Cromatografa

Objetivos Conocer la cromatografa como tcnica para ladeterminar la identidad y concentracin de los componentes de una mezcla.

Separar mezclas de sustancias , observando as sus caractersticas y los factores que en ella intervienen.

Que es la cromatografa? Mtodo fsico-qumico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia. Fundamentalmente intervienen dos fenmenos:

Adsorcin Reparto

Cromatografa (chroma-color y graphein-escribir)

escribir en colores

Conjunto de tcnicas

Separacin de mezclasDeterminacin de componentes

Mikhail Tswett 1906

FASE MVIL

A

B

F.

F. MVIL: (solvente) F. ESTACIONARIA: (retenida en un SOPORTE)

lquido gas slida lquida

FASE ESTACIONARIA

Los componentes de una mezcla son disueltos en una fase mvil que se desplaza a travs de una fase estacionaria. Cada molcula interacciona en distinta forma con

la f. mvil y la f. estacionaria (segn susPROPIEDADES FSICO-QUMICAS) atraviesan la fase estacionaria a diferente velocidad .

SEPARACIN O FRACCIONAMIENTO

La forma ms comn de clasificarla es segn la fase estacionaria empleada , esto es :

Cromatografa plana

Cromatografa en Columna

En papel

De gases

En capa fina

De lquidos

CROMATOGRAFIA EN PAPEL Es una tcnica utilizada para llevar a cabo la separacin e identificacin de nuevas sustancias contenidas en una mezcla dada. Pertenece al tipo de cromatografa de particin . Hay dos tipos de cromatografa en papel : la ascendente (papel hacia arriba) y la descendente (papel invertido)ascendente descendente

LABORATORIO

SOPORTE papel de celulosa F. ESTACIONARIA (LQUIDA H2O) una hoja de papelde celulosa de elevada pureza recubierta de un capa de H2O asociada a las fibras de celulosa.

F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico apolar parauna mejor cromatografa

F. ESTACIONARIA (polar)

CMARA CROMATOGRFICA

MUESTRA

FLUJO propiciado por CAPILARIDAD

Superficie plana = soporte

FASE MVIL (apolar o menos polar )

Materiales Papel de filtro:

Tintas

Cmara cromatografica o un recipiente

Solvente

ExplicacinH 2O H 2O H 2O HHHH2 H 2O O H 2O H 2O

H 2O H 2O H 2O

H 2O H 2O

H 2O

H 2O

Molcula Hidroflica LENTA (soluble) Retenida por la fase estacionariaFRENTE de avance del solvente

Molcula Hidrofbica RPIDA (insoluble) Disuelta en la fase mvil

OBSERVACION RESULTADOS

hidrofbica

hidroflica

Componentes de la tinta negraTERICAMENTE EXPERIMENTALMENTE

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINASoporte plancha de metal o vidrio Fase estacionaria (SLIDA) slido pulverizado sobre plancha de metal o vidrio. El ms usado es el gel de slica . Fase mvil (LQUIDA) Disolvente orgnico

Materiales Placa de vidrio

Capa fina

Cubeta cromatogrfica Lpiz

Regla

Capilar de vidrio

Muestra problema

Eluyentes ms comunes ter de petrleo

tolueno dietil-ter, t-butil-ter diclorometano acetato de etilo n-pentano, n-hexano ciclohexano

Procedimiento1. Realizar un rectngulo de papel de filtro de altura y permetro inferiores a los de la cubeta de cromatografa , procurando que a lo largo del experimento nos permita la visin perfecta del cromatofolio.

2.

Introducir el disolvente elegido en el interior de la cubeta con una altura de 5 mm. Con un lpiz y una regla trazar un lnea horizontal a unos 5 mm. de la base de un cromatofolio (la lnea deber quedar por encima del nivel de disolvente cuando el cromatofolio se introduzca en la cubeta).

3.

4. Preparar la mezcla de anaranjado de metilo, azul de metileno y rojoCongo, aadiendo unas 10 gotas de cada uno de ellos en 2 mL de etanol.

5. Con la ayuda del capilar de vidrio colocar una gota de la mezcla sobrela linea trazada en el cromatofolio.

7. Introducir rpidamente el cromatofolio en la cubeta, en posicin vertical, ligeramente inclinada (de forma que desde el exterior tengamos visin del nivel del disolvente en el cromatofolio en todo momento).

8. Una vez colocado el cromatofolio se procede a tapar la cubeta ,cuando el nivel de disolvente se site a unos pocos milmetros de la parte superior del cromatofolio, extraer y pasar a revelar la placa para observar los detalles.

Visualizacin de componentesLas manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden revelarse mediante: Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 F366), el nmero que aparece como subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador utilizado. El roco con una solucin de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de extraccin de gases). Despus calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero hasta carbonizar los compuestos .

Factores que influyen en la CCFa) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben ms

en la fase estacionaria.b) Limpieza de las placas. Muchas placas estn contaminadas con grasa o agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequea escala, stas

deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol ydespus dejar secar completamente antes de aplicar la muestra. c) Pureza de los disolventes. d) Evitar que durante la experimentacin haya presencia de las corrientes de aire.

Ventajas La tcnica para la cromatografa en capa fina es anloga en muchos aspectos a la cromatografa en papel, pero es mas ventajosa en lo siguiente:

Rapidez :su desarrollo es mucho mas veloz.

Distancia: La cual recorre el soluto es menor.Se puede trabajar con cantidades pequeas Pueden emplear reveladores energticos como cidos, oxidantes

(entre otros) ,que generalmente destruyen el papel.

Calculo del factor retencin Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el valor de Rf (factor de retencin), o la distancia que cada

compuesto se desplaza en la placa. Cadacompuesto tiene un Rf caracterstico que depende del disolvente empleado y del tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente. De

esta manera se puede ayudar a identificar uncompuesto en una mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando se hacen eluir en la misma placa de CCF).

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA La cromatografa en columna se usa para separar grandes cantidades de material: >100 mg. El proceso de cromatografa consta de una fase mvil (eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), los cuales dependen de las sustancias. Segn la afinidad de las molculas por la fase mvil o la estacionaria,stas se separaran.

Despus de cada cromatografa podremos sacar informacin del cromatograma tanto cualitativa (para identificar los distintos compuestos de la mezcla) como cuantitativa (para poder obtener la cantidad y composicin de las sustancias separadas).

FRACCIONESANLISIS DEL CONTENIDO DE LAS FRACCIONES

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Pero normalmente las fracciones no presentan diferente coloracinEspectrofotomtrico Abs 280nm Protenas Otras Abs - Colorantes

ExperimentoSEPARACIN DE COLORANTE ARTIFICIAL Pesar 0.5 g de colorante artificial. Para empacar la columna sujtela en el soporte con las pinzas. Engrase ligeramente la llave y mantenga la posicin de cerrado. Introduzca hasta el fondo un pequeo pedazo de algodn ayudndose con la varilla de vidrio, agregue 10 mL de eluyente y presione suavemente el algodn para que quede bien colocado y sin burbujas. Prepare una suspensin de 10 g de alumina para columna en 50 mL de eluyente y agite por 5 minutos hasta eliminar las burbujas de aire. A travs del embudo de vidrio vierta la suspensin en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme.

Abra la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar lavalumina sin disolvente. En un vaso de precipitado de 150 mL disuelva la mezcla problema con la mnima cantidad de eluyente (5 mL), ayudndose con el agitador, virtala con cuidado para que quede distribuida uniformemente encima de la superficie de la alumina. Abra la llave para colectar el disolvente y se adsorba la muestra aplicada (cuidando que no se seque la columna), inmediatamente inicie la elusin, eluya a muestra. Colecte las fracciones de los diferentes pigmentos de la muestra problema en los frascos viales.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICOSOPORTE Resina de micropartculas formadas por polmeros sintticos o naturales (dextranos, celulosas, agarosa). F. ESTACIONARIA (SLIDA) Grupos con cargas inicas unidos al soporte. Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-): cromatografa aninica Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+): cromatografa catinica F. MOVIL (LQUIDA) Solvente que anula la interaccin electrosttica. 2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga de las molculas de la muestra. Gradientes inicos (salinos) competencia por grupos electrfilos.

Molec. MENOR CARGA (+) RPIDAS* Son desplazadas ms fcilmente por la f.mvil. Las molc. (-) rechazadas por la f. estacionaria y eluidas directamente. Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS * Son retenidas por los grupos cargados inicamente de la f. estacionaria.

CROMATOGRAFA DE AFINIDADSOPORTE Matriz de micropartculas hidroflicas sin carga, con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrlica). F. ESTACIONARIA (SLIDA) Ligandos (grupos qumicos) especficos (con afinidad por alguna de las molculas a aislar) unidos a la matriz. -- Comerciales: Concavalina A une glicoprotenas Protena A une IgG (anticuerpos) -- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz F. MVIL (LQUIDA) Solucin que anula o disminuye la afinidad con el ligando de la fase estacionaria. -- Solucin con el propio ligando Molcula + ligando libre -- Solucin con algo que interacciona con el ligando Molcula

Molec. NO INTERACCIN RPIDAS * No se unen al ligando de la fase estacionaria eluyen directamente. Molec. INTERACCIN LENTAS * Se unen al ligando de la f. estacionaria. Elucin especfica.

CROMATOGRAFA DE EXCLUSINSe basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamao y forma de las molculas.

PROPIEDAD: Tamao (y forma)SOPORTE Resina de micropartculas esfricas porosas formadas por polmeros hidroflicos (dextrano, agarosa, poliacrilamida o mezcla de ellos). Dimetro de poro determinado. Tamaos de poro intervalo o rango de fraccionamiento. P.e. Sephadex G25: Sephadex G200: 1000 5000 Da 5000 250000 Da

F. ESTACIONARIA (LQUIDA) solvente acuoso (el mismo que el de la fase mvil) que se encuentra dentro de micropartculas. F. MVIL (LQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la columna por los espacios intersticiales (entre las micropartculas).

Molec. GRANDES RPIDAS * Avanzan a mayor velocidad a travs de los espacios intersticiales entre las bolas (con f. mvil) son eluidas antes

Molec. PEQUEAS LENTAS* Penetran en los pequeos conductos de las bolas de gel y avanzan a menor velocidad (con f. estacionaria) son eluidas despus

( High performance liquid chromatography )

En la cromatografa de alta eficacia ocurre el fenmeno de particin o de reparto Existen dos posibilidades de particin : cromatografa en fase normal cromatografa en fase inversa

La cromatografa de particin en fase inversa es la ms utilizada de todas las tcnicas HPLC La Fase estacionaria ms comn es C18 La fase mvil ms comn son; acetonitrilo, metanol, tetrahidrofurano, etc. con agua como componente de la fase mvil.

Las reglas bsicas en HPLC son cuatro: Fase mvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta. Todos los solutos han de ser solubles en la fase mvil (es decir, polaridad similar). Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagacin). Y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migracin diferencial).

Las columnas de HPLC estan hechas de acero inoxidable

bombas de presin de varios centenares de atmsferas

reservorios de disolvente que pueden contener cada uno ms de 500 ml.

En la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) la mezcla que contiene los compuestos a separar es disuelta e inyectada en una columna rellena de fase estacionaria a travs de la cual, es forzada a pasar por una fase mvil impulsada por la bomba de alta presin.

inyector

Dentro de la columna la mezcla se separa en sus componentes en funcin de su interaccin entre las dos fases. Esta separacin puede ser modificada eligiendo adecuadamente tanto la fase mvil, como la estacionaria, el flujo de la fase mvil, su concentracin, pH, mtodo de deteccin o la temperatura de la separacin.

La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fraccin de tiempo que ha necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector

El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la seal se transforma en una grfica en funcin del tiempo denominada cromatograma

Cromatograma

Cromatograma correspondiente a una cromatografa liquida en fase reversa para compuestos fenlicos

En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra

El anlisis habitual de los cromatogramas consiste en detectar sus picos, cuya movilidad se asocia a un compuesto determinado, y calcular el rea bajo cada pico, que indica la concentracin del compuesto .

Las concentracin viene dada por la altura del pico en el mximo .

La cromatografa no solo permite la separacin de los componentes de una mezcla, sino tambin su identificacin y cuantificacin.Se pueden separar molculas en funcin de sus cargas, tamaos y masas moleculares Las clases de cromatografa desde un ngulo ms general son cromatografa de lquidos Cromatografa de gases y cromatografa de fluidos supercrticos. Como su Nombre lo indica La fase mvil en las tres tcnicas son lquido, gas y fluido supercrtico respectivamente.