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Crescita batterica Identificazione batterica GIOVANNI DI BONAVENTURA CI «MICROBIOLOGIA E MICROBIOLOGIA CLINICA» CDS MEDICINA E CHIRURGIA UNIVERSITÀ “G. D’ANNUNZIO”, CHIETI-PESCARA AA 2019-2020

Crescita batterica Identificazione batterica

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Terreni di colturaCrescita batterica Identificazione batterica
G I O VA N N I D I B O N AV E N T U R A
C I « M I C R O B I O L O G I A E M I C R O B I O L O G I A C L I N I C A »
C D S M E D I C I N A E C H I R U R G I A
U N I V E R S I TÀ “ G . D ’A N N U N Z I O ”, C H I E T I - P E S C A R A
A A 2 0 1 9 - 2 0 2 0
Terreni di coltura Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo
Caratteristiche:
adeguato grado di umidità
Terreni di coltura Contenuto qualitativo
Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.)
NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti
Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, aggiunti per scopi specifici in terreni particolari
Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici
Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine; necessari per la crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista nutrizionale
Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)
Indicatori: coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.); a valori critici di pH del terreno ne causano il viraggio, fornendo in tal modo informazioni sul metabolismo fermentativo del batterio
Terreni di coltura Classificazione
Terreni LIQUIDI (brodi): componenti sciolti in acqua e sterilizzati.
Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)
In base alla composizione chimica:
Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi; gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note.
Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note.
Terreni COMPLESSI: non è nota l’esatta composizione chimica; comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.).
Terreni di coltura Classificazione
In base alla funzione:
Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche.
Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto, antibiotici) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di quella(e) di interesse; utilizzati per l’isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati (es. feci, espettorato).
Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso; usati per la identificazione di specifici microrganismi.
Terreni di coltura Preparazione
1. Pesata degli ingredienti
3. Correzione del pH al valore desiderato
4. Sterilizzazione terreni (calore umido: agar e brodi; filtrazione: brodi)
5. Distribuzione in capsule di Petri (terreni solidi) o provette (terreni liquidi)
6. Controllo della sterilità
Semina per isolamento
Tecnica più frequentemente utilizzata per ottenere la crescita di colonie separate, a partire da brodocoltura o crescita su agar.
Mediante utilizzo di un'ansa sterile si esegue una serie di semine in differenti aree della superficie dell’agar, in modo da separare le singole cellule.
Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento
Terreni di coltura Tecniche di semina
Semina per inclusione
La sospensione batterica viene miscelata, in una capsula Petri sterile, al terreno agarizzato allo stato liquido che, raffreddandosi, successivamente gelificherà.
Solitamente, l’agar si cimenta con differenti diluizioni, in soluzione fisiologica (NaCl 0.9%) sterile, del campione.
Terreni di coltura Tecniche di semina
Semina per infissione
Mediante un ago da inoculo, il campione viene seminato nello spessore del terreno agarizzato.
Consente di valutare il rapporto del metabolismo batterico con O2 sulla base della altezza in cui si osserva crescita: nella parte alta (AEROBIO), sul fondo (ANAEROBIO), diffusa (ANAEROBIO FACOLTATIVO).
Consente di valutare la motilità del microrganismo: se la crescita è diffusa, il batterio possiede flagelli.
Consente di valutare specifiche attività enzimatiche: proteasi, ureasi, produzione indolo
Terreni di coltura Utilizzo in Microbiologia diagnostica
Agar sangue
Non selettivo; la presenza di sangue (montone, cavallo) consente la crescita di gran parte dei batteri. Utile per la evidenziazione della emolisi (S. aureus, streptococchi emolitici).
Cetrimide Agar
Selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di P. aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato stimolano la produzione di pigmento. La presenza di cetrimide, composto ammonio quaternario verso cui P. aeruginosa è resistente, inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.
Terreni di coltura Utilizzo in Microbiologia diagnostica
Hektoen Enteric Agar
differenziale e selettivo per Salmonella e Shigella dalle
altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari
inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza
di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio
ferrico) per evidenziare la produzione di H2S (colonie
nerastre, Salmonella)
MacConkey agar
e sali biliari inibiscono la crescita di Gram+. Il lattosio
evidenzia la capacità fermentante: colonie fermentanti
lac+ (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appaiono
di rosa acceso, incolori quelle non fermentanti lac-
(Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).
Salmonella typhimurium Shigella flexneri
Mannitol Salt Agar
selettivo e differenziale per stafilococchi; elevata [NaCl] inibisce crescita di altri batteri; sistema fermentante: mannitolo e rosso fenolo (indicatore pH); S. aureus, fermentante, produce colonie con alone giallo-brillante, mentre stafilococchi coagulasi-negativi (es. S. epidermidis), non fermentanti, formano colonie rosso porpora
Salmonella-Shigella Agar (SS Agar)
selettivo e differenziale per Salmonella e Shigella; sodio citrato, sali biliari e verde brillante inibiscono la crescita di Gram+ e alcuni enterobatteri; sistema fermentante: lattosio e rosso neutro; Proteus e Salmonella presentano colonie con centro nero, dovuto alla precipitazione del ferro solfuro, indotta dalla produzione di H2S a partire da sodio tiosolfato presente nel terreno
Terreni «dedicati» Isolamento di agenti eziologici poco frequenti
Campione Diagnosi presuntiva Batteri patogeni Terreni per l'isolamento
Feci Colera Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus
Acqua peptonata alcalina
Faringite membranosa
Haemophilus influenzae
Corynebacterium diphteriae
Agar Loeffler Agar Tinsdale Terreno al tellurito di sodio
Tampone rinofaringeo
Sangue, midollo osseo o biopsia
Brucellosi Brucella spp. Agar brucella
Terreni «dedicati» Isolamento di anaerobi ed «esigenti»
Terreno Scopo
Agar sangue Terreno in piastra non selettivo di uso generale
Agar cioccolato Utilizzato principalmente per l'isolamento di Haemophilus e Neisseria; usato anche per l'isolamento di anaerobi esigenti
Agar MacConkey Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed anaerobi facoltativi
Agar sangue feniletil alcool Isolamento cocchi Gram+ anerobi facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+ e Gram-
Terreno al tioglicolato + emina + vitamina K1
Brodo di arricchimento utilizzato per arricchire i terreni in piastra particolarmente se il campione è scarso
Terreno di Thayer-Martin modificato Impiegato per arricchire i terreni per anaerobi quando si sopetta nel campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis
Agar sangue kanamicina-vancomicina Isolamento selettivo di bacilli anaerobi Gram-
Crescita batterica Definizioni
Crescita vs Tolleranza
in condizioni non permissive per la crescita, alcuni microrganismi possono sopravvivere ma non riprodursi, si usa il suffisso “-tollerante”
Esempio:
- un batterio “termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori
Obbligato (stretto) vs facoltativo
“obbligato” (o “stretto”): una data condizione è necessaria per la crescita
“facoltativo”: il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria; viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali
Esempio:
- un “termofilo obbligato” necessita di elevate temperature per la sua crescita
- un “termofilo facoltativo” può crescere sia ad alte che basse temperature
Crescita batterica Temperatura
La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 30°C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum termico”
Psicrofili: crescono nel range 0 20 °C (Listeria monocitogenes; Flavobacterium)
Mesofili: crescono nel range 10 - 50 °C (maggior parte dei batteri)
Termofili: crescono nel range 40 - 75 °C (Bacillus stearotermophilus)
Ipertermofili: crescono nel range 65 - 110 °C (Pyrodictium brockii)
La febbre rappresenta un efficace mezzo di difesa contro le infezioni
Crescita batterica pH
La maggior parte dei batteri cresce a valori di pH compresi tra 6 ed 8, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum di pH”:
Acidofili: crescono al di sotto di pH 6 (pH 2-6, generalmente); funghi e lieviti più tolleranti vs batteri (pH 5-6).
Neutrofili: crescono a pH 6-8 (la maggior parte dei batteri).
Alcalofili: crescono a pH > 8 (pH 8-9.5, generalmente).
I lattobacilli acidificano la mucosa vaginale, proteggendola dalle infezioni da parte di saprofiti (Escherichia coli, Streptococcus, Candida)
Crescita batterica Attività dell’acqua e pressione osmotica
Attività dell’acqua: indice relativo alla quantità d'acqua che, in un determinato prodotto, è libera da particolari legami con altri componenti; espressa in un valore adimensionale compreso tra 0 e 1
Crescita batterica Alofilia
crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche e bassa aw;
microrganismi alotolleranti (1-6% NaCl), alofili (6-15% NaCl), alofili estremi (15-30% NaCl)
queste condizioni sono incompatibili con la vita di gran parte dei microrganismi
Gli stafilococchi sono, tra i microrganismi clinicamente rilevanti, gli alofili per eccellenza
Crescita batterica O2
Aerobi obbligati: crescono soltanto in presenza di O2 (M. tuberculosis, N. gonorrheae)
Anaerobi obbligati: crescono in assenza di O2 (Bacteroides spp, Clostridium spp)
Anaerobi facoltativi: crescita ottimale in presenza di O2, sebbene crescano anche in assenza (stafilococchi, Enterobacteriaceae).
Anaerobi aerotolleranti: non usano O2, ma crescono anche in sua presenza (C. jejuni).
Microaerofili: crescono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%) (H. pylori).
La dipendenza della crescita batterica dal livello di O2 contribuisce a stabilire il tropismo di una specie batterica, ossia la tendenza a colonizzare siti peculiari dell’ospite.
Cappa (camera) per anaerobiosi
Giara per anaerobiosi
Sistemi per generazione di carbossifilia (5% O2, 10% CO2, 85% N2)
Crescita batterica Atmosfera «controllata»: carbossifilia
Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)
Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
5. Identificazione genotipica (molecolare)
Rilievo
Forma
Superficie
Margine
Staphylococcus aureusStreptococcus pyogenes
Emolisi completa (β-emolisi)
Emolisi: importante criterio distintivo per gli streptococchi.
Tre tipologie di emolisi: α, emolisi incompleta β, emolisi completa , assenza di emolisi
Agar sale-mannite
A) Il mannitolo non viene fermentato da S. epidermidis; il terreno non vira.
B) Fermentazione del mannitolo ad opera di S. aureus; il terreno vira al giallo.
A B
ID dei microrganismi Aspetti macroscopici: sciamaggio
Proteus mirabilis. Il batterio si muove grazie ai numerosi flagelli disposti alla superficie cellulare (peritrico), formando «fronti» concentrici (sciamaggio).
Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)
Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
5. Identificazione genotipica (molecolare)
Enterobacteriaceae, in particolare:
capacità di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio
• acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) + indicatore pH
presenza di particolari enzimi
produzione di specifici prodotti metabolici terminali
• H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)
capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test)
• 1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan (produzione di gas)
API (bioMérieux) Identification System
ID dei microrganismi Caratteristiche biochimiche
Lettura ed interpretazione del test in ciascun pozzetto: Giallo: reazione non avvenuta; no viraggio Viola: reazione avvenuta, come indicata dal viraggio
Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)
Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
5. Identificazione genotipica (molecolare)
La ricerca antigenica mira alla tipizzazione specifica (definizione di specie) e/o intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi appartenenti alla stessa specie).
La ricerca di Ag specifici avviene generalmente mediante utilizzo di Ab specifici.
Esempio: utilizzo di antisieri (Ab specifici) per reazione di agglutinazione:
colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico
reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi
Utilizzo di sferule di latex quali «carrier» di Ag o Ab (reazione macroscopica di agglutinazione).
Utilizzo di Abs specifici per la ricerca microscopica (immunofluorescenza)
Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)
Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
5. Identificazione genotipica
6. Tipizzazione fagica
Polymerase Chain Reaction (PCR)
amplificazione di sequenze “bersaglio”, specifiche per il genere, la specie o lo stipite batterico
elevata sensibilità (necessarie poche copie del target di partenza) e specificità
sequenziamento genico (genotipizzazione)
grandi quantità di rRNA altamente conservate in specie differenti.
presenza di sequenze di rRNA “specifiche” per specie e tipo. Il grado di differenza in rRNA di due batteri è funzione diretta della «vicinanza» filogenetica: piccole differenze sono suggestive per una “vicinanza” tra le specie, mentre grandi differenze indicano una distanza maggiore.
l’individuazione di un pattern in rRNA che non trovi riscontro in nessuna altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.
ID dei microrganismi Identificazione molecolare: PCR
Agarose gel electrophoresis of the PCR products for detection of bacteria. Line M: 100 bp DNA ladder. Lines 1-5: Nitrosomonas sp., Pseudomonas sp., Proteus inconstans , Pseudomonas fluorescence, Pseudomonas aeruginosa; Line 6: negative control without DNA.
ID dei microrganismi Tipizzazione fagica
Nell’ambito di una stessa specie possiamo rinvenire differenti ceppi batterici (sottospecie o tipi), ciascuno caratterizzato da un peculiare grado di virulenza.
E’ possibile utilizzare la tecnica della tipizzazione fagica sia a fini identificativi (tipo fagico) che epidemiologici (studio della circolazione dei ceppi sul territorio, studio delle modalità di diffusione dell’infezione).
Questo è il caso, ad esempio, di S. aureus:
estremamente sensibile a numerosi (almeno 20) fagi litici
la sensibilità non è uniforme (ceppo-specifica) e, pertanto, consente la individuazione di differenti “tipi fagici” sulla base dello spettro di sensibilità
ID dei microrganismi Tipizzazione fagica: S. aureus
Tipizzazione di S. aureus