CRISPR

MOLECULAR ENGINEERING

GENOM-EDITIERUNG

DNA

GENE DRIVE

GENTHERAPIE

GVO?

BIOTECHHOFFNUNG

ETHISCHE BEDENKEN PCR

RNA

HIV

OFF-TARGETS

KEIMBAHN

KONSENSORIENTIERTER DIALOG

TECHNOLOGISCHE REVOLUTIONPALINDROM

SYNTHETISCHE BIOLOGIE

BIOÖKONOMIE

KREBSTHERAPIE

AKZEPTANZ

GENOMCHIRURGIE

EMMANUELLE CHARPENTIER

JENNIFER DOUDNA

METABOLIC ENGINEERINGENZYM

SEQUENCE

KRISPERKAS

TALEN

DIABETES

ENGINEERING BIOLOGISCHER PROZESSE

GESELLSCHAFTLICHER NUTZEN

MOLEKULARE SCHERE

EXPRESSION

SCHLÜSSELTECHNOLOGIE

BIOKRAFTSTOFFE

PHARMA

CHEMIE

AGRARWIRTSCHAFT

MEDIZIN

ERNÄHRUNGSINDUSTRIE

FENG ZHANG

PHAGE

ERBGUT

EMBRYO

GENPOOL DER MENSCHHEIT

BIOPHARMAZEUTIKAREAPEATS

INTERFERENCE

BACTERIA

BAKTERIELLER ABWEHRMECHANISMUS

XENOTRANSPLANTATION

IN VIVO EX VIVO

BIG DATA

SPACERS

SCIENCE

ZINKFINGERPATENT

BIOHACKING

EDITING

CUT

CRISPR/Cas & Co – Neue Biotech-Werkzeuge

VDI-Thesen und HandlungsfelderNovember 2017

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Vorwort

Immer wieder haben technologische Durchbrüche die Welt dramatisch verändert, wie etwa die Nutzbarma-chung der Elektrizität in der Mitte des 19. Jahrhun-derts oder aktuell die so gut wie alle Wirtschaftsberei-che betreffende Digitalisierung. Derzeit mehren sich die Stimmen derer, die voraussagen, dass eine weitere technologische Revolution von der Biotechnologie ausgehen wird. Durchbrüche wie die CRISPR/Cas-Methode verheißen viele innovative Anwendungen in den Bereichen „Medizin“, „Agrarwirtschaft“ und „Industrie“. Beispiele hierfür sind Gentherapien gegen erblich bedingte und bisher nicht heilbare Krankhei-ten, die Entwicklung neuer Immuntherapien gegen Krebs sowie antivirale Strategien gegen HIV. Aber auch stark optimierte Prozesse in der Chemieindustrie sowie neue Methoden zu einer erleichterten Züchtung

von Nutzpflanzen, die die Anpassung der Agrarwirt-schaft an den Klimawandel unterstützen kann.

Allerdings haben diese Perspektiven auch Fragen aufgeworfen, und neue Technologien müssen immer hinsichtlich möglicher Risiken und/oder ethischer Bedenken diskutiert werden. Der VDI-Fachbeirat Biotechnologie möchte mit dem vorliegenden Doku-ment eine Einführung in diese Thematik und Diskus-sionsgrundlage geben. Es beschreibt Methoden geziel-ter Genomveränderungen und deren Anwendungsge-biete und beleuchtet rechtliche Aspekte sowie gesell-schaftliche, ökologische und ökonomische Implikati-onen.

Düsseldorf im November 2017

Prof. Dr. Jürgen Hemberger Vorsitzender des VDI-Fachbeirats Biotechnologie

Dr.-Ing. Stephan Kabasci Stellvertretender Vorsitzender des VDI-Fachbeirats Biotechnologie

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Die Mitglieder des VDI-Fachbeirats Biotechnologie sind:

Prof. Dr. Thomas Berlage, RWTH Aachen und Fraunhofer FIT, Sankt Augustin

Dr. Martin Egger, Roche Diagnostics GmbH, Penzberg

Dr. Claudia Englbrecht, BIO Deutschland e.V., Berlin

Prof. Dr. Sibylle Gaisser, Hochschule Ansbach

Dr. Vera Grimm, Projektträger Jülich (PTJ)

Tina Hausmann, Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (FNR), Gülzow

Prof. Dr. Jürgen Hemberger, TH Mittelhessen, Giessen (Vorsitzender)

Prof. Dr. Bernhard Huchzermeyer, Leibniz Universität Hannover

Dipl.-Ing. Rüdiger John, JEC John Engineering & Consulting, Eitorf

Dr.-Ing. Stephan Kabasci, Fraunhofer UMSICHT, Oberhausen (stellvertretender Vorsitzender)

Stanislaus Koch, Deutsche Industrievereinigung Biotechnologie (DIB) im VCI e.V., Frankfurt/Main

Dipl.-Ing. Thomas Peither, Maas & Peither AG/GMP-Verlag, Schopfheim

Dr. Andreas Pippow, Fraunhofer FIT, Sankt Augustin

Dr. Hans-Christian Schaefer, Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU), Osnabrück

Dr. Pablo Serrano, Bundesverband der Pharmazeutischen Industrie e.V. (BPI), Berlin

Dr. Stefan Sieben, Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg

Dipl.-Ing. (FH) Marc Thanheiser, Robert Koch-Institut (RKI), Berlin

CRISPR/Cas 3

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Inhalt Vorwort 1

Inhalt 3

1 Einführung 4

2 Anwendung und Perspektiven 6

2.1 Medizin 6

2.2 Agrarwirtschaft 8

2.3 Industrielle Biotechnologie 8

2.4 Patentlage 10

3 Rechtliche, gesellschaftliche, ökologische und ökonomische Implikationen 10

Literatur 14

4 CRISPR/Cas

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1 Einführung

Die Analyse des genetischen Codes vieler Organis-men in den vergangenen Jahrzehnten hat dazu geführt,dass molekulare Vorgänge in Zellen immer besserund detaillierter verstanden werden. DieserWissens-zuwachs fördert die Entwicklung neuer molekularerLabortechnologien, durch die der Wissenszuwachswiederum stark beschleunigt wird.

In jüngster Zeit haben sich aus Ergebnissen derGrundlagenforschung neue Technologien zum ge-zielten Eingriff in das Genom weiterentwickelt. Esgibt verschiedene Verfahren, mit denen punktgenaueEingriffe im Erbgut durchgeführt werden können(Genom Editierung). Die etwas älteren, aber weiterhinvielfach eingesetzten Methoden beruhen auf demEinsatz von Enzymen, die DNA an definierten Stellenerkennen und schneiden können. Hierzu gehören diesogenannten Meganukleasen, Zinkfinger-Nukleasen(ZFN) und Transcription-activator-like-effector-Nukleasen (TALEN).

Das neueste Werkzeug zur gezielten Veränderungvon Genomen wird CRISPR/Cas (sprich: Krisperkas)abgekürzt. Die Methode macht sich Mechanismen ausdem Abwehrsystem von Bakterien zu Nutze.CRISPR/Cas ist einfacher, kostengünstiger undschneller zu implementieren als die vorher entwickel-ten Genom-Editierungswerkzeuge und es ermöglicht,gleichzeitig mehrere Ziele im Genom zu adressieren(Multiplexing). Aufgrund dieser Eigenschaften hatsich die Anwendung von CRISPR/Cas in sehr kurzerZeit in allen Bereichen der Molekularbiologie etab-liert – sei es in der Therapieentwicklung, der Pflan-zenforschung oder der industriellen Biotechnologie.Diese breite Anwendung der Genom-Editierungs-methoden und insbesondere von CRISPR/Cas hatauch ethische Fragen aufgeworfen.

Diese Publikation führt in die Thematik der Genom-Editierung mittels CRISPR/Cas ein, beschreibt Me-thode und Anwendungsgebiete und beleuchtet rechtli-che Aspekte sowie gesellschaftliche, ökologische undökonomische Implikationen.

Wie funktioniert CRISPR/Cas?

Nicht nur Menschen, Tiere und Pflanzen, sondernauch Bakterien können von Viren infiziert werden.Nach der Infektion wird ihr sogenanntes adaptivesAbwehrsystem in Gang gesetzt: Das macht sich dasCRISPR/Cas-System zu Nutze – ein Gedächtnis-mechanismus auf molekularer Ebene.

Dabei wird im ersten Schritt die virale Geninformati-on zunächst von sogenannten Cas(CRISPR-associa-ted)-Proteinen erkannt und in kleine Fragmente ge-spalten. Diese wiederum werden in den CRISPR-Abschnitt (Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats) eingefügt. Das sind Abschnitteim bakteriellen Erbgut, die aus kurzen, sich wiederho-lenden DNA-Sequenzen (Repeats) bestehen (Akquisi-tionsphase).

Beim erneuten Virenbefall werden diese CRISPR-Abschnitte zunächst in eine pre-crRNA transkribiert,die anschließend mithilfe eines Cas-Komplexes inEinzelteile, sogenannte crRNA (CRISPR-RNA),gespalten werden (Bearbeitungsphase). Ein Teil dercrRNA ist komplementär zur viralen Geninformationund kann diese somit wiedererkennen. Stimmt diesemit dem gespeicherten Abschnitt überein, wird siedurch die Cas-Proteine zerschnitten und das einge-drungene Virus zerstört (Interferenzphase).

Dieses bakterielle Abwehrsystem wird nun in allenAnwendungsbereichen der Biotechnologie als Werk-zeug eingesetzt, um Erbgut an einer gewünschtenStelle exakt zu schneiden. Dabei funktioniert dasSystem nicht nur in Bakterien, sondern grundsätzlichauch in Pflanzen, Tieren und Menschen. Um ein Genmit CRISPR/Cas gezielt zu verändern, wird ein spezi-fisches RNA-Molekül, das komplementär zu der Stel-le im Erbgut ist, die man bearbeiten möchte, entwor-fen und synthetisiert. Diese sogenannte Guide-RNA(gRNA) führt das Cas-Protein punktgenau an dieStelle in der DNA, die bearbeitet werden soll, undschneidet die DNA an gewünschter Stelle. Die dabeientstehenden freien Schnittstellen der DNA werdendurch die Zelle repariert, indem sie entweder direktmiteinander verbunden werden, ohne dass Erbmaterialdazwischen eingesetzt wird, oder indem ein definier-tes Stück DNA in die Schnittstelle eingesetzt wird. Dadiese Reparatur nicht immer fehlerfrei verläuft,kommt es zu Änderungen der Basensequenz an dergewünschten Stelle (siehe Bild 1).

Das Cas9-Enzym, eine Endonuklease, schneidet denDNA-Doppelstrang sehr effizient an beiden Strängenund erzeugt damit einen Doppelstrangbruch (DSB).Die Schnittstelle wird dabei durch gRNA festgelegt,die von Cas9-Enzym gebunden wird und komplemen-tär zur Ziel-DNA ist. Nach dem DSB treten Repara-turmechanismen der Zelle in Kraft. Dabei werden dieDNA-Stränge durch einen Non-homologous-End-Joining (NHEJ) genannten Prozess wieder verbunden.

CRISPR/Cas 5

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Bild 1. Prinzip der Genom-Editierung durch CRISPR-Cas9. (Quelle: J. Hemberger)

Da dieser Prozess fehlerbehaftet abläuft, kommt es dabei zu Mutationen der ursprünglichen Sequenz. Dies führt in der Regel zu einem nicht mehr funkti-onsfähigen Gen (knock out). Gibt man allerdings eine Fremd-DNA dazu, wird diese im Zuge der Reparatur genau an die gewünschte Stelle eingebaut. Dieser Mechanismus wird Homology-dependent Repair(HDR) genannt.

Beim NHEJ-Prozess wird oftmals nur eine einzige Base, also ein Buchstabe, im Erbgut ersetzt oder ent-fernt. Solche Mutationen (genetische Veränderungen)

kommen in der Natur laufend vor, sie sind der Motorder Evolution. Ob diese Mutationen nun durchCRISPR/Cas oder auf natürlichem Wege spontanentstanden sind, die Ergebnisse sind nicht unter-scheidbar. Dies liegt nicht an methodischen Unzu-länglichkeiten, sondern daran, dass es im Ergebnistatsächlich keine physischen, chemischen oder biolo-gischen Unterschiede gibt. Hierbei wird keine Fremd-DNA in die Zielzelle eingebracht. Beim HDR-Mecha-nismus arbeitet man dagegen mit Fremd-DNA, diegezielt an einer genau definierten Stelle im Genomeingesetzt werden kann.

In den vergangenen Jahren hat sich gezeigt, dass Se-quenzen, die der vorgesehenen Erkennungssequenzähneln, auch geschnitten werden können (off-Tar-gets). Jedoch gibt es mittlerweile verbesserteCRISPR/Cas-Systeme mit deutlich erhöhter Spezifi-tät. Abgesehen davon sind die off-Targets aufgrundihrer Sequenzähnlichkeit zur eigentlichen Zielsequenzim Wesentlichen vorhersagbar. Entsprechend ist eshinterher experimentell überprüfbar, ob an den ähnli-chen Stellen eine Mutation aufgetreten ist. Insgesamtist die Methode denkbar einfach durchzuführen. Manbenötigt nur ein Cas-Protein und eine gRNA, die mitbeliebiger Erkennungssequenz chemisch-synthetischherstellbar ist. Will man mehrere Zielsequenzengleichzeitig treffen, gibt man einfach mehrere gRNAsdazu (Multiplexing).

(Quelle: Thomas Ernsting/LAIF)

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2 Anwendung und Perspektiven

2.1 Medizin

Einsatz in der biomedizinischenForschung

Seit seiner erstmaligen Beschreibung im Jahr 2012 inder Fachzeitschrift Science gewinnt CRISPR/Cas beider Erforschung grundlegender biologischer Prozesserasant an Bedeutung. Wissenschaftler können heuteschneller und zielgerichteter als bisher Veränderungenim Erbgut von Bakterien, Pflanzen, Tieren und Men-schen herbeiführen, und das sogar an mehreren Stel-len im Genom gleichzeitig. Das erleichtert die Aufklä-rung von Genen, ihren Wechselwirkungen in geneti-schen Netzwerken und vieles mehr [1; 42].

Bisher dauerte die gezielte Veränderung einzelnerGene mitunter Jahre und die Etablierung von Tiermo-dellen zur Erforschung von Krankheiten erforderteeine hohe Zahl an Versuchstieren. Dank der hohenEffizienz von CRISPR/Cas sind hierfür oft nur nochwenige Wochen nötig und die Zahl der Versuchstierekann deutlich reduziert werden. Modellorganismen

für die Untersuchung von Krankheitsmechanismensowie für die Entwicklung neuer Therapien könnenalso viel schneller herangezogen werden als je zuvor.In Zukunft ist es sogar denkbar, dass dank der gleich-zeitigen Veränderung mehrerer GeneModellorga-nismen erzeugt werden können, die komplexe multi-faktorielle Erkrankungen nachstellen, wie Bluthoch-druck, Diabetes oder Krebs [2].

CRISPR/Cas wird mehr und mehr zu einem Univer-salwerkzeug der funktionellen Genomforschung mitimmer neuen Einsatzbereichen in der biomedizini-schen Forschung. Dazu gehört z. B. auch die Verän-derung sogenannter epigenetischer Muster (Epige-nom-Editierung), also die Beeinflussung der Aktivitätvon Genen ohne die Gensequenzen selbst zu ändern[3]. Ein weiteres Beispiel ist der gezielte Einbau vonFarbmolekülen durch CRISPR/Cas an spezifischeGenabschnitte (CRISPR Imaging). Damit lassen sichStruktur und Dynamik des Genoms in lebenden Zel-len mit bildgebenden Verfahren analysieren [4].

(Quelle: Thomas Ernsting/LAIF)

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Anwendungen in der Medizin

Das Anwendungspotenzial von CRISPR/Cas in derMedizin ist heute noch nicht endgültig abschätzbarund es gilt noch einige Hürden zu überwinden. Diemit der Methode verbundenen Hoffnungen auf neuetherapeutische Ansätze sind allerdings sehr hoch.

Ein Beispiel ist hierfür ist die sogenannte somatischeGentherapie. Hierunter wird die Korrektur von Gen-defekten in Körperzellen (somatischen Zellen) ver-standen. Dies kann den Austausch oder die Reparatureines defekten Gens, aber auch das Entfernen vonGensequenzen oder das Einfügen therapeutischerGensequenzen beinhalten. Hierzu zählen Immunothe-rapien, antivirale Strategien und die Behandlung mo-nogener Erbkrankheiten. Die somatische Gentherapiewird bereits seit den 1990er-Jahren erforscht, zu-nächst allerdings mit geringem Erfolg. Neuere Stu-dien geben jedoch Anlass zu der Hoffnung, dass mitbesseren Methoden für die Aufnahme in die Zielzel-len und präzisen Werkzeugen wie CRISPR/Cas effek-tivere und sicherere Gentherapien entwickelt werdenkönnen [5; 6]. Beispielsweise könnten bei sogenann-ten Ex-vivo-Therapien (hier entnimmt man dem Pati-enten die zu behandelnden Zellen, verändert sie gen-technisch außerhalb des Körpers (ex-vivo) undschleust sie dann wieder ein) dank moderner Sequen-ziertechnologien nur jene veränderten Stammzellendem Patienten reimplantiert werden, die die ge-wünschte Gen-Korrektur tragen und keine Fehleraufweisen. Damit ließen sich die Erfolgschancendeutlich erhöhen und Nebenwirkungen verringern.

Besonders intensiv beforscht wird seit einigen Jahrendie Immunonkologie. CRISPR/Cas kann hier unteranderem dazu genutzt werden, die Entstehung vonTumoren zu untersuchen [7] oder Immunzellen gezieltumzuprogrammieren [8]. Eine klinische Studie in denUSA, die die generelle Verträglichkeit von CRISPR/Cas beim Menschen und die Anwendbarkeit in derImmunonkologie untersucht, soll hierzu in Kürzeweitere Erkenntnisse liefern [9]. In China erfolgte einerster Test am Menschen bereits im November 2016[10].

Zu den am besten untersuchten Ansätzen im Bereichantiviraler Strategien gehört die Veränderung vonspeziellen Immunzellen, um eine Infektion mit demAIDS-Erreger HIV zu verhindern. Die ersten Ergeb-nisse sind vielversprechend [11]. Auch andere patho-gene Viren stehen im Fokus der Wissenschaft. Darun-ter Herpes Simplex, Hepatitis B oder das humanePapillom Virus. Der Ansatz ist in der Regel das Her-ausschneiden von Genabschnitten und damit die Zer-störung des viralen Genoms, sodass keine weitereInfektion erfolgen kann. Sowohl für das Hepatitis-B-Virus [12] als auch für HIV wurde an Zellkulturengezeigt, dass dies möglich ist.

Derzeit wird mit CRISPR/Cas außerdem an Genthe-rapien gegen verschiedene monogene Erkrankungengeforscht. Darunter Blutgerinnungsstörungen,Muskeldystrophie oder Sichelzellenanämie [13].

Bei sogenannten Keimbahntherapien wird das Erb-gut von Eizellen, Samenzellen oder den Zellen einesEmbryos verändert und damit über die Keimzellen anfolgende Generationen weitervererbt. Anders als beider somatischen Gentherapie würden sich solcheVeränderungen nicht auf ein Individuum beschränken.In der Ethikdebatte, die diesen möglichen Ansatzbegleitet, wird daher vom „Eingriff in den Genpoolder Menschheit“ gesprochen. Keimbahn-Therapiensind in den USA, China und einigen Ländern Europasnicht verboten, werden aber von vielen abgelehnt[14; 15]. Wissenschaftliche Experimente an menschli-chen Keimzellen werden aber dennoch durchgeführt,beispielsweise in China. Bereits zweimal editiertenchinesische Forscher humane Embryonen zur Unter-suchung von genetisch bedingter Blutarmut [16] bzw.HIV. Allerdings waren diese Versuche bisher nichtsehr erfolgreich.

Zuletzt sei noch auf das sogenannte Gene Drive [37]als präventive Strategie gegenüber der Ausbreitungvon Infektionskrankheiten hingewiesen. Hiermitkönnten z. B. krankheitsübertragende Insekten soverändert werden, dass sie Mensch und Tier nichtmehr infizieren können oder steril gemacht werden,damit so deren Populationen zusammenbrechen. Mitdem Begriff Gene Drive werden Methoden zur be-schleunigten Ausbreitung von Genen in Populationenbezeichnet. Zum Verständnis ist hierbei Folgendeswichtig: Viele Arten, auch der Mensch, haben in derRegel zwei Kopien von jedem Gen. Diese Kopienkönnen identisch oder verschieden sein. Bei der Fort-pflanzung wird nach dem Zufallsprinzip an jedenNachkommen nur eine der beiden Genekopien wei-tergegeben. Wird bei der Genom-Editierung nun eineGenkopie gezielt verändert, erhalten die Nachkom-men zufällig entweder die veränderte Genkopie oderdie nicht veränderte. Die veränderte Kopie kommt inder nächsten Generation also statistisch in 50 Prozentder Nachkommen vor. Die Ausbreitung dieser Kopiekann aber beschleunigt werden. Dabei wird mitCRISPR/Cas in Keimbahnzellen von einzelnen Tierenein Gen verändert und außerdem eine Art Kopierma-schine eingefügt, die dafür sorgt, dass nicht nur eine,sondern beide Genkopien verändert werden. Somitwerden nur veränderte Kopien an die Nachkommenweitergegeben. Die genetische Veränderung könntesich so innerhalb weniger Generationen in einer Popu-lation oder gar innerhalb einer ganzen Art ausbreiten.Derzeit wird unter anderem an Konzepten geforscht,Stechmückenarten, die Krankheitserreger wieMala-riaparasiten, Dengue- oder Zikaviren übertragen,mittels Gene Drive so zu verändern, dass sie diesenicht mehr übertragen oder steril werden.

8 CRISPR/Cas

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2.2 Agrarwirtschaft

Die Veränderung von Pflanzeneigenschaften durchZüchtung unter Zuhilfenahme molekularer Merkmalewird seit einigen Jahrzehnten durchgeführt. Neben derreinen Auswahl von Pflanzeneigenschaften anhandmolekularer Informationen werden auch Gene zwi-schen Arten übertragen, um so gewünschte Merkmalein Pflanzen zu erhalten. So können Nutzpflanzenbeispielsweise gegen Schädlinge oder Herbizideresistent gemacht, ihre Anpassungsfähigkeit hinsicht-lich abiotischem Stress (Trockenheit, Salz) verbes-sert oder ihr Gehalt an bestimmten Nährstoffen er-höht werden. Diese so gezielt veränderten Pflanzenwerden heute weltweit in vielen Ländern, wie denUSA, Brasilien und Indien, angebaut.

Insbesondere hier eröffnet CRISPR/Cas die Möglich-keit, genetische Veränderungen deutlich schnellerund gezielter einzuführen. Denn Pflanzen besitzenhäufig mehrfache Chromosomensätze, in denen nundurch CRISPR/Cas die gleichliegenden Punktmutati-onen erzeugt werden können. Ein großer Unterschiedzu traditionellen gentechnischen Verfahren, bei denenganze Gene eingeführt werden, ist hierbei die Mög-lichkeit zur direkten Veränderung des pflanzeneige-nen Erbmaterials, bei der keine DNA aus anderenArten (z.B. aus Bakterien) eingeführt werden muss.

Einige Pflanzen, die durch die Genom-Editierungs-methode TALEN verändert wurden, befinden sich inden USA im Freilandversuch. Beispielsweise Kartof-feln, die nach der Prozessierung weniger Acrylamidenthalten, und Weizensorten mit verringertem Gluten-anteil oder mit Resistenz gegen Mehltau.

Im April 2016 wurde ein Mais vorgestellt, bei demdurch CRISPR/Cas ein Gen ausgeschaltet wurde, dasfür die Synthese der Stärke Amylose notwendig ist.Somit produziert dieser sogenannte Wachsmaishauptsächlich Amylopektin (ein stark verzweigtesStärkemolekül), das bei manchen Prozessen der tech-nischen Stärkenutzung gegenüber der unverzweigtenAmylose bevorzugt wird. Auch gibt es Arbeiten,Weizen durch den Einsatz von CRISPR/Cas trocken-toleranter zu machen sowie weitere Getreidesorten zumodifizieren [17; 18]. Ebenso wurden Speisepilze, dienach dem Anschneiden nicht bräunen, mithilfe vonCRISPR/Cas entwickelt. Auch Soja und Reis wurdenschon durch CRISPR/Cas verändert.

2.3 Industrielle Biotechnologie

Auch in der industriellen Biotechnologie finden Ge-nom-Editierungssmethoden wie CRISPR/Cas zuneh-mend Anwendung, wobei hier das Potenzial bei Wei-tem noch nicht ausgeschöpft ist. BiotechnologischeVerfahren ermöglichen die nachhaltige Produktion

(Quelle: Thomas Ernsting/LAIF)

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von Kraftstoffen, Chemikalien oder Arzneimitteln –in der Regel durch die mikrobielle Fermentationnachwachsender Rohstoffe. Heute werden z. B. Ami-nosäuren, Enzyme oder auch Therapeutika wieInsulin biotechnologisch hergestellt. Zur Entwicklungökonomisch konkurrenzfähiger Produktionsorganis-men sind hoch effiziente Methoden zur Genomverän-derung von großer Bedeutung.

Beispiele für solche Anwendungen finden sich unteranderem auf dem Gebiet des sogenanntenMetabolicEngineering, bei dem große Teile des Stoffwechsels(Metabolismus) eines Produktionsorganismus soverändert werden, dass ein gewünschtes Produkt hocheffizient synthetisiert werden kann. Beispielsweisemussten für die industrielle Herstellung der wichtigenGrundchemikalie 1,3-Propandiol mit einem E. coli-Stamm in einem sehr aufwendigen Prozess insgesamt26 genetische Mutationen eingeführt werden. Diesgelingt mit dem CRISPR/Cas-Ansatz wesentlichschneller und einfacher, da Multigen-Mutationen ineinem einzigen Ansatz durchgeführt werden können[19]. Dieser Ansatz ließ sich auch in Eukaryonten wieder Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae verifizie-ren. So gelang es einer Arbeitsgruppe, in einem einzi-gen Transformationsschritt an fünf verschiedenenGenomorten gleichzeitig anzugreifen und Verände-rungen zu induzieren. Dies führte zu einer Steigerungder Produktion einer Schlüsselsubstanz zur Synthesevon Insektiziden und Antitumorsubstanzen um den

Faktor 41. Zur Überprüfung von Off-Target-Effektenwurde eine vollständige Genomsequenzierung desStamms durchgeführt. Dabei wurden ausschließlichdie gewünschten Genommodifikationen gefunden[20].

Ein Teil des initialen industriellen Interesses anCRISPR/Cas kam aus der Lebensmittelindustrie, inder Lactobacillus-Stämme eine große Rolle spielen.So können z. B. Joghurtkulturen von Viren befallenwerden, was zu großen Produktionsausfällen führenkann. 2004 fanden französische Wissenschaftler beider Untersuchung von virenresistenten Lactobazillendie schon vorher beschriebenen CRISPR-Sequenzenund konnten nachweisen, dass diese für die Resistenzverantwortlich waren. Damit war erstmals bewiesen,dass CRISPR-Cas einen natürlichen Abwehrmecha-nismus gegen Viren in Bakterien darstellt. In derFolge wurde das CRISPR/Cas-System in nicht resis-tente Stämme eingeführt, um diese immun gegenViren zu machen. Allerdings geht die Einführungeines solchen Systems in einen Produzentenstamm inder Regel mit einer Reduktion der Fitness-Nutzen-Abwägung erfolgen muss.

Ein weiterer interessanter Aspekt des CRISPR/Cas-Systems besteht in der selektiven Entfernung ein-zelner bakterieller Stämme aus einer Mixtur ver-schiedenster Bakterienspezies [21]. Dazu wird ein

(Quelle: Thomas Ernsting/LAIF)

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CRISPR/Cas-System, z. B. aus E. coli, verwendet, dasspezifische Genomstellen von essenziellen Genen deszu entfernenden Bakteriums angreift. Damit gelingtes, diese ungewünschten Bakterienpopulationen nahe-zu vollständig zu entfernen. Dies kann z. B. dazugenutzt werden, um selektiv kontaminierende Mikro-organismen aus einem biotechnologischen Produkti-onsprozess zu entfernen. Grundsätzlich könnten dieseBeobachtungen auch den Weg zu neuen hochselek-tiven Antibiotika ebnen. Ein wesentlicher Vorteilwäre dabei, dass im Falle einer Infektion nur daspathogene Bakterium angegriffen wird, währendnützliche Bakterien, wie die gesamte Darmflora, in-takt bleiben, was zu einer schnelleren Erholung nachder Infektion beiträgt.

2.4 Patentlage

Die Patentlage ist kompliziert. Die beiden Wissen-schaftlerinnen Emmanuelle Charpentier und JenniferDoudna haben das CRISPR/Cas-System in seiner

Anwendung zur Genom-Editierung 2012 erstmals inScience veröffentlicht und im Mai desselben Jahreszum Patent angemeldet. Im Dezember 2012 meldeteFeng Zhang vom Broad Institute/MIT die Anwendungder Methode in Eukaryoten zum Patent an. NachdemZhang sein Patent erhalten hatte, legten Doudna undCharpentier Einspruch dagegen ein. Ihr Argument:Zhangs Patent würde von ihrem schon abgedeckt undwäre somit hinfällig. Anfang 2017 entschied das Pa-tent Trial and Appeal Board (PTAB) des U.S. Patentand Trademark Office (USPTO), dass Zhangs Patentrechtmäßig sei [22] und sich nicht mit dem Patent vonDoudna und Charpentier überlagere. Die Entschei-dung hatte unmittelbare Auswirkung auf die Aktien-kurse der Unternehmen, die von Charpentier, Doudnaund Zhang gegründet worden sind. Für andere Unter-nehmen, die die CRISPR/Cas Methode nutzen, ist soetwas mehr Klarheit geschaffen worden. Allerdingshaben die beiden Wissenschaftlerinnen gegen dieEntscheidung Einspruch erhoben. Wie diese Ausei-nandersetzung endgültig ausgeht, ist nach wie vorunklar.

3 Rechtliche, gesellschaftliche, ökologischeund ökonomische Implikationen

Zukünftige Auswirkungen der routinemäßigen Nut-zung moderner Genom-Editierungsmethoden auf dieGesellschaft sind noch nicht abschätzbar – regelmä-ßig werden teils genuin neue Anwendungsmöglich-keiten in Fachartikeln beschrieben.

Eine vergleichsweise große Einigkeit besteht aberdarin, dass mit Methoden wie CRISPR/Cas keinegrundlegend neuen gesellschaftlichen und ethischenFragen einhergehen, bestehende aber durchaus ver-schärft werden. Die Möglichkeit, Pflanzen, Tiere undauch menschliches Leben nach eigenen Vorstellungengenetisch zu verändern, ist nicht neu, wenn auch diebisherigen biologischen Werkzeuge bei Weitem nichtso präzise, einfach und schnell anwendbar waren.Daher rücken Experimente und Interventionen inerreichbare Nähe, die zuvor schon aufgrund begrenz-ter Ressourcen und zeitlicher Restriktionen gar nichtumsetzbar gewesen wären.

Gerade wegen der schnellen Entwicklung von Ge-nom-Editierungsmethoden und der damit verbunde-nen Beschleunigung von Forschungen und neuenAnwendungen in der Medizin, Landwirtschaft oderder industriellen Biotechnologie ist ein breiter gesell-schaftlicher, politischer und fachlicher Dialog

notwendig. Die Gesellschaft muss sich mit den Fragenim Zusammenhang mit der Anwendung von Genom-Editierungsmethoden – auch im Hinblick auf dieBedeutung heutiger Entscheidungen für künftigeGenerationen – befassen. Der Vorsitzende des Deut-schen Ethikrats Prof. Dr. Dabrock formuliert entspre-chend in seiner Begrüßungsrede einer Tagung desEthikrats: „Wir sind an einem Punkt, an dem man sichzu den Möglichkeiten von CRISPR/Cas und Co nichtmehr nicht verhalten kann. […] Vielmehr muss eshier und heute darum gehen zu prüfen, worauf wir alsGesellschaft – wer immer wir auch ist – uns einlassenoder eben nicht einlassen wollen mit CRISPR/Casund Co.“ [23].

Eine durch CRISPR/Cas verändertePflanze muss kein GVO sein.

Laut Gentechnikgesetz (§ 3 Absatz 3 GenTG) handeltes sich bei einem „gentechnisch veränderten Orga-nismus um einen Organismus mit Ausnahme desMenschen, dessen genetisches Material in einer Weiseverändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedin-gungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombinationnicht vorkommt […]“ [43].

CRISPR/Cas 11

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(Quelle: Finck, VDI)

Mit CRISPR/Cas werden zum aktuellen Entwick-lungsstand insbesondere Punktmutationen erzeugt,wie sie fortwährend auch spontan in Organismen aufnatürlichem Wege entstehen, nur eben gezielt. Dahersind solche durch CRISPR/Cas entstandene Organis-men nicht von herkömmlichen Varietäten zu unter-scheiden und fallen nicht unter die derzeit geltendeDefinition des europäischen und deutschen Gentech-nikrechts, so entschied das in Deutschland für dieEinordnung zuständige Bundesamt für Verbraucher-schutz und Lebensmittelsicherheit (BVL), in dem dieZentrale Kommission für Biologische Sicherheit(ZKBS) angesiedelt ist. In einer Stellungnahme vomNovember 2015 kommt das Amt zu dem Schluss,dass Pflanzen, die durch CRISPR/Cas hervorgerufe-nen Punktmutationen aufweisen, keine gentechnischveränderten Organsimen im Sinne der EU-Richtlinie2001/18/EG sind [24]. Dieser Einschätzung schließensich die Mitglieder des VDI-Fachbeirats Biotechnolo-gie an. In einem Impulspapier des Verbands Biologie,Biowissenschaften und Biomedizin in Deutschland(VBIO) wird diese Position ebenfalls vertreten undbegründet [25]. Diesem Aspekt stimmt auch die Deut-sche Industrievereinigung Biotechnologie (DIB) imVerband der Chemischen Industrie (VCI) zu [38].Allerdings widersprechen dieser Einschätzung aucheine Reihe von Nichtregierungsorganisationen undGentechnikkritikern [39; 40; 41]. Aus ihrer Sichtnämlich definiert das EU-Recht Gentechnik alleinprozessbezogen, sodass auch diejenigen Organismenunter das Gentechnikrecht fallen, bei denen mitCRISPR/Cas nur Punktmutationen eingeführt wurden.Werden jedoch größere Abschnitte von Erbgut ineinen Organismus eingeführt, fallen diese in den Gel-tungsbereich des Gentechnikrechts, weswegen nachAnsicht des VDI-Fachbeirats die rechtliche Einord-

nung der derzeitigen Methoden im Rahmen des aktu-ellen EU-Gentechnikrechts und der nationalen Um-setzungen regelkonform möglich ist.

Die Frage der Einordnung wird auch in anderen Län-dern diskutiert: So urteilte das schwedische „Board ofAgriculture“ im Mai 2016, dass bestimmte Pflanzen,die durch CRISPR/Cas verändert wurden, nicht unterdas EU-Gentechnikrecht fallen [26]. Das „UnitedStates Department of Agriculture“ (USDA) sah in denletzten Jahren bei einigen durch Genom-Editierungentwickelten Pflanzen, die Punktmutationen enthalten,keinen Regulierungsbedarf [27], so z. B. bei obenerwähntem Speisepilz oder einer herbizid-tolerantenRapssorte. Bei der Einordnung des Rapses hatte sichdas deutsche Bundesamt für Verbraucherschutz undLebensmittelsicherheit der Einschätzung des US-amerikanischen Landwirtschaftsministeriums USDAangeschlossen. Derzeit arbeitet die USDA an derAnpassung ihrer Regularien, um die aktuellen Ent-wicklungen abzubilden [28].

Leopoldina, acatech und die Union der DeutschenAkademien der Wissenschaften haben sich ebenfallsmit der Thematik befasst und empfehlen im Septem-ber 2015 „aufgrund der schwindenden Differenzier-barkeit zwischen durch Züchtung, natürliche Prozesseoder Genom-Editierungsverfahren erzielten Verände-rungen die Entwicklung neuer Verfahren […] für dieRegulation gentechnisch veränderter Organismen[29]. Auf EU-Ebene ist dazu noch keine Entscheidunggefallen. Seit Jahren arbeiten Experten in Brüsseldaran, eine Einordnung verschiedener Methoden zurPflanzenzüchtung vorzunehmen, u. a. von TALENund CRISPR/Cas. Eine Entscheidung, ob diese Me-thoden nun unter das Gentechnikrecht fallen odernicht, wurde von der Kommission mehrfach verscho-

12 CRISPR/Cas

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ben und liegt immer noch nicht vor. In der Zwischen-zeit haben gentechnikkritische Organisationen wie dieConfédération paysanne und andere gegen einen Arti-kel des französischen Umweltgesetzes geklagt [30], indem mit Genom-Editierung erzeugte Organismennicht als GVO eingestuft werden. Die Entscheidung,ob GVO oder nicht, liegt nun beim EuropäischenGerichtshof (EuGH). Ein Urteil wird in Fachkreisennicht vor 2018 erwartet.

Keimbahnexperimente am Menschen?

In Deutschland ist es gemäß § 5 des Embryonen-schutzgesetzes verboten, die Erbinformation mensch-licher Keimbahnzellen (Eizelle, Samenzelle und derenVorläuferzellen) künstlich zu verändern und einemenschliche Keimzelle (Eizelle, Samenzelle) mitkünstlich veränderter Erbinformation zur Befruchtungzu verwenden [31]. Ebenso werden innerhalb derWissenschaft Experimente und Interventionen an dermenschlichen Keimbahn zum gegenwärtigen Zeit-punkt und Wissensstand mehrheitlich abgelehnt. Ver-schiedene Organisationen haben hierfür einMorato-rium gefordert, wie etwa die Leopoldina gemeinsam

mit acatech, der DFG und der Union der DeutschenAkademien der Wissenschaften [32]. Die Mitgliederdes VDI-Fachbeirats Biotechnologie schließen sich indiesem Punkt an und folgen in der Argumentation derinterdisziplinären Arbeitsgruppe Gentechnologiebe-richt (IAG) der Berlin-Brandenburgischen Akademieder Wissenschaften (BBAW) [33], die zwar prinzipi-ell die Erforschung der neuen Genom-Editierungs-methoden für den medizinischen Bereich befürwortet,sich jedoch zum gegenwärtigen Zeitpunkt eindeutiggegen Genom-Editierungsexperimente an der mensch-lichen Keimbahn ausspricht. Die Leopoldina hat ineinem jüngeren Diskussionspapier für die Forschungan Embryonen und an Keimbahnzellen ergänzt, dassder Einsatz von Genom-Editierungsmethoden hierzwar Bedenken aufwerfe, jedoch nicht grundsätzlichethisch abzulehnen sei [34]. Die Autoren betonenhier, dass sich die menschliche Embryonalentwick-lung zum Teil deutlich von der Entwicklung bei Tie-ren unterscheidet und Erkenntnisse aus Tierexperi-menten nur begrenzt auf den Menschen übertragbarsind, weswegen der Einsatz von Genom-Editierungs-methoden für das Verständnis der menschlichen Emb-ryonalentwicklung von besonderer Relevanz sei.

(Quelle: Thomas Ernsting/LAIF)

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Vorsicht bei Gene Drive

Aus ökologischer Sicht sind insbesondere die soge-nannten Gene- Drive-Methoden (siehe Abschnitt 2.1)in ihren Auswirkungen zu untersuchen. CRISPR/Casermöglicht bzw. vereinfacht die Umsetzung des GeneDrive, bei dem ökologische Auswirkungen unver-meidbar und sogar beabsichtigt sind. Folge des Ein-satzes von Gene Drive bei bestimmten Stechmücken-arten könnte das Verschwinden der Mücken aus demÖkosystem sein – mit entsprechenden Folgen fürSpinnen oder Vögel, die sich von den Mücken ernäh-ren. Da das Wirkprinzip des Gene Drive impliziert,dass die Verbreitung der genetischen Veränderungkaum gestoppt und höchstens durch die erneute An-wendung eines Gene Drive rückgängig gemacht wer-den könnte, ist schon die Forschung an derartig ver-änderten Organismen aufgrund einer möglichen unbe-absichtigten Freisetzung mit Risiken behaftet. Ob dieFolgen eines solchen Eingriffs in die Vererbung undin das Ökosystem vorhersagbar, kontrollierbar oderumkehrbar wären, ist heute noch völlig ungewiss.Daher sollten auch gut gemeinte Ansätze, wie dieBekämpfung von Infektionskrankheiten und Schäd-lingen oder die Ausrottung von invasiven Arten infremden Lebensräumen einer sehr sorgfältigen ethi-schen oder ökologischen Risiko-Nutzen-Abwägungunterzogen werden.

Ökonomische Auswirkungen derzeit nichtabschätzbar

Die ökonomischen Auswirkungen von Genom-Edi-tierungsmethoden sind nicht abschätzbar. Zu vielewissenschaftliche und vor allem auch regulatorische,gesetzliche und patentrechtliche Fragen sind nochoffen. CRISPR/Cas-Anwendungen können in fastallen Industriezweigen, die sich mit biologischenSystemen befassen, zum Einsatz kommen. Beispielesind die Wirkstoffentwicklung für Arzneimittel, Gen-und Zelltherapien, die Pflanzen- und Tierzüchtung.Wie groß künftige Märkte sein werden und welchenAnteil CRISPR/Cas daran haben könnte, ist derzeitnicht bezifferbar. Zum jetzigen Zeitpunkt lässt sichjedoch feststellen, dass die Zahl der veröffentlichtenPatentanmeldungen von CRISPR/Cas seit 2014sprunghaft steigt [35] und allein zwischen Anfang2013 und April 2015 bereits über 600 Mio. USD anRisikokapital von interessierten Unternehmen (Cari-bou Therapeutics, CRISPR Therapeutics, IntelliaThera-peutics) eingeworben wurden [36]. Hinzu-kommen nun zahlreiche Aktivitäten internationalerKonzerne aus Pharmazie, Chemie und Landwirt-schaft. Der Einsatz von CRISPR/Cas könnte auchfinanzielle Auswirkungen auf das Gesundheitssystemhaben – sollten beispielsweise heute noch sehr teureGentherapien in Zukunft deutlich günstiger werdenund großflächiger zum Einsatz kommen – aber auchdiese möglichen Auswirkung sind derzeit nicht ab-schätzbar.

(Quelle: Thomas Ernsting/LAIF)

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Fazit

Es ist wichtig, dass sich die Gesellschaft auf dierechtzeitige Beantwortung der Fragen im Zusammen-hang mit der Anwendung von Genom-Editierungs-methoden, auch im Hinblick auf die Bedeutung undAusstrahlung heutiger Entscheidungen auf künftigeGenerationen, vorbereitet. Diese Fragen betreffeninsbesondere Aspekte somatischer Gentherapien oderKeimbahneingriffe sowie die Verwendung sogenann-ter Gene-Drive-Methoden. Ebenfalls in die Betrach-tungen mit einzubeziehen sind Analysen der Folgen,nicht nur für die Gesellschaft, sondern auch für eingesamtes Ökosystem. Darüber hinaus sollte offen

darüber diskutiert werden, mit welchen Konsequenzenbeim Unterlassen bestimmter Eingriffe zu rechnen ist.Die Abwägung einer gezielten und präzisen Verände-rung genetischer Eigenschaften sollte wissensbasierterfolgen. Insgesamt plädiert der VDI-Fachbeirat Bio-technologie für einen interdisziplinären, konsens-orientierten und öffentlichen Dialog – unter Einbin-dung von Vertretern aus Wirtschaft, Wissenschaft,Gesellschaft, Politik und Verwaltung. Ziel muss essein, mögliche Vor- und Nachteile für Umwelt undGesellschaft zu diskutieren sowie offene Fragen zuklären, damit der Einsatz von Genom-Editierungs-methoden zukunftsorientiert und zumWohle allergestaltet werden kann.

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[24] https://www.bvl.bund.de/SharedDocs/Downloads/06_Gentechnik/gentechnikrechtlichen%20Einordnung%20von%20neuen%20Pflanzenz%C3%BCchtungstechniken.html?nn=1401078 (aufgerufen am 12.10.2017)

[25] www.vbio.de/vbio/content/e25/e15139/e15146/e36766/e36448/filetitle/160914_GE_Impuls_ger.pdf (aufge-rufen am 12.10.2017)

[26] https://www.upsc.se/about-upsc/news/4815-green-light-in-the-tunnel-swedish-board-of-agriculture-a-crispr-cas9-mutant-but-not-a-gmo.html (aufgerufenam 12.10.2017)

[27] http://www.nature.com/news/gene-edited-crispr-mushroom-escapes-us-regulation-1.19754 (aufgerufenam 12.10.2017)

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[30] http://curia.europa.eu/juris/document/document.jsf?text=&docid=186771&pageIndex=0&doclang=en&mode=req&dir=&occ=first&part=1&cid=698924 (aufge-rufen am 12.10.2017)

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[39] http://transkript.de/menschen/pro-kontra/seite/freisetzung-crispr-co-als-gvo-einstufen.html (aufgerufen am 12.10.2017)

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