Corso Di Biologia Molecolare e Cellulare

7/27/2019 Corso Di Biologia Molecolare e Cellulare

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Enrico Colombo Biologia molecolare e cellulare 1

CORSO DI BIOLOGIA MOLECOLARE ECELLULARE

II semestre 2007/2008

Prof.ssa Marina Colombi

Indice…




Introduzione.

La Biologia è lo studio degli esseri viventi sulla terra, delle lorostrutture, dei loro meccanismi vitali.

Individua delle caratteristiche comuni e procede alla classificazionedegli esseri viventi e all‟approfondimento delle specifichecaratteristiche di ogni regno, classe, specie.

Per essere vivente si intende un qualsiasi sistema molecolare in gradodi nascere, crescere, dar vita a nuovi viventi con caratteristiche simili .

Ciascun vivente può raggiungere questo obbiettivo solamente perchéè in possesso di un materiale genetico, che contiene in sé tutte lecaratteristiche dell‟individuo.

La vita è permessa da complessi meccanismi che avvengono a livellodelle macromolecole biologiche, che sono formate sostanzialmente da

pochi elementi chimici, con caratteristiche idonee alla vita:- carbonio- ossigeno- idrogeno- azoto- zolfo.

I regni

La teoria dell’evoluzione ha permesso di individuare le tappe con cui è

avvenuta la formazione dei singoli individui. La classificazione, quindi,avviene su scala evolutiva e parte inizialmente in una divisione per stadio macroevolutivo.

Si possono individuare due grandi regni cellulari: procarioti edeucarioti.

I procarioti sono cellule estremamente semplici, per quanto riguardal‟evoluzione. Il loro materiale genetico non è racchiuso in alcun tipo diinvolucro, ma immerso nel citosol.

Le cellule eucariotiche invece, possiedono un nucleo che è racchiusoin un involucro, la membrana nucleare, che scambia informazioni con ilcitoplasma della cellula.

Le cellule eucariotiche formano due grandi regni dei viventi:

- protisti: sono cellule eucariotiche che permangono nello stadiounicelulare e non si associano in organismi complessi.

- Organismi pluricellulari: sono dei complessi di cellulespecializzate e differenziate, che assieme concorrono per ilmantenimento e l‟espletazione della vita.

L‟evoluzione ha portato gli individui pluricellulari a suddividersi in tregrandi regni:

- animali

- vegetali- funghi

L’origine della vita sulla terra.

4,6 miliardi di anni fa, l‟atmosfera della terra era molto differenterispetto a quella che si presenta adesso.

L‟atmosfera terrestre era composta da:

- vapore acqueo (H2O)- anidride carbonica CO2.

- Monossido di carbonio CO.- Idrogeno molecolare H2.- Azoto molecolare N2.

Inoltre, la forte presenza di radiazioni UV permetteva la produzione di:

- Ammoniaca NH3.- acido solfidrico H2S.- metano CH4.




Formazione di molecole organiche.

Nell‟atmosfera terrestre di quegli anni, vi era totale assenza diossigeno libero (O2), quindi la possibilità di formare molecoleorganiche senza andare incontro ad ossidazione.

Vi erano, oltre all‟assenza di ossigeno, altre condizioni molto favorevoli

alla formazione di molecole:- presenza di enormi fonti energetiche: c‟erano innumerevoli

vulcani, tempeste di scariche elettriche, radiazioni ultraviolette(UV) e continui bombardamenti da parte di meteoriti.

- Presenza di precursori chimici: c‟era acqua sottoforma divapore, minerali inorganici che fungevano da catalizzatori(rocce argillose e numerose bocche idrotermali e sulfuree), adesempio Zn e Fe.

- Tempo sufficientemente lungo: queste condizioni si protrasseroper un tempo adeguato.

L‟esperimento che provò la probabilità della formazione di molecole

organiche da elementi inorganici fu fatto da due coppie di scienziati indue epoche differenti:

- 1920, da Oparin e Haldane- 1950, da Miller e Ury, da cui prese il nome.

L‟esperienza di Miller e Ury , consisteva nel simulare, all‟interno diun‟ampolla le condizioni dell‟atmosfera primordiale:

- misero vapore acqueo, metano, ammoniaca e idrogeno.- Li bombardarono con delle scariche elettriche.

Il risultato fu sorprendente: si trovarono degli amminoacidi, piccoli acidinucleici, altre piccole molecole organiche.

Questa dimostrazione permette di formulare la teoria dell‟origine dellavita:

- le prime molecole organiche si sono formate in piccole lagune- in seguito si accumularono in ciò che venne definito brodo

primordiale.

Dal brodo primordiale si rese possibile la formazione di macromolecole quali proteine, RNA, DNA, zuccheri, ecc…

La polimerizzazione, in assenza di O2, avvenne su rocce argillose e inprossimità delle sorgenti sulfuree:

- si univano i monomeri con l‟eliminazione di una molecola

d‟acqua. - La reazione era catalizzata dai numerosi elementi metallicipresenti nelle rocce argillose, come zinco e ferro, ramemetallico, magnesio, ecc…

Nascita dei viventi.

Grazie alla formazione dei polimeri di maggiori dimensioni, questi, siassociano, dopo un lunghissimo lasso di tempo. La prima cellulaprocariote comparse circa 3,5 miliardi di anni fa:

- ebbero origine i procarioti che vivevano facendo respirazioneanaerobia.

- Erano organismi eterotrofi, molto semplici.- Successivamente divengono autotrofi, ovvero capaci di

sintetizzare le proprie molecole vitali.

Gli eucarioti comparvero circa 2 miliardi di anni orsono, secondo lateoria simbiotica, per internalizzazione e fusione di batteri, cloroplasti,mitocondri:

- questi iniziano la produzione di ossigeno molecolare- Pian piano, si forma l‟atmosfera odierna, ricca di ossigeno e di

azoto.- Col passare del tempo si estinguono gli anaerobi e nascono gli

organismi a respirazione aerobica.In queste modalità si ha la nascita della vita, che dall‟acqua, si spostasulla terra ferma.




dogma centrale della biologia.

Ciascun essere vivente ha una peculiarità, un proprio ciclo vitale, che èscritto nel suo codice genetico:

- racchiude il progetto biologico di ciascun individuo.- Ogni patrimonio genetico è unico.

- Il patrimonio genetico è costituito da una o più molecole diacido desossiribonucleico, il DNA.

Il dogma centrale della biologia, in cui è racchiuso il progetto biologicodi ciascun individuo, riassume le seguenti tappe:

- il DNA può duplicare sé stesso (replicazione ) o codificare per RNA (t rascr iz ione )

- l‟RNA codifica per le proteine ( t raduzione ).

Il corretto funzionamento di uno di questi meccanismi può causareaberrazioni cromosomich e , le quali possono avere sia effetti positiviche negativi:

- evoluzione- malattie genetiche.

La vita è garantita dal DNA, che codifica per le proteine, le qualisvolgono tutte le azioni di catalizzazione e di funzionamento per lasopravvivenza di ogni cellula.

Il genoma umano.

Gli acidi nucleici

Il genoma di un individuo è l‟insieme di geni e di informazioni circa lasua struttura e le sue funzioni, con i relativi meccanismi che leregolano.

Negli anni „40 s‟iniziò a porre il quesito della natura chimica delpatrimonio genetico umano. Era chiaro, che il patrimonio geneticodovesse risiedere in una qualche struttura molecolare.

Risultò, dopo esperimenti condotti da numerosi ricercatori, che ilgenoma di qualsiasi cellula era composto di molecole di DNA: acidi desossiribonucleici .

Prima della scoperta della struttura della molecola di DNA da parte diWatson e Crick, era chiaro che il DNA era formato da una unitàchimica chiamata nucleotide, formato da:

- Uno zucchero pentoso (a cinque atomi di C).- Un gruppo fosfato posizionato in posizione 5‟ sullo zucchero - Una base azotata.

Zuccheri pentosi

Nel caso della molecola di DNA, lozucchero fondamentale è il D-2‟ribofuranosio, altresì dettodesossiribosio, poiché deriva dalladeidrossilazione del carbonio 2‟ delribosio.




È altrettanto chiaro, oggi, che la molecola di RNA, che si origina astampo dal DNA è composta da ribosio, come zucchero pentoso.

Sia nel DNA che nell‟RNA ilcarbonio in 5‟ è esterificato da ungruppo fosfato, che consentiràanche all‟altro anello zuccherino

di legarsi allo zuccherosuccessivo.

Il legame tra il desossiribosio e lozucchero successivo avvienesempre in posizione 3‟:

- si vedrà che sulla lungacatena di DNA e di RNA sipossono individuare due estremità, una 3‟ e l‟altra 5‟.

Basi azotate.

Esistono due tipi di basi azotate nei nucleotidi:

- pirimidine: ad anello singolo.- purine: ad anello doppio, uno esagonale e l‟altro pentagonale.

Le purine sono due, identiche sia nel DNA che nell‟RNA, e sono: - adenina- guanina

Le pirimidine sono due nel DNA:

- citosina- timina

Nell‟RNA la pirimidina timina è sostituita dall‟uraci le , che differisce per la mancanza di un metile sul C-2.

Nucleotidi.

I nucleotidi sono delle strutture formate da uno zucchero pentoso a cuisi legano una base azotata e un gruppo fosfato.

Sono presenti anche più gruppi fosfato, legati tra loro da legamifosfodiesterici. Tra questi si può annoverare l‟ATP (adenosintrifosfato)e altri nucleotidi di o trifosfato, che svolgono funzioni differenti nellacellula, non solamente quelle di codice genetico.

La nomenclatura dei nucleotidi prende il nome del nucleoside da cuiparte, cioè la parte di molecola formata dallo zucchero e dalla base,che si lega in posizione 1 sullo zucchero.

Al nome del nucleoside si fa seguire il numero dell’atomo di carbonio cui si lega il fosfato e mono-, di-, tri-fosfato.

Baseazotata

Nucleoside nucleotide

Adenina (desossi)adenosina (desossi)adenosina-5‟ monofosfato

Guanina (desossi)guanosina (desossi)guanosina 5‟-monofosfato

Citosina (desossi)citidina (desossi)citidina 5‟-monofosfato

Timina (desossi)timidina (desossi)timidina 5‟-monofosfato

Uracile Uridina Uridina-5‟ monofosfato

Ovviamente, il prefisso desossi- si inserisce qualora lo zucchero checostituisce il nucleoside sia il desossiribosio.




La struttura della molecola di DNA.

I vari nucleotidi si dispongono ordinatamente tra loro, in un filamentoche costituisce la stampella primaria del DNA.

Il filamento singolo di DNA e RNA

Una molecola di oligonucleotide è formata da una catena di nucleotidi che si dispongono in serie, che differiscono solamente per le basi azotate.

I legami sono di tipo fosfodiesterico e si instaurano tra:

- il carbonio in 3‟ di uno zucchero - il fosfato posto in 5‟ sullo zucchero precedente

Questo tipo di legame permette di individuare una certa polarità nellamolecola di DNA. Si individuano infatti, agli estremi della catena, dueestremità differenti:

- l‟estremità 3‟ in cui si ha un –OH- l‟estremità 5‟ in cui si ha legato un –PO32-.

Le scoperte di Chargaff

Le prime analisi a diffrazione di raggi X dimostrarono che un nucleotideimpilato su un altro nell‟ambito della molecola di DNA occupava unospazio verticale di 0,34 nm.

Si suggerì inoltre la presenza di una ripetizione ogni 10 nucleotidi,circa, di 3,4 nm.

Erwin Chargaff, nel 1950, scoprì importanti informazioni che permisero

a Watson e Crick di elaborare il modello della molecola:- smentì la teoria del tetra nucleotide, che prevedeva che i

nucleotidi si ripetessero con la medesima sequenza di basi, ilche faceva pure dubitare del ruolo informazionale dellamolecola.

- Studiando i rapporti della composizione in basi dei nucleotidiscoprì che una purina si appaia sempre con una pirimidina,nello specifico, in coppie:

o Adenina - timinao Guanina - citosina

Era dunque presupposto, che la molecola era composta da coppie di

basi che si legavano tra loro.




Il modello di Watson e Crick

Anche sulla base dei dati elaborati da diffrattometrie a raggi X da partedi Franklin e Wilkins, i due scienziati che scoprirono la struttura dellamolecola di DNA poterono formulare la loro ipotesi.

Il modello prevedeva:

- la molecola è composta da due catene di nucleotidi .- Le catene si avvolgono a spirale formando una doppia elica

destrorsa.- I due filamenti scorrono in direzioni antiparallele, uno da 5‟ a 3‟,

l‟altro da 3‟ a 5‟. - Lo scheletro formato dalle molecole zucchero – fosfato –

zucchero – fosfato, è situato all‟esterno. Il fosfato porta unacarica negativa alla molecola.

- Le basi sono impilate una sull‟altra con un decorsoperpendicolare all‟asse del filamento.

- Le varie basi, seguendo la regola AT CG, sono appaiatemediante legami idrogeno:

o Gli atomi di azoto legati a C4 della citosina e C6dell‟adenina sono nella configurazione amminica (-NH2),piuttosto che in quell‟imminica

o Gli atomi di ossigeno legati a C4 della timina e a C6della guanina sono nella forma chetonica (-C=O),piuttosto che in quell‟enolica.

- Ne consegue che i legami a idrogeno sono facili da scindere eavvengono in numeri differenti:

o Tre per le coppie G-Co Due per le coppie A-T.

- La larghezza della catena, poiché un singolo nucleotide è largo

10 nm, è di 20 nm.- L‟avvolgimento delle due catene avviene con un solcomaggiore e un solco minore. Nel solco maggiore si inserisconole proteine associate al DNA.

- La doppia elica, forma un giro completo ogni 10 coppie di basi .- I due filamenti seguono la regola della complementarietà tra

basi azotate.

L’importanza del modello di Watson e Crick

Affinché il materiale genetico sia effettivamente portatoredell‟informazione, deve soddisfare a tre fondamentali funzioni:

1) deposito dell’informazione genetica: deve contenere leistruzioni precise per il mantenimento e l‟espressione dei

caratteri dell‟organismo. 2) Auto duplicazione ed ereditarietà: il DNA deve essere ingrado di essere trasmesso alla progenie.

3) Espressione del messaggio genetico: deve poter stabilirel‟ordine con cui alcuni amminoacidi che codificano per proteineo enzimi, vengono espressi. Deve regolare il centro direzionaledelle attività cellulari.

Dal punto di vista del primo e del secondo punto Watson e Crickavevano azzeccato:

- la sequenza di basi azotate codificava per amminoacidicorrisposti nell‟ordine in cui comparivano nel peptide

corrispondente. Un certo numero di basi sarebbe un gene.- Anche per quanto riguarda la replicazione. Le due catene sislegano e ognuna funge da stampo per la cellula figlia. Il DNArisulterebbe quindi un materiale semiconservato.

Per quanto riguarda la regolazione dell‟espressione genica e altrespecifiche funzioni regolative a livello cellulare, se si accetta laproposta di Watson e Crick, ogni futura teoria sul DNA deve esserecoerente con tale modello.

Vi è da aggiungere che la conformazione del DNA come descritta daWatson e Crick non è l‟unica possibile, ma quella più stabile cheriguarda il DNA inattivo o in particolari condizioni.

Questa forma è detta B-DNA, mentre ne esistono altre, tra cui la forma A e la forma Z:

- la forma A è sempre una doppia elica destrorsa ma con unpasso più elevato

- la forma Z è un avvolgimento sinistrorso e irregolare, senzasolchi difformi.




Ordine e lunghezza dei nucleotidi

Quanto DNA nell’uomo

La unità di misura del DNA sono le coppie di basi . Un filamento di DNAcontiene miliardi di coppie di basi, infatti sono utilizzati i multipli del “B”:

- chilo base (kb)- megabase (Mb)- gigabase (Gb).

Nel DNA umano sono presenti circa 6 gigabasi:

- equivale a circa 60 libri di 600 pagine, ciascuna con circa 1000caratteri per pagina.

come sono ordinati i nucleotidi

Le sequenze di basi portano in sé l‟informazione genetica. Tuttal‟informazione contenuta in un nucleo è detta genoma .

L‟ordine con cui le basi si dispongono è stato dato dall‟evoluzione, cheattraverso la selezione naturale ha selezionato gli individui chepossedevano sequenze più vantaggiose.

Ogni specie ha generalmente un assetto nucleotidico proprio.

I nucleotidi, all‟interno del DNA sono ordinati con specifiche sequenzeche portano informazioni per la codifica delle proteine:

- geni: sono sequenze di nucleotidi che codificano per unaproteina.

- Cassette di sequenza con raggruppamenti specifici: sonodelle stringhe ripetute che portano informazioni non codificanti,

funzionali alla regolazione dell‟espressione genica oall‟assunzione della conformazione della molecola stessa diDNA.

Cassette di sequenza specifiche sono le TATA box , ad esempio, chesono facilmente scindibili poiché hanno per lunghi tratti solo duelegami idrogeno da scindere:

- sono segnali riconoscibili da proteine specifiche.- Attraverso queste sequenze il DNA è in grado di interagire con

le proteine specifiche per la sua regolazione, duplicazione,espressione, ecc…

i geni

cosa sono i geni?

Un gene è una specifica sequenza di DNA che codifica per un RNAfunzionale o per un RNA messaggero, quindi per una proteina.

Il quantitativo di geni presenti in una specie è sintomo della suacomplessità:

- se vi sono pochi geni, l‟organismo sarà molto più semplice,- se ve ne sono molti, l‟organismo avrà specifiche funzioni.

Negli umani (homo sapiens), il contenuto in geni nel nucleo è pari al

2% dell‟intero genoma: - il restante 98% ha funzioni strutturali e regolative- i geni sono assai scarsi, se non assenti, a livello dei telomeri e

dei centromeri. Questo permette di evitare errori di delezione degli estremi del DNA.

In organismi più semplici, con un minore rapporto geni/basi, il DNA èutilizzato e sfruttato al massimo:

- possono presentarsi i geni policistronici.

Omologia di sequenza: se due specie possiedono almeno un 20% digenoma in comune, è un indice di origine comune dal punto di vista

evolutivo.Solamente in seguito, l‟evoluzione introdurrà delle differenze specie-specifiche.




Il crossing-over ineguale

Il crossing-over ineguale è un sorprendente meccanismo che portatalvolta alla dupl icazione genica , su un filamento, e alla delezione suun altro.

L‟evento di crossing-over ineguale avviene quando nella meiosi i

cromosomi omologhi non si appaiano perfettamente, avendo unoscambio genetico difforme, in cui:

- un cromosoma possiede un tratto di DNA in più che può essereun gene duplicato

- l‟altro possiede un tratto di DNA in meno, quindi la delezione dei geni in esso contenuto.

La maggior parte delle duplicazioni viene persa nell‟evoluzione, maalcune si rivelano vantaggiose e passano alla generazione successiva:

- si origina un gruppo di geni disposti in tandem - successivamente, i geni possono subire delle mutazioni , che li

porta a codificare delle proteine che tra loro sono i so forme .

Sono numerosi i casi in cui le proteine sono delle isoforme, cheformano monomeri a funzione più specializzata:

- tubuline- actine- globine,

I loro geni sono disposti in tandem o capita che possano trovarsi, inseguito, anche su cromosomi differenti (come nel caso dei monomeridell‟emoglobina), a causa di altri eventi sul DNA.

Pseudogeni: geni con sequenze analoghe a quelle funzionali che

hanno subito mutazioni che non gli permettono di funzionarecorrettamente.

Perché possono avvenire gli errori?

Le basi azotate, formano i legami idrogeno con l‟azoto e l‟ossigenopresenti nella parte interna della catena di DNA.

Gli ossigeni sono normalmente nella conformazione chetonica, ma per azioni esterne o condizioni chimico-fisiche particolari, si possonoportare alla forma enolica, per quel fenomeno che si chiamatautomeria ch eto-enol ica .

La medesima cosa avviene per le terminazioni dell‟anello chepossiedono un gruppo amminico, che per eventi chimici o fisici

particolari si possono portare nella forma imminica, per quell‟eventoche si chiama tautomeria immino -ammin ica .

Proprio per questa serie di fenomeni possono avvenire le mutazioni ,che coinvolgono le basi azotate:

- si possono avere appaiamenti scorretti (AC, AG, TC, ecc..) aseconda della configurazione atomica che si viene a creare sulmargine interno del filamento.

- Sono eventi inevitabili, scritti nella natura stessa del DNA.

La molecola di RNA

Struttura e funzioni.

La molecola di acido ribonucleico è formata da nucleotidi checomprendono:

- uno zucchero a 5 atomi di carbonio, il ribosio;- un gruppo fosfato legato su 5‟ del ribosio - una base azotata scelta tra due pirimidine (citosina e uracile) e

due purine (guanina e adenina), legata al carbonio in 1‟.

L‟RNA è una molecola a singolo filamento, legatosi con legami fosfodiesterici tra il carbonio 5‟ di uno zucchero e il 3‟ del successivo.

Nonostante sia una molecola a singolo f ilamento, l‟RNA può appaiarsiin vari punti per formare delle strutture particolari che gli permettono disvolgere le proprie funzioni.

Si classificano vari tipi di RNA, che possiedono funzioni specifiche:




- rRNA: il più frequente (80%), che si compone di differentiframmenti che vanno a costituire i ribosomi .

- tRNA: è la molecola che porta l‟amminoacido al ribosomadurante la sintesi proteica. È formato da 76 nucleotidi circa, aforma di trifoglio, possiede varie anse. L‟amminoacido si legasull‟anticodone , un sito di legame sull‟ansa complementare a

quello dell‟mRNA che passa nel ribosoma, corrispondenteall‟amminoacido che trasporta, al suo estremo ter minale(estremità 3‟). Sono circa il15% degli RNA della cellula.

- mRNA: è un RNA a un solo filamento, anche se puòeffettivamente ripiegarsi a formare un loop, che portal‟informazione per la proteina.

- RNA serie U: sono molecole poco frequenti, la cui funzionenon è del tutto chiara.

- microRNA: sono piccoli frammenti che possono legarsiall‟mRNA a formare porzioni di doppio filamento. Sembra cheabbiano la possibilità di inibire un punto di trascrizione.

Gli rRNAGli rRNA sono gli acidi ribonucleici più frequenti:

- i tratti di DNA che li codificano sono sequenze mediamenteripetitive disposte in tandem

- esistono vari frammenti di rRNA che portano alla formazione diun ribosoma, anche con modifiche post-trascrizionali.

Negli eucarioti, gli rRNA che formano un ribosoma, sono:

- 28 S- 18 S- 5,0 S- 5,8 S

L‟assemblamento e la modifica di questi rRNA di dimensioni ecaratteristiche differenti porta alla costituzione delle due subunità delribosoma eucariotico, con coefficiente di sedimentazione 80 S:

- 60 S (subunità maggiore)- 40 S (subunità minore).

Trascrizione

La trascrizione è un fenomeno per cui dal DNA si trascrive unfilamento di RNA.

La trascrizione in generaleGli enzimi responsabili della trascrizione, sia in procarioti che eucarioti,sono detti RNA-polimerasi:

- sono in grado di assemblare i nucleotidi uno alla volta, a partireda un tratto di DNA che funge da stampo.

- Le RNA polimerasi possono riconoscere e legare dellespecifiche sequenze sul DNA.

Le sequenze a cui si lega RNA polimerasi sono definite promotore:

- affinchè le RNA polimerasi si leghino ai promotori è necessariala presenza di numerosi fat tor i di trascr iz ione , delle proteineancillari es. GTF.

- Il promotore contiene anche informazioni addizionali, adesempio il filamento su cui avviene la trascrizione.

La RNA polimerasi muove in direzione 3‟ >> 5‟ lungo il filamento distampo:

- il filamento di DNA si srotola localmente- la polimerasi assembla un filamento complementare di RNA

che cresce dal suo 5‟ in direzione 3‟. (filamento antiparallelo al DNA).

La reazione catalizzata dalla RNA polimerasi è:

RNAn + nuc-PPP RNAn+1 + PPi

In cui i ribonucleosidi trifosfato vengono idrolizzati in nucleosidimonofosfati e polimerizzati covalentemente nell‟RNA corrispondente.

Non appena la polimerasi ha oltrepassato una certa soglia di nucleotidifunzionali, la doppia elica del DNA si riavvolge. La RNA-polimerasi,




infatti, incorpora da 20 a 50 nucleotidi alla volta: dietro di sé non haalcun ibrido, ma la catena di DNA si riavvolge.

Più polimerasi funzionano contemporaneamente e trascrivono genidifferenti sulla medesima molecola di DNA.

La DNA polimerasi non ha una velocità prettamente costante nella

trascrizione:- può arrestarsi per vari motivi e riprendere- è più veloce quando ha a che fare con la rottura di basi

appaiate AT, piuttosto che CG sul DNA, poiché possiedono unlegame idrogeno in meno.

La RNA-polimerasi si slega quando incontra una sequenza dinucleotidi sul DNA che porta un‟informazione specifica di termine,detta sequenza di termine .

La trascrizione nei procarioti

Nei batteri come E. Coli è presente un solo tipo di RNA polimerasi, cheper legarsi correttamente al promotore necessita di alcuni fattoriopzionali, detti fattori sigma ( ).

La RNA polimerasi batterica è formata da un nucleo enzimatico composto da 5 subunità proteiche (di cui 2 alfa e 2 beta).

Il nucleo enzimatico della polimerasi batterica è formato da una sortadi chele che arpionano in mezzo il filamento di DNA, facendoloscorrere in un canale carico positivamente.

I promotori batterici si trovano a monte del gene, subito in prossimità diesso e sono composti da due sequenze di consenso:

- CAAT box: è una sequenza che inizia a -35, sull‟estremità 3‟rispetto al gene, ed è un tratto di circa 35 basi- TATA box: è la sequenza di consenso che indica precisamente

il punto in cui viene aperta la catena (notare che TATA èformato per la maggior parte da nucleotidi con solo 2 legamiidrogeno, quindi più facili da scindere).

Possono esistere, a seconda delle condizioni, differenti fattori sigma.

La sintesi avviene seguendo le seguenti tappe:

1) il fattore sigma interagisce con il promotore, quindi l‟enzimacompleto (2alfa, 2beta e sigma) si legano alla CAAT box

2) l‟enzima completo, detto anche oloenzima, dopo alcunitentativi separa le due catene avvolte di DNA.

3) Dopo che vengono incorporati alcuni enzimi nel complesso di

RNA nascente (ricordare 3‟ >> 5‟), l‟oloenzima subisce uncambiamento conformazionale che lo fa diventare complesso di al lungamento del la trascr izione , che si muove poiprocessivamente lungo il DNA.

4) La trascrizione si interrompe a livello della sequenza di termine .

Talvolta il termine della trascrizione avviene ad opera di una proteina detta fat tore rho ( ), un anello che scorr e lungo l‟RNA neosintetizzatoper poi scindere l‟RNA poli dal DNA.

Trascrizione negli eucarioti

Le cellule eucaristiche possiedono tre differenti tipi di RNA polimerasi,ciascuna delle quali sintetizza per un determinato gruppo di RNA.

Questi tre tipi di polimerasi sono identici in tutte le cellule eucariotiche:

- differiscono dalle procariotiche solamente per la presenza dialcune subunità aggiuntive, mentre il nucleo restasostanzialmente lo stesso.

- Le subunità aggiuntive hanno la principale funzionenell‟interazione con i numerosi fattori di trascrizione.

Le proteine accessorie, denominate fattori di trascrizione, svolgono unruolo fondamentale nella regolazione e nello svolgimento dellatrascrizione negli eucarioti:

- legame della polimerasi allo stampo- allungamento,- terminazione- inizio della trascrizione,- ecc…




I principali tipi di RNA derivano tutti da molecole di RNA-precursori ,detti preRNA, o trascritti primari:

- è un segmento perfettamente complementare a quello del DNAche è funto da stampo.

- I trascritti primari sono subito associati a proteine, dopo la copiadell‟unità di trascrizione sul DNA.

Lo stadio finale in cui si possono raggiungere tRNA, mRNA, rRNAviene raggiunto grazie ad operazioni di processing:

- è una sorta di taglia e incolla in cui le catene di preRNAvengono tagliate e ricucite in punti specifici.

- Perché avvenga il processing è necessario che vi sia una granvarietà di piccoli RNA, lunghi circa 90-300 basi, e le proteineche vi si associano.

I tipi di RNA polimerasi eucaristica sono riassunti in tabella:

enzima RNA di sintesi

RNA polimerasi I RNA ribosomi ali più grandi (18, 28, 5,8 S)

RNA polimerasi II mRNA, maggior parte dei piccoli snRNA e snoRNA, microRNA e RNA delle telomerasi

RNA polimerasi III Piccoli RNA, tRNA, rRNA 5S e RNA serie U6.

Sintesi e maturazione degli rRNA

Nelle cellule eucariote l‟80% dell‟RNA è RNA ribosomiale:

- i ribosomi sono numerosissimi e devono continuamentesintetizzare le proteine più disparate.

- Nel DNA le sequenze che codificano per rRNA (dette ancherDNA) sono sequenze mediamente ripetitive, ripetute circa 100volte in tandem in 5 macroregioni

Le 5 regioni di rDNA sono responsabili della formazione dei nucleoli:

- questi contengono le neo codificate subunità ribosomiali- hanno un aspetto granulare, di primo acchito.

Sintesi e precursori di rRNA

Nei nucleoli, seguendo l‟analisi che Oscar Miller fece nel 1960, si puòosservare una grande fibra circolare che risulta composta da una“catena di alberi di natale”:

1) i geni che codificano per gli rRNA sono disposti in tandem suun filamento di DNA

2) l‟albero di natale si compone di:a. tronco: il DNAb. rami: rRNA neo sintetizzatoc. base dei rami: RNA-poli I.d. il tratto di DNA compreso tra il primo ramo (quello più

corto, con sintesi appena iniziata) e l‟ultimo ramo (il più

lungo, con sintesi completata) si chiama unità ditrascrizione.3) Le fibrille di rRNA precursore contengono gruppi di particelle

associate, che sono responsabili della formaizone dellesubunità ribosomiali:

a. Proteineb. RNA

4) Tra le due unità di trascrizione è presente una fibra che noncodifica per nessun RNA, detta spacers non trascritto.

Gli spacers non trascritti sono spesso presenti tra i codificanti conmedia ripetitività.

Maturazione dell’rRNA precursore.

I ribosomi eucaristici contengono quattro rRNA distinti:

- subunità maggiore: 28S, 5,8S, 5S- subunità minore: 18S.

Sul DNA vi due sequenze differenti:




- preRNA: 28S, 18S, 5,8S- rDNA 5s: 5s.

Il preRNA è composto da un unico filamento che contiene in sé il 28S,il 18S e il 5,8S, che poi vengono separati ad opera di varie nucleasi.

Le caratteristiche peculiari del preRNA sono:

- gran numero di metilazioni e residui di pseudouridina.- Vengono aggiunti come modificazioni post-trascrizionali .

I nucleotidi metilati e i residui di pseudouridina sono rimasti sui preRNAnel cor so dell‟evoluzione sulle sequenze immutate:

- le nucleasi non tagliano in prossimità dei nucleotidi segnati conmetilazioni

- discheratosi: mutazione mortale nell‟enzima che promuove laconversione di uridina in pseudouridina.

Nel processo di maturazione, dal trascritto 45S primario di preRNA dicirca 13000 nucleotidi ne rimangono circa 7000 nei tre segmenti

risultanti dalla maturazione.Gli snoRNA: la maturazione del preRNA avviene grazie all‟aiuto dipiccolo RNA nucleo lari (snoRNA) che, assieme ad altre proteineformano le r ibonucleoproteine piccole nucleolar i :

- queste snoRNP si associano all‟rRNA ancora prima del terminedella trascrizione

- alcuni possono recidere l‟estremità 5‟ del trascritto - altre recisioni sono ad opera di esonucleasi specifiche (circa 12

differenti).- Alcuni snoRNP presenti in quantità minore svolgono funzioni

quali:o Indicare quali nucleotidi vengono metilati sul ribosioo Indicare quali uridine devono essere convertite in

pseudo uridine.

Questi snoRNP contengono piccole sequenze di RNA, che possonoibridarsi e formare, per brevi tratti, dei doppi filamenti di RNA con ilneotrascritto.

Il nucleolo non è solamente il sito di elaborazione di rRNA ribosomiali,ma anche quello del montaggio delle due subunità:

- vi si associano due tipi di proteine:o proteine ribosomiali : sono stabili e formano le subunitào proteine accessorie: si associano in maniera transitoria

e catalizzano le reazioni di maturazione (elicasi x

riarrangiamenti strutturali, esonucleasi, ecc..)

Sintesi e maturazione dell’rRNA 5S

Una molecola di rRNA 5S, lunga circa 120 nucleotidi, è presente comecomponente della subunità maggiore del ribosoma.

Negli eucarioti le molecole di rRNA 5S sono codificate fuori dal nucleolo, su una serie di sequenze identiche inframezzate a quelle checodificano per gli altri rRNA:

- sono codificate dalla RNApoli III.- Vengono poi trasportate nel nucleolo e assemblate assieme

agli altri rRNALa RNA polimerasi III è particolare poiché si lega ad un promotoreche si trova all’interno della sequenza che viene trascritta:

- codifica per tipi differenti di RNA, compreso il tRNA, ma per questi tipi il promotore si trova a monte

Gli RNA transfer (tRNA)

Le cellule animali hanno circa 50 tipi differenti di RNA transfer, uno per tripletta codificante:

- si trovano all‟interno del genoma più sequenze che codificanoper lo stesso tRNA

- i geni che codificano per tRNA sono raggruppati in cluster ,ovvero gruppi di sequenze brevi che codificano per differentitRNA

- la sequenza che codifica per un dato tRNA si trovageneralmente in più di un cluster.




I tRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi III e la sequenza promotrice si trova all‟interno della parte codificante de l gene, anzichéall‟estremità 5‟.

Il trascritto primario di una molecola di RNA transfer è più grande delprodotto finale:

- devono essere rimossi dei tratti sulle due estremità 5‟ e 3‟. - Uno degli enzimi che tagliano il pre-tRNA è la ribonucleasi P.

Sintesi e maturazione degli mRNA (messaggeri).

Nella trascrizione dei messaggeri eucariotici sono presenti numerosifattori, sia sul DNA che a livello di proteine (fattori di trascrizione eRNA polimerasi):

- RNA poli II- Promotore distale

o Enhancer o Silencer

- Promotore prossimaleo Pseudo CAAT boxo TATA box

- Fattori di trascrizioneo elementi in trans (non sul filamento di DNA)o elementi in cis (sul filamento che deve essere trascritto).

- sequenza di termine.

Il promotore distale

Il promotore distale si compone di sequenze sul DNA che si possono

trovare a notevole distanza dalla sequenza da trascrivere, da -500 a -10'000.

Possono essere presenti o non esserci. Quando ci sono possonoessere situati sia a valle che a monte del gene.

La sequenza enhancer è una sequenza di circa 200 nt che potenzia latrascrizione:

- è legato a fattori di trascrizione specifici , proteine che si leganoalla sequenza e ne permettono la regolazione.

I silencer sono sequenze a cui normalmente si lega un inibitore, chequando si slega, al passaggio di fattori di trascrizione, reprimono latrascrizione dell‟mRNA o di altri RNA.

Il promotore prossimale

Il promotore prossimale si compone di due tipologie di sequenze:

- delle pseudo CAAT box ,- la TATA box.

Le CAAT box sono sequenze che consentono il legame delle proteineche formano il complesso dell RNA polimerasi II:

- sono elementi regolatori in cis, ovvero sul filamento che vienetrascritto

La TATA box è una sequenza di nucleotidi ricchi in adenina e timina

posta sul DNA tra -20 e -35:- è la cassetta di sequenza che indica il punto in cui deve essere

aperta la bolla di trascrizione.

Fattori di trascrizione o elementi in trans

I fattori di trascrizione in trans sono elementi che interagiscono con ilDNA, ma non appartengono al filamento:

- si legano agli elementi regolativi in cis (promotore prossimale edistale)

- hanno una struttura quaternaria particolare.

I più comuni fattori di trascrizione in trans sono proteine che pinzano ilDNA e ne modificano la conformazione, quali:

- zinc finger,- leucine-zipper - helix turn helix.




Il processo di trascrizione.

Il processo di trascrizione avviene in varie tappe, che comprendono:

- l‟ancoraggio di RNA poli II - la cascata di GTF sulla TATA box- l‟elongazione del filamento di pre-mRNA- il termine della trascrizione.

L‟ancoraggio di RNApoli II sul filamento dipende dall‟interazione difattori di trascrizione specifici in trans che si legano all‟enhancer e alpromotore:

- questi complessi proteici legati a enhancer e promotoreripiegano la catena e si legano tra loro

- formano una trappola sterica per l‟RNApoli II - permettono la formazione dell‟enhanceosome , un complesso

proteico di 12 proteine fondamentale per la trascrizione.

Con la formazione dell‟enhanceosome si ha una cascata di GTF sullaTATA box:

- alla TATA box si lega una proteina detta TATA bindingprotein (TBP)

- Questa proteina richiama numerosi GTF (general transcriptionfactors) che si legano alla TBP, che sono chiamati TF II(transcription factors II )

- I TF II sono sette proteine che si legano al complesso TATA-TBP, che permettono il legame della RNA polimerasi II .

Quando la polimerasi si lega, la trascrizione ha inizio e numerosi TF IIsi distaccano dal complesso.

L‟elongazione è quel processo in cui la polimerasi allunga il filamento

di RNA, con la regola della complementarietà delle basi rispetto alDNA.

Il termine della trascrizione avviene quando l‟RNA polimerasi arrivaalla sequenza TTATTT, che è posta circa 25 nucleotidi a monte del 3‟del filamento da trascrivere:

- sull‟RNA si trascrive la sequenza AAUAAA, che richiama unaendonucleasi che taglia il filamento di RNA dopo il passaggiodella polimerasi.

- Con il taglio, si ha il distacco della polimerasi.

Vi sono delle eccezioni alla regola dei promotori con TATA: dei genidetti TATA-less promoters. Questi, a monte della sequenza, nonhanno una TATA box, ma delle sequenze analoghe ricche in C e G,

che occupano la medesima posizione della TATA:- sono più difficili da aprire- sono derivati da geni ripetuti in tandem- sono per le proteine in cui vi è un enorme bisogno in qualsiasi

momento (istoni, rRNA, ecc…) - hanno una efficienza generalmente minore per le proteine che

sono rare.

La derivazione di questa tipologia di promotore è arcaica edeucariotica.

La differenza tra endonucleasi e esonucleasi, quando tutte e duesono impiegate nel taglio di una sequenza di nucleotidi è:

- Endonucleasi: sono enzimi che rompono i legamifosfodiesterici tra due nucleotidi della catena.

- Esonucleasi: sono enzimi che depolimerizzano una catenanucleotidica dalle estremità del filamento.

-




Maturazione del RNA messaggero

Le modifiche che avvengono per la maturazione di un RNAmessaggero sono:

1) capping

2) poliadenilazione3) splicing

Il capping di un mRNA

Il capping consiste nell‟aggiunta di una 7-metil-guanosinasull‟estremità 5‟ del filamento di RNA neotrascritto, appena è iniziata latrascrizione:

- una guanosinatrifosfato (GTP) viene metilata ad opera dinumerosi enzimi in 7-metil-guanosina

- la 7-metil guanosina si lega con il suo gruppo fosfato al fosfato

del 5‟ del filamento di RNA - si ha un legame fosfodiesterico 5‟ – 5‟ invertito al capo dell‟RNAnascente.

La funzione del capping è multipla:

- protezione dalle esonucleasi, per impedire che il filamentovenga depolimerizzato

- esportazione e riconoscimento dal nucleo al citoplasma- inizio della sintesi proteica, permettendo il riconoscimento al

ribosoma.

Poliadenilazione della coda del mRNA

La poliadenilazione è un avvento post-trascrizionale che permette diportare tranquillamente l‟mRNA nel citoplasma:

- dopo la sequenza AAUAAA sul filamento neotrascritto vengonoaggiunti da 50 a 250 nucleotidi di adenina, formando la codapoli(A).

- Questa non è codificata da alcun gene, ed è aggiunta unenzima chiamato pol i(A)pol imerasi .

Le sue funzioni sono di protezione dall‟azione di esonucleasi e ditrasporto nel citoplasma.

I geni sprovvisti della TATA box non subiscono la poliadenilazione,poiché vengono subito tradotti, appena sono trascritti.

Splicing

Lo splicing è un evento post trascrizionale che avviene nel nucleo:

- comporta la rimozione degli introni dal filamento.

Il procedimento avviene nel seguente ordine:

- l‟hnRNA (mRNA nucleare) si associa con un complesso dettospliceosoma, che riconosce gli introni tagliando le estremità 5‟e 3‟ di questi

- lo spliceosoma, poi, riunisce le estremità degli esoni, a dare l

filamento di mRNA maturo.Nel processo di splicing intervengon numerose molecole:

- snRNA che con proteine formano le snRNP (ribonucleoproteine nucleari)

- U-RNA, altri complessi ribonucleoproteici.

Lo splicing alternativo è un procedimento di regolazionedell‟espressione genica che permette la formazione di proteinedifferenti ma analoghe a partire da un solo trascritto:

- avviene nel 60 % dei trascritti- il meccanismo comporta una scelta differente degli introni da

tagliare.- Solitamente la scelta degli esoni avviene in base alla specificità

del tessuto.




Sequenze UTR.

Negli mRNA maturi sono presenti spesso delle sequenze nontradotte (UTR, untranslated regions):

- sono regioni che si trovano alle estremità degli RNA- proteggono questi filamenti dalle RNAasi (esonucleasi che

degradano gli introni eliminati)- vengono trascritte, ma non tradotte.

La traduzione

Il codice genetico

Il codice genetico è una tabella che mette in relazione le triplette dinucleotidi su un filamento di RNA con gli amminoacidi corrispondentiper la sintesi delle proteine.

Le triplette che si trovano sugli mRNA sono dette codoni, che hannosequenze complementari sui tRNA, dette anticodoni.

Sul fondo dei tRNA si trovano gli amminoacidi corrispondenti aglianticodoni, montati sui trifogli di tRNA dagli enzimi amminoacil-tRNAsintetasi.

Il codice genetico gode di determinate proprietà:

- è degenerato: codoni differenti possono codificare per lostesso amminoacido. Fanno eccezione met e trp e i codoni diSTOP.

- Non è ambiguo: a ogni codone corrisponde perfettamente unaa o uno STOP.

- È universale: è presente ugualmente in tutti i nuclei di tutti gliorganismi cellulari. Fanno eccezione solamente i mitocondri,che nel loro unico filamento circolare hanno dei geni condifferenti codici genetici a seconda delle classi di appartenenzadegli organismi.

Mutazioni geniche o puntiformi.Le mutazioni geniche sono mutazioni che coinvolgono solamente unnucleotide. Si contrappongono a quelle cromosomiche, in cui si ha lamutazione di un tratto di nucleotidi consistente.




Le mutazioni sono modificazioni permanenti spontanee del DNA,dovute alla tautomeria delle basi azotate, in cui si ha l‟appaiamentoscorretto di determinate basi.

I tipi di mutazione puntiforme sono:

- sostituzione: è la più frequente, e può essere casualmentereversibile. Può portare a:

o codoni missenso: triplette che codificano per un altroamminoacido, poco gravi.

o Codoni non senso: codoni che codificano per unostop. Hanno una discreta gravità.

- Inserzione, delezione o duplicazione: sono spostamentireciproci dei due filamenti. Possono provocare delle frame shift ,ovvero lo slittamento dell‟intera cornice di lettura nel DNA.Molto spesso si ha un ptc, codone di terminazione prematura.

Può capitare, che proprio la proprietà di essere degenerato del codicegenetico, non porti ad una mutazione significativa:

- molto spesso, un codone può trasformarsi in un codonedegenere, che codifica per lo stesso aa, pur essendo differente.

il ruolo dei tRNA.

Gli RNA sono gli intermediari del processo di traduzione:

- da un lato sono legati ad un aa, formando u aa-tRNA- dall‟altro possiedono l‟anticodone, che può riconoscere la

sequenza sull‟mRNA corrispondente all‟aa.

Bidimensionalmente, le molecole di tRNA hanno una struttura a

trifoglio, con:- 3 anse in cui non v‟è complementarietà delle basi appaiate - quattro bracci in cui le basi si appaiano

La molecola di tRNA presenta inoltre numerose particolarità:

- possiedono spesso dei nucleotidi modificati, che permettono illegame di specifiche proteine.

- all‟estremità 3‟ hanno sempre la sequenza CCA – OH, a cui silega l‟aminoacido

- sull‟ansa centrale presenta un anticodone formato da unatripletta complementare al filamento di DNA.

La struttura tridimensionale della molecola invece presenta una formadi L rovesciata con due doppie eliche.

In realtà non esistono 61 tRNA, tanti quanti i codoni del messaggero,ma in minore quantità:

- questo è reso possibile dalla regola del vacillamento inrelazione alla degenerazione del codice genetico:

o l‟amminoacido codificato da più codoni è caratterizzatodalle prime due basi, mentre la terza è menoimportante.

o Quindi vi sono tRNA che possono instaurare legamidifferenti con la terza base.

Gli aa sono legati covalentemente al tRNA corrispondente da un

enzima chiamato amminoacil-tRNAsintetasi:- Ve n‟è uno per ogni aa - Utilizza ATP per formare prima amminoacil-AMP, poi

amminoacil-tRNA e AMP- il legame tra l‟aa e il tRNA è un legame altamente energetico,

che permette di attuare facilmente la formazione dei futurilegami peptidici.

- se avviene l‟appaiamento sbagliato, l‟amminoacil-tRNAsintetasiè in grado di correggere le bozze, tramite un meccanismo dettodi proofreading.

Il procedimento di traduzione

Il processo di traduzione è uno dei processi più complessi che siverificano all‟interno della cellula, che porta alla sintesi dei componentifunzionali della cellula stessa: le proteine.

Per la sintesi proteica sono necessari:




- tutti gli amminoacil-tRNA- i ribosomi- l‟mRNA - proteine con funzioni ausiliarie- cationi e GTP.

Il processo può essere diviso in varie fasi:

- inizio della catena- elongazione della catena- terminazione.

L’inizio della sintesi.

Affinchè il ribosoma si leghi nel punto di lettura corretto, esso devericonoscere la sequenza d’inizio AUG, codone sull‟mRNA checodifica per la metionina:

- una volta che il ribosoma ha riconosciuto il punto d‟inizio si èposto nell‟appropriato modulo di lettura.

- Proseguirà leggendo una tripletta alla volta e codificando esintetizzando gli amminoacidi del peptide.

Il processo avviene in varie fasi che si sintetizzano di seguito.

Fase 1. La subunità minore del ribosoma si porta al sito d’inizio. L‟mRNA si lega prima alla subunità minore del ribosoma, con il suocodone AUG, che è la sequenza d‟inizio.

Per riconoscere la sequenza d‟inizio corretta e non una all‟interno dellacatena che codificherebbe per la proteina i ribosomi si avvalgono diuna sequenza che si trova 5 o 10 nucleotidi prima dell‟AUG:

- per gli eucarioti è detta sequenza Kozak ed è ACCAUGG

- per i procarioti è la sequenza Shine-Dalgarno, GGAGGALe sequenze tipo Shine-Dalgarno sono poste all‟estremità 3‟dell‟mRNA e vengono ricononosciute da una sequenzacomplementare presente sul ribosoma.

Fattori di inizio. La sintesi, per iniziare necessitano di proteinesolubili, dette fattori di inizio (IF o eIF per eucarioti).

Nei procarioti si trovano:

- IF1: facilita l‟attacco della subunità minore all‟mRNA eimpedisce un aggancio errato.

- IF2: lega GTP richiesta per legare il primo amminoacil-tRNA- IF3: impedisce il legame prematuro della subunità maggiore.

Negli eucarioti son presenti invece 8 IF.

Fase 2. Il primo aa-tRNA si inserisce sul ribosoma. AUG è l‟unicocodone che codifica per la metionina. Infatti, la metionina è sempre ilprimo amminoacido incorporato in una catena peptidica, anche senella maggior parte dei casi viene poi rimosso enzimaticamente.

Nei procarioti solitamente la met N-terminale viene formilata, mentrenegli eucarioti non si presenta formilazione.

Esistono però due distinti tRNA:

- uno per la metionina d‟inizio- e l‟altro per incorporare la metionina in una catena.

La sintesi inizia quando il tRNAMet iniziatore si lega ad AUG sull‟mRNA: - si lega a IF2- vengono rilasciati IF1 e IF3.

Fase 3. Assemblaggio del complesso d’inizio completato. Quandoil tRNA iniziatore si lega alla subunità minore si ha l‟idrolisi di GTP suIF2:

- si lega la subunità maggiore- si rilascia il complesso IF2 GTP.

Particolarità negli eucarioti. Negli eucarioti gli eIF sono 12, maanche in questo caso si ha il legame di eIF2-GTP, quando il tRNA

iniziatore si lega alla sequenza d‟inizio. La subunità minore cerca quindi il cap metilguanosinico sull‟estremità5‟ di mRNA e avviene il legame.

Quando il complesso 43S che si è formato dall‟aggancio del cap, ilmessaggero scorre fino alla sequenza Kozak (5‟ – CCACCAUGC – 3‟):




- viene raggiunto il codone appropriato AUG- eIF2-GTP viene idrolizzato e- la subunità maggiore si lega al complesso.

Il ruolo dei ribosomi. I ribosomi sono macchine molecolari che confunzione meccaniche ripetitive permettono lo scorrimento del filamentodi mRNA, la selezione dei tRNA, la formazione dei legami peptidici,

tramite l‟utilizzo di energia rilasciata dall‟idrolisi di GTP. La peculiarità dei ribosomi è il contenuto di rRNA, che permette:

- accuratezza della traduzione- lega fattori proteici- seleziona i corretti tRNA- polimerizzano gli amminoacidi.

Ogni ribosoma presenta tre siti in cui i tRNA scorrono nei vari passaggidella sintesi e dell‟elongazione della catena peptidica:

- sito A, amminoacidico- sito P, peptidico

- sito E, di uscita, exit.I tRNA che si legano a questi siti hanno:

- codone legato alla subunità minore >> decodificazione delleinformazioni contenute nell‟mRNA

- sito amminoacidico a contatto con la subunità maggiore >>catalizza la formazione del legame peptidico.

Elongazione

La elongazione è il vero e proprio processo di costruzione della catenapolipeptidica della proteina.

Fase1. Selezione dell’amminoacil-tRnA. Quando il tRNA iniziatore ènel sito P , il sito A è pronto ad accettare il secondo amminoacil-tRNA.

Per poter essere idrolizzato, l‟amminoacil-tRNA deve essere legato adun altro fattore di elongazione detto EF-Tu-GTP, che possiede GTP:

- tutti i tRNA legati a EF-Tu possono essere immagazzinati nelsito A, ma solamente quel tRNA complementare al codone silega

- quando amminoacil-tRNA-EF-Tu-GTP è legato viene idrolizzatoGTP e rilasciato il fattore di elongazione.

-

Fase 2. Formazione del legame peptidico. I due amminoacidi legatiai loro tRNA sono vicini l‟uno all‟altro e possono reagire tra loro:

- L‟estremo N-terminale dell‟amminoacido nel sito A reagisce conil carbonile dell‟aa nel sito P.

- Si forma il legame peptidico catalizzato dalla peptidiltransferasi, complesso enzimatico (ribozima) della subunitàmaggiore

- A legame formato il tRNA del sito P si distaccadall‟amminoacido.

Fase 3. Traslocazione. La traslocazione è un processo mediante ilquale il ribosoma slitta di tre nucleotidi sull’mRNA:

- è catalizzato da EF-G, che attua una modifica conformazionalecon l‟utilizzo di GTP.

- Si rompono i legami idrogeno e il tRNA con legato il dipeptide sisposta nel sito P

- Il tRNA deacilato si sposta dal sito P al sito E.

Fase 4. Rilascio del tRNA deacilato. Nella tappa finale, il tRNAdeacilato si sposta ed esce dal ribosoma liberando il sito E:

- nel processo di elongazione vengono utilizzate 2 GTP per ogniaa.

- Ogni ciclo dura circa un ventesimo di secondo.

- Il sito A è nuovamente libero per poter iniziare un altro ciclo.

Terminazione.

La terminazione ha inizio quando sul messaggero sono presenti unodei tre condoni di STOP, che inducono il ribosoma a slegare l‟ultimo




amminoacido dal tRNA nel sito P, anche senza la presenza di unnuovo tRNA.

Affinchè la terminazione abbia fine, è necessaria la presenza di fattoridi rilascio, RF o eRF per gli eucarioti, che riconoscono i codoni di stop.

Quando entrano nel sito A del ribosoma e riconoscono un codone di

stop (UAA, UAG, UGA), inducono la rottura del legame estereo tral‟ultimo tRNA e la catena polipeptidica ad esso legata.

Per la rottura del legame è necessaria la presenza di un altro EF, EF-G, che lega ed idrolizza GTP.

Dispositivi di correzione degli errori

In caso del cambiamento di una base o dell‟inserzione di un nucleotidenel mRNA o nel DNA sono facilmente pervenibili delle mutazioninonsenso, che comportano la presenza di un codone di STOP

prematuro:

- le cellule possiedono un meccanismo di sorveglianzadell‟mRNA in grado di rivelare la presenza di codoni di stopprematuri

- sono tradotte solitamente una sola volta prima di andareincontro a distruzione ad opera di un meccanismo chiamatononsense-mediated decay o NMD.

L‟NMD protegge le cellule dalla produzione di proteine tronche e nonfunzionali.

Quando si ha l‟unione tra due esoni ad opera dello spliceosoma, unagglomerato di proteine detto complesso di giunzione esonica(EJC), rimane associato all‟mRNA fino a che non viene tradotto:

- quando passa nel ribosoma, prima dell‟ingresso, l‟attivitàelicasica e altre attività lo rimuovono

- se si inserisce un codone di stop prematuro, parte del filamentoresta attaccato al ribosoma con addosso alcuni EJC

- quando un mRNA possiede ancora EJC dopo essere statotradotto viene identificato come aberrante e distruttoenzimaticamente.

Poliribosomi

Il filamento di mRNA, quando è trascritto, può esserlo ad opera di

numerosi ribosomi contemporaneamente, poiché questi si legano alcap e si dirigono verso il 3‟ uno dopo l‟altro.

Il complesso che si forma con i numerosi ribosomi sul filamento dimRNA è detto poliribosoma.




La replicazione del DNA

La replicazione del materiale genetico è un evento unico, che hapermesso il tramandarsi della vita stessa e l‟evoluzione ad organismicomplessi.

Infatti, la vita in sé, non sarebbe potuta progredire se non avesseconservato il proprio patrimonio informazionale:

- inizialmente si aveva tramite RNA,- solo successivamente l‟informazione venne tramandata tramite

DNA.

Teorie sul tipo di replicazione.

La replicazione dei due filamenti di DNA, che sono complementari traloro lasciava intendere a Watson e Crick dei diversi modelli dicomportamento re plicativo, che potevano essere:

- replicazione semiconservativa: ogni doppia elica figlia ricevemetà della struttura parentale.

- Replicazione conservativa: ogni filamento avrebbe fatto dastampo per un nuovo filamento. I nuovi si uniscono tra loro e ivecchi ritornano uniti. Una cellula figlia ha ancora il vecchiopatrimonio genetico.

- Replicazione dispersiva: il DNA si replica a tratti, l‟integritàdei filamenti parentali viene dispersa.

Il modello semiconservativo, a seguito degli esperimenti di Mesleson e

Stahl, prevalse:- fecero crescere e riprodurre dei batteri in terreno di coltura con

un isotopo pesante dell‟azoto - quando posero in coltura batteri in terreno neutro, con azoto-

14, si vide, analizzando la densità dopo centrifugazione, che siottenevano degli ibridi pesante-leggero, senza il mantenimentodi una molecola di DNA pesante

- l‟esperimento si confermò valido anche nelle generazionisuccessive e si concluse che il DNA si replica con un model lo semiconservat ivo .

La replicazione nei procarioti

Con lo sviluppo delle tecniche biochimiche di laboratorio, oggi èpossibile studiare anche i meccanismi di replicazione del DNAeucariotico.

Tuttavia, alcuni anni fa, non era possibile fare per gli eucarioti duepassi fondamentali per lo studio del processo di replicazione:

1) avere disponibilità di mutanti incapaci di sintetizzare qualcheproteina necessaria per il processo di replicazione

2) avere sistemi di coltivazione in vitro che consentissero distudiare la replicazione in cellule purificate di determinateproteine.

In questo modo, si poté conoscere le proteine che intervengono nellareplicazione dei batteri (circa 30 in E. Coli). Oggi è possibile studiareanche il processo in cellule eucariotiche e si dimostra sensibilmentesimile.

Forcella di replicazione e replicazione bidirezionale.

Nella molecola circolare di DNA double strend batterico la replicazioneinizia in un punto detto origine, in cui sono presenti sequenze detteoriC :

- il doppio filamento si apre ad opera di proteine specifiche - si forma la forcel la di repl icazione .- La replicazione avviene in entrambe le direzioni rispetto all‟ori ,

è quindi una replicazione bidirezionale .

A livello della forcella di replicazione corrispondono punti in cui:

- la doppia elica va incontro a separazione dei due filamentipaterni






Appunto perché la sintesi del filamento che ha come stampo di DNA ladirezione 5‟ > 3‟ avviene a piccoli frammenti di 1000/2000 nucleotidi, lareplicazione viene detta semidiscontinua.

Ma se la DNA polimerasi da sola non è capace di dare inizio ad unfilamento, l‟inizio è dovuto da un altro particolare enzima, la RNAprimasi:

- questa sintetizza una sequenza di RNA detta sequenza primer - queste sequenze primer servono come inizio per la DNA

polimerasi, la quale poi inizia dal primer a sintetizzare ilfilamento di DNA.

- I primer vengono poi rimossi e viene sintetizzato DNA e unito alfilamento mediante DNA ligasi.

Il macchinario che opera a livello della forcella replicativa.

La replicazione richiede non solo l‟incorporazione dei nucleotidi, mamoltissimi altri processi che avvengono a livello del DNA.

Uno tra i processi più complessi è lo srotolamento del duplex e il mantenimento dei filamenti slegati . Questi compiti sono attuati da:

- elicasi: srotolano il duplex ad elica del DNA mediante l‟energiafornita dall‟idrolisi di ATP.

- Proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB):coadiuvano l‟azione dell‟elicasi legandosi al filamento singolo emantenendolo slegato, impedendone il riavvolgimento.

L‟azione dell‟elicasi avviene in contemporanea con quella dellaprimasi, poiché i due enzimi si associano formando un complessodetto pr imosoma :

- l‟elicasi si muove in direzione 5‟ > 3‟ sul filamento stampo(DNA) in ritardo

- la primasi si lega a intervalli regolari sulla elicasi rilasciando lesequenze primer.

È stato dimostrato inoltre che i differenti frammenti di Okazaki sonosintetizzati dalla medesima DNA polimerasi III. Affinché ciò avvenga ènecessario un meccanismo particolare:

- si ritiene che le due DNA polimerasi dei due filamenti simuovano assieme, legate una all‟altra.

- Si possono muovere assieme, nonostante si sintetizzi indirezione opposta, poiché sul f i lamento in ri tardo si forma un occhiel lo (ansa circolare) che permette di portare il filamentoin cui si sta sintetizzando il frammento nella stessa direzione del filamento stampo guida (3‟ > 5‟ sul DNA)

- Questo meccanismo permette alle due polimerasi di muoversiassieme senza violare il meccanismo della direzione 5‟ – 3‟.

- Quando la polimerasi che forma il filamento in ritardo raggiungel‟estremità 5‟ del frammento di Okazaki sintetizzato durante ilciclo precedente, abbandona il filamento stampo, spostal‟occhiello e si dirige, assieme alla primasi, su un nuovostampo.

Strutture e funzioni delle DNA polimerasi.

L‟enzima che opera nella formazione del filamento di DNA nellareplicazione di E. Coli è la DNA polimerasi III, che è parte di un grandecomplesso chiamato repli soma o oloenzima DNA polimerasi III ,formato da varie subunità:

- pinze ß: Sono pinze che circondano il filamento di DNA erestano associate allo stampo. Hanno una struttura a ciambellache formano una pinza scorrevole formata da due subunità.

o Le pinze sul filamento in ritardo vengono costantementesostituite ad opera di una pinza caricatore.

- Pinza caricatore: pinza legata ad ATP, che permette il cambiodella pinza ß a livello del filamento in ritardo, al termine dellasintesi del frammento di Okazaki.

- Polimerasi: è la parte funzionale nella sintesi dei nucleotidi sulcomplesso enzimatico. Addossata alla pinza ß.

La DNA polimerasi I ha sostanzialmente alcune funzioni diriparazione, ma la maggiore funzione che ha è quella di rimuovere i

primers.

i l b i l i l l ll l




La DNA polimerasi II è invece impiegata interamente nel riparo enella correzione del DNA neosintetizzato.

Attività esonucleasica della DNA polimerasi I

La DNA polimerasi I ha tre tipi di attività:

- polimerizzazione- esonucleasica nelle due direzioni.

L‟attività esonucleasica 5’ – 3’ viene esplicata quando la DNA poli Ideve rimuovere i primer :

- degrada le sequenze primer che prima sono state lasciate dalla primasi .

Dopo aver degradato l‟RNA primer, la polimerasi sintetizza per lasequenza mancante al posto del primer un filamento di DNA.

Alta fedeltà della replicazione del DNA

Un errore nella replicazione del DNA rappresenta un fatto molto piùgrave rispetto ad un errore di trascrizione su un filamento di mRNA:

- sull‟mRNA un errore incide per un solo ciclo sintetico di unaproteina.

- Sul DNA invece, si trasforma in una mutazione ereditaria.

A causa della tautomeria cheto-enolica e di quella immino-amminica,le basi possono essere riconosciute in maniera scorretta dalla DNApolimerasi, che le prova una ad una:

- la polimerasi ruota come le dita di una mano, mentre ha ilfilamento nel palmo.

- Se l‟appaiamento avviene in modo errato, si ha unaconformazione scorretta, e la polimerasi non può attuare ilcambiamento conformazionale corretto per l‟attività catalitica.

- se nel tentativo di appaiamento una base che non rispetta ATCG è in una conformazione tautomerica scorretta si ha unappaiamento errato,

o la frequenza è di uno ogni 10‟000 nucleotidi incorporati

o le tre polimerasi batteriche possiedono un sito di esonucleasi 3’ -5’ .

o La catena tende automaticamente a spostarsi in bassoverso il sito esonucleasico poiché preferisce restare afilamento singolo.

o Questo meccanismo di correzione di bozze funzionanel 99% dei casi.

Tuttavia i batteri prevedono anche la possibilità di un altro meccanismodetto riparazione dell’appaiamento scorretto:

- entra in azione dopo la replicazione- corregge quasi tutti gli errori sfuggiti alla correzione di bozze- abbassa a 10-9 il tasso di mutazione spontanea.

In definitiva, la precisione e la fedeltà della replicazione del DNA èdovuta a:

- accurata selezione dei nucleotidi- immediata correzione di bozze (sito esonucleasico 3’ -5’) - riparazione dell‟appaiamento scorretto ( post-replicazione)

Replicazione nelle cellule eucariotiche

L‟analisi della replicazione nelle cellule eucariotiche è stata molto piùdifficile rispetto a quella dei batteri per la maggiore complessità e per iminori meccanismi a disposizione dei ricercatori.

Oggi, con nuove tecniche e scoperte di metodiche, è stato possibileconoscere più a fondo la replicazione del patrimonio genetico di unacellula eucariotica.

Inizio della replicazioneLa replicazione di un batterio inizia in un solo punto chiamato origine,mentre nelle cellule degli organismi superiori, che possiedono un DNAmolto più complesso, avviene in più punti, detti repliconi:

- ciascun replicone ha una propria origine di replicazione

E i C l b Bi l i l l ll l 26




- apre una forcella replicativa e la sintesi avviene in entrambe ledirezioni.

- In una fase S di un ciclo cellulare sono attivi un 10-15% deirepliconi, che iniziano la loro sintesi nello stesso momentoanche nei cicli successivi.

- Probabilmente, nella scelta dei repliconi, è implicato lo stato dicondensazione della cromatina e l‟eventuale acetilazione degli

istoni ad essa legati.Mentre nelle cellule eucariotiche di lievito la replicazione inizia su dellespecifiche sequenze, dette ARS, negli eucarioti dei vertebrati il puntodi inizio non sembra avere delle sequenze preferenziali , ma dipendeprobabilmente da:

- dallo stato di condensazione- dal tipo di modificazione istonica- dallo stato di metilazione del DNA- dal grado di superavvolgimento,- ecc…

Restrizione della replicazione a un unico evento per ciclocellulare

È fondamentale che durante la duplicazione, poiché l‟origine avviene inpiù punti, ogni parte del genoma venga replicata una volta sola.

Deve quindi esistere un meccanismo che eviti che si apra una forcellasu un filamento che si è già duplicato, che consiste pressappoco in:

- un complesso di riconoscimento dell’origine (ORC) legal‟origine di replicazione e resta associato durante tutto il ciclocellulare

- proteine autorizzanti (fattori Mcm2 – Mcm7) legano l‟ORC,costituendo un complesso di pre replicazione (pre-RC),autorizzando l‟inizio della replicazione.

- Una ciclina protein-chinasi, la Cdk, durante la fase S restaattivata ad alta concentrazione durante la fase S della mitosi ,impedendo la formazione di nuovi complessi di replicazione.

- Una sola volta per ciclo si ha il legame di una Cdk, quindi nonsi avrà apertura di nuove origini.

Una volta che il complesso pre-RC è stato attivato le Mcm2 e Mcm7 siattivano e formano un complesso attivo durante la replicazione:

- si ritiene che possano avere attività elicasica.- Nei mammiferi, le proteine Mcm si dissociano e restano nel

nucleo quando hanno finito la loro attività.- Non si possono associare ad un pre-RC già attivato.

La forcella di replicazione negli eucarioti

La replicazione degli eucarioti è praticamente identica a quella deiprocarioti, la replicazione effettiva avviene sempre nello stesso modo.

Gli attori di questo meccanismo non sono proprio gli stessi in terminimolecolari, ma sono totalmente analoghi:

- elicasi- proteine che si legano al filamento singolo (RPA)

- topoisomerasi- primasi- DNA polimerasi (sono maggiori e differenti)- DNA ligasi.

Come avviene nei procarioti, il Dna delle cellule eucariotiche èsintetizzato in maniera semidiscontinua, con differenze minime:

- il replisoma è anche in questo caso formato da un dimero diDNA polimerasi, che sintetizza con lo stesso metodo iframmenti di Okazaki (formazione dell‟ansa per renderecomplementari i due filamenti).

- I frammenti di Okazaki sono sensibilmente più corti (150 nt).

Nelle cellule eucariotiche sono finora state individuate cinque DNApolimerasi classiche, ovvero presenti in tutte le cellule eucariotiche:

- solamente due di queste 5 non sono coinvolte nellareplicazione del DNA nucleare





o La DNA polimerasi è coinvolta nella replicazione delDNA mitocondriale.

o La DNA polimerasi è implicata nei processi diriparazione del DNA.

- Le altre tre DNA polimerasi hanno invece funzioni di sintesiparticolari:

o La DNA polimerasi è associata all‟RNA primasi ,codifica un piccolo tratto di DNA dopo il primer (20 nt)poi abbandona la replicazione.

o La DNA polimerasi si pensa che sia la principalepolimerasi implicata nella sintesi del DNA. Come neibatteri, questa è formata da:

Una pinza scorrevole, simile alle subunità ß deibatteri, chiamata PCNA

Un caricatore della pinza sulla polimerasichiamato RFC.

Questa polimerasi completa la sintesi deiframmenti di Okazaki sul filamento in ritardo, che

poi vengono uniti tra loro da una DNA ligasi .o La DNA polimerasi è ancora non ben definita. Ha

comunque funzione sintetica di nuovo DNA e possiedeun sito esonucleasico per la correzione degli errori.

Come nei batteri, le polimerasi sintetiche ( hanno caratteristichetriplici:

- Allungano il filamento neosintetizzato in direzione 5‟ – 3‟ - Non possono iniziare replicazione senza un primer. - Possiedono dei siti esonucleasici per la correzione degli errori

di appaiamento.

La funzione delle telomerasi

I frammenti di RNA primer posti alle estremità dei cromosomi linearilasciano un gap di DNA non sintetizzato quando sono rimossi dal sito:

- Nessuna DNA polimerasi è in grado di sintetizzare nuovo DNAsu quelle sequenze senza la presenza di un Primer.

- Le estremità 3‟ dei filamenti sono sempre più corte.

Al margine dei cromosomi sono sempre presenti delle sequenze noncodificanti, dette telomeri, che servono appunto per proteggerel‟informazione da delezioni o rimozioni locali nei punti più esposti:

- Nell‟uomo sono formati da circa 100-1500 unità di sequenzeripetute

- ad esempio TTAGGG.Per ovviare all‟inconveniente dei “buchi” di DNA al termine 3‟ deifilamenti neo sintetizzati vi sono degli enzimi detti telomerasi:

- Aggiungono le stesse sequenze di desossiribonucleotiditrifosfato.





La riparazione del DNA

All‟interno della cellula, il DNA è la molecola più importante, ma anchela più fragile.

Delle alterazioni alle basi azotate o delle rotture nella catenanucleotidica si possono verificare in qualsiasi momento (una cellula nesubisce circa 10000 al giorno), ad opera di differenti fattori:

- agenti chimici- radiazioni termiche- radiazioni ultraviolette- onde elettromagnetiche- ecc…

Se queste lesioni non vengono riparate si trasformanoautomaticamente in mutazioni , che si trasmettono alla progenie dellacellula.

La cellula ha dei sistemi di riparazione formidabili e molto vari, quasicapaci di recuperare qualsiasi danno subito:

- solo 1 lesione su mille circa sfugge ai sistemi di riparazionecellulare

- vi sono numerosi sistemi enzimatici capaci di riparare i dannisubiti dal DNA, che funzionano secondo differenti meccanismi:

o riparazione istantaneao escissione

La grande proprietà che permette al DNA una possibile correzionedelle aberrazioni è la sua complementarietà delle basi , che permette di

ricostruire il filamento che deve essere corretto su stampo delle basidel filamento complementare.

Il processo tuttavia è complesso e richiede il rimodellamento dellacromatina, poiché questa limita l‟accessibilità ai complessi enzimaticidi correzione.

Riparazione per escissione nucleolitica.

I sistemi di r iparazione per escission e nucleol i t ica (NER) agisconoattraverso la rimozione di un piccolo tratto di filamento di DNA checontiene una grossa lesione, quale ad esempio:

- dimeri di pirimidina

- nucleotidi con legati gruppi chimici non propriQuesto sistema di riparazione può procedere per due vie:

- via associata alla trascrizione: viene di preferenza riparato ilfilamento stampo che contiene i geni che vengono trascritti.

o La riparazione del filamento stampo avviene incontemporanea alla trascrizione del DNA

o La segnalazione avviene attraverso il meccanismo dellaRNA polimerasi.

o I geni che vengono trascritti maggiormente, ovveroquelli più importanti, hanno la massima prioritànell‟ordine di riparazione.

- via globale: più lenta e meno efficiente che corregge i filamentidi DNA nel resto del genoma.

Il fulcro di questo meccanismo è il fattore di trascrizione TFII H, chelegge le sequenze scorrette del DNA durante la trascrizione. Questaproteina possiede tra le sue subunità due siti elicasici, che qualoravenga ravvisato un errore separano il duplex e inizia il processo:

- il filamento viene tagliato ai lati della sequenza scorretta dalleendonucleasi e viene rimosso

- la DNA polimerasi riempie il gap- delle DNA ligasi legano a livello dei nicks.

Nei procarioti vi è un sistema simile, che è ad opera di due proteineMut (H, L e S).





Riparazione per escissione di base

Per la rimozione di singoli nucleotidi alterati dovuti a composti chimicialterati introdotti con la dieta o prodotti dal catabolismo cellulareinterviene un meccanismo chiamato riparazione per excisione dibase (BER).

La BER inizia attraverso una DNA glicosidasi che legge il DNA erimuove, attraverso rottura del legame glicosidico, la base scorretta:

- esistono DNA glicosidasi per ogni possibile base alterata.- La DNA glicosidasi scorre lungo il filamento di DNA facendo

flippare di 180° le basi ed analizzandole- Quando trova una base scorretta, la recide, lasciando soli lo

zucchero e il fosfato.

Il meccanismo, dopo la rimozione della base alterata, prosegue nelseguente modo:

- una particolare endonucleasi (AP) taglia lo scheletro del DNA- la DNA polimerasi ß reinserisce il nucleotide corretto- una DNA ligasi ripara i legami.

Nei procarioti come E. Coli, il meccanismo per excisione di baseavviene ad opera di proteine Uvr A, B e C.

Riparazione degli appaiamenti scorretti.

Si è già visto come nel successivamente alla replicazione del DNA visia un meccanismo di controllo che si chiama meccanismo diriparazione degli appaiamenti scorretti:

- questo prosegue risistemando le basi male appaiate che sonosfuggite alla correzione di bozze fatta dalla polimerasi

- riconosce le distorsioni della catena causate dal malappaiamento delle basi.

In E. Coli , il riconoscimento del filamento neosintetizzato avvienegrazie alla metilazione del filamento stampo, quindi il complessoenzimatico di riparazione non può sbagliare.

Nelle cellule eucariotiche non esiste la metilazione del DNA, quindi èprobabile che vi siano altri meccanismi per permettere di riconoscere ilfilamento idoneo.

Riparazione delle rotture a doppio filamento

Quando radiazioni ionizzanti attraversano la cellula e colpiscono ilDNA o quando vengono introdotti degli agenti chimici che causanorotture, può avvenire che il doppio filamento si rompa.

Le rotture del doppio filamento (DSB) possono essere riparatiattraverso vari meccanismi di riparazione.

Il più comune meccanismo di riparazione è chiamato unione delleestremità non omologhe (NHEJ), in cui in complesso di proteinecatalizza una serie di reazioni per unire le estremità rotte del DNA:

- se non è possibile appaiarsi al punto corretto intervengonoproteine Ku, che hanno attività elicasica sui due filamenti e

attività chinasica- permettono alle due estremità del DNA ss di trovare delleregioni di micromologia, attraverso le quali i due filamenti siappaiano.

- Le porzioni di filamenti che restano esclusi vengono rimossi.- La DNA ligasi salda i Nick.

Si ha perdita di un tratto di gene.





La vita della cellula e la trasmissione del patrimonioereditario.

Il patrimonio genetico umano sta racchiuso nel nucleo e, durante lefasi di divisione meiotica o mitotica, si organizza in strutture allungatein cui il filamento di DNA sta ripiegato su se stesso e su uno scheletroproteico, mediante vari superavvolgimenti .

Queste strutture allungate sono i cromosomi.

Un cromosoma è formato da due cromatidi fratel l i , dopo che èavvenuta la replicazione del patrimonio genetico nella fase S:

- i due cromatidi contengono una molecola di DNA identica- sono il risultato della replicazione del patrimonio genetico.- Sono uniti tra loro in un punto detto centromero, in cui le fibre

del fuso si legano per separare i due cromatidi.- I due estremi dei cromosomi sono detti telomeri.

Il cariotipo umano

Il corredo cromosomico umano è, nelle cellule somatiche, diploide:

- è formato da due coppie di cromosomi omologhi, uno diorigine materna e uno paterna

- due cromosomi omologhi contengono le medesime sequenzedi geni e solitamente, solo uno è utilizzato come filamento distampo per la sintesi delle proteine, l‟altro è di riserva.

L‟Homo sapiens ha un corredo cromosomico di 22 coppie di

cromosomi omologhi, più una coppia di cromosomi sessuali:- ha in totale 46 cromosomi, 23 derivanti dal padre e 23 dalla

madre.- I cromosomi sessuali differiscono tra maschio e femmina:

o Un maschio avrà una coppia detta XYo Una femmina una coppia XX.

Le divisioni cellulari

Negli organismi sessuati, le divisioni cellulari differiscono a secondadel tipo di cellule che si prendono in considerazione:

- le cellule somatiche si dividono per mitosi, processo in cui dauna cellula madre 2n derivano due cellule figlie 2n

- le cellule sessuali (gameti) sono invece generate dagli oogoni edagli spermatogoni mediante meiosi, in cui da un patrimonio2n, mediante due successive divisioni, vengono generatequattro cellule figlie con patrimonio aploide n.

La mitosi.

Formazione dell’apparato mitotico

All‟inizio della fase M:

- i cromosomi si spiralizzano- si formano i costituenti dell‟apparato mitotico

L‟apparato mitotico si compone di: - centrioli- materiale pericentriolare- fuso mitotico (fasci di microtubuli che collegano i due

centrioli)

All‟inizio della mitosi i diplosomi (coppie di centrioli dispostiperpendicolarmente) sono già stati duplicati:

- sono circondati da un‟area tondeggiante detta centrosoma - all‟inizio della mitosi i centrosomi sono circondati da raggi di

microtubuli che formano le astrosfere.

- I due centrosomi della cellula si vanno separando e tra loro sievidenzia una struttura fusiforme, è il fuso mitotico.

Il fuso mitotico è costituito da due gruppi di microtubuli polari chepartono da ciascun centrosoma e si incontrano al centro del fuso:




g

- quando la membrana nucleare scompare, compare unsecondo fuso che parte dai centrosomi e si lega ai cinetocoridei cromosomi

- i cromosomi si dispongono al termine della profuse lungol‟asse equatoriale della cellula, lungo un piano che vienedefinito equatoriale, ortogonale alle fibre del fuso.

- In metafase è completo l‟apparato mitotico.

Fasi e significato della mitosi

Il primo stadio del processo mitotico è denominato profase:

- nel citoplasma si organizza l‟apparato mitotico - tutta la cromatina si trova sotto forma di cromosomi al

termine della profase.- Ogni cromosoma appare come un duplice filamento, poiché

costituito da due cromatidi fratelli uniti a livello delcentromero.

- Verso la fine i nucleoli si disintegrano legandosi ai cromosomi

- Si disgrega l‟involucro nucleare (si d isperde nel reticoloendoplasmatico o si addossa alle fibre del fuso)

Con il termine prometafase si individua uno stato intermedio cheintercore tra:

- la dissoluzione dell‟involucro nucleare - l‟organizzazione dei cromosomi sul piano equatoriale da

opera dei microtubuli del fuso

Il secondo stadio è detto metafase, in cui i cromosomi si trovanoallineati sul piano equatoriale della cellula con i centromero direttiverso il centro:

- i cromosomi costituiscono una figura a forma di stella dettaaster o piastra metafasica.

- I cromosomi raggiungono il massimo livello di spiralizzazione,salvo che a livello del centromero.

- Ai due cinetocori del centromero di ogni cromosoma sonocollegate le fibre del fuso mitotico che dividono i duecromatidi

La localizzazione dei cromosomi al piano equatoriale dipende dallacapacità dei cinetocori di legarsi ai microtubuli del fuso e dall‟azione diproteine motore.

La terza fase è definita anafase e viene distinta in due sotto-momenti:

- anafase I: i cromosomi sono tirati verso i due poli dalle fibredel fuso, verso i centrosomi. I cromatidi identici si scindono eognuno migra verso un polo differente

- anafase II: all‟allontanamento dei cromosomi dal pianoequatoriale si somma anche un allontanamento dei due poli,che divergono.

L‟ultimo stadio è rappresentato dalla telofase, in cui si ha laricostruzione dell‟involucro nucleare:

- i cromatidi sono diventati cromosomi delle cellule figlie- ogni polo possiede un corredo cromatidico identico- i cromatidi si vanno despiralizzando

- si riforma il nucleoloLa formazione della membrana nucleare avviene per la fusione di:

- lamine defosforilate che ricreano la lamina nucleare (stratoproteico sottostante al nucleo)

- vescicole sintetizzate nuovamente nel RER- vescicole appartenenti al vecchio nucleo

Con la formazione dei due nuovi nuclei intorno ai cromosomi figli siriformano anche i pori nucleari e tutte le proteine di membranapresenti nel nucleo:

- l‟apparato mitotico si va depolimerizzando

- i centrioli restano inalterati.

L‟ultimo processo che completa la divisione delle cellule è quello dicitodieresi:




- la cellula presenta una strozzatura in posizione equatoriale,ad opera di fibre di actina e miosina disposte a circonferenzasotto la membrana nucleare.

- le membrane si introflettono, si fondono e si staccano le duenuove cellule con i nuclei figli.

- le nuove cellule sono geneticamente identiche, la mitosi è unprocesso conservativo.

La meiosi

La divisione meiotica avviene esclusivamente per le cellule germinali,quelle destinate alla formazione dei gameti :

- è l‟ultimo evento di divisione della gametogenesi - ha come scopo la formazione di cellule aploidi, differenti tra

loro per quanto riguarda il patrimonio genico.

La meiosi è quindi la base della riproduzione sessuata, che consenteun ampio rimescolamento del patrimonio genico:

- ha determinato la scelta di questo meccanismo riproduttivonell‟evoluzione

La fonte di diversità tra gli individui figli rispetto ai genitori è data da:

- rimescolamento delle informazioni presenti- unione di due genomi differenti- mutazioni.

La riproduzione sessuale di un individuo è data dalla fusione di duecellule aploidi dette gameti:

- il gamete maschile è lo spermatozoo - il gamete femminile è l‟ovulo, una cellula di grandi

dimensioni poiché contenente parecchi materiali di riserva.L‟unione tra i due gameti è detta fecondazione, che da origine ad unacellula diploide detta zigote:

- dallo zigote, per successive mitosi si origina il nuovoindividuo

Le cellule somatiche degli organismi pluricellulari sono generalmentediploidi :

- i cromosomi sono sempre presenti in doppia copia- si presentano copie di cromosomi omologhi , corrispondenti

per forma, dimensioni e contenuto genico.

I gameti , dopo la divisione meiotica, possiedono solamente metà del

patrimonio genico della cellula diploide che li ha formati:- di ciascuna coppia dei cromosomi omologhi viene ereditato

solamente uno- ricostituendosi con il gamete dell‟altro sesso, si ricostruisce il

patrimonio genetico diploide nello zigote

Ciascuna delle coppie di omologhi presenti nelle cellule di unorganismo a riproduzione sessuale è costituita da:

- un cromosoma di origine materna- un cromosoma di origine paterna

La meiosi porta alla formazione di quattro cellule aploidi a partire da

una cellula diploide che ha solamente una fase S, mentre vede duedivisioni nucleari consecutive.

Il passaggio di un cromosoma paterno o materno in un gamete ètotalmente casuale, cosicché si possono ottenere 223 combinazionidifferenti solamente in un gamete.

Un altro processo di rimescolamento dei geni è dato dal crossing-over :

- geni presenti su cromosomi differenti possono in seguitotrovarsi su un solo cromosoma

- permette un ampio rimescolamento genico.

Né deriva che i gameti di un individuo sono sempre differenti tra di lorodal punto di vista genetico:

- si possono avere eventi che danno luogo ad una ampiavariabilità anche tra loro

- questo processo aiuta enormemente il processo di selezionenaturale.




IL MECCANISMO DELLA MEIOSI

Il meccanismo della meiosi porta alla formazione di un gamete aploide,con patrimonio genetico 1n, dopo una sola fase S seguita da duedivisioni nucleari cosecutive.

I processi delle divisioni consecutive sono simili a quelli meiotici(profase, metafase, anafase, telofase), tuttavia presentanocaratteristiche peculiari. Si parla di:

- prima divisione meiotica (meiosi I)- seconda divisione meiotica (meiosi II).

Il primo stadio della meiosi I è la profase I, che è un processo moltolento che si può dividere in 5 parti:

- leptotene: inizio della spiralizzazione della cromatina che siavvolge in filamenti. I telomeri sono tutti rivolti verso un polo

dell‟involucro nucleare - zigotene: i cromosomi iniziano ad appaiarsi e ognicromosoma (formato da una coppia di cromatidi fratelli) sisovrappone al suo omologo mediante una struttura proteicachiamata complesso sinaptemale (CS), formando i bivalenti o tetradi (formati da 4 cromatidi dei due cromosomiomologhi)

- pachitene: i bivalenti si spiralizzano ulteriormente pur rimanendo gli omologhi appaiati. Avviene il crossing-over .

- Diplotene: i bivalenti iniziano a separarsi e rimangono incontatto solamente nei punti in cui è avvenuto il crossing-over, detto chiasmo .

- Diacinesi: i chiasmi scorrono verso le estremità e sidistaccano tra loro. Scompare l‟involucro nucleare e icromosomi iniziano a legarsi ale fibre del fuso.

Il secondo stadio è lo stadio della metafase I:

- le tetradi (o bivalenti) si orientano sul piano equatoriale dellacellula

- i cinetocori delle tetradi sono orientati verso un polo cellulare- a ogni coppia di omologhi si attacca una fibra del fuso.

La terza fase è la anafase I:

- i due cromosomi di ogni coppia si separano e si muovonoverso i poli opposti

- ogni cromosoma è ancora formato da due cromatidi fratelli

uniti a livello del centromero.Segue la telofase I:

- la cellula di partenza si divide in due cellule figlie, ciascunacontenente un numero aploide di cromosomi con unaquantità 2c di DNA.

- si forma un involucro nucleare- ha inizio la citodieresi

Tra la prima e la seconda divisione meiotica v‟è una intercinesi moltobreve poiché i cromosomi non si sono ancora despiralizzate ed ènecessario solamente costruire un nuovo apparato mitotico in

ciascuna cellula figlia.La profase II:

- i centrioli migrano ai poli opposti della cellula- si riforma l‟apparato del fuso

La metafase II comporta l‟allineamento del numero aploide dicromosomi all‟equatore della cellula.

Con l‟anafase II i cromosomi figli (cromatidi fratelli) migrano verso i poliopposti della cellula.

Il processo meiotico si conclude con la telofase II, in cui:

- si riforma l‟involucro nucleare - avviene una seconda citodieresi

la seconda divisione meiotca è equazionale, ha cioè il solo scopo dismistare ai gameti la metà ordinata dei cromatidi fratelli presenti nellecellule della prima divisione.




I quattro gameti che si formano sono tutti geneticamente differenti tradi loro, poiché hanno subito una ricombinazione casuale con loscambio di quelli paterni e materni, oltre che al crossing-over .

Il crossing-over è un meccanismo di ricombinazione che avviene nel pachitene della profase I:

- i cromatidi corrispondenti di due cromosomi omologhi

possono subire ricombinazioni, scambiandosi porzioni dicromosoma tra loro- il punto di incontro è detto chiasma.- Vengono scambiati segmenti corrispondenti tra cromatidi non

fratelli appartenenti a cromosomi differenti.

Il ciclo cellulare eucariotico.

In una popolazione di cellule, ciascuna cellula passa attraversonumerosi stadi ben definiti, che nel complesso individuano il ciclo cel lulare .

Il ciclo cellulare si può dividere inizialmente in due principali fasi:

- fase M: include il processo di mitosi, in cui i cromosomi siseparano, e di citodieresi.

- Interfase: è una fase che può avere varia durata (o essereaddirittura permanente) in cui la cellula svolge le proprieattività metaboliche, di sintesi e di duplicazione del propriopatrimonio genetico.

L‟interfase si compone di tre differenti fasi:

- fase G1.- Fase S- Fase G2

La fase G1 è una fase compresa tra la fase M e la fase S, in cui:

- la cellula accresce le proprie dimensioni- svolge le sue attività si sintesi di RNA e proteine.

La fase S è la fase in cui la cellula duplica il DNA e sintetizza gli istoniche devono duplicare il numero di nucleosomi.

La fase G2 è la fase che precede la fase M e si costituisce di unperiodo in cui la cellula prepara il proprio apparato mitotico:

- sintesi del fuso mitotico- formazione dei cromosomi.

In base alla durata e alle peculiarità del ciclo cellulare, checorrispondono alle funzioni delle cellule, si possono individuare tregrandi categorie di cellule:

Il ciclocellulare, Fase

G1, 8.2, 59%

Il ciclo

cellulare, Fase

S, 3.2, 23%

Il ciclo

cellulare, Fase

G2, 1.6, 12%

Il ciclo

cellulare, Fa

M, 0.8, 6%

Il ciclo cellulare

Fase G1

Fase SFase G2

Fase M




⇀ cellule estremamente specializzate (nervose,muscolari, globuli rossi) che perdono la capacità didividersi

⇀ cellule che non si dividono in condizioni normali, mapossono rigenerarsi in seguito a stimoli appropriati(epatociti, linfociti)

⇀ cellule che possiedono normalmente un livellorelativamente alto di attività mitotica.

La notevole variabilità della durata del ciclo cellulare ha permesso diindividuare una nuova fase particolare, che è presente nelle cellule chetemporaneamente si bloccano in fase G1:

- questa fase, che precede la replicazione del DNA è dettafase G0

- in G0 la cellula è temporaneamente ferma, si porta in fase Ssolamente a seguito di uno stimolo, quando ciò è possibile.

Meccanismi di controllo del ciclo cellulareNumerosi esperimenti condotti nel 1970 da Rao e Johnson inColorado, dimostrarono che le cellule subiscono meccanismi dicontrollo positivo, quindi con presenza di fattori di stimolazione indue passaggi:

- dalla fase G1 alla fase S- dalla fase G2 alla fase M

Questi due passaggi erano dunque indotti da fattori che stimolavano,nel primo caso la replicazione e nel secondo la divisione cellulare(mitosi o meiosi).

I check-point del ciclo cellulare

Nella cellula sono presenti due punti di controllo principali, che, comesi è già detto, provvedono a verificare che vi siano le condizioni per ilpassaggio alla fase successiva.

Inoltre, un tale meccanismo di controllo, permette anche losvolgimento delle attività di crescita e di ciclo cellulare nell‟ordinecorretto.

La stimolazione di un passaggio e l‟attivazione del check point dipendeda condizioni esterne quali ad esempio:

- presenza di fattori di crescita

- quantità di nutrienti- stimolazione ormonale.

Il primo punto di controllo è al termine della fase G1 e verifica:

- la dimensione della cellula- la presenza di nutrienti- la presenza di fattori di crescita- l‟assenza di danni al DNA

Il primo punto di controllo, in assenza di queste condizioni, può ancheindurre il passaggio in fase G0 .

Il secondo punto di controllo è situato al termine della G2 e verifica:

- dimensione della cellula- completamento della replicazione del DNA- assemblaggio dei cromosomi

Esiste in realtà un terzo punto di controllo che però si trova all‟internodella fase M:

- verifica il corretto appaiamento delle fibre del fuso aicentromeri dei cromosomi.

Il ruolo delle protein-chinasi

La maturazione e i passaggi attraverso le fasi del ciclo cellulare sonoregolati da dei fattori di promozione della maturazione (MPF), chesono composti da:

- proteina chinasica: proteina responsabile del trasferimentodi gruppi fosfato (fosforilazione) di specifici substrati proteici

- cicline: subunità di tipo regolatorio.




La concentrazione della ciclina varia da una fase all‟altra e, quando sitrova a concentrazione sufficientemente elevata si ha l‟attivazione dellaprotein-chinasi corrispondente.

La protein chinasi attivata fosforila determinati substrati cheintervengono nelle fasi di replicazione o di divisione.

Negli ultimi anni si è scoperto che il ciclo cellulare è controllato da

chinasi c icl ina-dipendenti (Cdk) :- si attivano in seguito alla concentrazione di cicline- fosforilano determinati substrati, attivandoli o inattivandoli.

Nei due punti di regolazione principali (al termine delle fasi G1 e G2)intervengono rispettivamente:

- ciclina G1- ciclina mitotica

La cicl ina mitot ica viene sintetizzata nel periodo che va da G1 a G2ed aumenta costantemente di concentrazione:

- ha una specifica Cdk che al termine del ciclo lega la ciclinamitotica per fosforilazione

- forma il complesso Cdk-ciclina mitotica che promuove il passaggio dal check point G2 alla mitosi .

Le proteine che vengono fosforilate (con ATP) dal complesso Cdk-ciclina mitotica sono:

- lamine nucleari , permettendo quindi la disintegrazione dellamembrana nucleare.

- Istoni H1, inducendo la condensazione della cromatina.

La ciclina G1 con la sua Cdk controlla il check-point G1 attraverso lafosforilazione della proteina Rb:

- la proteina Rb, quando non è fosforilata, inibisce il fattore ditrascrizione E2F, che promuove la trascrizione e la sintesidegli enzimi necessari per la replicazione

- quando la proteina Rb viene fosforilata, libera l‟E2Fsequestrato e rende possibile la sintesi degli enzimireplicativi, permettendone la trascrizione dei geni.

L’apoptosi

L‟apoptosi è un processo che avviene normalmente negli organismi esegue una sequenza ben precisa di eventi che portano alla mortecellulare programmata.

È un processo pulito, ordinato e naturale, che prevede:

- diminuzione complessiva del volume della cellula- scomparsa del nucleo e frammentazione del DNA- perdita di adesione alle molecole e rottura delle membrane

cellulari- rilascio di enzimi idrolitici dai lisosomi e idrolisi generalizzata- la membrana plasmatica si mantiene intatta- fagocitosi da parte dei macrofagi.

Perché avviene l’apoptosi

Il significato dell‟apoptosi è molto ampio e generalmente è quello dieliminare cellule invecchiate o dannose all’organismo:

- durante l‟embiogenesi ha un‟azione morfogena, ovvero servead eliminare strutture transitorie

- nell‟adulto di homo sapiens, vi sono parecchi esempi diapoptosi:

⇀ regressione della ghiandola mammaria dopol‟allattamento

⇀ perdita di capelli

⇀ formazioni delle superfici cornee nella pelle.- Eliminazione di neuroni che non terminano correttamente

sugli organi bersaglio

- Eliminazione di linfociti T potenzialmente autoimmuni- Eliminazione di qualsiasi cellula invecchiata.

L‟apoptosi può essere indotta o repressa, da differenti segnali:

- segnali antiapoptotici:

⇀ segnali di adesione tissutale




⇀ fattori di crescita

⇀ segnali di adesione alla matrice extracellulare- segnali apoptotici:

⇀ TNF, tumor necrosis factor

⇀ Virus (granzimi)

⇀ Anoikis (integrine)

⇀ Danni del DNA

L’azione delle caspasi.

L‟apoptosi è causata da una serie di enzimi che è oggi denominatacaspasi.

Le caspasi sono una serie di enzimi proteolitici che sono attivati daivari fattori apoptotici. Agiscono tagliando un gruppo selezionato diproteine e strutture bersaglio nella cellula quali:

- alcune protiein chinasi: la distruzione fa saltare le adesioni

intercellulari- lamine: distruzione dell‟involucro nucleare. - Proteine del citoscheletro: actina, tubulina, gelsolina, ecc…

vengono tagliate, devastando la forma della cellula e dellesue strutture.

- Attivazione della DNasi attivata da caspasi: è un enzimache viene attivato dalle caspasi e frammenta in piccoli pezzila cromatina.

Le vie dell’apoptosi

L‟apoptosi può essere indotta da due differenti vie, una estrinseca, e

una intrinseca.La via estrinseca è attivata da stimoli esterni alla cellula, come adesempio i TNF, che invitano la cellula ad andare a farsi fottere.

Nella via intrinseca la cellula si accorge da sola di essere ormai inutilee dannosa al tessuto e, grazie a stimoli interni, si fa fuori da sola.

La necrosi

La necrosi, a differenza dell‟apoptosi, è un processo che è dovuto astimoli esterni e non è programmato: presume che vi sia un danno.

Le cause di necrosi possono essere danni causati da:

- urti meccanici

- radiazioni elettromagnetiche radioattive- corrosioni chimiche.

In seguito al danno subito, la cellula inizia la sua distruzione:

- scoppia e rilascia nell‟ambiente le sue macromolecole,provocando una risposta infiammatoria

- il tessuto leso si trasforma in una massa amorfa friabile- secerne pus.- Viene a crearsi una zona scura.

Il sistema immunitario di macrofagi provvede, quando possibile, ariparare il danno subito.




I virus

I virus sono degli oggetti macromolecolari dotati di patrimoniogenetico, che ne dirige il ciclo vitale una volta che ha infettato unacellula ospite:

- i virus sono infatti definiti parassiti, ovvero riproducono séstessi sfruttando i meccanismi sintetici delle cellule ospiti .

I virus sono sostanzialmente formati da:

- molecola di RNA o DNA, a doppio o a singolo filamento, adoppia elica o lineare.

- involucro proteico detto capside, che comunemente haforma di icosaedro.

Quando il virus si trova al di fuori di una cellula vivente si dice che èsottoforma di virione:

- un virione può avere nel proprio patrimonio genetico da pochiad alcune centinaia di geni.- Il capside è solitamente formato da subunità tutte uguali .

⇀ Può avvenire, come nel caso del virus HIV nell‟uomo,che il virione abbia anche un rivestimento fosfolipidico,derivante dalla membrana plasmatica della cellula chelo ha prodotto e esocitato.

- Ogni virus ha sulla sua superficie alcune proteine chesporgono e interagiscono con le proteine di membrana dellacellula ospite.

Ogni virus ha una propria gamma di cellule ospiti:

- può accadere che un virus abbia numerosissime cellule chelo possono accogliere

- nella maggior parte dei casi, però, sono solamente alcuni tipidi cellula che possono ospitare un dato virus.

Le tipologie di infezioni virali.

Il virus può infettare la cellula con due differenti modalità:

- rubando le attività sintetiche- inserendosi nel DNA della cellula ospite, diventando cioè

provirus.

Infezione litica

Nella maggior parte dei casi il virus che penetra nella cellula ospite viinserisce il proprio patrimonio genetico e sfrutta gli apparati di sintesidella cellula:

- duplica il proprio patrimonio genetico- sintetizza le proteine del proprio capside.- La cellula, alla fine viene indotta a rompersi (lisi cellulare) e

a liberare i virioni neosintetizzati.

Formazione di provirus

In alcuni casi, tuttavia, i virus non infettano la cellula inducendola allalisi, ma si inseriscono integrandosi nel patrimonio genetico della cellulaospite.

Il DNA virale integrato si chiama provirus e ha differenti effetti aseconda del tipo di virus e della cellula ospite:

- le cellule batteriche che contengono un provirus:

⇀ il Dna virale è solitamente silente

⇀ viene attivata la sintesi dei geni virali solamente aseguito di stimoli esterni come radiazioni UV oinnalzamenti della temperatura.

- Alcune cellule animali infettate da provirus, sintetizzano unanuova progenie sfruttando la cellula ospite senza indurla alisi:

⇀ Il virus HIV infetta le cellule continuando a produrrevirioni che infettano le cellule vicine.




- Alcune cellule animali che contengono un provirus divengonocellule maligne:

⇀ Perdono il controllo della loro crescita

⇀ Questo tipo di virus causa l‟insorgenza di tumori.

I batteriofagi

I virus batterici, o batteriofagi, sono virus che infettano le celluleprocariote e sono generalmente formati da:

- capside proteico a forma di icosaedro- lunga coda proteica- placca di adesione con alcune punte.

Vi sono differenti classi di virus che, ad esempio, infettano il caro E.Coli:

- T2, T6, T4: virus con DNA a doppio filamento lineare moltolungo

- Fago : virus a DNA ds lineare più breve. - T1, T3, T5: fagi con DNA ds lineare intorno alle 38 000 nt.- X174: è un virus a DNA con singolo filamento circolare. Il

genoma virale è molto corto. Non possiede la coda.

Il fago T4

Il DNA a doppio filamento del fago T4 è formato da 166000 bp checodificano per 130 geni. È un virus abbastanza complesso.

Il meccanismo di azione di questo batteriofago è quello della lisicellulare:

- viene assorbito dalla cellula ospite: la cellula batterica devepossedere i recettori di membrana adeguati per il fago inquestione.

- nel batterio penetra il genoma virale- vengono trascritti i messaggeri del DNA virale e sintetizzate

le proteine dell‟involucro

- si assemblano i virioni con il patrimonio genetico duplicato- si ha la lisi batterica e l‟espulsione di nuovi virioni.

Fagi della serie .

I fagi di questa serie hanno una interazione più mite con la cellula cheli ospita:

- immettono il loro DNA nella cellula- questo DNA si integra con il DNA batterico, restando nello

stato di profago.- La lisi deve venire indotta da agenti esterni, come ad

esempio radiazioni UV.

⇀ In presenza di radiazioni UV i virioni vengono prodotti eviene indotta la lisi.

Virus animali

I virus animali sono di differente natura ed hanno delle specificitàproprie, come ad esempio la possibilità di effettuare la retrotrascrizione da RNA a DNA.

Vi sono alcuni virus a DNA, quali l‟Herpesvirus o i numerosi virusoncogeni (SV40, Adenovirus, Epstein-Barr, ecc…).

I Virus a RNA comprendono il virus dell’HIV o il retrovirus delsarcoma di Rous , (oncogeno).

SV40 – simian vacuolating virus 40.

Il SV40 è un virus a DNA circolare formato da 5240 bp e da istoni.Possiede due classi di geni dette:

- geni precoci: codificano per 2 proteine T, funzionali allareplicazione del DNA.

- geni tardivi: codificano per VP1, VP2, VP3.

Nell‟uomo il suo ciclo si struttura nelle seguenti tappe:

1. la cellula viene infettata e rilascia la sua molecola di DNA




2. il DNA viene trasferito nel nucleo, in cui vengono trascritti gliantigeni T, che codificano per proteine funzionali allareplicazione del DNA virale.

3. Viene degradato il DNA cellulare e vengono utilizzati inucleotidi per la replicazione del DNA virale.

4. Vengono sintetizzate le proteine del capside VP1, VP2, VP3.5. Si assemblano i nuovi virioni e vengono rilasciati all‟esterno

della cellula.Nel criceto, l‟interazione con l‟SV40 ha un effetto differente:

- l‟immissione del DNA nel nucleo della cellula e la sintesi degliantigeni precoci induce la duplicazione cellulare

- ha l‟effetto di virus oncogeno.

Provirus a DNA e integrazione.

L‟integrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite puòavvenire in due differenti modalità:

- ricombinazione: si ha la rottura di sequenze omologhe

presenti in entrambi i DNA e la loro ricombinazionescambiandole.

- Inserimento in siti fragili: nei siti di rottura del DNAgenomico si inserisce il DNA virale.

Anche le cellule animali, come quelle batteriche, possono avereun‟interazione temperata con la cellula ospite:

- il Dna virale si integra con la cellula ospite e rimane latentefino a quando non è scatenato da fattori esterni

- si trova nello stato di provirus

Nel caso dell‟Herpesvirus, virus a DNA, il genoma virale è integrato

nel genoma ospite:- resta normalmente inattivo trascrizionalmente- ha proprietà litiche qualora sia attivato da cause esterne

come stress, farmaci, raggi UV, antibiotici, ecc…

Virus a RNA e retrovirus

I retrovirus RNA sono una famiglia di virus provvisti di un genomadiploide a RNA monocatenario con polarità negativa.

La peculiarità dei virus a RNA è quella di poter fare la trascrizioneinversa, da RNA a DNA, attraverso un enzima detto trascrittasiinversa:

- è una DNA polimerasi RNA dipendente- forma una molecola di doppio filamento ibrida DNA-RNA a

partire dal genoma virale a RNA- mentre sintetizza il primo filamento di cDNA depolimerizza

l‟RNA virale - in seguito sintetizza anche il secondo filamento, in modo da

formare il cDNA a doppio filamento.

Il genoma di un retrovirus RNA è formato da tre sequenze particolariche sono:

- gag: codifica per le proteine strutturali del capside, icapsomeri

- pol: codifica per la trascrittasi inversa.- Env: codifica per le glicoproteine del pericapside.

Le sequenze LTR stanno per long terminal repeat:

- la LTR sul 5‟ costituisce il promotore per la sintesi delmessaggero- quella sul 3‟ è la sequenza di termine.

Il ciclo di un retrovirus a RNA prevede:

1. penetrazione del pericapside per endocitosi.2. liberazione dell‟acido nucleico.




3. Retro trascrizione e sintesi del doppio filamento di cDNA4. Trasporto nel nucleo della cellula e integrazione con il DNA

con la formazione di un provirus.5. Traduzione delle proteine virali.6. Sintesi di nuovi RNA7. Assemblaggio del capside8. Esocitosi dei virioni.

Un famoso virus con retro trascrizione è quello del sarcoma di Rous,che induce sarcomi nel pollo, comportandosi come un virusoncogeno.




Regolazione dell’espressione genica nei procarioti

Una cellula batterica è strettamente legata all‟ambiente in cui vive, ilquale può mutare la propria composizione chimica in ogni momento:

- un composto può essere presente in determinati periodi,

mentre non esserci in altri.

Si considerano ora due casi in cui dal terreno minimo si aggiungono:

1. lattosio2. triptofano.

Il lattosio è un disaccaride che viene scisso in due monosaccaridi dalbatterio mediante l‟enzima ß-galattosidasi:

- in condizioni minime la presenza di tale enzima è bassissima- all‟aggiunta di lattosio al terreno la presenza dell‟enzima ß-

galattosidasi e dell‟mRNA che lo codifica aumentanosensibilmente.

- Il lattosio ha indotto la produzione dell‟enzima funzionalealla propria digestione.

Il triptofano è un amminoacido necesario per la sintesi delle proteine.Se nel terreno di coltura questo amminoacido non è presente, ilbatterio spende determinata energia per sintetizzarlo:

- qualora si immettesse del triptofano nel terreno di coltura, lecellule non producono più gli enzimi adatti alla sintesi deltriptofano.

- In presenza del triptofano, la sintesi degli enzimi è statarepressa.

L’operone batterico

Nei batteri, i geni che codificano gli enzimi per una determinata attivitàmetabolica sono raccolti insieme in un unico complesso funzionaledetto operone.

Gli operoni batterici operano secondo meccanismi ben precisi epossiedono tutti delle determinate sequenze chiave quali:

- geni strutturali: son i geni che codificano effettivamente per gli enzimi. Tutte le sequenze che codificano per gli enzimidella via metabolica sono disposte una a fianco all‟altra,senza alcun introne, e vengono trascritte generalmente in ununico filamento di mRNA.

- Promotore: è il sito in cui la RNA polimerasi si lega al DNAprima di iniziare la trascrizione.

- Operatore: è una sequenza associata al promotore cheserve come legame per il repressore. Il repressore è unaproteina regolatrice di geni, ovvero che può selettivamentelegare una sequenza di DNA, regolandone la trascrizionedell‟operone.

- Gene regolatore: codifica per la proteina repressore.

La chiave di controllo dell‟espressione genica è quindi il repressore:

- quando esso è legato all‟operatore, non permette alla RNApolimerasi di legarsi al promotore, quindi di trascrivere i genistrutturali.

- Quando la concentrazione del metabolita invece è alta, ilrepressore viene stericamente indotto a slegarsi dallasequenza per permettere la trascrizione dei geni strutturali.

L’operone lattosio, inducibile.

L‟operone lattosio è un esempio di operone inducibile, ovvero cheinduce la trascrizione dei messaggeri necessari per produrre gli enzimifunzionali alla digestione del lattosio.

L‟operone lattosio contiene tre geni strutturali disposti in tandem che

codificano per la ß-galattosidasi e altri enzimi:- se il lattosio è disponibile nel terreno di coltura, all‟aumentare

della sua concentrazione nella cellula, questo si lega alrepressore, modificandone la conformazione.

- Il repressore, normalmente legato all‟operatore sul DNA, sistacca e permette la trascrizione dei tre geni strutturali.




La proteina repressore, in un operone inducibile, si lega all‟operatorein assenza di lattosio, l quale è un induttore.

Quando la concentrazione di lattosio scende, il repressore torna alegarsi alla molecola di DNA.

Controllo positivo mediante cAMP

I repressori come quelli degli operoni lac e trp esercitano la loroinfluenza mediante controllo negativo, poiché quando interagisconocon il DNA la trascrizione è repressa.

L‟operone lac è anche sotto il controllo positivo dell‟AMP ciclico, inpresenza di un fenomeno detto effetto del glucosio:

- quando nel terreno di coltura è presente il glucosio incontemporanea ad altri substrati (lattosio o galattosio, ecc…)il batterio ignora gli altri substrati e metabolizza il glucosio.

- Il glucosio nel terreno di coltura, determina quindi lasoppressione d el la produzione degl i altr i enzimi catabol ic i .

Con studi effettuati su E. Coli nel 1965, si scoprì che nel metabolismoera coinvolto il cAMP:

- maggiore era la concentrazione di glucosio, minore eraquella di cAMP

- con l‟aggiunta di cAMP nel terreno di coltura, la cellulaproduceva rapidamente tutti gli enzimi per il metabolismodegli altri nutrienti (enzimi per lattosio, galattosio, ecc…)

Una molecola di cAMP non è in grado di stimolare direttamentel‟espressione di una batteria di geni:

- nei procarioti agisce legandosi ad una proteina recettoredel cAMP (CAP) che è capace di legare il DNA quando èassociata al cAMP.

- In presenza di cAMP la CAP lega una regione di controllosull’o perone lac , che determina un cambiamentoconformazionale del DNA.

- Il DNA con la nuova conformazione indotta da cAMP-CAP èin grado di trascrivere i geni strutturali del lattosio anchequando il repressore è inattivo per la presenza comunque dilattosio.

Fino a quando i livelli di glucosio sono elevati, l‟enzima adenilato-ciclasi non produce cAMP:

- i livellli di AMP ciclico restano al di sotto della soglia ditrascrizione dell‟operone.

Operone triptofano, operone reprimibile.

L‟operone triptofano è un classico esempio di operone reprimibile:

- il repressore non è in grado di legare da solo il DNA, madeve essere complessato con un co-repressore.

- Il co-repressore, in questo caso, è lo stesso triptofano.

In assenza di triptofano l‟operatore non possiede legato i l repressore:

- il DNA è libero di fare trascrivere i geni strutturali alla RNA

polimerasi- vengono sintetizzati gli enzimi per la sintesi del triptofano.

Quando il triptofano diventa disponibile, gli enzimi della via sinteticanon sono più necessari:

- il complesso triptofano-repressore si lega al DNA- la trascrizione dei geni strutturali dell‟operone trp è repressa.




La regolazione genica negli eucarioti.

Ogni cellula possiede l‟intero patrimonio genetico dell‟individuo, ma inseguito a specializzazione, ne trascrive solo una parte per poicodificare le proteine che vi sono necessarie.

Questo significa che vi sono alcuni geni che vengono trascritti ed altriche vengono repressi:

- ci si accinge quindi a capire quali siano gli stimolatori dellatrascrizione di determinati geni.

- Devono esserci segnali dall‟esterno che inducono unaregolazione interna della cellula specializzata.

Meccanismi di trasduzione del segnale.

I segnaliI segnali tra una cellula e l‟altra possono essere di varia natura:

- ormoni steroidei- ormoni proteici- fattori circolanti o secreti- fattori derivati dall‟ambiente:

⇀ contatti tra cellule mediante molecole di adesione

⇀ segnali nutrizionali

⇀ shock termico.

Ognuno di questi segnali ha una precisa tipologia di trasduzione

all‟interno della cellula: - in seguito attiva dei meccanismi che intervengono nei vari

livelli della regolazione dell‟espressione genica.

Meccanismo degli ormoni steroidei.

La peculiarità degli ormoni steroidei è quella di oltrepassare senzaostacoli la membrana plasmatica:

- il loro recettore si trova nel citoplasma.- L‟ormone si lega al recettore, il quale interagisce

direttamente con la cromatina.

Il recettore citoplasmatico per gli ormoni steroidei è costituitogeneralmente da una proteina o da una lipoproteina che possiede duesiti specifici:

- sito per l’ormone: sequenza di amminoacidi idrofobici chelega stericamente l‟ormone.

- Sito per il legame del DNA: è un sito che si lega ad unasequenza specifica sul DNA a monte del gene, nelpromotore.

Sul DNA, di contro, sono presenti delle specifiche sequenze, detteelementi di risposta, secondo l‟ormone che ne deve regolare latrascrizione:

- GRE: sequenza promotrice per i glicocorticoidi.- ERE: sequenza di regolazione per gli estrogeni.- TRE: sequenza di regolazione per il testosterone.

La sequenza GRE, per esempio, è presente prima di vari geni, quindiun so lo stim olo pu ò attivare la trascrizione di più geni , quindi lasintesi di differenti proteine.

Ormoni proteici

Un ormone proteico, a differenza di uno steroideo, non riesce aattraversare il plasmalemma, quindi necessita della presenza direcettori di membrana.

Quando il ligando si lega al recettore di membrana, nel citoplasma siverificano una serie di reazioni che portano all‟attivazione deisecondi messaggeri:




- vi sono proteine che vengono fosforilate, quindiattivate/disattivate da protein-chinasi , che poi intervengonocome fattori di trascrizione all‟interno del nucleo.

L‟attivazione di un secondo messaggero è attuata con il comunemeccanismo di fosforilazione o di de fosforilazione:

- per fosforilare una proteina è necessaria l‟azione di un fattoreproteico detto protein-chinasi, che catalizza l‟aggiunta deigruppi fosfato su residui di serina, treonina o tirosina dellaproteina effettrice

- la defosforilazioine, invece, avviene ad opera dell‟enzimafosfatasi, che rimuove i gruppi fosfato, inattivando laproteina effettrice.

Struttura e attivazione di un recettore con attività tirosin-chinasica.

Le tirosin-chinasi sono enzimi che fosforilano residui di tirosina susubstrati proteici:

- la fosforilazione della tirosina è un meccanismo per latrasduzione del segnale proprio degli eucarioti

- coinvolge differenti processi cellulari quali:

⇀ crescita

⇀ proliferazione

⇀ differenziamento

⇀ sopravvivenza (segnali antiapoptotici)

⇀ adesione alla matrice extracellulare

⇀ migrazione

Le tirosin-chinasi si dividono in due principali categorie:- recettori tirosin-chinasi: sono proteine transmenmbrana

con un dominio extracellulare in cui si lega un ligando e undominio tirosin-chinasico intracitoplasmatico

- tirosina chinasi citoplasmatiche: non possiedono recettorinell‟ambiente extracellulare.

Le tirosin-chinasi recettoriali sono direttamente attivate da ligandiextracellulari, come ad esempio:

- EGF, epidermal growth factor - PDGF, fattore di crescita delle piastrine- Insulina- Altri regolatori metabolici.

Dimerizzazione del recettore. Il ligando induce la dimerizzazione delrecettore, la quale, permetterà poi di giungere alla auto fosforilazione delle code tirosin-chinasiche.

Il recettore per EGF, una volta legato all‟EGF, si accoppia con un suosimile recettore EGF - ligando EGF appaiando, sul versante citosolicole code tirosiniche:

- i due domini tirosin-chinasici delle molecole procedono allatrans auto fosforilazione, ovvero un dominio chinasicofosforila la coda dell‟altro

- e vice versa.

Attivazione della proteina chinasi. I siti di auto fosforilazione hanno

una doppia funzione:

- regolano l‟attività chinasica - sono sito di legame per le proteine citoplasmatiche.

La fosforilazione della tirosina modula il rapporto con le proteinecitoplasmatiche:

- l‟ansa di attivazione, in assenza di fosforilazione, chiude ildominio di legame per ATP e le altre molecolecitoplasmatiche

- con la coda fosforilata, si ha la progressiva fosforilazione ditutti i residui tirosinici, che permette di liberare il sito di

legame per i secondi messaggeri.Interazioni proteina-proteina dipendenti dalle fosfo-tirosine. Le viedi segnalazione intracitoplasmatiche sono catene di proteine segnaleche interagiscono l‟una con le altre in modo sequenziale.


L i l i d di i i i i i i Alt i i t i di t f i t di l d l tt t i



Le proteine segnale sono in grado di associarsi ai recettori tirosin-chinasi attivati perche contengono dei domini che si leganospecificamente a residui tirosina fosforilati.

Una particolarità di questo meccanismo sta nel fatto che si legano aprecise sequenze amminoacidiche a partire dal pTyr.

Attivazione delle vie di segnalazione a valle. Nel caso del recettoreper EGF, la proteina che interagisce con le code fosfo-tirosiniche delrecettore è la proteina Grb2:

- questa si lega alla tirosina fosforilata ed ha legata a sé uncomplesso Sos o uno Gab.

- Sos attiva una piccola proteina, Ras, che fa parte dellasuperfamiglia delle proteine G ed è associata alla membranaplasmatica sul versante citosolico.

- La proteina Ras è presente in due forme:

⇀ Attiva: legata a GTP

⇀ Inattiva: legata a GDP.- La Ras-GTP lega e attiva le proteine segnali e si disattiva

idrolizzando GTP a GDP, tornando nella forma inattiva⇀ L‟idrolisi GTP >> GDP è mediata e accelerata da

proteine GAP, che inducono e favoriscono la fosfatasi.- Lo scambio in Ras tra GTP e GDP induce l‟attivazione di una

proteina Raf , una proteina-chinasi per serina-treonina cheinduce il ciclo delle Map chinasi

Il ciclo delle MAP-chinasi è una serie di reazioni a catena che portanovarie proteine MAP ad interagire direttamente con il nucleo:

- il termine della catena interagisce, nel nucleo, con geni chepossono indurre la proliferazione cellulare.

- Vengono quindi sintetizzate cicline, Cdk, ecc… segnali cheinducono la cellula a duplicarsi.

Altri sistemi di trasferimento di segnale dal recettore a proteinesituate più a valle

Sono noti altri sistemi di trasduizione del segnale associati ad attivitàprotein-chinasica. Fosforilati da:

- proteine fosforilanti di tipo G: sono proteine GTPasi chedissociano GTP, si legano a recettori-ligandi e trasducono ilsegnale mediante interazioni con altre proteine

- adenilato ciclasi: converte ATP in cAMP, mediatore dellarisposta cellulare.

- Fosfolipasi C: converte dei precursori in inositolo-3-fosfato eDiacilglicerolo (DAG) che mediano altre risposte cellulari.

Modello di un’integrina recettrice per la fibronectina.

Le integrine sono molecole che legano le cellule alle fibre della matriceextracellulare.

La specificità di alcune integrine è anche quella di essere un recettoredi segnali dall’ambiente esterno:

- associata a sé ha spesso meccanismi macromolecolari sulversante citosolico

- in seguito a particolari stimoli, probabilmente meccanici,l‟integrina attiva la fosforilazione di tirosina, che interagiscecon Grb2

- Grb2 è legata a Sos, che attiva Ras-GTP, che attivano lacascata delle MAP chinasi, inducendo la proliferazionecellulare.


Ci li Cdk li lli t



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L’insorgenza di tumori legata alla regolazionedell’espressione genica

I fattori di crescita implicati nell’insorgenza del cancro.

Il controllo della crescita cellulare, dal punto di vista della stimolazione,si avvale di 5 classi di geni che codificano per proteine quali:

- sis: fattori di crescita- erb: recettori per fattori di crescita- ras: trasduttori intracellulari- myc, jun: fattori di trascrizione- cicline, Cdk e loro inibitori.

I geni che codificano per queste proteine regolatrici del ciclo cellularepossono essere causa dell‟insorgenza del tumore se la produzionedelle proteine non è correttamente regolata:

- questi geni, nella loro attività regolare sono definiti proto-oncogeni - nella loro attività scorretta diventano oncogeni.

Questi fattori che regolano il ciclo cellulare, in seguito a dellemutazioni, possono comportare l‟insorgenza di tumori. Alcuni esempi:

- Sis: i fattori di crescita come PDGF o EGF possono venir prodotti senza regolazione ed indurre la proliferazionebarbara.

- Erb: i recettori per i fattori di crescita possono avere, dietromutazione del proto-oncogene, il recettore tronco, quinditrasdurre il segnale anche senza ligando.

- Ras: nelle cellule tumorali, ras può essere costitutivamenteattiva e non indotta!

- Myc, jun: questi fattori di trascrizione sono espressi nellecellule tumorali senza controllo, inducendo continuamente latrascrizione

- Cicline e Cdk: possono essere espresse a livelli troppoelevati, o possono mancare i loro inibitori.

Oncogeni e onco-soppressori.

I geni implicati nella cancerogenesi sono di due categorie:

- onco-soppressori: agiscono da freni. Codificano per

proteine che limitano e regolano la crescita cellulare eimpediscono alla cellula di diventare maligna.- Oncogeni: codificano per proteine che favoriscono la perdita

del controllo della proliferazione cellulare. Possono indurre lacellula a raggiungere uno stato maligno.

⇀ Le cellule possiedono normalmente alcuni geni che inseguito a piccole e brevi mutazioni si possonotrasformare in oncogeni. Tali geni sono detti proto-oncogeni.

Una mutazione sola, al proto-oncogene o all‟onco-soppressore nonbasta normalmente a far insorgere il tumore:

- il cancro si sviluppa quando si hanno mutazioni simultanee di proto-oncogeni in oncogeni e di onco-soppressori incapacidi svolgere la propria attività.

I virus possono inserire nel DNA dell‟ospite degli oncogeni giàprecostituiti e causare insorgenza del cancro.

Attivazione di proto-oncogeni a oncogeni.

L‟attivazione dei proto-oncogeni a oncogeni può avvenire per variecause:

- Amplificazione genica che aumenta il numero di copie delgene trascritto.

- Mutazioni puntiformi che mantengono la proteina ras(trasduttrice del segnale) costitutivamente attiva.

- Traslocazione cromosomica, che crea un nuovo genechimerico che codifica per una proteina costitutivamenteattiva


Traslocazione cromosomica che genera un gene chimerico lega ad esempio il fattore di trascrizione E2F agendo da



- Traslocazione cromosomica che genera un gene chimericotrascritto sotto il controllo di un enhancer forte.

- Inserzioni virali nel genoma della cellula ospite, in cuivengono inseriti direttamente degli oncogeni .

Inattivazione di onco-soppressori

La trasformazione di una cellula sana in una cellula tumorale è

associata alla perdita di funzione dei geni onco-soppressori :

- in un modo o nell‟altro, i vari geni onco-soppressori (ne sonoidentificati 24 nell‟uomo) agiscono regolando negativamentela proliferazione cellulare.

- La loro eliminazione promuove la crescita incontrollata.- Sono anche garanti della stabilità genetica.

RB, il retino blastoma. Tumore ereditario.

Il gene che codifica per pRB è stato il primo onco-soppressore che siastato riscontrato e studiato. Una alterazione di questo gene causal‟insorgenza del tumore della retina, detto retinoblastoma.

Questo tipo di tumore si verifica se entrambi i geni sono alterati, poichése ne è alterato solamente uno, l‟altro cromosoma 13 può codificareper pRB.

Si dimostrò che vi sono alcune famiglie che hanno ereditariamente uncromosoma Rb mutato:

- hanno, nel 90% dei casi la possibilità di sviluppare il tumore.Questo avviene se nelle cellule somatiche avviene unamutazione spontanea al gene RB del cromosoma sano

- la possibilità di sviluppare il retinoblastoma nelle famiglie non

a rischio scende notevolmente, poiché devono avveniremutazioni spontanee su entrambe i cromosomi.

La proteina RB è una proteina che controlla negativamentel‟espressione dei geni necessari per il passaggio G1>>S:

- lega, ad esempio, il fattore di trascrizione E2F, agendo darepressore sui geni che codificano per enzimi implicati nellareplicazione.

- Quando le cicline-Cdk G1 alzano il loro livello, RB vienefosforilata e rilascia E2F, permettendo la trascrizione deglienzimi replicativi

Qualora la proteina RB sia assente o non sia funzionale, a causa della

mutazione di entrambi i geni RB, il passaggio G1>S non può essereinibito, quindi si ha una crescita incontrollata della popolazionecellulare.

La proteina p53.

La proteina p53 è una proteina che ha funzioni rilevantissime nellaprotezione della cellula e nella sua regolazione:

- blocca il ciclo cellulare per consentire riparazioni del DNA- induce all‟apoptosi se le mutazioni sono troppo

compromettenti

La sua azione inibitrice del ciclo cellulare è data dalla capacità diindurre la produzione di CDK p21, che causa direttamente l‟arresto delciclo cellulare:

- questo spiega perché nel 50 % dei tumori, sono mutatientrambi i geni TP53.

- p21, se non è presente nella cellula a causa di mutazioni dip53, permette alle cellule di proliferare con il DNA nonriparato, divulgando le aberrazioni cromosomiche.

Inoltre, la mancata produzione di p53, la quale è in grado di indurreapoptosi, blocca il suicidio della cellula a seguito di mutazioni molto

dannose:- dimostrato dal fatto che se vi è un genoma danneggiato, i

livelli di p53 sono molto alti.


I vari livelli della regolazione dell’espressione genica - vengono replicate un maggior numero di volte le catene che



I vari livelli della regolazione dell espressione genica

La regolazione dell‟espressione genica può avvenire a vari livelli, nonsolamente sulla trascrizione, ma:

1) cambiamenti del DNA: metilazione, amplificazione, mutazionesomatica, ricombinazione somatica, trasposizione

2) trascrizione: struttura della cromatina, inizio e termine della

trascrizione.3) Maturazione post trascrizionale: capping, poliadenilazione,

metilazione, splicing, editing.4) Stabilità dei messaggeri maturi. 5) Modificazioni post traduzionali: modificazione dei prodotti

proteici.

Tutto l‟insieme di processi che regolano l‟espressione genica sonocodificati e regolati geneticamente dal DNA.

Cambiamenti del DNA.

Una delle più semplici regolazioni geniche a livello del DNA è quelladella metilazione:

- ha la funzione di inibire la trascrizione- vengono metilate le citosine a cui seguono delle guanine in

una sequenza ripetuta CpG.

La metilazione varia a seconda dei periodi della vita di un individuo:

- differenti siti possono essere metlati nel feto e de metilatinell‟adulto.

- Uno degli esempi più lampanti è quello delle globine, chehanno differente forma nel feto (due catene alfa e duegamma) nell‟embrione (due catene chi e due epsilon) e

nell‟adulto (due alfa e due beta).

Un altro meccanismo di controllo, che però avviene a livello piùevolutivo, è quello della amplificazione dei geni:

- geni che devono essere trascritti più volte

- vengono replicate un maggior numero di volte le catene chenecessitano di maggior trascrizione (formazione di double minuts ), poi vengono ricombinate nel cromosoma.

- Nell‟uomo ciò avviene con l‟rRNA.

Regolazione a livello della trascrizione

Le proteine che legano il DNA e lo condensano in eucromatina non lo

rendono accessibile alla trascrizione:- gli istoni sono le proteine deputate all‟organizzazione della

cromatina e non permettono la trascrizione quando sonolegati al DNA.

- In fase G1 gli istoni devono essere rilasciati per permettere latrascrizione dei geni.

Gli istoni sono slegati dal DNA mediante metilazione, acetilazione efosforilazione:

- vi sono enzimi deputati al rilascio di istoni che vengonoattivati a seguito di stimoli del ciclo cellulare (istone

acetiltransferasi, HAT) Anche la conformazione che il DNA assume è un fattore che puòinfluire sulla trascrivibilità di un dato segmento:

- nella forma Z il DNA tende a srotolarsi ed è maggiormentefacile raggiungere i nucleotidi

- nella forma B, invece, il DNA è ordinato ed è idonea a legareproteine.

L‟inizio di una trascrizione è finemente regolato da vari fattori, dettipromotori distale e prossimale.

Il promotore distale si compone di:

- enhancer: elemento del DNA situato molto distante dallasequenza promotrice distale e dal gene, lungo circa 200nucleotidi. È intensificatore della trascrizione.

- Coattivatori: si legano all‟enhancer e al promotoreprossimale. Sono di due tipi:


Coattivatori in trans: sono elementi proteici che - Se nella cellula non viene prodotta alcuna proteina



⇀ Coattivatori in trans: sono elementi proteici cheinteragiscono sulla cromatina permettendone ilripiegamento del filamento e l‟accessibilità allatrascrizione.

⇀ Coattivatori in cis: elementi che interagisconodirettamente con l‟apparato di trascrizione.

Il ripiegamento a livello dell’enhancer sul promotore prossimalefavorisce la formazione dell‟enhanceosoma, a cui si lega il complessodi proteine GTF (TF II e TBP) e la RNA polimerasi.

Induzione da elevata concentrazione di metalli pesanti. Il gene checodifica per una proteina detta metallotioneina è codificato dasequenze MRE, mettallic response elements:

- codificata da fattori basali di trascrizione.

Modificazione post-trascrizionale dei messaggeri.

La modificazione post-trascrizionale dei messaggeri è sostanzialmentelegata ai meccanismi di splicing .

Del meccanismo di splicing si è già parlato, ma ciò che regola ancoradi più la trascrizione di un determinato gene è il meccanismo dellosplicing alternativo:

- permette da un solo pre-mRNA di ottenere proteine differenti- è in funzione di:

⇀ stadio di sviluppo della cellula

⇀ tessuto in cui fa parte.

Lo splicing alternativo avviene grazie a specifiche proteine presenti nelnucleo della cellula che vengono sintetizzate nel particolare tipocellulare:

- se in una cellula sono presenti alcune proteine regolatr ic i specif iche , queste si legano a siti di splicing deboli e neimpediscono il taglio da parte dello spliceosoma.

Se nella cellula non viene prodotta alcuna proteinaregolatoria, in presenza degli stessi siti può avvenire il taglio.

Un esempio lampante, negli organismi procarioti, è quello dello splicingdel pre-mRNA della fibronectina:

- nel fegato vengono rimosse due specifiche sequenze (EDB eEDA) che invece sono prodotte nei fibroblasti.

- La fibronectina in circolo sarà quindi differente rispetto aquella che si trova a livello della matrice extracellulare.

Una cosa simile avviene nelle proteine di troponina T e tropomiosina diratto:

- tra il ratto e l‟uomo vi sono differenti meccanismi di splicing,nonostante il gene sia molto simile.

Un altro caso è il pre-mRNA del gene per la calcitonina, che intessuti differenti produce:

- calcitonina nelle ghiandole della tiroide.- CGRP nei neuroni

Livello di stabilità dei messaggeri.

Il controllo a livello della traduzione degli mRNA già trasportati nelcitoplasma avviene su tre livelli:

- localizzazione degli mRNA nel citoplasma- capacità di controllare la frequenza di traduzione e la quantità

di proteine tradotte.- La longevità del filamento di mRNA.

I meccanismi di controllo a livello della traduzione generalmenteoperano tramite interazione tra il filamento di mRNA e proteine.

Determinanti nel controllo della stabilità e della traduzione di un mRNAsono le sequenze UTR (sequenze non tradotte):

- 5‟-UTR si estende dal cappuccio di metilguanosina fino ad AUG

- 3‟ –UTR va dal codone di stop al termine della coda poliA.


Localizzazione citoplasmatica degli mRNA. Verrà trattata in seguito, Controllo della stabilità dell’mRNA. La lunghezza della vita di un



Localizzazione citoplasmatica degli mRNA. Verrà trattata in seguito,parlando dello sviluppo embrionale.

Controllo della traduzione dell’mRNA. Nelle cellule eucarioticheumane vi sono differenti meccanismi che regolano la traduzionedell‟mRNA in proteine.

Alcuni meccanismi possono essere definiti globali , poiché influenzanola traduzione di tutti gli mRNA.

Un meccanismo è quello che influenza eIF2:

- questa proteina, in seguito a stress della cellula, è fosforilatada una particolare chinasi.

- La fosforilazione inibisce la traduzione di tutti gli altri trascritti.- Esistono quattro tipi di chinasi per diversi stress:

⇀ Termico

⇀ Infezione virale

⇀ Presenza di proteine mal piegate

⇀ Carenza di amminoacidi

Altri meccanismi agiscono alterando la frequenza di traduzione dimRNA specifici. Uno degli esempi è quello del mRNA per la ferritina,proteina che regola la quantità di ferro nel citoplasma:

- la traduzione è regolata da una protein a regolatric e del ferro (IRP), che dipende dalla concentrazione di ferro nellacellula.

- Quando la concentrazione di ferro è bassa, il repressore silega ad un UTR dell‟mRNA chiamato elemento di rispostaal ferro.

- Questo impedisce fisicamente la sintesi di altre ferritine.- Quando la concentrazione di Fe resta elevata, viene rimosso

IRP dal 5‟ dell‟UTR e sintetizzate nuove ferritine.

È ancora in fase di studio il ruolo dei microRNA.

Controllo della stabilità dell mRNA. La lunghezza della vita di unRNA dipende dalla necessità della cellula ad avere pronta sintesi nelcitoplasma.

Uno dei principali meccanismi di controllo è quello della coda poli(A):

- un mRNA che è necessario per maggior tempo, esce conuna maggiore coda poliA

- la coda viene gradualmente degradata dall‟enzima poli(A)ribonucleasi.

- Quando la coda si riduce a meno di 30 residui di adenosina,il messaggero viene rapidamente degradato da ribonucleasigeneriche.

La longevità di un mRNA non dipende solo dalla coda poli(A), maanche da specifiche sequenze che ne regolano il tempo diaccorciamento a livello dell‟estremità 3‟-UTR:

- se un mRNA deve avere un‟emivita lunga, la sua coda UTRsarà ricca di sequenze CCUCC, che legano proteine chestabilizzano il messaggero

- se deve avere vita breve, la coda UTR sarà ricca disequenze AUUUA, che legano proteine destabilizzanti .

Se una coda AUUUA viene rimossa, la proteina di cui ne serve unamodica quantità viene prodotta in maniera superiore alla necessità:

- la cellula può diventare maligna.

Controllo post-traduzionale.

Le modificazioni post-traduzionali di proteine sintetizzate possonoessere di varia natura. Tra i più comuni processi vi sono:

- l’acetilazione (aggiunta di – CH3 - OH) come protezione

della degradazione- la fosforilazione su residui di serina, treonina e tirosina- l’aggiunta di gruppi lipidici.- La glicosilazione, che conferisce proprietà funzionali e

recettoriali.




2. Le cellule B producono anticorpi in assenza di antigene: le⇀ Sulla superficie di cellule infettate da virus il linfocita T



cellule B producono anticorpi e li espongono con la porzionerecettoriale sulla loro membrana. Vengono prodotti prima dellastimolazione di un dato ag , e sono pronti a legarsi ad esso.

3. La produzione di antucorpi segue la selezione delle celluleB da parte degli ag: il legame di una cellula B con ildeterminato antigene ne stimola la proliferazione che da vita adue popolazioni di cellule clonali :

a. Plasmacellule: estremamente differenziate, cheproducono notevole quantità di anticorpi.

b. Cellule B memoria: alcune cellule che sono pocodifferenziate ma mantengono la memoria del dato clone.

4. La memoria immunologica produce immunità a lungotermine: le cellule B memoria possono rispondere rapidamentea una successiva comparsa del dato antigene. Se stimolatenuovamente dall‟antigene, producono una risposta immunesecondaria, che dura solo poche ore, a differenza dei giorninecessari per la prima

5. La tolleranza immunologica previene anticorpi contro sé

stessi: I geni che codificano per anticorpi sono combinati acaso per ottenere la variabilità quindi esiste una possibilità disintetizzare degli autoant icorpi . Per la necessaria tolleranzaimmunologica verso il self le cellule che riconoscono comeantigene il proprio organismo vengono subito inattivate odistrutte.

Linfociti T. Attivazione e meccanismo d’azione.

Come le cellule B, anche i linfociti T possono essere attivate da unprocesso di selezione clonale:

- possiedono sulla loro membrana il recettore delle cellule T,

che permette loro di interagire con un dato antigene. Ognicellula T possiede un solo TCR.

- Le cellule T sono attivate da frammenti di antigeni che sonopresentati da cellule presentanti l’antigene (APC) chepossono essere mostrati in differenti modalità:

Sulla superficie di cellule infettate da virus il linfocita Tpuò riconoscere particelle del capside

⇀ In altri casi l‟APC è un macrofago o una celluladendritica che ha degradato enzimaticamentel‟antigene e lo presenta sulla sua membrana in piccolipezzi.

- L‟antigene presentato dalle APC viene poi riconosciuto dalle

cellule T, che attivano la risposta.- A risposta terminata alcune cellule T clonali vengonomantenute come cellule T memoria, mentre altre vengonodegradate o muoiono per apoptosi.

Contrariamente alle cellule B, le cellule T interagiscono direttamentecon altre cellule (macrofagi, altre cellule T, cellule B, ecc…), inducendol‟inattivazione o la morte della cellula bersaglio come risultato finale:

- i mediatori chimici di queste risposte sono le citochine, unaclasse di proteine molto attive che funzionano aconcentrazioni basse:

⇀ sono prodotte da vari tipi di cellule e comprendono gliinterferoni (IFN), le interleuchine (IL) e i fattori necroticitumorali TNF.

⇀ Queste citochine si legano alle cellule bersaglio,modificandone l‟attività, inducendo produzione di altrecitochine o la proliferazione cellulare.

⇀ Una classe particolare, le chemiochine, inducono lamigrazione dei linfociti nelle zone infiammate.

Esistono differenti tipi di cellule T, le cui classi più importanti sono:

- linfociti T citotossici: sono cellule che controllano lapresenza di anomalie nelle cellule del corpo. Induconoapoptosi nelle cellule bersaglio, secernendo perforine egranzimi (questi attivano le caspasi , segnali apoptotici).Identificate dal CD8.

- Linfociti T helper: riconosciuti da CD4, sono attivate da APC professionali (macrofagi, cellule dendritiche, ecc…)


regolano l‟attivazione delle cellule B o di altre cellule T - parte costante (C)



secernendo interleuchine.- Linfociti T regler: complesso CD4+ CD25. Sopprimono

l‟attività di altre cellule immunitarie, soprattutto per evirarefenomeni autoimmuni.

La struttura modulare degli anticorpi.

L‟organismo umano produce milioni di molecole anticorpali differenti,capaci di legarsi praticamente a qualunque sostanza estranea siinserisca nel corpo.

Nonostante la grande diversità e complessità del sistema immunitario,una specifica Ig può interagire solamente con uno o pochi antigeni.

Gli anticorpi sono proteine globulari chiamate immunoglobuline,costituite da differenti catene unite da ponti disolfuro, a livello dellecisteine:

- catene pesanti.- catene leggere.

Vi sono 5 tipi di Ig: A, D, E, G, M:L

- ogni tipologia di Ig è sintetizzata in tempi differenti diesposizione alla sostanza estranea.

- Hanno differente funzione biologica.- Ogni tipo di Ig ha una catena pesante- Ogni Ig ha due tipi di catene leggere.

Una molcola di IgG è composta, formando una Y, da:

- due catene pesanti identiche- due catene leggere identiche.

Vi sono due tipi di catene leggere presenti in tutti gli anticorpi:

- kappa: metà di ogni catena ha una sequenza identica in tuttele Ig, l‟altra metà differisce.

- lambda: avviene la medesima cosa che in kappa.

Anche le catene pesanti possiedono:

- parte variabile (V).

Le catene leggere sono composte:

- metà da una parte variabile, situata all‟estremo dell‟Fc, VL.- metà da una parte costante CL.

Le catene pesanti sono formate:

- nel quarto distale da catene variabili VH.- per i tre quarti prossimali da 3 catene costanti CH1, CH2, CH3.

Ogni porzione costante di una catena si lega tramite ponti disolfuro conl‟omologo della catena pesante o leggera che ha a fianco.

I siti di legame per l‟antigene sono situati alla fine di ogni braccio della molecola a forma di Y e sono identici da entrambe i lati:

- sono costituiti dalla porzione variabile della catena pesanteunita con quella della catena leggera

- l‟assemblaggio delle differenti porzioni variabili causa laenorme variabilità delle Ig.

- La porzione terminale delle due catene variabili (pesanti eleggere) presenta delle porzioni ipervariabili , che giocano ilruolo chiave nel riconoscimento di Ag.

- Il sito di legame per un particolare antigene si chiamaepitopo.

Le porzioni costanti delle catene pesanti, giocano un ruolodeterminante nella determinazione della classe di Ig, che ne determinala specifica funzione.

Base genetica per le sequenze condivise e differenti nelle Ig.

L‟ipotesi prevalente in materia di formazione delle Ig è quella delr iarrangiamento del DNA .

Si scoprì che nell‟embrione le sequenze che codificavano per sequezeV e C erano molto separate sul Dna, ma erano molto vicine nellecellule mieloidi che secernevano anticorpi.


Ad esempio, si possono considerare le sequenze del DNA umano ini l t l k

Con la formazione di catene pesanti e catene leggere e una variazionei ti it ll li i lt ti i tt i



cui sono comprese le catene leggere k:

- una sequenza di geni Vk differenti e ripetuti sono separati daun singolo gene Ck posto ad una certa distanza.

- Si scoprì che le catene leggere V sono più corte dellasequenza necessaria per la sintesi di una catena leggera kcompleta.

⇀ Vi è una certa regione che codifica per i 13amminoacidi rimanenti ad una certa distanza da Vk,chiamata segmento J.

⇀ Il segmento J è formato da 5 distinti segmenti Jk

disposti in tandem.- L‟intero gene completo Vk è formato dall‟unione di uno

specifico gene Vk con una cassetta Jk, mediante uncomplesso proteico chiamato V(D)J ricombinasi, che piegail DNA in un anello in modo da appaiare il gene Vk sceltocasualmente con il gene Jk scelto casualmente.

- Vengono tagliati gli estremi dell‟anello mediante due proteine

associate al V(D)J ricombinasi , dette RAG1 e RAG2:⇀ I Vk e Jk scelti vengono uniti tra loro ed entrano a fare

parte del trascritto mRNA

⇀ I geni che facevano parte dell‟anello formano unacatena di DNA circolare che viene allontanata dalcromosoma.

- Nel processo di splicing , dall‟mRNA vengono allontanati gliintroni, che si frappongono in maniera consistente tra VJ e C.

- Viene poi tradotta la catena dell‟IgG corrispondente.

Da quando vengono allontanate le sequenze dell‟anello, la cellula cheha subito questa trasformazione è in grado di produrre un solo

clone di Ig.Per le catene pesanti il riarrangiamento avviene con simili modalità,ma sono 3 i frammenti genici che compongono VH: V, D, J.

enzimatica, unita allo splicing alternativo si possono ottenere circa200‟000'000 di combinazioni.

Ulteriori variazioni possono per giungere a livello delle mutazioniipersomatiche, che avvengono parecchio tempo dopo la formazionedel DNA riarrangiato:

- il tasso di mutazione è di circa 100 000 volte più alto in quel

luogo rispetto al resto del genoma- ciò avviene a opera di specifici enzimi, come la terminal-

deosossi-nucleotidil-transferasi (TDT), che aggiunge neipunti di rottura dei nucleotidi in modo casuale, comportandodelle mutazioni di piccola entità.

- Queste mutazioni possono avere effetti di sensibilemiglioramento nel riconoscimento dell‟antigene.


- cellule specializzate come quelle della retina, dei denti, dellatuba uditiva



Differenziamento cellulare

Gli stadi del differenziamento

Il differenziamento cellulare è un processo che avviene quando lacellula uovo viene fecondata dal gamete maschile ed avvengono lecondizioni per la crescita del nuovo individuo.

La fusione dei due pronuclei da vita allo zigote, che è formato dapoche cellule indifferenziate e totipotenti.

Lo stadio successivo è quello di blastula, in cui le cellule iniziano adassumere una forma differente, ma sono ancora multi potenti.

Il differenziamento dei tre foglietti embrionali primitivi avviene a livellodella gastrula, in cui si possono individuare:

- endoderma

- ectoderma- mesoderma: il mesoderma è ancora composto da celluleindifferenziate che potranno poi sviluppare lineenotevolmente differenti.

Al termine dell‟embiogenesi, ll neonato avrà una notevole quantità ditessuti diffrenziati, che si calcolano intorno ai 210 differenti.

Il foglietto embrionale endodermico da origine a:

- epatociti, da cui derivano anche le cellule della tiroide- trachea- polmoni

- vescica- pancreas esocrino

L‟ectoderma forma:

- tessuto nervoso- cellule ghiandolari

tuba uditiva.- Midollare del surrene

Il mesoderma da origine a notevoli tessuti differenti:

- osseo- cartilagine- gonadi

- reni- muscoli- corticale del surrene- cuore, cellule endoteliali- cellule sanguigne- ecc…

i morfogeni.

Hans Spemann si mise a cercare nella cellula uovo dei fattoricitoplasmatici che influenzassero lo sviluppo.

Prese due uova di salamandra e le divise in maniera differente:

- una cellula uovo venne divisa in due metà comprendentiuguale quantità di citoplasma > si ottenevano due individuinormali

- l‟altra venne divisa lasciando solamente il nucleo in una enell‟altra il nucleo con la gran parte del citoplasma. >> siottennero un individuo normale e uno anormale.

Spemann fu il primo ad elaborare la teoria del trasferimento delNucleo, e ne ottenne una formidabile prova di validità:

- i nuclei erano trasferibili da una cellula somatica ad unozigote senza alcun problema, ma importante era il citoplasmaper lo sviluppo effettivo dell‟individuo

- gettò le basi della clonazione.


Nelle cellule uovo di Drosophila melanogaster, si scoprì chedeterminati mRNA prodotti ancora prima della fecondazione si

Tre tipi di geni del differenziamento per la Drosophila.



determinati mRNA prodotti ancora prima della fecondazione sisituavano in posizioni specifiche:

- il gene bicoid aveva il suo trascritto posizionato nella parteanteriore dell‟uovo

- il gene oskar si situava nella parte posteriore.

Questa differente disposizione degli

mRNA materni nel citoplasmadell‟uovo viene detta gradientemorfogenetico, poiché vede ladisposizione ordinata di determinatimorfogeni.

Un morfogene è un gene chespecifica per la forma di un organinell‟individuo in fase di sviluppo.

Nella Drosophila si individuaronotre morfogeni, che si disponevano agradienti:

- bicoid: specificava per laregione cefalica

- nanos: specificava per la regione caudale- Toll: determinava lo sviluppo ventrale non legando un altro

fattore Dorsal.

In relazione allo sviluppo della drosophila si scoprì che esistono deigeni del differenziamento:

- si attivano a cascata tra loro, per permettere di codificare per fattori di crescita specifici al momento giusto.

- I morfogeni si esprimono con una sequenza specifica, perché

deve esserci una specifica gerarchia nell‟espressione digeni che regolano lo sviluppo embrionale.

Il moscerino della frutta si scoprì che aveva uno sviluppo controllato datre tipologie di geni:

- geni materni: sono mRNA presenti nella cellula uovo,espressi durante l‟oogenesi. Esprimono la polarità di sviluppoe l‟organizzazione spaziale.

- Geni di segmentazione: regolano lo sviluppo dei vari

segmenti (la drosophila è un animale segmentato, l‟uomono). Sono espressi dopo la fecondazione in seguitoall‟attivazione dei geni materni.

- Geni omeotici: sono geni che specificano l‟identità, la formae la funzione dei segmenti corporei. Si esprimono nellagastrula in seguito all‟attivazione dai geni di segmentazione(nella drosophila) o dei geni materni (nell‟uomo).

Queste tipologie di geni che codificano per proteine di sviluppo hannoanche la capacità, una volta prodotti, di indurre il bloccaggio,l‟eliminazione o l‟inattivazione dei geni della tappa precedente.

La specificità di questi geni attiva una cascata di fattori ditrascrizione che codificano per le proteine necessarie allo sviluppodella parte del corpo individuata dal morfogeno.

Nell‟uomo, dopo i geni materni, sono utilizzati i geni omeotici, chesono disposti su 4 cromosomi con funzioni simili a quelli dellaDrosophila:

- sono direzionati in senso cranio-caudale. Infatti lo sviluppodella maggior parte dei mammiferi ha un indice cefalico.

- Se messi in fila i 4 string del DNA che possiedono imorfogeni, questi

⇀ iniziano al 3‟ con i morfogeni cefalici

⇀ Proseguono con quelli toracici⇀ Al 5‟ vi sono quelli caudali.


Il differenziamento nell’uomo e il mantenimento dello statodifferenziato

-



differenziato

Durante lo sviluppo dell‟individuo umano si esprime nel giusto ordineuna cascata di fattori di trascrizione a gradiente, che sonoespressione dei morfogeni .

Il differenziamento è un processo che si attua per la maggiore durante

lo sviluppo embrionale, ma prosegue nell‟adulto attraverso ilmantenimento dello stato differenziato:

- cellule permanenti: alcuni tessuti non si rinnovano mai più,hanno cellule eterne (nervoso, muscolare, cellule delcristallino…)

- tessuti che si rinnovano per duplicazione semplice: epatociti, cellule endoteliali. Possiedono già nel lorocitoplasma le cellule differenziate.

- Tessuti rinnovati da cellule staminali: epiteli, midolloosseo, ecc… Devono subire determinati segnali che gliimpongono una specializzazione e un differenziamento.

Negli adulti il mantenimento dello stato differenziato è ancora regolatodall‟espr essione di geni che codificano per fattori di differenziamento:

- attivati da fattori di crescita e ormoni- la cellula ha specifici recettori che, in presenza di questi

segnali, inducono la trascrizione dei geni caratteristici deltessuto.

Mantenimento dello stadio differenziato

Il mantenimento dello stadio differenziato ad opera di ormoni o altristimoli può seguire diverse modalità:

- endocrina: gli stimoli giungono attraverso il flussosanguigno, con ormoni che si legano a specifici recettori sullecellule

- paracrina: il mantenimento della specializzazione puòessere indotto dalle cellule vicine attraverso vari meccanismi

- autocrina: la cellula stessa produce segnali che autoimpongono il mantenimento dello stato differenziato.

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