Contrôle de qualité des antibiotiques dans la Pharmacopée Européenne : évolution récente dans le cas des aminosides

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    2007. Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs Ann Pharm Fr 2007, 65 : 174-182

    Contrle de qualit des antibiotiques dans la Pharmacope Europenne : volution rcente dans le cas des aminosides

    A. Nicolas,

    Rsum.

    Les aminosides constituent une classe dantibio-tiques caractrise par une structure chimique drive desucres amins lis par un pont glycosidique un noyaucentral aminocyclitol. Plusieurs dentre eux font lobjetdune monographie dans ldition en vigueur de la Pharma-cope Europenne. Le contrle des impurets est effec-tu par lessai des substances apparentes. La ncessitdun contrle plus efficace du profil de qualit conduit remplacer la chromatographie en couche mince par lachromatographie liquide. Dans le cas particulier des amino-sides se pose alors le problme de la dtection car cescomposs sont dpourvus de chromophores. Il est doncimpossible dutiliser le traditionnel couplage la dtectionUV-visible. Si le contrle de lamikacine (base et sulfate)utilise encore une raction de drivation prcolonne avecdtection 340 nm, lapproche actuelle privilgie lanalysedirecte des substances pharmaceutiques. Deux modesparticuliers de dtection peuvent alors tre utiliss : ladtection par ampromtrie pulse et la dtection par dif-fusion de lumire. La prsentation discutera les avantageset les inconvnients respectifs de chacun.

    Mots-cls :

    Aminosides, Contrle analytique, Pharmaco-pe europeenne, Dtection, Chromatographie liquidehaute performance.

    Summary.

    Aminoglycosides constitute a particular classof antibiotics presenting aminoglycoside moieties linked toa central aminocyclitol ring. Several aminoglycosides aredescribed by a monograph in the European Pharmaco-poeia. The related substances test is used to check forimpurities. For this purpose, thin layer chromatography isnow being replaced by high performance liquid chromato-graphy. In the case of aminoglycosides the main challengeis the detection of these compounds since they do notpossess a chromophore in their structure. Different possi-bilities are proposed in the monographs. Amikacine isdetected at 340 nm after pre-column derivatization. Inmore recent monographs, pulsed amperometry detection isproposed. However, this mode of detection requires skilfulmanipulations. Evaporative light scattering detection could be avaluable alternative. The advantages and drawbacks of eachapproach will be discussed.

    Key-words:

    Aminoglycosides, Analytic quality control,European Pharmacopoeia, Detection, High-performanceliquid chromatography.

    Control of the quality of antibiotics in the EuropeanPharmacopoeia: recent development in the case of ami-noglycosides.

    A. Nicolas,

    Ann Pharm Fr

    2007,

    65

    : 174-182.

    Laboratoire de Chimie analytique et Bioanalyse du mdicament, Umr Uhp-Cnrs 7561, Facult de Pharmacie, Universit Henri-Poincar,

    5, rue Albert Lebrun, BP 80403, F 54001 Nancy.

    Prsentation devant lAcadmie nationale de pharmacie, sance du 23 mars 2006 dlocalise Nancy.

    Correspondance :

    A. Nicolas, ladresse ci-dessus.

    E-mail : alain.nicolas@pharma.uhp-nancy.fr

  • Analyse des aminosides

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    Introduction

    La famille des aminoglycosides (aminosides)occupe une place particulire dans larsenal desantibiotiques. Depuis la dcouverte de la strepto-mycine en 1944 par Waksman [1], plusieursmolcules ont t dveloppes en thrapeutiquehumaine [2]. Malgr leur anciennet, les amino-sides conservent une activit bactricide remar-quable vis--vis notamment des bacilles Gramngatif arobies. Ils agissent sur les germes enperturbant la synthse des protines au niveau dela fraction 30S du ribosome. Leur effet synergi-que avec les btalactamines et leur bactricidierapide sur de nombreux agents pathognes lesrendent incontournables, malgr leur faible dif-fusion tissulaire, pour le traitement de nombreusesinfections svres. La streptomycine est notam-ment active sur

    Mycobacterium tuberculosis.

    Plusieurs dentre eux font lobjet de monogra-phies dans la Pharmacope Europenne en vigueur[3].

    Structure, origine et proprits physico-chimiques des aminosides

    Les aminosides sont des sucres amins lis par unpont glycosidique un noyau central aminocy-clitol dont la structure permet de distinguer troisgroupes de composs : les streptomycines, lesdsoxystreptamines et les fortimicines. Ils sontdorigine naturelle (streptomycine, kanamycine,tobramycine, gentamicine) ou hmisynthtique(amikacine, ntilmicine)

    (tableau I)

    .Les aminosides sont des bases polycationiques.

    Leur solubilit dans leau est amliore sousforme de sels, gnralement des sulfates. Lesprincipaux groupements chimiques ractifs sontdes groupements hydroxyles et des groupementsamins primaires en nombre variable.

    Les aminosides ne possdent pas de chromo-phores lexception de la streptomycine (grou-pements guanidine). La dtection de cescomposs et de leurs substances apparentes pr-sente donc des difficults lors danalyses mettanten uvre des mthodes chromatographiquesncessitant leur dtection. Les mthodes actuel-lement utilises pour le contrle des substances

    apparentes et la dtermination de la teneur figu-rent dans le

    tableau II

    .

    Dtection aprs raction de drivation

    Les ractions de drivation consistent modifierchimiquement la structure des analytes gnra-lement pour introduire des proprits permettantleur dtection [4]. Les ractions de drivationpeuvent avoir lieu soit avant (drivation prco-lonne), soit pendant (drivation sur colonne),soit aprs le processus chromatographique (dri-vation post-colonne).

    Le choix du mode de drivation est fonction dediffrents paramtres : cintique de la raction,dveloppement dune mthode chromatogra-phique propre aux drivs forms, stabilit desdrivs, automatisation possible de la ractionchimique.

    De nombreux ractifs ont t dcrits pour obte-nir des drivs partir de la fonction amine. Ilspeuvent donner lieu une dtection en UV-visibleou en fluorescence qui sont les deux modes dedtection les plus utiliss en CLHP.

    Drivation prcolonne de lamikacine par lacide 2,4,6-trinitrobenzne sulfonique (TNBS)

    Les monographies relatives lamikacine (base etsulfate) sont les seules qui utilisent une ractionde drivation la fois pour le contrle des subs-tances apparentes et pour la dtermination de lateneur.

    Lacide 2,4,6-trinitrobenzne sulfonique a tutilis initialement par Satake

    et al

    . [5] pour ladrivation des aminoacides et des peptides puisappliqu par Gambardella

    et al.

    lanalyse desaminoglycosides [6].

    Les conditions dobtention du driv (milieupyridine, 75

    C, 45 min) sont proches de cellesdcrites par Gambardella

    et al

    . Laddition dacideactique en fin de raction stabilise les drivsforms pour une dure minimum de 10 heures.Les solutions sont maintenues 10

    C pendantlanalyse et la dtection seffectue 340 nm.

  • A. Nicolas

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    Tableau I. Structure chimique et origine des aminosides figurant la Pharmacope Europenne [3].Chemical structure and origin of the aminosides described by a monograph in the European Pharmacopoeia [3].

    Antibiotique Structure chimique Origine

    AmikacineAmikacine (sulfate d)

    Hmisynthse partir de ka-namycine A.Acylation de la fonction amine en 1 par lacide 4-amino-2-hydroxybutyrique.

    Framyctine (sulfate de)Nomycine (sulfate de)

    Streptomyces fradiae ou Strepto-myces decaris

    Gentamicine (sulfate de) Micromonospora purpurea

    Kanamycine (monosulfate de) Streptomyces kanamyceticus

    Ntilmicine (sulfate de) Hmisynthse partir de siso-micine

  • Analyse des aminosides

    177

    La sparation des drivs met en uvre uneCLHP polarit de phases inverse en mode iso-cratique. La mthode permet de sparer en40 minutes le prcurseur de synthse (kanamy-cine A) ainsi que les trois isomres de positionobtenus lors de lhmisynthse : isomres mono-substitu en 2, disubstitu en 1 et 2, monosubstituen 3.

    Bien que le nombre de groupements aminsdrivs ne soit pas le mme pour toutes les impu-rets, la mthode ne propose pas de facteur decorrection. Linjection dun blanc est ncessaireafin de tenir compte des pics dus lexcs de rac-tif et dventuels produits secondaires.

    Dtection lectrochimique

    Si la mise en uvre de raction de drivationrsout des problmes de dtection par un choixappropri du ractif de drivation et sappuie surlutilisation de mthodes spectroscopiques bien

    connues, elle peut nanmoins prsenter des limi-tations en terme de quantification des impurets :cintique de formation diffrente, nombre de grou-pements drivs diffrents, facteur de rponse dif-frent.

    Lapproche suivie dsormais par la Pharmaco-pe europenne est de privilgier lanalyse dessubstances pharmaceutiques sous forme nativeexcluant la formation de drivs.

    Lanalyste se trouve alors confront au choix dela mthode de dtection. En effet, la mise enuvre de la CLHP ne saccompagne pas de lexis-tence dun mode de dtection universel. Si larfractomtrie peut remplir ce rle, ses limites enanalyse quantitative sont bien connues : impossi-bilit dutiliser des lutions par gradient, sensibilit la temprature, mauvaise limite de dtection.Afin de pouvoir remplacer les mthodes tradi-tionnelles de chromatographie en couche mince(CCM), le passage la CLHP a ncessit, dans lecas des aminosides, lintroduction de la dtectionlectrochimique.

    Tableau I (Suite). Structure chimique et origine des aminosides figurant la Pharmacope Europenne [3].Chemical structure and origin of the aminosides described by a monograph in the European Pharmacopoeia [3].

    Antibiotique Structure chimique Origine

    Streptomycine (sulfate de) Streptomyces griseus

    Tobramycine Streptomyces tenebrarius

  • A. Nicolas

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    Celle-ci est dsormais utilise dans plusieursmonographies de la Pharmacope europenne :framyctine et nomycine, gentamicine, ntilmi-cine, tobramycine.

    Lampromtrie pulse constitue un mode dedtection particulirement bien adapt la dtec-tion des sucres et des composs structurellementproches tels que les aminosides [7-14].

    pH lev (> 12), les sucres subissent uneoxydation lectrocatalytique la surface dunelectrode en or port un potentiel positif E

    1

    [15]. Le courant gnr est proportionnel laconcentration en aminosides. Cependant, si onnapplique quun potentiel unique llectrode,celle-ci sempoisonne par accumulation desproduits doxydation conduisant une perte dusignal. Ce phnomne est vit par lapplicationdune srie de potentiels pendant des duresdtermines (profils de potentiel).

    La rgnration de ltat de surface passe parlapplication dun potentiel doxydation lev E

    2

    induisant la dsorption des espces par la forma-tion doxyde (AuO). Cependant ces derniers sontinertes et doivent tre limins par dissolutioncathodique au potentiel ngatif E

    3

    pour restaurerune surface mtallique propre et ractive. Lappli-cation rpte de ce cycle de potentiels constituele fondement de la dtection par ampromtriepulse (PAD). Une excellente mise au point surloptimisation des profils de potentiels a t publiepar LaCourse et Johnson [16].

    Rcemment, un profil de potentiel dans lequella dsorption des espces est effectue unpotentiel E

    2

    trs ngatif ( 1,0 2,0 V) a tpropos [17-20]. La stabilit du signal longterme est alors grandement augmente au dtri-ment dune moins bonne limite de dtection paraugmentation du bruit.

    Lutilisation de la dtection par ampromtriepulse est facilite lorsque la sparation chroma-tographique est ralise en milieu trs alcalincompatible directement avec la dtection. Cest

    Tableau II. Mthodes actuellement utilises pour le contrle des substances apparentes et la dtermination de la teneur [3].Methods for relative substances test and assay [3].

    Substances apparentes Dosage

    AmikacineAmikacine (sulfate d)

    CLHPDrivation prcolonne TNBSDtection UV-visible 340 nm

    CLHPMme mthode96,5 102,0 pour cent (base)

    Framyctine (sulfate de)Nomycine (sulfate de)

    CLHPDtection ampromtrique pulsationsDtection : 0,00 VOxydation : + 0,80 VRduction : 0,60 V

    Titrage microbiologique

    Gentamicine (sulfate de) Composition et substances apparentesCLHPDtection ampromtrique pulsationsDtection : 0,05 VOxydation : + 0,75 VRduction : 0,15 V

    Titrage microbiologique

    Kanamycine (monosulfate de) CCM Titrage microbiologique

    Ntilmicine (sulfate de) CLHPDtection ampromtrique pulsationsDtection : 0,05 VOxydation : + 0,75 VRduction : 0,15 V

    Titrage microbiologique

    Streptomycine (sulfate de) CCM Titrage microbiologique

    Tobramycine Dtection ampromtrique pulsationsDtection : 0,05 VOxydation : + 0,75 VRduction : 0,15 V

    CLHPMme mthode97,0 102,0 pour cent

  • Analyse des aminosides

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    le cas lorsquune chromatographie dchangedanions est utilise [19].

    Malheureusement, la Pharmacope europennea choisi des procds chromatographiques quincessitent une alcalinisation post-colonne de laphase mobile par addition dune solutiondhydroxyde de sodium concentre exempte decarbonates. La mise en uvre globale de lamthode devient alors dlicate et le choix dunpotentiel E

    2

    positif conduit une diminution dusignal au cours du temps qui ne permet plus de res-pecter les limites dexclusion fixes par les mono-graphies (rsultats personnels).

    Dtecteur vaporatif diffusion de lumire (DEDL)

    Ce type de dtecteur a t introduit rcemmentdans larsenal possible des dtecteurs en CLHP[21-23] et ses domaines dapplication ont faitlobjet dune revue rcente [24]. Son principerepose sur la possibilit de dtecter tout analytemoins volatil que la phase mobile par la mesurede la lumire diffuse par des particules solides[25-27].

    Trois tapes principales existent : la nbulisa-tion de lluat chromatographique, lvaporationde la phase mobile, la dispersion de la lumirepar les particules solides formes.

    La nbulisation est gnralement assure parun gaz tel que lair ou le diazote. Cette tapetransforme la phase liquide en un arosol de finesgouttelettes. Lvaporation de la phase mobile estralise dans un tube chauff. Lvaporation doitse produire la temprature la plus basse possibleafin dempcher la perte de substances facilementvolatiles. Dans le cas dune lution chromatogra-phique par gradient, la temprature doit tre ajus-te en tenant compte du solvant le moins volatil.Une augmentation de la longueur du tube permetde travailler une temprature plus basse. Il estimportant de crer un dbit stable de gaz afin dene pas dgrader lefficacit chromatographique.Les particules solides rsultant de lvaporationde la phase mobile sont capables de diffuser lalumire mise par une source lumineuse poly-chromatique (lampe tungstne/halogne) ou leplus souvent laser.

    Plusieurs tudes se sont intresses linfluencedes conditions opratoires [28, 29] et la naturedu signal obtenu [30, 31].

    Il est reconnu que dans un domaine assez largede taille des particules, la surface (A) du picobtenu est relie la masse (m) de lanalyte parune relation du type A = am

    b

    dans laquelle a etb sont des coefficients dpendant des conditionsexprimentales (nature de la phase mobile, dbitde la phase mobile et du gaz, temprature devaporisation) et du solut (taille des gouttelettes,concentration).

    La linarisation de la rponse peut tre obtenuepar transformation logarithmique : log A = b log m+ log a.

    La rponse de ce type de dtecteur tant fonc-tion de la quantit de particules diffusant lalumire et non des proprits individuelles dusolut, une rponse uniforme est obtenue dansle cas de composs structurellement ap...

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