian tổng hợp axit glutamic kém, tạo thành ít acid glutamic mà tạo

nhiều acid lactic, axit sucxinic

- Thực khuẩn thể: là yếu tố gây hại rất lớn cho vi khuẩn. Để an toàn cho sản xuất người

ta cho vào môi trường chất chống thực khuẩn thể (Acid citric, oxalic, tri hoặc tetra-

polyphosphat) để tạo khả năng thích nghi cho vi khuẩn đồng thời tiến hành luân canh

giống 2 – 3 tháng 1 lần.

- Dầu phá bọt: Sự có mặt của dầu phá bọt trong môi trường có thể làm giảm khả năng

sinh trưởng và phát triển của VSV. Vì vậy chỉ bổ sung một lượng dầu phá bọt vừa đủ

khi bọt nhỏ, mịn, dai (khi bọt to, xốp và dễ vỡ thì chưa cần bổ sung dầu).

Trang 81

d. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất axit glutamic

* Quá trình lên men: thường được chia làm 3 giai đoạn

- Giai đoạn đầu: 8-12 giờ gọi là giai đoạn sinh khối. Giai đoạn này các chất dinh

dưỡng thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn để vi khuẩn đạt kích thước cực đại để bắt đầu

sinh sản. Quá trình cứ lặp lại như vậy cho đến khi số lượng vi khuẩn đạt cực đại.

Trang 82

Pha dịch lên men

Lên men (pH 7-8, 32-

35oC, 72h)

Ly tâm

Cô đặc lần 1 (30-40%)

Kết tinh

Thủy giải (+HCl)

Thành phẩm

Đóng góiSấy

Nguyên liệu

(Rỉ đường)

Xử lý bằng axit H2SO4

Giống, oxi

Ni tơ, Muối

khoáng, biotin, B1

Loại bỏ tạp chất

Sinh khối

Sấy khô làm

thức ăn gia súc

Dịch axit glutamic (3-4%)

Lọc

Cô đặc lần 2

Dầu phá bọt

Trong giai đoạn này nhiệt độ tăng vừa phải, càng về cuối tốc độ tăng nhiệt càng

nhanh, pH tăng từ 6.5-6.7 lên 7.5-8, lượng đường tiêu hao tăng dần, lượng tế bào vi

khuẩn tăng, hàm lượng acid glutamic chưa có hoặc rất ít

- Giai đoạn giữa: Từ giờ thứ 12 đến giờ thứ 48, giai đoạn này số tế bào gần như không

tăng, nhiệt độ cần giữ ở 38oC. Trong giai đoạn này đường và đạm vô cơ thẩm thấu qua

màng tế bào vi khuẩn để các quá trình chuyển hóa bởi các enzym xảy ra để sinh tổng

hợp axit glutamic. Trong giai đoạn này tế bào tích tụ acid glutamic làm pH môi

trường giảm nên phải bổ sung NH3 hoặc ure, CO2 tạo ra nhiều làm bọt tăng ào ạt nên

cần kiểm soát không khí và thêm dầu phá bọt sao cho hàm lượng CO2 không vượt quá

4.5% thể tích, lượng đường tiêu hao nhanh nên cần bổ sung đường để đảm bảo nồng

độ đạt 160 g/l, nhiệt độ tăng nhanh nên fải làm lạnh.

- Giai đoạn cuối: Giữ môi trường lên men cho đến khi hàm lượng đường nhỏ hơn hoặc

bằng 1% thì kết thúc. Thông thường quá trình lên men dừng lại ở 60-65 giờ với hàm

lượng acid glutamic đạt 100 g/l. Để đảm bảo quá trình lên men đạt hiệu quả cao phải

chú ý khống chế các điều kiện kỹ thuật như: nhiệt độ khoảng 32oC, lượng không khí

30 – 40 m3/giờ cho 1 m3 môi trường, sử dụng cánh khuấy 2 tầng với tốc độ 180 v/p,

khi pH giảm xuống 7 cần bổ sung ngay ure để pH tăng lên 8 (thường bổ sung 1 nồi

lên men gián đoạn 2 – 3 lần), bọt nhiều phải bổ sung dầu phá bọt và tạo điều kiện để

CO2 thoát ra ngoài.

(Các chế độ cần kiểm tra trong giai đoạn này:

- pH: Mỗi giờ kiểm tra 1 lần

- OD: đo vào các giờ 0, 6, 12, 18

- Độ đường: phân tích vào các giờ thứ 0, 6, 12, ... đến kết thúc.

- Ure bổ sung vào các giờ 0, 6, 12

- Hàm lượng axit glutamic đo vào các giờ 6, 12, 16, 20, 24, 28, 30, 32, ... đến kết thúc.

- Trường hợp bình thường khi lượng đường giảm dần thì hàm lượng axit tăng dần. Tuy

nhiên có trường hợp cá biệt lên men được nửa chừng thì lượng đường vẫn tiêu hao

nhiều nhưng lượng axit glutamic thì không tăng lên thậm trí còn giảm đi. Trong

trường hợp đó cần phải xác định nguyên nhân chính xác và quyết định biện pháp xử

Trang 83

lý ngay, nếu chậm đường sẽ tiêu hao hết và số axit glutamic tạp thành trong những

giờ trước cũng không còn. Nguyên nhân thông thường gây ra các hiện tượng đó là

dịch lên men đã bị nhiễm do không khí, ure hoặc dầu mang vào. Loại tạp khuẩn này

sử dụng axit glutamic làm cơ chất và cùng tồn tại với vi khuẩn sinh axit glutamic chứ

không tiêu diệt lẫn nhau. Khi quyết định biện pháp xử lý phải căn cứ theo tình hình cụ

thể, nếu hàm lượng axit glutamic lúc đó đã tương đối cao, đường còn ít thì kết thúc

sớm quá trình lên men. Nếu lượng axit glutamic chưa đáng kể thì gia nhiệt thanh

trùng lại, tiếp giống mới và tiến hành lên men lại từ đầu).

e. Xử lý dịch sau lên men

- Cô đặc dịch: Mục đích là loại đi phần lớn nước và acid còn lại sau thủy phân để dung dịch đạt

tới trạng thái bão hòa. Nồng độ cô đặc rất quan trọng, nếu nồng độ quá nhỏ sẽ làm tăng độ hòa

tan của acid glutamic, giảm hiệu suất thu hồi. Nếu nồng độ quá lớn, độ nhớt dung dịch sẽ tăng

không chỉ ảnh hưởng đến việc tách acid glutamic mà còn ảnh hưởng đến thao tác (do muối NaCl

kết tinh theo). Thông thường cô đặc ở nhiệt độ nhỏ hơn 80oC đến nồng độ khoảng 30 – 50%.

- Tách và làm sạch acid glutamic

Để tách acid glutamic ra khỏi dịch lên men người ta thường sử dụng 2 phương pháp là

điểm đẳng điện, trao đổi ion.

- Phương pháp sử dụng điểm đẳng điện: Sinh khối sau khi lên men đem ly tâm thu

dịch rồi thực hiện các bước sau:

+ Cô đặc ở nhiệt độ 60-70oC đến nồng độ 40-50%

+ Acid hóa bằng HCl đến pH = 2.9-3.2 (=pI, điểm đẳng điện, tại điểm đẳng điện thì kết

tinh)

+ Kết tinh ở điều kiện nhiệt độ 10-12oC trong 48 giờ

+ Tách tinh thể

+ Sấy sản phẩm thô ở 60oC

Đối với sản phẩm tinh khiết cần hòa tan sản phẩm thô bằng nước nóng ở 95 oC sau đó

dùng than hoạt tính để xử lý, lọc trong và quá trình kết tinh lần 2.

Trang 84

- Phương pháp trao đổi ion: Sử dụng hạt nhựa polyetylen sunfonic (refin) sau khi

được cation hóa có khả năng giữ lại trên bề mặt của nó các anion (acid glutamic) sau

đó lại sử dụng NaOH để tách anion ra khỏi hạt nhựa.

+ Pha dịch lên men: Dịch lên men có hàm lượng acid glutamic cao nếu không pha loãng

thì khả năng tiếp xúc giữa các phân tử acid glutamic với hạt nhựa kém sẽ gây ra tổn thất.

Vì vậy người ta cần pha loãng sơ bộ đến 18-20 g/l.

+ Mặt khác quá trình lên men kết thúc ở pH 6-7, tại pH này thì acid glutamic không phân

cực nên không thực hiện được quá trình trao đổi ion. Do đó phải hạ pH xuống 5-5.5 để

hầu hết acid glutamic phân cực thì hạt nhự hấp thu tốt nhất.

+ Xử lý hạt nhựa: Hạt nhựa sau 1 mẻ trao đổi không còn khả năng hấp phụ nữa, muốn

tiếp tục trao đổi phải qua khâu tái sinh. Dùng nước sạch rửa ngược khoảng 1 giờ, dùng áp

suất chân không và van đóng mở gián đoạn để sục đảo cho khối nhựa được tơi đều, rửa

cho tới khi pH = 8-9 (trước khi rửa pH = 12-13), xả bỏ hết nước bẩn ở trên, sau đó cho

nước vào rửa xuôi cho đến khi pH = 7 thì thôi và tiến hành tái sinh. Cho acid HCl cho

chảy ngược khoảng 15-20 phút cho tới khi pH = 2-2,5 thì dừng lại. Sau đó thu hồi acid

rồi rửa hạt nhựa bằng nước lạnh khoảng 40-60 phút cho đến khi pH = 3 thì có thể tiến

hành trao đổi.

+ Quá trình trao đổi ion: Sau khi hạt nhựa được tái sinh, để ổn định rồi bơm dịch lên men

vào cột, thời gian thực hiện khoảng 80 phút/mẻ.

+ Nhả hấp phụ: Sau khi trao đổi hết để hạt nhựa lắng xuồng tự nhiên, xả bỏ hết lớp dịch

bẩn trên bề mặt rồi rửa bằng nước cho đến khi hạt sạch. Sau đó sử dụng nước nóng gia

nhiệt toàn bộ khối hạt đến 60oC (nước thải ra lúc nóng có thể chứa 1 lượng nhỏ axit

glutamic nên được thu hồi lại làm nước pha dịch lên men ở mẻ sau) rồi dùng NaOH 5%

để nhả hấp phụ.

Có thể dùng nhiều loại nhựa hấp phụ, các loại nhựa này có tính chất không tan trong

NaOH, HCl, rượu, aceton và benzen, độ ẩm 46-52%, khả năng trao đổi ion 45 mg/g nhựa.

- Thủy giải, làm lạnh, kết tinh

Toàn bộ dung dịch axit glutamic được đưa vào thùng kết tinh, cho cánh khuấy hoạt động

liên tục để ngăn ngừa axit glutamic kết tinh sớm, tinh thể nhỏ, hiệu suất thấp. Bổ sung HCl 31%

Trang 85

hạ pH xuống điểm đẳng điện (2,9 – 3,2). Sau đó hạ dần nhiệt độ thùng kết tinh xuống, tiếp tục

sử dụng hệ thống khuấy làm cho axit glutamic kết tinh to, tơi xốp. Sau 8h thì ngừng khuấy, tiếp

tục hà nhiệt độ từ từ đến 12oC. Sau ít nhất 48h thì quá trình làm lạnh kết tinh kết thúc. Ly tâm

thu tinh thể, phần dịch chưa kết tinh được đưa đi trao đổi lại.

4. Ứng dụng

Ứng dụng trong y học trị liệu và bổ sung dinh dưỡng:

Trong tổ chức phức tạp của máu người, có chứa GA, ngoài làm nguyên liệu để tổng hợp

Protein ra, trong quá trình dẫn truyền liên quan đến hệ thần kinh trung ương. Do mối quan hệ

của GA và quá trình chuyển hóa năng lượng tuần hoàn Krebs (TCA cycle) trong cơ thể con

người, GA đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất trong cơ thể con người.

Do đó ngoài dùng trong trị liệu thần kinh như động kinh và bổ sung dinh dưỡng sau phẫu thuật

hoặc tiêm tĩnh mạch ra, những năm gần đây GA còn ứng dụng để giảm thiểu nhiễm trùng và

tăng cường miễn dịch sau phẫu thuật, như nghiên cứu tế bào T và GA còn góp phần rất lớn trong

quá trình nghiên cứu sinh lý trong quá trình tổng hợp peptide cũng như protein. Ngoài ứng dụng

trong thực phẩm dinh dưỡng như glutathione ra , GA còn có thể dùng làm thuốc kháng sinh và

một số dược phẩm khác trong y học trị liệu.

 Ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi:

Công năng của GA và Gln trong cơ thể động vật cũng gần giống như cơ thể người,Ví dụ trong

cơ thể gà nếu thiếu GA và Gln thì chậm phát triển. nhìn chung, GA thường được sử dụng như

hình thức thêm vào MSG (monosodium glutamate)

 Ứng dụng trong hương liệu thực phẩm:

GA có nhóm Amin có thể cùng với Carbonyl làm giảm lượng đường trong chuỗi phản ứng

Maillard, tạo ra chất tạo hương vị. Bằng cách sử dụng nhiều loại đường khác nhau có thể tạo ra

hàng loạt các chất tạo hương vị . Đối với các chất tạo hương có màu sắc khá nhạt, nên sẽ không

ảnh hưởng đến ngoại quan của thực phẩm khi cho thêm chất tạo hương, nên có thể sử dụng rộng

rãi trong chế biến thực phẩm.

 Ứng dụng trong vi sinh vật học:

Trang 86

 

GA là thành phần chủ yếu của màng tế bào Gram-positive, và nó cũng là một trong những Amin

quan trọng trong sự phát triển của vi sinh vật khác, Cần cho thêm GA vào để thúc đẫy sự phát

triển của vi sinh vật khi nuôi dưỡng vi sinh vật..

 Ứng dụng trong nông nghiệp:

GA là một trong những axit amin quan trọng trong Protein thực vật, mà Gln cũng là nitrogen

chủ yếu ở dạng dự trữ trong cơ thể thực vật, do đó GA có thể sử dụng làm chất bổ sung tăng

trưởng cho thực vật. Đối với tầm quan trọng của GA trong quá trình chuyển hóa nitrogen, có thể

đem GA điều chỉnh thích hợp, để bị kết hợp với axit thành Gln, Vì vậy, sẽ tích lũy tạo thành

Amonia trong cơ thể thực vật,và khi cơ thể thực vật chết có thể sử dụng làm thuốc diệt cỏ.

 Ứng dụng trong chế phẩm hóa học:

Sử dụng trong chất hoạt tính giao diện ( Surfactant)và chất xúc tác( Buffer)

GA là tổ hợp hai thuộc tính là Axit và kiềm có thể làm chất xúc tác. Mà phản ứng lực điện từ

của Pro- GA và Axit béo Pro- dầu, có thể tạo thành chất hoạt tính giao diện (surfactant). Ứng

dụng của chất hoạt tính giao diện (surfactant) được làm từ GA là rất lớn, Do mức độ kích ứng da

thấp, chế phẩm được tạo ra rất mịn nên có thể làm mỹ phẩm như mỹ phẩm trang điểm , dầu gội

đầu vân vân, và có công dụng như các loại axit hữu cơ khác, có thể làm chất tiền dẫn trong chế

tạo nguyên liệu siêu dẫn.

 Ứng dụng trong keo hóa học:

GA và sự hình thành của các axit béo của chất Surfactant, đóng vai trò như Amoni, có thể chế

tạo thành keo hóa học, ứng dụng trong quá trình thu hồi dầu do sự cố tràn dầu.

Sử dụng làm nước cứng:

Chất dẫn xuất của GA có thể dùng làm chất làm cứng, chẳng hạn như thêm vào chất làm cứng

nhựa epoxy. Có thể nâng cao sức mạnh liên kết nhựa.

CHƯƠNG VII: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ GEN TRONG SẢN XUẤT

PROTEIN TÁI TỔ HỢP

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ gen và sự hoàn thiện

của các giải pháp tinh sạch protein, các protein tái tổ ngày càng được sử dụng nhiều hơn trong

các lĩnh vực của đời sống xã hội từ y học, công nghiệp thực phẩm đến nghiên cứu cơ bản. Tính

Trang 87

đến năm 2005 có 66 trong 77 loại protein được FDA (Food and Drug Administration) cho phép

lưu hành có nguồn gốc tái tổ hợp. Trong lĩnh vực y học, dược học, công nghệ sản xuất protein

tái tổ hợp có nhiều ưu điểm so với công nghệ sản xuất protein truyền thống như có khả năng

cung cấp lượng lớn protein dược phẩm với giá thành rẻ, an toàn do không gây ra các phản ứng

không mong muốn và giảm thiểu nguy cơ nhiễm virus và các vật gây bệnh khác.

1. Cơ sở công nghệ gen

Protein tái tổ hợp là các protein được tạo ra bởi công nghệ ADN tái tổ hợp. Nói một cách

khác là các protein được tạo ra bằng cách kết hợp vật liệu di truyền từ các nguồn khác nhau có

sử dụng đến các kỹ thuật gen in vitro

1.1. Các loại enzym sử dụng trong công nghệ ADN tái tổ hợp

Có thể chia enzym trong công nghệ ADN tái tổ hợp làm 5 nhóm cơ bản [3]

- Các enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste. Ví dụ: các enzym endonuclease (enzym

giới hạn, DNase, Mungbean nuclease, RNase H, RNase T1, RNase U2 ...), các exonuclease

(exonuclease III, exonuclease VII ...), các enzym vừa có chức năng endonuclease và

exonuclease (nuclease Bal 31, N. crassa nuclease, nuclease S1, ...).

- Các enzym nối khung phân tử ADN. Ví dụ: E.coli ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA

ligase,...

- Các enzym bổ sung hoặc loại nhóm phosphat ở đầu tận cùng của axit nucleic. Ví dụ: T4

polynucleotide kinase, alkaline phosphatase, tobacco acid pyrophosphatase, ...

- Các enzym tổng hợp các mối liên kết phosphodieste mới trong phân tử axit nucleic. Ví dụ:

các enzym DNA polymerase (T4 DNA polymerase, T7 DNA polymerase, Taq DNA

polymerase, ...), RNA polymerase, reverase transcriptase, poly(A) polymerase, terminal

deoxynucleotidyl transferase, polynucleotide phosphorylase, ...

- Các enzym tham gia bảo vệ, đóng gói, xoắn và giãn xoắn phân tử ADN. Ví dụ: DNA

methylase, các protein liên kết ADN (RecA, SSB, ANaB ...), topoisomerase I và II,...

1.2.Vector tách dòng

4.5.1. Khái niệm [4]

Trang 88

Tách dòng là cài gắn một gen, hay một trình tự ADN vào vector tách dòng, tạo các vector tái

tổ hợp và chuyển vector tái tổ hợp này vào các tế bào chủ. Trong các tế bào chủ, các vector tái tổ

hợp được nhân lên thành một số lượng lớn bản sao của đoạn gen (đoạn ADN) ban đầu.

Vector tách dòng là các phân tử ADN có kích thước nhỏ, cho phép gắn các đoạn ADN cần

thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại trong tế bào vật

chủ qua nhiều thế hệ, không gây biến đổi bộ gen của tế bào vật chủ.

Vector tách dòng phải có nhiều điểm cắt đặc hiệu duy nhất cho các loại enzym giới hạn

khác nhau, đồng thời mang các gen tín hiệu (gen chỉ thị màu hoặc chỉ thị kháng sinh) để dễ dàng

nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp.

4.5.2. Đặc điểm của vector tách dòng

Khi thiết kế một vector tách dòng cần đảm bảo các yêu cầu sau: [2,4]

- Vector phải có khả năng sao chép độc lập với sự sao chép bộ gen của tế bào chủ.

- Kích thước càng nhỏ càng tốt, có thể cài (gắn) ADN có kích thước tối đa, kích thước

vector nhỏ dễ xâm nhập vào tế bào chủ và được sao chép nhanh, hiệu quả.

- Vector phải có những gen chỉ thị để phát hiện sự có mặt của chúng một cách dễ dàng trong

tế bào chủ. Thông thường, đó là những gen kháng kháng sinh giúp cho vi khuẩn mang vector

sống được trên môi trường có kháng sinh hoặc có khả năng tổng hợp một enzym chuyển hóa

một cơ chất tạo mầu phát hiện trên môi trường thạch.

- Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và phải ít gây xáo trộn nhất cho tế

bào chủ.

- Vector phải mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số lượng tối đa enzym giới hạn

(nghĩa là chỉ tồn tại một vị trí cắt cho mỗi enzym). Hơn nữa, các vị trí nhận biết này thường

được đặt vào giữa các gen chọn lọc. Nhờ vậy mà khi một trình tự ADN gắn xen vào vị trí cũng

sẽ xen vào chính giữa gen và làm bất hoạt gen ấy. Trong các loại vector tách dòng hiện có, các

plasmid được sử dụng rộng rãi hơn cả. Cho đến nay đã có nhiều thế hệ plasmid khác nhau ra

đời, thế hệ sau là cải tiến của thế hệ trước và ngày càng mang nhiều đặc tính quý báu cho việc

tạo dòng.

4.5.3. Các loại vector tách dòng [2,4]

Vector tách dòng (cloning vector) gồm nhiều loại như plasmid, phage, cosmid, phagemid,

nhiễm sắc thể nhân tạo của tế bào nấm men ... Mỗi loại vector tách dòng có những ưu, nhược

Trang 89

điểm nhất định. Tuỳ thuộc kích thước của gen cần tách dòng và đặc điểm của loại tế bào chủ để

chọn loại vector tách dòng thích hợp.

- Vector tách dòng là plasmid là những phân tử ADN có cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ

(1-200 kb) dạng vòng, nằm trong tế bào chất của vi khuẩn, nấm men ..., có khả năng tái bản độc

lập với số lượng lớn, tốc độ nhanh, không phụ thuộc vào sự tái bản của bộ gen tế bào, dễ tinh

sạch. Tuy nhiên vector plasmid có các nhược điểm như đôi khi hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ

thấp, không hiệu quả khi biến nạp vào eukaryote và không tách dòng được các đoạn ADN có

kích thước lớn (>10 kb)

Theo chức năng và các gen trên plasmid, chia plasmid thành nhiều loại khác nhau như

plasmid giới tính (F), plasmid kháng chất kháng sinh (R), plasmid col (có gen mã hoá colicin

giết các vi khuẩn khác). Từ các plasmid tự nhiên đã phân lập, cải tiến tạo nên nhiều thế hệ

plasmid nhân tạo khác nhau, mang nhiều đặc tính quí, thuận lợi cho kĩ thuật tách dòng gen.

Hình 1. Sơ đồ vector tách dòng plasmid pBR332

- Vector tách dòng là phage: các phage sử dụng làm vector tách dòng hiện nay phần lớn bắt

nguồn từ phage λ, có ADN mạch kép kích thước 48.502bp, nằm trong phần đầu của phage λ.

Vector tách dòng là phage có lợi hơn các loại plasmid vì phage có hệ thống gen giúp xâm nhập

vào vi khuẩn nhanh, tái bản rất nhanh, hiệu quả với tế bào chủ là prokaryote và eukaryote.

Vector tách dòng phage có thể mang các đoạn cài lớn đến 20 kb và vector này dễ bảo quản vì

chúng bền ở nhiệt độ lạnh. Tuy nhiên do kích thước lớn hơn plasmid nên phân tích phức tạp hơn

và số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào cũng thấp hơn số bản sao plasmid.

Trang 90

pBR332 4363 bp

Hình 2. Sơ đồ vector tách dòng phage λ

- Vector tách dòng là cosmid: là vector nhân tạo, ghép nối từ một plasmid với đoạn trình tự

cos của phage λ nên nó mang ưu điểm của hai loại vector này, có kích thước 40-50kb. Vector

này có khả năng tái bản với số lượng lớn như plasmid, có khả năng đóng gói invitro như phage

và mang các đoạn gen cài có kích thước 35 – 40 kb.

Hình 3. Sơ đồ vector tách dòng cosmid

- Vector tách dòng là phagemid: là vector được cấu tạo trên cơ sở của pBR322 được gắn

thêm đoạn khởi đầu tái bản (Ori) của phage f1, một đoạn có chứa promoter của phage T3, T7 và

polycloning site.

Trang 91

Hình 4. Sơ đồ vector tách dòng phagemid M13 chủng tự nhiên

- Vector tách dòng là nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men là các vector tạo dòng mạch

thẳng dựa trên cấu trúc nhiễm sắc thể tự nhiên của nấm men. Vector này có thể mang các đoạn

gen cài có kích thước 200 – 500 kb.

Hình 5. Sơ đồ vector tách dòng nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men

- Vector tách dòng là nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn dựa trên cơ sở plasmid giới tính

(F). Vector này cũng có khả năng mang các đoạn cài có kích thước lớn lên đên 300 kb ngoài ra

còn có khả năng sao chép trong E. Coli giống như plasmid, cosmid, phage λ.

Trang 92

Hình 6. Sơ đồ vector tách dòng là nhiểm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn pECBCI

- Vector tách dòng là Ti plasmid (Ti – tumor inducing): có kích thước 200kb, không thuận lợi cho

tách dòng gen. Từ Ti plasmid tạo nên nhiều loại plasmid nhân tạo như vector chỉ thị, vector liên hợp...có

hiệu quả trong tách dòng và chuyển gen ở thực vật.

Agrobacteriumtumefaciens

Ti plasmid

ADN nh©nVK

Agrobacteriumtumefaciens

Ti plasmid

ADN nh©nVK

VVïï ngnggg©©y y khkhèèiiu (u (OncOnc))

T-ADN VVïï ngngphph©©n n gigi¶¶iinopalinenopaline

VVïï ngngtt i bi b¶¶nn

VVïï ngngtiÕptiÕphhîî ppplasmidplasmid

VVïï ngnggg©©y y ®®ééccvirvir

A

B

C

DpTiC58

(Nopaline)

VVïï ngnggg©©y y khkhèèiiu (u (OncOnc))

T-ADN VVïï ngngphph©©n n gigi¶¶iinopalinenopaline

VVïï ngngtt i bi b¶¶nn

VVïï ngngtiÕptiÕphhîî ppplasmidplasmid

VVïï ngnggg©©y y ®®ééccvirvir

A

B

C

DpTiC58

(Nopaline)

Hình 7. Sơ đồ vector tách dòng pTiC58

- Vector tách dòng là virus của tế bào eukaryote: thường là các loại virus SV40 (Simian

virus), adenovirus, retrovirus, baculovirus, virus herpes...

Trang 93

4.6. Vector biểu hiện

4.6.1. Đặc điểm cấu trúc vector biểu hiện

Vector biểu hiện gen là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho phép biểu

hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng, tạo nên các protein lai. Một vector biểu hiện gen

gồm các thành phần chủ yếu promoter mạnh, trình tự sao chép (ori), vị trí khởi đầu phiên mã, vị

trí bám của ribosome, tín hiệu kết thúc dịch mã, các trình tự đa cắt nối (MCS) và các gen chỉ

thị…

Hình 9. Sơ đồ cấu tạo của một vector biểu hiện gen.

Vector biểu hiện mạnh là các vector có những đặc điểm có khả năng tạo số lượng lớn bản

sao trong tế bào chủ (ori mạnh), promoter hoạt động mạnh, dịch mã tạo nhiều protein lai, đoạn

trình tự MCS có nhiều vị trí cắt đặc hiệu của nhiều loại enzym giới hạn, vector vẫn giữ được đặc

tính khi chèn gen tách dòng kích thước lớn, hoạt động của vector không ảnh hưởng hoặc gây ức

chế tế bào chủ, gen chỉ thị dễ dàng nhận biết…

Vector biểu hiện gen ở procaryot được thiết kế đầy đủ bao gồm tập hợp các nhân tố di

truyền, được sắp xếp hợp lý nhằm điều khiển tối ưu các quá trình phiên mã để tổng hợp nên

protein từ gen ngoại lai. Ngoài ra vector còn phải chứa gen mã hóa cho protein có chức năng

làm dấu hiệu chọn lọc. Gen thường sử dụng trong vector biểu hiện là gen kháng chất kháng sinh.

Gen này tạo thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế bào mang plasmid. Đối với plasmid tự sao

chép, một trình tự không thể thiếu đó là tâm sao chép. Tâm sao chép quyết định số lượng bản

copy của plasmid trong một tế bào. Để tạo điều kiện cho việc đưa các đoạn gen vào vector biểu

hiện theo đúng chiều của promoter, trên vector luôn phải chứa vùng đa nối (polylinker region)

mang các trình tự của các enzym hạn chế có tần số xuất hiện thấp trên các gen cấu trúc.

Trang 94

Hầu hết các plasmid được sử dụng để biểu hiện gen đều là vector con thoi có nghĩa là các

plasmid có chứa các trình tự đảm bảo cho chúng tồn tại và sao chép ở cả tế bào nấm men và

E.coli. Vector biểu hiện gen trong nấm men được phân thành 2 nhóm, nhóm không có khả năng

sao chép trong tế bào là nhóm plasmid tích hợp vào hệ gen của nấm men (YIp: yeast intergrating

plasmid) và nhóm có khả năng tự sao chép trong tế bào (YEp: yeast episomal plasmid), plasmid

tái bản (YRp: yeast replicating plasmid), plasmid chứa tâm động (YCp: yeast centromere

plasmid)

4.6.2. Các loại vector biểu hiện

* Trong hệ biểu hiện E.Coli có nhiều loại promoter khác nhau ảnh hưởng tới mức độ biểu

hiện ở E.coli. Các promoter có khả năng biểu hiện cao có những đặc điểm chung sau:

-Là promoter mạnh có khả năng tạo protein ngoại lai lớn hơn 10-30% protein tổng số của tế

bào.

-Chỉ hoạt động phiên mã gen ở mức độ cơ sở (phiên mã khi không cảm ứng) với mức độ

nhỏ tối đa. Promoter bị ức chế cao khi không cảm ứng là điều kiện quan trọng để biểu hiện các

protein độc hoặc có hại đối với sự sinh trưởng của tế bào.

-Promoter được cảm ứng theo cách đơn giản nhưng hiệu quả cao.

Operon lac là một hệ điều hòa của gen ở Procaryot được biết đến sớm nhất. Promoter từ

operon tryptophan (tryp) được sử dụng để biểu hiện protein nội bào, có nhiều ưu điểm là

promoter mạnh, được nghiên cứu kĩ, lượng protein được tổng hợp nhiều, có thể biến nạp vào

hầu hết các chủng E.Coli, cảm ứng đơn giản. Tuy nhiên khi sử dụng vector chứa promoter tryp

để biểu hiện các protein độc thì tế bào sẽ mọc rất ít [1].

Trang 95

Bảng 2. Promoter biểu hiện

Hệ biểu hiệnMức độ biểu hiện

(chất cảm ứng)Đặc điểm nổi bật

lac promoter Từ thấp đến trung

bình (IPTG)

Biểu hiện yếu, có điều khiển; thường thích hợp để

sản xuất những sản phẩm có nồng độ nội bào rất

thấp. Chi phí cảm ứng khá cao

T7 RNA

polymerase Rất cao (IPTG)

Sử dụng T7 RNA polymerase. Mức độ biểu hiện rất

cao. Hệ thống T7lac có thể kiểm soát biểu hiện chặt

chẽ trong trường hợp tạo chất có tính độc tế bào. Chi

phí cảm ứng khá cao, độ biểu hiện nền thường phụ

thuộc cả vào chủng vi khuẩn

Phage promoter

PL

Tương đối cao (thay

đổi nhiệt độ)

Cần chủng vi khuẩn riêng nhạy nhiệt

độ biểu hiện nền cao ở nhiệt độ dưới 30°C

 không cần chất cảm ứng

tetA promoter

Từ trung bình đến

cao (an-

hydrotetracyclin)

Điều khiển chặt, không phụ thuộc mức độ trao đổi

chất và chủng E. coli.

 chi phí cảm ứng khá thấp. Độ biểu hiện nền thấp

PRBAD promoter Từ thấp đến cao (L-

arabinose)

Có thể vi điều chỉnh mức độ biểu hiện.

 chi phí cảm ứng thấp. Độ biểu hiện nền thấp.

rhaPBAD promoter Từ thấp đến cao (L-

rhamnose)

Điều khiển chặt, độ biểu hiện nền thấp

 chi phí cảm ứng khá thấp

* Trong hệ biểu hiện nấm men, hệ biểu hiện P. Pastoris cũng như các hệ thống khác, được

xây dựng dựa trên hệ thống vector biểu hiện trong E. coli. Qua nhiều năm nghiên cứu các nhà

khoa học đã tạo ra nhiều loại vector biểu hiện cũng như chủng P. pastoris khác nhau: vector

pPICZ, pPICZα, pGAPZ, pGAPZα, pPIC6, pPIC6α, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815; chủng P.

pastoris GS115, X-33, SMD1168, SMD1168H, KM71, KM71H [10,11].

Trang 96

Hầu hết các vector biểu hiện trong P. pastoris có chứa đoạn trình tự AOX1 promoter (0,9

kb) gồm trình tự 5’ promoter và trình tự nhỏ khác cần thiết cho quá trình kết thúc phiên mã

(AOX1 transcription terminator). Xen giữa promoter và terminator là vùng đa điểm (multiple

cloning site, MCS) dùng để chèn thêm gen mong muốn. thông thường thì kết quả biểu hiện gen

ngoại lai tốt nhất khi trình tự ATG của gen ngoại lai nằm gần trình tự ATG của gen AOX1. Vị trí

này thường trùng với điểm cắt ở đầu 5’ ở vùng MCS. Khi vector được gắn thêm các yếu tố tiết

thì có thể tạo ra protein dung hợp [12]. Tùy vào mục đích thu nhận protein, chúng ta có thể chọn

các loại vector khác nhau.

Promoter trong hệ biểu hiện nấm men gồm ít nhất 3 yếu tố làm nhiệm vụ điều khiển sự khởi

đầu phiên mã gen ngoại lai một cách hiệu quả và chính xác:

- Trình tự hoạt hóa nằm phía trước promoter về đầu 5’, có tính chất tương tự như yếu tố hoạt

hóa ở động vật, điều hòa sự hoạt động của promoter thông qua việc liên kết đặc hiệu với chất

hoạt hóa phiên mã.

- Hộp TATA ở vị trí cách xa điểm khởi đầu phiên mã 40-120bp, đối với Eucaryot bậc cao

thì hộp TATA cách vị trí khởi đầu 25-30bp

- Yếu tố khởi đầu quyết định vị trí bắt đầu tổng hợp protein.

Promoter của nấm men thường kéo dài trên 500bp, có nhiều loại khác nhau được sử dụng:

-Promoter của hệ đường phân: là promoter được sử dụng đầu tiên để khởi động sự phiên mã

gen ngoại lai. Promoter này có khả năng hoạt động tốt nhất trong số các promoter của

S.cerevisiae.

-Promoter được điều hòa bởi galactose (GAL): là promoter được điều khiển tương đối chặt

chẽ trong S.cerevisiae

-Promoter được điều khiển bởi phosphat: đây là promoter được sử dụng rộng rãi để biểu

hiện gen ngoại lai ở nấm men. Promoter này được cảm ứng bằng nguồn phosphat vô cơ.

-Promoter bị ức chế bởi glucose

-Promoter cảm ứng bởi metanol (AOX1): đây là promoter được sử dụng trong hầu hết các

vector biểu hiện ở tế bào P.pastoris. Đây là promoter mạnh có nguồn gốc từ gen mã hóa cho

alcohol oxidase ở P.pastoris.

-

Trang 97

4.7. Các hệ tế bào chủ trong biểu hiện gen

5. Phụ thuộc vào mục đích sử dụng loại protein tái tổ hợp được sản xuất. Có rất nhiều hệ tế

bào chủ hiện nay đang được sử dụng:

Hiện nay có 4 hệ tế bào chủ thường được sử dụng để biểu hiện gen như vi khuẩn (E.coli,

B.subtilis), nấm men (S. Cerevisiae, P. Pastoris), tế bào thực vật và tế bào động vật. Ngoài ra

còn có thể biểu hiện trên một vài loại nấm sợi nhưng chưa có hiệu quả cao.

Bảng 4. Các loại tế bào chủ chủ yếu

Các nhóm chính Kiểu loại nhân Kiểu loại tế bào Thí dụ

Vi khuẩn Nhân sơGram âm

Gram đương

Escherichia coli

Bacillus subtilis

Streptomyces spp

Nấm Nhân chuẩnVi sinh vật

có khuẩn ty

Sacchromyces cerevisiae

Pichia pastoris

Aspergillus nidulans

Thực vật Nhân chuẩn

Tế bào trần

Tế bào nguyên

Cả cơ thể

Các loại khác nhau

Các loại khác nhau

Các loại khác nhau

Động vật Nhân chuẩn

Tế bào sâu bọ

Tế bào động vật

Tế bào trứng

Cả cơ thể

Drosophila melanogaster

Các loại khác nhau

Các loại khác nhau

Các loại khác nhau

5.1.1. Hệ biểu hiện ở vi vi khuẩn

E.coli là vi khuẩn gram âm, có một nhiễm sắc thể riêng lẻ nằm trong cấu trúc gọi là vùng

nhân, hệ gen có kích thước khoảng 4.106 cặp bazơ, là một vật chủ đơn giản nhất được sử dụng

rộng rãi. Các quá trình biểu hiện gen (phiên mã và dịch mã) đi đôi với nhau, sinh ra sợi mARN

được tổng hợp mới và được sử dụng ngay cho quá trình dịch mã. Không có hiện tượng sửa đổi

Trang 98

sau phiên mã đối với sản phẩm phiên mã ban đầu như thường xảy ra trong các tế bào nhân

chuẩn [1]

Hình 11. Tế bào E.coli

Một trong những bất lợi khi sản xuất protein ở E. coli nhằm mục đích sử dụng trong y học là

thường lẫn với lipopolysaccharide, một loại nội độc tố ở người. Vì lý do như vậy mà một số loài

vật chủ vi khuẩn khác như Caulobacter, Staphylococcus và Streptomyces được lựa chọn để biểu

hiện protein. Các chủng vi khuẩn Bacillus Gram dương cũng là vật chủ được ưa thích, trong đó

phải kể đến B. megaterium, B. subtilis và B. brevis. Những điểm nổi bật của các vật chủ này là

hoạt tính protease thấp, các plasmid tương đối bền về cả cấu trúc lẫn phân ly trong phân bào,

khả năng sinh trưởng trên nhiều loại cơ chất khác nhau và hiệu suất biểu hiện cực cao. Trong đó,

B. subtilis được nghiên cứu sâu và ứng dụng rộng rãi hơn 2 loài còn lại vì nó có khả năng biểu

hiện và tiết rất tốt protein có nguồn gốc từ procaryot ra ngoài môi trường nuôi cấy.

Để tăng cường khả năng biểu hiện các protein eukaryote hoặc protein có chứa codon hiếm ở

E. coli, có thể lựa chọn những chủng E. coli đã được cải biến di truyền phù hợp với mục đích

này. Ngoài vấn đề vật chủ, promoter, thì số lượng bản sao plasmid cao, thấp hay trung bình cũng

liên quan đến mức độ biểu hiện. Khi gắn protein tái tổ hợp với một đoạn cài lớn có thể làm tăng

tính tan của tổng thể protein. Các đoạn cài liên kết maltose hoặc đoạn cài Sumo (Sumo-tags) có

khả năng làm protein tan cực tốt, tuy nhiên lại kết vón sau khi loại bỏ đoạn cài khỏi protein tái tổ

hợp. Protein với các cầu disulfide thường được tiết ra vùng ngoại vi bào chất (periplasm) thay vì

trong tế bào chất (cytoplasm). Để định hướng tiết protein biểu hiện ra vùng ngoại vi bào chất,

protein tái tổ hợp cần được gắn một đoạn peptide dẫn đường (leader peptide) ở phía đầu N.

Thông thường các chủng E. coli K-12 hoặc B thường sử dụng cơ chế tiết protein kiểu I và kiểu

II với các peptide tín hiệu sau: Lpp, LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, PelB,

PhoA, PhoE, SpA và Tat.

Trang 99

- Staphylococcus aureus (có khả năng tiết protein dung hợp ra ngoài môi trường nhưng

không biểu hiện mạnh như E. coli, là vi khuẩn gây bệnh)

5.1.2. Hệ biểu hiện trong nấm sợi

Hệ nấm sợi đã bắt đầu được quan tâm và sử dụng làm vật chủ để sản xuất protein tái tổ hợp.

Những loại nấm sợi thường được sử dụng cho mục đích trên là Neurospora crassa, Acremonium

chrysogenum, Tolypocladium geodes, Mucor circinelloides và Trichoderma reesei… Trong đó,

loài Aspergillus đã được sử dụng làm vật chủ rất hiệu quả cho sản xuất protein tái tổ hợp.

Aspergillus là loài nấm thứ cấp có khả năng sinh bào tử. Chủng Aspergillus nidulans và

Aspergillus oryzae đều được sử dụng cho mục đích sản xuất protein tái tổ hợp, tuy nhiên một số

chủng Aspergillus tỏ ra không có hiệu quả trong việc biểu hiện các protein khác loài. Ngoài ra,

khả năng sinh độc tố mycotoxin và sản sinh protease cũng là một hạn chế lớn trong việc ứng

dụng một số chủng Aspergillus làm vật chủ. Chủng được sử dụng trong hệ biểu hiện nấm sợi là

chủng không sản sinh mycotoxin, protease và một lượng lớn các protein nội sinh khác [8]

5.1.3. Hệ biểu hiện nấm men

Nấm men là cơ thể Eucaryot đầu tiên được dùng để biểu hiện gen ngoại lai. Đây là sinh vật

đơn bào được biết rất kĩ về mặt di truyền, có khả năng sinh trưởng nhanh, tạo sinh khối lớn, các

thao tác di truyền đơn giản, đặc biệt nấm men có khả năng tiết protein ngoại bào. Nấm men

được sử dụng để biểu hiện gen như Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris, được sử dụng

rộng rãi trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm và y học, bởi có sự an

toàn sinh học cao. Nấm men sinh trưởng nhanh và có khả năng sản xuất protein dạng hoạt động

mà hệ biểu hiện ở vi khuẩn không có. Vì vậy, nấm men rất được ưa chuộng để biểu hiện các gen

của eucaryot và gen mã hoá cho protein sử dụng trong thực phẩm và chữa bệnh.

Tuy nhiên hệ biểu hiện ở nấm men có những hạn chế. Nấm men không thích hợp để biểu

hiện một số protein cần được glycosil hóa. Các glycoprotein ở người được tổng hợp bởi nấm

men không thích hợp cho việc sử dụng để tiêm vào tĩnh mạch do kháng nguyên và tính đáp ứng

miễn dịch bị thay đổi.

Nấm men S.cerevisiae là một vi sinh vật nhân chuẩn được ưa thích để nghiên cứu kĩ thuật di

truyền. Hệ gen của S. cerevisiae có khoảng 1,35.107 bazơ nitơ. S. cerevisiae được sử dụng rộng

rãi trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm và y học. Bởi vì S.

cerevisiae có độ an toàn sinh học cao, bản thân tế bào S. cerevisiae có hàm lượng protein,

vitamin rất lớn, có giá trị dinh dưỡng cao thường được bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho người

Trang 100

và động vật. Hireman là người đầu tiên thành công trong việc sử dụng S. cerevisiae làm vật chủ

sản xuất interleukin của người. Các sản phẩm tiếp đó như interferon, insulin, albumin huyết

thanh người, chất hoạt hoá plasminogen, lysozym.

Tuy nhiên protein ngoại lai được tiết ra từ S. cerevisiae đạt 0,1-0,5mg/l . Nguyên nhân chủ

yếu là do:

- Plasmid dùng để biểu hiện gen trong S. cerevisiae dạng đa phiên bản rất dễ bị mất dần qua

một số thế hệ.

- Promotor dùng để khởi đầu phiên mã gen ngoại lai như promotor của hệ gen đường hoá dễ

bị thay đổi, ảnh hưởng tới việc biểu hiện gen.

- Môi trường nuôi cấy thường đắt tiền.

Bên cạnh đó, S. cerevisiae chưa có hệ vector biểu hiện hữu hiệu, chưa có hệ promotor mạnh

được điều khiển chặt chẽ bởi chất cảm ứng [1]. Để khắc phục những nhược điểm của hệ biểu

hiện gen trong S. cerevisiae, nấm men Pichia pastoris đã được sử dụng như một hệ biểu hiện

thay thế.

Hệ biểu hiện P. pastors khắc phục được những nhược điểm của hệ biểu hiện S. cerevisiae,

trở thành hệ thống biểu hiện gen ngoại lai cực kỳ hữu hiệu với các đặc điểm nổi trội:

- Có promoter AOX I (alcohol oxidase I) đặc hiệu cho việc kiểm soát việc biểu hiện các gen

ngoại lai, bằng nguồn C có trong môi trường.

- Plasmid được sử dụng để biểu hiện gen thường được trao đổi chéo với hệ gen của nấm

men nên làm tăng tính ổn định của plasmid trong tế bào.

- Là sinh vật hiếu khí, thu được sinh khối có mật độ cao, môi trường nuôi cấy đơn giản.

- Có khả năng tiết mạnh protein ngoại lai ra môi trường nuôi cấy.

- Kit biểu hiện đã được công ty Invitrogen thương mại hóa.

Vào năm 1993, công ty Phillips Petroleum đã cho ra đời hệ thống P. pastoris biểu hiện đầu

tiên và từ đó đã có rất nhiều công trình biểu hiện gene ngoại lai thành công trên vật chủ này.

Hiện đã có hơn 100 protein khác nhau được sản xuất thành công nhờ P. pastoris, công bố ở

hơn 500 bài báo. Là một nấm men, P. pastoris là một vi sinh vật đơn bào, rất dễ tiến hành các

thao tác di truyền hay tiến hành nuôi cấy thu sinh khối. Là sinh vật nhân thật nên trong quá trình

tạo ra protein còn kèm theo các quá trình biến đổi sau dịch mã như: các quá trình phân cắt, gấp

Trang 101

nếp, tạo cầu disulfide, gắn thêm các phân tử đường. Do đó nhiều protein không thể có hoạt tính

nếu được biểu hiện trong vi khuẩn lại có đầy đủ hoạt tính sinh học khi biểu hiện trong P.

pastoris. Hệ thống biểu hiện P. pastoris được xem là hệ thống biểu hiện nhanh, đơn giản, rẻ hơn

so với các hệ thống biểu hiện từ các sinh vật nhân thật bậc cao khác như hệ thống biểu hiện

protein trên sâu hay trên tế bào động vật có vú mà hiệu quả biểu hiện lại cao hơn.

P. pastoris là chủng nấm men có khả năng sử dụng methanol như nguồn cacbon, nguồn

năng lượng độc lập. Để sinh trưởng trong môi trường chứa methanol đòi hỏi P. pastoris phải có

các enzym thiết yếu như alcohol oxidase (AOX), dihydroxyacetone synthase (DHAS) và một số

enzym khác trong quá trình trao đổi methanol. Trong đó alcohol oxidase là enzym quan trọng

nhất, được mã hóa bởi gen AOX1 và AOX2, không đặc hiệu cho methanol, nó có thể oxy hóa

nhiều loại rượu khác [16].

Các chủng P. pastoris được phân lập từ tự nhiên sinh trưởng trong môi trường có bổ sung

methanol với tốc độ không ổn định (kiểu hình Mut+). Chủng P. pastoris bị đột biến gen AOX có

khả năng sản xuất protein ngoại lai tốt hơn so với chủng phân lập từ tự nhiên [10]. Hơn nữa các

chủng này đòi hỏi một lượng rất nhỏ methanol dùng cho cảm ứng nên giảm thiểu nguy cơ ngộ

độc methanol khi tiến hành lên men. Chủng đột biến KM71 (his4 arg4 aox1∆::SARG4) là một

chủng mà gen AOX1 bị xóa, thay vào đó là gen S. cerevisiase ARG4 (kiểu hình MutS), sinh

trưởng rất chậm trong môi trường có bổ sung methanol. Chủng đột biến MC100-3 (his4 arg4

aox1∆::SARG4 aox2∆::Phis4) bị xóa cả hai gen AOX và không thể sinh trưởng trong môi

trường methanol (kiểu hình Mut-). Tất cả các chủng này, kể cả chủng Mut- đều duy trì khả năng

biểu hiện protein ngoại lai ở mức độ cao bởi AOX1 promoter [16].

Một số chủng thiếu hụt protease như SMD1163 (his4 pep4 prb1), SMD1165 (his4 prb1), và

SMD1168 (his4 pep4) có khả năng giảm thiểu sự phân hủy protein ngoại lai do sự thiếu hụt

protease, điều này rất quan trọng khi tiến hành lên men thu protein ngoại bào. Song các chủng

thiếu protease lại không hoạt động mạnh bằng các chủng dại do khả năng sống sót thấp hơn, tốc

độ sinh trưởng chậm hơn. Các chủng thiếu protease chỉ dùng khi các biện pháp giảm thiểu sự

phân hủy protein không thu được kết quả mong muốn.

Trong quá trình lên men, Pichia pastoris là một vật chủ có năng suất cao, đây là một ưu

điểm nổi trội so với S. cerevisiae. Hiện nay đã có các công trình nghiên cứu mô hình hóa quá

trình lên men đối với nấm men P. pastoris. Việc nghiên cứu kỹ lưỡng con đường chuyển hóa

methanol, các giai đoạn sinh trưởng phát triển của nấm men giúp chúng ta có thể kiểm soát quá

trình lên men, tạo điều kiện thu được lượng sản phẩm mong muốn lớn nhất có thể. (Tế bào nấm

Trang 102

men rất an toàn, rẻ tiền, dễ tinh chế, sản xuất được trên quy mô lớn, nấm Aspergillus sp rẻ tiền,

an toàn, tiết protein ra môi trường, thường dùng để sản xuất enzym trên quy mô công nghiệp tuy

nhiên hiệu quả biểu hiện chưa cao)

5.1.4. Hệ biểu hiện ở thực vật và động vật

Hệ biểu hiện trong tế bàothực vật và động vật có khả năng biểu hiện được tất cả các protein

của 4 nhóm nhưng tốn thời gian và quá trình chọn lọc, nhân dòng và nuôi cấy dòng tế bào phức

tạp hơn nên hệ biểu hiện này thường không được sử dụng rộng rãi. (Thực vật rẻ tiền, quy mô sản

xuất không hạn chế, bảo quản sản phẩm dưới dạng hạt hoặc củ rất thuận tiện, hiệu quả kinh tế

cao khi sử dụng sản phẩm dạng không tinh chế tuy nhiên hiệu quả chuyển gen chưa cao, thời

gian dài mới tạo được cây chuyển gen)

Tế bào động vật bậc cao cho phép biểu hiện các protein có kích thước lớn hơn 50 kDa. Các

vector biểu hiện gen thường có promotor mạnh SV40, CMV. (Tế bào động vật có vú có cùng

hoạt tính như protein tự nhiên, có nhiều loại vecto biểu hiện gen, có thể nuôi trên quy mô lớn tuy

nhiên nuôi cấy tế bào khó và đắt, tế bào mọc chậm, tế bào chuyển gen ko ổn định, năng suất

thấp hơn so với vi khuẩn).

Trang 103

Quy trình công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp

6. Phân lập gen đặc tính: là tuyển chọn những gen mã hóa cho protein mong muốn. Có thể

phân lập dựa trên thư viện AND thể gen hay sử dụng phương pháp PCR.

7. Lựa chọn vecto biểu hiện: Để nhân dòng một gen quan tâm thì tất cả các vecto phải có một

vị trí cắt độc nhất tại vùng sau promoter. Việc lựa chọn vecto hoàn toàn do hệ thống tế bào

chủ quyết định vì vậy sau khi xem xét lựa chọn được tế bào chủ mới xem xét lựa chọn lợi

vecto thích hợp. Tùy từng mục đích sử dụng sản phẩm protein tái tổ hợp mà lựa chọn vecto

biểu hiện hợp lý để thuận tiện cho việc tách chiết, tinh chế và xác định sản phẩm cần thiết.

3. Ứng dụng công nghệ gen để sản xuất protein tái tổ hợp

Sản xuất insulin tái tổ hợp

Insulin (C257H383N65O77S6), khối lượng phân tử 5808 Dalton là một loại hormon do tế bào

tuyến tụy tiết ra được cấu tạo bởi 2 chuỗi polypeptid A và B được liên kết với nhau bằng cầu

Trang 104

Phân lập gen đặc tính

Lựa chọn tế bào chủ

Đưa gen đặc tính vào vectơ biểu hiện

Biến nạp vectơ vào tế bào chủ

Nuôi cấy tế bào để khuếch đại protein

Tách và tinh chế protein

Bảo quản, đóng gói

Lựa chọn vectơ biểu hiện

disulfua. Chuỗi A gồm 21 aa, chuỗi B gồm 30 aa. Insulin có tác dụng điều hòa nồng độ glucose

trong máu, đây là chức năng cực kỳ quan trọng vì glucose là nguồn nguyên liệu chính của hô

hấp tế bào và là nguồn khung cacbon quyết định cần cho tổng hợp các hợp chất hữu cơ. Duy trì

nồng độ glucose trong máu ở mức ổn định giúp cân bằng trao đổi chất. Ngoài ra insulin thúc đẩy

gan dự trữ glucose để hình thành glycogen. Phần lớn glucose được hấp thụ ngay từ ruột non vào

tế bào gan để chuyển hóa thành chất dự trữ glycogen. Insulin có nhiều tác động trong gan thúc

đẩy quá trình sinh tổng hợp glycogen. Đầu tiên nó hoạt hóa enzyme hexokinasse, chất này

phosphoryl hóa glucose làm glucose bị bẫy vào trong tế bào. Ngoài ra insulin còn hoạt hóa

enzym phosphofructokinase và glycogen syntase là những enzym liên quan trực tiếp đến quá

trình sinh tổng hợp glycogen. Khi cơ thể không có insulin , quá trình tổng hợp glycogen trong

gan sẽ dừng lạivà các enzym chịu trách nhiệm phân hủy glycogen sẽ hoạt động. Khi glycogen

tích tụ ở mức cao (≥5% khối lượng thô của gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Khi gan bão

hòa glycogen thì tất cả glucose hấp thụ vào tế bào gan đều chuyển sang tổng hợp acid béo sau

đó được vận chuyển ra khỏi gan ở dạng lipoprotein. Các lipoprotein này một phần đi vào vòng

tuần hoàn cung cấp các acid báo cho các mô khác như mô mỡ để tổng hợp triglycerid. Insulin ức

chế phân hủy chất béo trong mô mỡ bằng cách ức chế quá trình thủy phân triglycerid thành

glycerol và acid béo tự do. Ngoài ra insulin còn thức đẩy sự hấp thụ các acid amin, giúp các tế

bào tăng tính thấm đối với các ion kali, magie và phosphat vô cơ tạo thuận lợi cho quá trình

phosphoril hóa và sử dụng glucose.

Glucose được giải phóng từ tinh bột, saccarose… nhờ quá trình thủy phân khi tieu hóa

thức ăn sau đó được hấp thụ vào máu ở ruột non. Nồng độ glucose cao trong máu kích hoạt sự

giải phóng insulin và insulin hoạt động trong các tế bào khắp cơ thể nhằm thức đẩy sự hấp thụ,

sử dụng và dự trữ glucose. Các phân tử insulin tuần hoàn trong máu cho tới khi chúng gắn với

thụ thể của chúng trên màng tế bào. Khi đó phức hợp thụ thể - insulin khởi phát một chuỗi

truyền tín hiệu: “chuyển glucose ra khỏi huyết tương”. Trong tất cả các bước thì bước làm tăng

sự hoạt động của protein vận chuyển glucose GLUT4 là quan trọng nhất. GLUT4 vận chuyển rất

hiệu quả glucose vào các tế bào nên đã loại glucose ra khỏi máu một cách nhanh chóng (từ vài

phút đến vài giờ). GLUT4 có mặt trên màng tế bào của nhiều loại mô trong cơ thể như mô

xương (đốt cháy glucose làm năng lượng), mô mỡ (chuyển glucose thành triglyxerid để dự trữ)

Trang 105

… Vì insulin ngăn cản mức độ tăng quá cao của đường trong máu nên không được phép dư thừ

insulin trong cơ thể. Vì vậy có một nhân tố kiểm soát hàm lượng insulin là insulinase phân hủy

insulin đang tuần hoàn trong máu làm cho hormon này phân hủy trong thời gian bán rã khoảng 6

phút. Quá trình này đảm bảo mức độ insulin lưu hành trong máu được điều chỉnh và mức độ

glucose trong máu không giảm xuống thấp đến mức nguy hiểm.

Tiểu đường là bệnh rối loạn về chuyển hóa hydrat cacbon trong đó đường trong máu

không bị oxi hóa để sinh năng lượng mà tích tụ trong máu ở mức cao (>1,2 g/l) gọi là tăng

đường huyết. Ở Mỹ hàng năm có khoảng 17 triệu người (6% dân số) mắc bệnh tiểu đường phổ

biến ở những người trên 45 tuổi, béo phì và ít hoạt động, tiểu đường là căn bệnh đứng thứ 6

trong các bệnh gây chết người. Những bệnh nhân tiểu đường hàm lượng glucose trong máu cao

làm tăng áp lực thẩm thấu tuy nhiên quá trình hấp thụ glucose vào tế bào lại kém. Khi hàm

lượng glucose trong máu cao vượt quá ngưỡng hấp thụ của thận thì cơ quan này sẽ đào thải

glucose qua nước tiểu dẫn đến việc nước, các ion cần thiết cho sự trao đổi chất qua màng tế bào

sẽ bị theo ra ngoài.

Trong cơ thể insulin được tổng hợp bở các tế bào beta của tuyến tụy. Insulin được tạo ra

từ một phần của một protein lớn hơn để đảm bảo sự gấp nếp đúng. ARN thông tin tiến hành dịch

mã một protein gọi là preproinsulin bao gồm một trình tự tín hiệu đầu amin cần thiết để tiền chất

này đi qua được màng lưới nội chất tham gia vào quá trình sau dịch mã. Khi vào mạng lưới nội

chất thì trình tự tín hiệu của preproinsulin không còn cần thiết nữa nên nó bị thủy phân để tạo

thành proinsulin. Ngay sau khi hình thành 3 cầu disulfua thiết yếu đối với insulin thì một số

peptidase sẽ phân cắt insulin tạo ra sản phẩm cuối cùng là insulin hoàn chỉnh có hoạt tính sinh

học. Insulin được đóng gói chứa trong các hạt tiết tích tụ trong tế bào chất cho đến khi được kích

hoạt và giải phóng ra ngoài.

Tiểu đường typ I (tiểu đường phụ thuộc insulin) thường gặp ở tuổi dưới 20 chiếm từ 10

đến 15% số ca tiểu đường. Nguyên nhân của tiểu đường typ I là các tế bào beta ở tuyến tụy bị

phá hủy do nhiều nguyên nhân khác nhau như do bệnh tự miễn (do cơ thể bị nhiễm 1 loại virus

nào đó, cơ thể đáp lại bằng cách tạo ra kháng thể chống lại virus đó. Tuy nhiên kháng nguyên

của virus lại giống với kháng nguyên của tế bào tuyến tụy nên kháng thể được hình thành để

chống lại virus cũng chống luôn tế bào tuyến tụy). Có khoảng 20 gen đóng vai trò quan trọng

Trang 106

trong tiểu đường typ I. Để điều trị bênh này chỉ cần bổ sung insulin thường xuyên có thể duy trì

sự sống cho người bệnh.

Tiểu đường Typ II (tiểu đường không phụ thuộc insulin) là đặc trưng bởi sự thiếu hụt

insulin hoặc phổ biến hơn là giảm tính đáp ứng của các tế bào đích đối với insulin do một số

thay đổi của thụ thể trên màng tế bào (25% bệnh nhân tiểu đường giảm tiết insulin, 25% không

giảm tiết, 50% tăng tiết). Tiểu đường typ II thường xuất hiện ở những người trên 45 tuổi, những

người béo phì … Vì vậy đối với loại bệnh này thì cần phải kết hợp điều trị, tập luyện và chế độ

ăn uống.

Trước khi các nhà khoa học khám phá ra cơ chế hoạt động của insulin, những người mắc

bệnh tiểu đường typ I không có cơ hội sống khỏe. Năm 1921 hai nhà khoa học người Canada là

Frederick G. Banting và Charles đã tinh sạch thành công insulin từ tụy chó. Năm 1936 các nhà

nghiên cứu đã tìm ra cách làm cho insulin giải phóng chậm hơn trong máu. Năm 1950 sản xuất

được insulin hoạt động nhanh hơn và không tồn tại lâu trong máu. Vào thập kỷ 70 của thế kỷ

XX các nhà nghiên cứu đã sản xuất được insulin có hoạt động giống insulin tự nhiên là giải

phóng lượng nhỏ trong suốt cả ngày và tăng lên tại thời điểm các bữa ăn. Đầu tiên người ta sản

xuất insulin từ tụy bò, lợn, ngựa tuy nhiên nó có rất nhiều nhược điểm như:

- Cần 1 lượng lớn tế bào tụy động vật

- Insulin động vật có cấu trúc không hoàn toàn giống insulin người

- Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulin của người

- Khả năng hấp thụ kém

- Có thể gây các phản ứng miễn dịch trong cơ thể (có thể gây dị ứng)

- Không thể loại bỏ hết các tác nhân gây bệnh từ động vật

- Quá trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao

- Chi phí đắt

- Khó có thể sản xuất lượng lớn trên quy mô công nghiệp

- Giá thành cao

Cho đến năm 1977 một nhóm nghiên cứu đã ghép thành công gen mã hóa insulin của

chuột vào vi khuẩn và sau đó vi khuẩn này sinh tổng hợp insulin. Năm 1982 tập đoàn Lilly đã

sản xuất được insulin người và đó là sản phẩm sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên được

Trang 107

phê chuẩn. Không cần nhờ đến động vật các nhà nghiên cứu đã có thể sản xuất insulin bằng kỹ

thuật di truyền với số lượng không giới hạn. Sản phẩm này cũng không hề chứa bất kỳ tạp chất

nào từ động vật. Sử dụng insulin người cũng phá đi sự lo ngại về các bệnh lây nhiễm tiềm tàng

từ động vật. Số người sử dụng insulin sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngày một tăng. Năm

2001, 95% số người mắc bệnh tiểu đường trên thế giới sử dụng insulin tái tổ hợp.

Sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất insulin

Việc tổng hợp insulin người là một quá trình sinh hóa gồm nhiều bước. Mỗi nhà sản xuất

theo đuổi một phương pháp riêng tuy nhiên có 2 phương pháp cơ bản sau:

Phương pháp 1: Sản xuất bằng cách tạo ra các chuỗi riêng biệt sau đó kết hợp hóa học

lại hoặc bàng cách tạo ra 1 tiền chất chuỗi đơn proinsulin người sau đó phân cắt để tạo thành

insulin hoàn chỉnh. Để sản xuất thuốc thì con đường tổng hợp proínulin thích hợp hơn vì nó chỉ

đòi hỏi một khâu lên men và tách

- Bước 1: Tách gen mã hóa proinsulin của người, gen này nằm trên nhiễm sắc thể số

11. Gen này có thể được tách từ ngân hàng gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Người

ta cũng có thể tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ các tế bào tuyến tụy sau đó

dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen. Tiến hành sau mẢN

thành ADN (cDNA) nhờ enzym phiên mã ngược và các dNTP.

- Bước 2: Tách và thiết kế plasmid tái tổ hợp. cắt gen proinsulin và plasmid bằng cùng

một enzym giới hạn rồi nối chúng lại bằng enzym ligase của phage T4 (Các đoạn

cDNA mã hóa insulin hoàn chỉnh được biến nạp vào 1 plasmid đứng sau 1 promoter

mạnh). Trong thành phần của vecto biểu hiện phải có các promoter mạnh giúp cho

gen có thể biểu hiện được trong vi khuẩn. mặt khác cần phải thiết kế các trình tự mã

hóa protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất.

- Bước 3: Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ (E. coli) bằng sốc nhiệt

- Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen được lên men trong các điều kiện tối ưu

- Bước 5: Tinh sạch insulin bằng ly tâm và lọc.

- Bước 6: Hoạt hóa. Hệ thống E. coli có khả năng biểu hiện gen insulin nhưng không có

khả năng hoạt hóa insulin (biểu hiện hoạt tính insulin) nên phải thực hiện hoạt hóa

proinsulin bằng cách sử lý với các dung dịch đệm (axit, bazơ, …) giúp nó đạt cấu trúc

Trang 108

bậc 4 sau đó dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm

thu được mới có hoạt tính cần thiết.

- Bước 7: Sử dụng phương pháp sắc lý để tinh chế insulin sao cho hỗn hợp sau tinh

sạch chỉ còn insulin.

Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ 2 chuỗi A và B. Phương pháp này không cần thiết

các enzym đặc hiệu để cắt proinsulin thành insulin. Hai gen mã hóa 2 chuỗi A và B được

phân lập và tổng hợp bình thường như phương pháp 1. Tuy nhiên ở giai đoạn cuối hai

chuỗi A và B được trộn với nhau và nối bằnd cầu disulfua qua phản ứng oxi hóa khử nhờ

một chất oxi hóa.

Ngoài E. coli thì hiện nay nấm men cũng được sử dụng trong sản xuất insulin. Nấm men

có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo ra các phân tử insulin người gàn như hoàn chỉnh

với cấu trúc không gian hoàn hảo. Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của

các giai đoạn tinh sạch.

Trang 109