© Masson, Paris, 2004. Gastroenterol Clin Biol, 2004, 28

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CO21ÉTUDE DE LA VARIABILITÉ INTRA HÉPATIQUE DU GÈNEDE LA CAPSIDE DU VIRUS DE L’HÉPATITE C DANS DESCELLULES TUMORALES ET NON TUMORALES ISOLÉESPAR MICRODISSECTION

R Sobesky (1), F Rimlinger (2), A Dos Santos (1),F Demaugre (1), C Equi (1), C Bréchot (1), V Thiers (2)

La protéine de capside du virus de l’hépatite C (VHC) parti-cipe à la formation de la particule virale comme une protéinede structure mais elle module également l’expression de plu-sieurs génes cellulaires, avec un effet sur la prolifération et laviabilité cellulaire. Des mutations ponctuelles du gène de lacapside du VHC pourraient jouer un rôle dans les différentesétapes de la carcinogenése hépatique. En effet, il a été mis enévidence que des protéines de capsides codées de génomesisolés à partir des cellules tumorales présentaient des effetsbiologiques différents de celles des cellules non tumorales.Cependant ces études ont été limitées par l’hétérogénéité deslésions dans un foie infecté.

But : Effectuer une analyse comparative des séquences de cap-side du VHC isolées par microdissection laser de populationsspécifiques d’hépatocytes tumoraux et non tumoraux.

Malades et méthodes : Nous avons sélectionné pour cetteétude des coupes de foie congelées provenant de 5 maladesinfectés par le génotype 1b du VHC atteints de carcinomehépatocellulaire. Pour chaque malade des groupes d’environ2 000 hépatocytes adjacents isolés par microdissection laserdans la zone tumorale et d’au moins 2 nodules cirrhotiques ontété analysés. Les séquences complètes du gène de la capsidedu VHC ont été amplifiées par RT-nested PCR. Les produitsde PCR ont été directement séquencés et clonés en utilisant lesystéme TA-cloning. Dix clones de chaque zone microdissé-quée ont ensuite été séquencés.

Résultats : Nous avons mis en évidence pour un mêmemalade des mutations hétérogènes dans les séquences de cap-side isolées de la zone tumorale et à partir des différents nodu-les cirrhotiques. La majorité de ces mutations étaientsilencieuses après traduction de la séquence en acides aminés.L’analyse des différents clones a mis en évidence l’accumula-tion de substitutions nucléotidiques dans les hépatocytestumoraux par rapport aux hépatocytes non tumoraux. Aprèsdéduction de la séquence en acides aminés, le taux de surve-nue de mutations de la séquence de capside était plus élevé àpartir des quasi-espèces isolées des hépatocytes tumoraux.

Conclusion : Par cette approche combinant microdissectionlaser et RT-PCR : 1) nous avons isolé des séquences du gènede la capside du VHC à partir d’un nombre limité d’hépatocy-tes et ainsi clarifié la distribution des quasi-espècesintrahépatiques ; 2) nous avons mis en évidence une hétérogé-néité du gène de la capside entre des hépatocytes tumoraux etnon tumoraux, mais également de façon moins fréquente entredes nodules cirrhotiques distincts ; 3) ces résultats suggèrentque des mutations du gène de la capside pourraient être impli-quées dans la pathogenèse de l’infection par le VHC ; 4) nousavons mis au point un outil permettant d’étudier les rapportsentre des lésions hépatiques spécifiques et l’hétérogénéité dela capside du VHC.

CO22L’INHIBITION PAR ARN INTERFÉRENCE D’UNEPROTÉINE D’ÉCHAFAUDAGE, EBP50, DIMINUE LACROISSANCE DES CELLULES DE CARCINOME BILIAIRE

L Fouassier (1), M Mergey (1), RB Doctor (2), C Housset (1)

La protéine d’échafaudage EBP50 (Ezrin-Radixin-Moesinbinding Phosphoprotein 50) participe à la localisation apicaleet à l’activité de protéines-clé qui interviennent à la fois dansles fonctions de transport et la signalisation intracellulaire descellules épithéliales, incluant les hépatocytes et les cellulesépithéliales biliaires. Récemment, il a été montré qu’EBP50était phosphorylée par la kinase cdc2 au cours de la mitose etqu’elle pouvait interagir avec la beta-caténine, protéine desjonctions adhérentes qui au cours de la carcinogenése peutsubir une translocation nucléaire et se comporter comme unfacteur de transcription. L’objectif de cette étude était de déter-miner si EBP50 a une influence sur la croissance des cellulesde carcinome biliaire.

Méthodes : Une lignée de carcinome biliaire humain (Mz-ChA-1) a été transfectée de manière stable avec un vecteur plasmidi-que codant l’ARN interférence d’EBP50 humaine ou avec levecteur vide. Le niveau d’expression des transcrits et de la pro-téine EBP50 a été quantifié par RT-PCR en temps réel et parWestern blot. Le comportement des cellules en culture a étéobservé en microscopie optique. La prolifération cellulaire a étémesurée par incorporation de BrDU dans l’ADN des cellules.

Résultats : L’expression constitutive d’un ARN interférenced’EBP50 a permis de réduire le taux des ARNm de 30 % et laprotéine de 90 % par rapport à des cellules témoins transfec-tées avec le vecteur vide. La diminution d’expressiond’EBP50 a entraîné dans les cellules en culture un ralentisse-ment net de leur croissance par rapport aux cellules témoins.Les études de BrDU ont confirmé que la prolifération étaitinhibée de 70 % dans ces cellules. De plus, une augmentationde l’adhésion des cellules au support et une diminution desinteractions intercellulaires ont été observées.

Conclusions : Dans des cellules de carcinome biliaire, la perted’expression d’EBP50 entraîne une inhibition de la proliféra-tion et des interactions cellulaires. Ces résultats suggèrentqu’EBP50 pourrait jouer un rôle essentiel dans la proliférationet le pouvoir invasif des cellules de carcinome biliaire.

(1) INSERM U370, CHU Necker, Paris, (2) Centre nationalde référence sur les hépatites virales B et C, Institut Pas-teur/CHU Necker, Paris.

(1) INSERM U402, UFR Saint-Antoine UPMC, Paris,(2) Departments of medicine and cellular and structuralbiology, UCHSC Denver, CO, États-Unis.