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FacoltàdiMedicinaePsicologiaDipartimentodiScienzeMedico‐ChirurgicheediMedicinaTraslazionale
DOTTORATODIRICERCAINONCOLOGIA(XXIXCICLO)CurriculumOncologiaDigestiva
Sviluppodiunmodello“exvivoorganculture”perlavalutazionedelmicrobiotaintestinale:
applicazioniinOncologiaDigestiva
Dottorando CoordinatoreDott.ClaudioLanini Prof.GiovanniRamacciatoRelatore CoordinatoreCurriculumDott.CristianoPagnini Prof.GianfrancoDelleFave
AnnoAccademico2015‐2016
III
Indice
1.Introduzione 1
1.1.Ilmicrobiotaintestinale 1
1.1.1.Definizione 1
1.1.2.Composizioneelocalizzazione 2
1.1.3.Sviluppoemodificazioni:ilmicrobiotanelneonatoenell’adulto 3
1.1.4.Funzioni 4
1.2.Probioticieprebiotici 5
1.2.1.Probiotici:definizioneefunzioni 5
1.2.2.Prebiotici:definizioneefunzioni 7
1.3.Cancerogenesidellamucosacolica 8
1.3.1.Polipiintestinali 8
1.3.1.1.Definizioneecaratteristiche 8
1.3.1.2.Polipinon‐neoplastici 8
1.3.1.3.Polipineoplasticioadenomi 9
1.3.2.Carcinomacolo‐rettale 10
1.3.2.1.Epidemiologiaeprognosi 10
1.3.2.2.Eziologiaefattoridirischio 10
1.3.2.3.Storianaturaleealterazionimolecolari 11
1.4.Relazionetramicrobiotaetumoredelcolonretto 13
1.4.1.Ruolopro‐carcinogeneticodelmicrobiota 14
1.4.1.1.Microbiotaedinfiammazione 14
1.4.1.2.Microbiotaeattivazionedeipro‐carcinogeni 15
1.4.2.Ruoloanti‐carcinogeneticodelmicrobiota 16
IV
1.4.3.Modifichealivellodell’ospite 18
1.5.Metodidistudiodelmicrobiota 19
1.5.1.Metodiclassici 20
1.5.1.1.Coltureinbatch 20
1.5.1.2.Colturecontinue 21
1.5.1.3.Modellianimali 21
1.5.2.Metodibasatisulsequenziamento 22
1.5.2.1.Sequenziamentodell’RNAribosomiale 22
1.5.2.2.Sequenziamentocompletodelgenoma 23
1.5.2.3.Metagenomica 24
1.5.2.4.Sequenziamentodasingolacellula 25
1.5.2.5.Metatrascrittomica 26
1.5.3.Metodimolecolari 26
1.5.3.1.DNAfingerprinting 26
1.5.3.2.DNAmicroarray 27
1.5.4.Metodiquantitativi 28
1.5.4.1.PCRquantitativa(oReal‐timePCR) 28
1.5.4.2.Ibridazionefluorescenteinsitu(FISH) 29
1.5.5.Metodifunzionali 29
1.5.5.1.Metaproteomica 29
1.5.5.2.Metabolomica 30
1.5.5.3.Marcaturaconisotopistabili 31
2.Scopodellatesi 32
3.Materialiemetodi 33
3.1.Pazienti 33
V
3.2.Campionibioptici:ilmodellosperimentaleexvivo 33
3.3.EstrazionedelDNA/RNA 34
3.4.Real‐timePCR 35
3.5.Statistica 35
4.Risultatieconclusioni 36
4.1.Risultati 36
4.2.Conclusioni 43
5.Bibliografia 45
1
1.IntroduzioneDamoltianniènotoilruolochelamicroflorabattericaintestinaleomicrobiota,svolge
nelmantenimentodell’omeostasidell’organismoumano,masolorecentemente,tramite
l’utilizzoditecnichecolturaliedibiologiamolecolaresemprepiùefficienti,sisonoavuti
progressinotevolinellostudiodellamicrofloraendogena.
L’interessedellacomunitàscientificaèstatofocalizzatosulleinterazionitramicrobiota
intestinaleeospite1,conparticolareriguardoallecondizionifisiologichee/opatologiche
chepossonocausareun’alterazionedellacomposizioneedelnumerodeimicrorganismi
presentinell’intestinoumano.D’altrocanto,numerosistudihannogiàpropostol’utilizzo
dibatteriprovvistidieffettibeneficisullasalutedell’uomooprobiotici,neltrattamento
di alcune condizioni patologiche, quali la diarrea infettiva, la sindrome dell’intestino
irritabile(IBS)elemalattieinfiammatoriecronicheintestinali(IBD).
Atalproposito,assumeunanotevoleimportanzal’approfondimentodeglistudisulruolo
delmicrobiotaintestinalenellacancerogenesidellamucosadelcolon,dallaformazione
deipolipi adenomatosi finoaquelladel carcinomacolon‐rettale, allo scopodi ridurne
l’insorgenzae/ol’incidenzanell’uomo.
1.1.Ilmicrobiotaintestinale
1.1.1.Definizione
Permicrobiotaintestinalesiintendel’insiemedeimicrorganismi,deilorogeniedeiloro
metaboliti,presentineltrattogastrointestinaleumano2.
Asecondadeltipodirapportocheilmicrobiotarealizzaconilproprioospiteparleremo
dimicrorganismisimbionti,commensalie/opatobionti:nelprimocaso,siailmicrobiota
che l’individuo traggono un vantaggio dalla loro associazione, nel secondo caso, sono
soltanto imicrorganismia trarrevantaggiodall’associazionecon l’ospite, senza recare
ad esso né danni né benefici ed infine, nel terzo caso, i batteri, innocui in condizioni
normali,possonoindurreundannoall’ospiteincondizionipatologiche.
2
All’internodeltrattogastroenterico,lefontidinutrimentodelmicrobiotasonocostituite
essenzialmentedallesostanzeingeriteconladietadall’individuoedavariecomponenti
presentialivellodellamucosaintestinale,comemucoecelluleepitelialisfaldate.
Normalmente,ilsistemaimmunitariodell’individuoelamicrofloraintestinalesitrovano
inunacondizionediequilibriodinamicoche, incasodialterazionedellacomposizione
dellamicroflora,puòessereperturbatoesarebbeassociatoconlacomparsadipatologie
gastroenteriche,comecolonirritabile,malattieinfiammatoriecroniche,diverticolitee/o
cancrodelcolonesistemiche,comeallergie,obesità,diabeteditipo2edaterosclerosi3.
1.1.2.Composizioneelocalizzazione
Grazieallosviluppodinuovetecnichedibiologiamolecolarebasatesulsequenziamento
dellasubunità16Sdell’RNAribosomiale,iricercatorihannopotutoidentificarenonché
classificareicostituentidellamicrofloraintestinale.
Questo complesso ecosistema comprende sia specie autoctone, ovveromicrorganismi
commensali acquisiti alla nascita o, come recentemente ipotizzato, trasferiti in fase
prenataledallamadrealfetopoichégiàpresentinelliquidoamniotico,nellaplacentao
nelsanguedelcordoneombelicale111‐113,siaspecietransitoriediorigineambientale9.
Inoltre,inaccordoconlalocalizzazione,ilmicrobiotaintestinaleècostituitosoprattutto
dabatterianaerobi10,siafacoltativicheobbligati:traiprimiannoveriamoLactobacillie
Streptococchi,EnterococchieEnterobatteriacee,mentrenelsecondogrupporitroviamo
BifidobatterieClostridi11.
Nell’individuoadulto,iphylabattericipiùrappresentatinellamicrofloraintestinalesono
Firmicutes,72%,Bacteroidetes,20%eActinobacteriaeProteobacteria,5‐8%12.Alprimo
phylumappartengonopiùdi200generidiversi,tracuiBacilli,CocchieClostridi,mentre
nelsecondosonoracchiusipiùdi20generi,tracuiBacteroidesePrevotella13.Nelgruppo
degliActinobacteriaritroviamoiBifidobatteri,mentreinquellodeiProteobacteriasono
compreseleEnterobatteriaceeedEscherichiacoli.
Nel complesso, la popolazionemicrobica gastrointestinale includedalle 500 alle 1000
speciedifferenti,appartenentia14famiglieea45generi,edistribuitesuun’areatotale
dicirca300m2diintestino.Intotale,lecellulebatterichechecostituisconolamicroflora
intestinalesono1014,unnumero10volte superioreaquellodelle celluleeucariotiche
umane4: èperquesto che ilmicrobiota intestinaleumanocontieneunnumerodi geni
3
almeno100voltesuperioreaquellodeigenichecostituisconoilgenomaumanoesipuò
considerareunveroepropriogenomasupplementareperl’ospite,dettomicrobioma5.
Ilmicrobiotaintestinale,cheincludeoltreil70%deimicrorganismipresentinelcorpo
umano6,varianotevolmentealivelloquantitativoequalitativonelledifferentiporzioni
del tratto gastrointestinale ed in particolare, la densità batterica aumenta in modo
esponenziale passando dalla porzione superiore a quella inferiore dell’intestino.Nello
stomacoenelduodenosiregistraunaminoredensitàbatterica(101‐103CFU/g),mentre
neltenue(digiunoeileo),questadensitàaumenta(104‐107CFU/g),perpoiraggiungere
ilsuopicconelcolon(1011‐1012CFU/g)7.
Le variazioni qualitative e quantitative che si registrano lungo tutto il tubo digerente
dipendonodafattoribatterici(es.capacitàdiadesioneeattivitàmetabolica)edafattori
legatiall’ospite,chesisuddividonoinfattoriestrinseci(es.dieta,assunzionedifarmacie
fattoriambientali)edintrinseci(es.pH,motilitàetempoditransito,muco,acidigastrici
esecrezionigastrointestinaliepresenzadiossigeno)8.
Così, ilcolonpresentaun’altadensitàbattericaacausadeltransito lentodelmateriale
ingerito,maanchedelbassopotenzialeredoxcaratteristicodiquestotrattoedèdunque
l’unicaporzionediintestinoincuilamicroflorasistabilizzainmanierapermanente.
Viceversa,lapopolazionebattericaèscarsanellostomacoacausadelpHestremamente
acidodell’ambientegastricoedè costituita soprattuttodaLactobacilli, Streptococchi e
Lieviti,cherisiedononellostratodimucosacherivestel’epiteliogastrico.
Ancheilduodenoèscarsamentecolonizzatodallamicrofloraacausadeltransitorapido
delciboingerito,dellasecrezionedeifluidibiliariepancreatici,cheeliminanogranparte
dei microrganismi presenti e dell’effetto dell’attivitàmotoria propulsiva dell’intestino
cheneimpediscelacolonizzazionestabiledellume.
1.1.3.Sviluppoemodificazioni:ilmicrobiotanelneonatoenell’adulto
Lacolonizzazionedeltrattogastrointestinaledapartedelmicrobiotainiziaalmomento
dellanascitaecontinuaconl’avanzaredell’etàfinoacostituireunamicrofloraspecifica
perogni individuo14.Èunprocessocomplesso,chenellesuefasipiùprecocicoinvolge
diversifattorichepossonoverificarsidurantelanascita(es.tipodiparto)oppuredopo
lanascita (es. tipodi allattamento),maancheprimadellanascitae sonocollegati alle
condizionidisalutematerne(es.stresseutilizzodiantibiotici)114.Infatti,sebbeneilfeto
4
siadaconsideraresteriledurante lasuavitauterina, lapresenzadibatterinel liquido
amniotico, nella placenta o nel sangue contenuto nel cordone ombelicale suggerisce
l’esistenzadiunatrasmissionemadre‐fetodicommensaliancheintalefase111‐113.
Dunque, anche il tipodiparto influenzanotevolmente la composizionedelmicrobiota
dei neonati, ovvero i nati con parto naturale hanno una flora simile a quella vaginale
materna15,mentrequellinaticonpartocesareohannounaflorasimileaquellacutanea
materna16,presentandounridottonumerodiBacteroideseBifidobatteri,edunnumero
maggiorediClostridi.
Unaltrofattoredeterminantenellosviluppodellafloraintestinaleduranteilprimoanno
divitadelneonatoèlamodalitàdialimentazione:nelneonatoallattatoalsenolafloraè
costituitaprevalentementedaBifidobatteri18, la cui crescitaèpromossadai complessi
oligosaccaridipresentinellattematerno,mentrenellafloradelneonatonutritoconlatte
artificialepossonoesserepresentispessoanchespeciepotenzialmentepatogenecome
Escherichiacoli eClostridiumdifficile, normalmente controllatedagli elementipresenti
nellattematerno,comelattosio,glicoproteine,glicolipidieoligosaccaridi17.
Neiprimitreannidivitasiverificauncambiamentocostantedelmicrobiota,cheriflette
unafineregolazionedell’espressionegenicaall’internodellostesso115.Successivamente
laflorabattericarimanesostanzialmentestabile,sebbenepossanoverificarsicomunque
dellevariazioniinessa,adesempioaseguitodiuncambiamentodelleproprieabitudini
alimentariodell’insorgenzadipatologie.
1.1.4.Funzioni
Lamicrofloraintestinalesvolgediversefunzionichecontribuisconoalmantenimentodi
unostatodisalutebuonodell’individuo,tracuiquellemetaboliche,troficheedidifesa
edhaunruolo importanteanchenellaregolazionedell’immunitàedell’infiammazione
sistemica19.Perquantoriguardal’attivitàmetabolica,ènotochelafloracontribuiscealla
produzionedellevitamineKeB12,dellabiotinaedell’acidofolico,oltreadintervenire
nelmetabolismodegliacidibiliariedellabilirubina,andandoaformaregliacidibiliari
secondarimediantedeconiugazioneedeidrossilazionediquelliprimari.
Ilmicrobiotapartecipaanchealprocessodifermentazionesaccarolitica,tramiteilquale
ipolisaccaridinondigeribilicomecellulosa,gommeepectinesonoconvertitiinsostanze
volatili(es.anidridecarbonica)eacidigrassiacatenacortaoSCFA(es.acidopropionico
5
eacidobutirrico).GliSCFAmiglioranol’assorbimentodicalcio,magnesioeferro,sono
fondamentalinelmantenereun’acidificazioneottimaledelpHintestinale,checostituisce
unefficientesistemadidifesacontroipatogeni20,elaloroproduzionestimolalacrescita
elaproliferazione/differenziazionedellecelluleintestinaliepiteliali.L’acidobutirricoè
laprincipalefontedienergiadellecelluleepitelialidelcolonehaun’azioneantitumorale
(modulandolacrescitaedifferenziazionenellelineecellularitumoraliepitelialiinvitroe
favorendoilritornoadunfenotipononneoplastico,attraversoilbloccodell’espressione
dellacicloossigenasi‐2el’induzionediapoptosiinadenomiecarcinomadelcolon21‐22).
Perquantoriguardal’attivitàdidifesaedimodulazionedelsistemaimmunitario,laflora
residentecostituisceunavalidalineadiresistenzaallacolonizzazionedapartedibatteri
esogeni,indirettamente,competendoperilorositidiattaccosull’orlettoaspazzoladelle
celluleepitelialiintestinaliedirettamente,producendosostanzeantibatteriche23.
Sistemaimmunitarioemicrobiotasonoinperenneequilibriotraloro:quandolamucosa
intestinaleinnescailsistemaimmunitarioinnatotramiteiToll‐likereceptorsoTLR,che
riconosconoeleganovariemacromolecolemicrobiche(es.lipopolisaccaride,flagellinae
peptidoglicano),sudiessasiavviaunacascatadisegnalicheportanoallaproduzionee
alrilasciodipeptidi,citochineefagocitichecontribuisconoalladifesadell’organismo.
Èutilequindicheilsistemaimmunitariointestinalenonreagiscainmodoincontrollato
almicrobiota,cosìdascongiurarelapossibilitàdisvilupparemalattieautoimmuni.
Lostudiodelmicrobiotaedelruolochericoprenell’ambitodellasaluteumanahaspinto
iricercatoriacercaredimodificarequestomicrohabitat,tramitel’utilizzodiantibioticio
lavariazionedelladieta,masoprattuttolasomministrazionedibatteriprobiotici.
1.2.Probioticieprebiotici
1.2.1.Probiotici:definizioneefunzioni
Iltermineprobiotico,cheèstatoconiatodaLillyeStillwellnel196528,nascedall’unione
della preposizione latina pro (“a favore di”) e dell’aggettivo greco βιωτικός (“biotico”)
contenenteilsostantivoβίος(“vita”)116,pertantoessosignifica“afavoredellavita”.
InbasealladefinizionedelricercatoreingleseFullerdel1989,l’OMSdefinisceprobiotici
tutti“queimicrorganismiviventiche,sesomministratiinquantitàadeguate,esercitano
uneffettopositivosullasalutedell’ospiterafforzandol’ecosistemaintestinale”24‐26.
6
Ilprimoateorizzaresuunruoloprotettivodeibatteriviviassunticonladietafuilrusso
EliMetchnikoff,premioNobelperlamedicinanel1908proprioperquestascoperta:egli
studiòlavitaeleabitudinialimentarideipastoricaucasici,enotandoquantofacessero
largousodilattefermentato,vollevalutareisuoieffettibeneficisullasaluteumana.
Iprobioticiperesseretalidevonorispettarecerteproprietà,ovverodevonoessere:
sicuriperl’impiegonell’uomo;inEuropaunutileriferimentoinquestosensopuò
essere la lista delle specie batteriche qualificate presuntivamente come sicure
dall’AutoritàEuropeaperlaSicurezzaAlimentareoEFSA,ossiachenonrisultano
portatricidiantibiotico‐resistenzeacquisitee/otrasmissibili;
attivievitalialivellogastrointestinale,inquantitàtalidagiustificareglieventuali
effettibeneficiosservatiinstudidiefficacia;
ingradodipersistereemoltiplicarsinell’intestinoumano,ossiadevonoresistere
all’elevataaciditàdeisucchigastrici,pancreaticiedellabile;
capacidiconferirebeneficifisiologiciosservatitramitestudieffettuatiseguendo
lelineeguidadettatedellaFAO/OMS.
SullabaseditalicaratteristichesonoconsideratimicrorganismiprobioticiiLactobacilli
(es.Lactobacillusacidophilus,casei,lactisebulgaricus)eiBifidobatteri(es.Streptococcus
thermophiluseBifidobacteriumbifidum)29.
È inoltre importantesottolinearecomeglieffettibiologiciprodottidaiprobioticisiano
ceppo‐specifici,tantochel’utilizzodiunnuovoceppobatterico,ancheseappartenente
adunaspeciegiàimpiegata,richiedeunanuovavalutazionedellasicurezzaedefficacia.
Nelsuoinsiemelaclassedeiprobioticisvolgemolteedimportantifunzioninell’ambito
delmantenimentodiunostatodisalutebuonodell’individuo27.
Innanzitutto,poichéiLactobacillisonoingradodiconvertireil lattosioinacidolattico
(fermentazionelattica),laloroassunzionepuòaiutaregliindividuiintollerantiaquesto
zuccheroadigerirnepiùdiquantoriuscirebberoaltrimenti117.Questoeffettobeneficoè
possibilegraziealrilasciodapartediquestibatteridell’enzima‐galattosidasi,ingrado
discindereillattosionellesuecomponentipiùdigeribiliglucosioegalattosio.
Comeindicatodamoltemeta‐analisi118‐123,iprobioticibloccanoefficacementeladiarrea
associataagliantibioticioAAD,unacondizionepatologicache,causandoun’alterazione
delmicrobiota,producedeicambiamentinelmetabolismodeicarboidrati,conilridotto
7
assorbimentodiacidigrassiacatenacortaeunaconseguentediarreaosmotica.Questo
processo,inoltre,puòfavorirelaproliferazionedipatogenicomeClostridiumdifficile.
ILactobacillisonopoiconsideratiutiliancheneltrattamentonegliadultidelleinfezioni
sostenutedaHelicobacterpylori, in associazione ai farmaci chevengononormalmente
utilizzatiperlasuaeradicazione;inparticolare,dastudirecentièemersochel’aggiunta
diyogurtcontenentiprobioticiallatriplaterapiaconvenzionale,nonostantelasciiltasso
dieradicazionedelbatterioinvariato,siaingradodiridurrelafrequenzadistomatitee
costipazionecorrelateallasuapresenzanellostomaco124.
Moltepatologiegastrointestinalicomelasindromedelcolonirritabile,ilinfomieanche
l’obesitàtrovanounapossibilecausanell’alterazionedelmicrobiota125,tantodaindicare
comestrategiaterapeuticaadiuvantel’usodeiprobioticiassunticonl’alimentazione126.
Infine,èstatodimostratoinstudidilaboratoriochealcuniLactobacilli(es.Lactobacillus
bulgaricus)hannouneffettoanti‐mutageno,dovutopresumibilmentealla lorocapacità
dilegarsialleammineeterocicliche,prodotteduranteilprocessodicotturadeicibidalle
sostanzecancerogenecontenutenellacarne127.Studisuglianimalihannodimostratoche
alcuniceppidiLactobacillipossonoavereuneffettoprotettivoneiconfrontideltumore
alcolonneiroditori,mentrequellieffettuatisull’uomosonoancorainsufficientiespesso
discorditraloro127.Lamaggiorpartediessihadimostratocheiceppibattericiutilizzati
possonoaveredeglieffettianti‐tumoralimediantelariduzionedell’attivitàdiunenzima
notocolnomedi‐gluconoridasi,chepuògenerarecarcinogenialivellointestinale128.
1.2.2.Prebiotici:definizioneefunzioni
LaFAOdefinisceprebiotico“uncostituentedeglialimentinonvitaleenondigerito,che
conferiscebeneficiallasalutetramiteunamodulazionedelmicrobiotaintestinale”30.
Tralediversesostanzechepossonoessereconsideratedeiprebioticiritroviamolefibre
idrosolubili,‐glucaniefructani,glioligofruttosaccaridioFOS,deiqualiilpiùstudiatoè
l’inulina,eillattulosio.Lalorofunzioneèquellasostenerelacrescitaelaproliferazione
diunaopiùspeciebatteriche“buone”nelcolon,capacidimodularel’equilibrioesistente
nellamicrofloraintestinaleendogena31.
Molticibicheassumiamonormalmentecontengonoprebiotici,comefrumentoegerme
digrano,miele,aglioecipollaelegumi,edinoltre,essisonopresentiancheneiprincipali
alimentifermentaticomeilpane,lapizzaenaturalmenteloyogurt.
8
Iprebiotici,insiemeaglispecificiprobioticipercuirappresentanoilnutrimento,danno
origineai cosiddettiprodotti simbiotici, chedimostranodi solitoun’efficaciamaggiore
rispettoaquelladelleduesostanzeassuntesingolarmente32.
1.3.Cancerogenesidellamucosacolica
1.3.1.Polipiintestinali
1.3.1.1.Definizioneecaratteristiche
Ipolipiintestinalisonoprotuberanzepatologichechesporgononellumedell’intestinoe
chesolitamenteprendonooriginedallamucosasottostante.
Alivellodeltrattogastrointestinalesilocalizzanocomunementenelcolon,mapossono
ritrovarsianchenell’esofago,nellostomacoenelpiccolointestino.
Daunpuntodivistamorfologicopossonoessereditiposessileopeduncolato:nelprimo
casohannounastrutturacupoliformeconnessaaduna largabasedi impianto,mentre
nel secondocasoappaionocome lesioni fungiformi, costituitedauna testapiùgrande
delpeduncolo33.
Istologicamente,invece,ipolipisidividonoinnon‐neoplasticieneoplastici34,35.
1.3.1.2.Polipinon‐neoplastici
Sisuddividonoinpolipiinfiammatori,polipiiperplasticiepolipiamartomatosi.
Ipolipiinfiammatori,comesuggerisceilnome,originanodallecicatrizzazionidilesioni
infiammatorie,sonocostituitidaunacomponenteghiandolare,presenteinproporzioni
variabili,edaunostromainfiltratodacelluleinfiammatorieesonospessoriscontrabili
inpatologieinfiammatoriecronichedell’intestino.
Ipolipiiperplasticisonoipiùfrequenti,sidiagnosticanoprincipalmenteinetàavanzata
(intornoai50anni),hannooriginedaproliferazionisecondariedellamucosaadalterato
turnoverepiteliale/stromaleelalorosedeprimariad’insorgenzaèilcolondistale,dove
appaionocomeescrescenzedidimensioneinferioread1cm.
Èopportunosottolinearecheipolipiiperplasticinonsonolesioniprecancerose,tuttavia
possonodiventarlesecompaionosudiessifocidiatipiacitologicaestrutturale.
9
Sirealizzacosìil fenotipomistoiperplastico‐adenomatoso,chepuòevolvereinseguito
inadenocarcinoma.
Ipolipiamartomatosi,infine,possonoesseresporadicioassociatiasindromigenetiche
(es.lasindromediPeutz‐Jegherselapoliposigiovanile)edeivaripolipinon‐neoplastici
sonoquelliaminoreriscontropercentuale.Essiderivanodallaproliferazionedidiverse
componentidellamucosa(es.lemiocellulelisce,iltessutostromaleequelloghiandolare
mucosecernente)ebenchélelorosediprevalentid’insorgenzasianoilcolonel’intestino
tenue,talvoltasonoriscontrabilianchenellostomaco.
Ilrischioditrasformazioneneoplasticadiquestipolipiènulloobasso.
1.3.1.3.Polipineoplasticioadenomi
Ipolipineoplastici,oadenomi,sononeoplasieintraepitelialiditipobenignocircoscritte
allamembranabasale(noninvasive)echederivanodallecelluleepitelialidellecripte36.
Laloroincidenzaaumentaall’aumentaredell’età,tantochesonopiùfrequentidopoi50
anni37,38epossonoessereosservatimediantelacolonscopia,unesamediagnosticoche
consentediidentificareeventualilesioniprecancerose,comeipolipiadenomatosi.
Questotipodipolipihadelledimensionivariabilichevannoda0,3ai10cmdidiametro
esicontraddistingueperunacertaatipiacitologicaestrutturale,ovveropuòpresentare
displasiadigradopiùomenoelevato.Ilrischiodicancerizzazioneaumentainbasealle
dimensioniealgradodiatipiastrutturale.
Ipolipineoplasticidelgrossointestinosiclassificanoinadenomipolipoidiconvenzionali
eadenomipiatti,adenomiserratieadenomiserratisessili.
Gliadenomipiatti,inbaseallaloroarchitettura,sonosuddivisiintubulari,tubulo‐villosi
evillosi,secondounordinedecrescentedifrequenzaecrescentediatipiastrutturale.
Ipolipiserraticondividonolaloroarchitettura“dentellata”conipolipineoplastici,che
caratterizzasoltantolasuperficiediquestiultimi,mentresiestendeatuttalalunghezza
dellaghiandola,compresalacripta,nelpoliposerrato39esilocalizzanoprincipalmente
nelcolonsinistro,alcontrariodeicosiddettipolipiserrati‐sessilichesonolocalizzatipiù
frequentementenelcolondestro.
Gliadenomisonoperlamaggiorpartedeicasiasintomatici,matalvoltapossonocausare
anemiadastillicidioematicooematocheziao,qualorasianodigrandidimensioni,sono
causadidoloriaddominaliepersinodiun’occlusioneintestinale.
10
1.3.2.Carcinomacolo‐rettale
1.3.2.1.Epidemiologiaeprognosi
Ilcarcinomacolo‐rettale(CCR)oadenocarcinomaèunaneoplasiaepitelialemalignache
haderivazioneghiandolareedèmoltofrequenteneipaesioccidentali,doveèiltumore
piùdiagnosticatodopoquellopolmonarenell’uomoequellomammarionelladonna.
Rappresentalasecondacausadimortecancro‐relata40elasuaincidenzadifferiscetrale
diverseareegeografichemondiali,variandodai45casi/100.000/annoinNordAmerica
eAustraliaai3‐6casi/100.000/annoinAsiadelSudeinNord‐Africa,mentreinEuropa
sihaun’incidenzaintermediastimatain36casi/100.000/anno41.
InItaliasistimacheogniannovenganoeffettuatecirca48.000nuovediagnosidiCCRe
che16.000personemuoianoacausadellecomplicanzelegateaquestaneoplasia.
IlCCRcolpisceconunaleggeraprevalenzailsessomaschileelasuaincidenzaaumenta
conl’aumentaredell’età,tantochelamaggiorpartedeicasi,circail90%,èdiagnosticata
dopoi50anni,mentrerisultamoltorarosottoi45anni.
Nell’ultimoquartodisecolo,neipaesiindustrializzati,sièregistrataunanettariduzione
dell’incidenzadiCCRedellamortalitàlegataadesso,cheèdovutamoltoprobabilmente
allapossibilitàdieseguirediagnosipiùprecocigraziealladiffusaadesioneaiprogrammi
discreeningeadunamaggioreefficaciadeitrattamentimediciechirurgici.
Viceversa,neipaesiinviadisviluppo,sirilevauncostanteaumentodicasidicarcinoma
colo‐rettale,nonostantelasuaincidenzarimangaglobalmentepiùbassa.
LaprognosidelCCRèinfluenzatadallostadioraggiuntodallamalattiaalmomentodella
diagnosi,tantochelasopravvivenzaglobalea5anniinpazientiaffettidaquestotumore
neipaesiindustrializzatièdel65%inmedia129,considerandochelamaggiorpartedelle
diagnosiavvieneallostadioIIIdellamalattia.Èquindichiarocheunadiagnosiprecoce
puòincidereinmododeterminantesull’esitodiuneventualetrattamentochirurgicoe/o
terapeuticoepiùingenerale,suldecorsodellamalattia.
1.3.2.2.Eziologiaefattoridirischio
Lamaggiorpartedeicarcinomicolo‐rettali (oltre90%)èdioriginesporadica,mentre
circail5%èditipoereditario42edinsorgenelcontestodivariesindromigeneticamente
determinate(es.lasindromediLynchelapoliposiadenomatosafamiliare)43,44.
11
Nonostantel’eziologiadeltumoredelcolon‐rettosiaancorasconosciuta,ilsuocarattere
multifattorialesuggeriscechefattoriambientaliesuscettibilitàgeneticapossanoavere
unruolopreponderantenellagenesidiquestotumore.
TraifattorifavorentilosviluppodelCCRritroviamounadietariccadigrassianimalie
poveradifibre,incuiadesempiosihaunconsumoeccessivodicarnirosse,soprattutto
selavorate45,unostiledivitasedentario,l’obesità46,ilfumodisigaretta47,unconsumo
eccessivodialcool48,lapresenzadidiverticolidelcolonoppuremalattieinfiammatorie
cronicheintestinali.Aquestifattorivaaggiuntoquelloforsepiùimportante,ovverol’età
avanzata,siaperl’aumentodellafrequenzadeipolipidelcolonesiaperillungoperiodo
diesposizioneacancerogeniambientalichelacaratterizza.
Traifattoriprotettivi,invece,ritroviamounadietariccadifruttaediverdura,l’attività
fisicamoderataeregolare,einoltre,comeèstatodimostratorecentemente,l’assunzione
giornalieradibassedosidiacidoacetilsalicilico(ASA)perlunghiperiodi(ovveroalmeno
6anni)odifarmacianti‐infiammatorinonsteroidei(FANS)49,50.
1.3.2.3.Storianaturaleealterazionimolecolari
Nelcorsodeglianninumerosistudihannodimostratoche,solitamente,lacarcinogenesi
del carcinomacolo‐rettaleèunprocessomultistepprogressivo,definitogeneralmente
“sequenzaadenoma‐carcinoma”51.
Ilprocesso,secondounmodellosequenzialeipotizzatoperlaprimavoltadall’americano
Vogelsteinnel1988,prevedeunafasedi“iniziazione”,nellaqualesihalatrasformazione
dell’epitelionormaleinadenoma,seguitadaunafasedi“promozione”conl’evoluzione
daadenomaacancro52.
Comesièdetto,gliadenomicostituisconoiprecursoridelCCR,tuttaviasoloil6%circa
degliadenomidegeneraincarcinomaeciòdipendedadiversifattori,tracuilavariante
istologicadeipolipiadenomatosi,ledimensioni(semaggioridi2cm)edilnumerototale
deipolipi,direttamenteproporzionalealrischioditrasformazione.
Ognitrasformazioneèconseguenzadell’accumulosequenzialedialterazionigenetichee
epigenetiche,cheagisconosuigenioncosoppressori,oncogenie/osuigenichesvolgono
unruolochiavenellariparazionedelDNA53.Nellospecifico,lealterazionigenetichesono
riconducibilinellatotalitàdeicasiadun’instabilitàcromosomica(CIN),adun’instabilità
deimicrosatelliti(MSI)eadun’instabilitàdelleisoleCpG(CIMP)54.
12
LaprimacausadiinsorgenzadelCCRfamiliareesporadicoèl’instabilitàcromosomica
(CIN),caratterizzatadaunamodificazionequantitativa(dettaaneuploidia)efunzionale
delDNA55,soprattuttoacaricodeigeniAPC,KRAS,SMAD4ep53.
L’eventoprecoceinizialedella“sequenzaadenoma‐carcinoma”èlamutazionedelgene
oncosoppressoreAPC,ilqualeinibiscela‐catenina,coinvoltanellaviadisegnalazione
intracellulareWNT.LaperditadifunzionediAPC,causatadallamutazionedientrambi
gliallelidelgenesulcromosoma5,provocal’accumulointracellularedi‐catenina,che
traslocandonelnucleo,attivalatrascrizionediqueigenipromuoventilaproliferazione
cellulare(es.c‐MYCeciclinaD1).
Nellapoliposiadenomatosafamiliare(FAP),adesempio,cioèunapatologiaautosomica
dominante,unamutazionediAPCprovocalosviluppodicentinaiadipolipiadenomatosi
nelcolon‐rettosinodallatardainfanzia,colrischiodievoluzioneinCCRinetàgiovanile
del100%(a30‐40anni).
KRASèunoncogenelacuimutazione,presentenel40%degliadenomiecarcinomi56,si
riscontranellafaseinizialedellaconversionedaadenomaacarcinoma.Èunamutazione
deltipo“gainoffunction”,cioèlaproteinaGTPasicodificatadalgeneKRASrimanenello
statoattivatoepromuovelaproliferazionecellulare57.
SMAD2eSMAD4sonoduegenioncosoppressoriche,diversamentedaKRAS,mostrano
unamutazioneditipo“lossoffunction”,cioèperdonolalorocapacitàinibitoriasulciclo
cellularedeterminandounacrescitaautonomaincontrollatadellacellulatumorale.
Infine,TP53èungeneoncosoppressorechecodificaperlaproteinap53, il“guardiano
delgenoma”,perilsuoruolochiavenelprevenireidannialDNA,mediantel’attivazione
dellasuariparazioneol’induzionedell’apoptosinellacellula.
Questotipodimutazione, tardivaerilevantenella fasedi trasformazionedaneoplasia
non‐invasiva,oNIN,dialtogradoacarcinomainfiltrante,èpresentenellamaggiorparte
deicarcinomi(inpiùdel60%),mentreèraranegliadenomi58.
L’instabilitàdeimicrosatelliti,ossiasequenzediuno,dueotrenucleotidiirregolarmente
dispersenelDNAesuscettibiliaerroridurantelareplicazione,ècoinvoltanellosviluppo
del15%deiCCRsporadiciedioltreil95%delleformeereditarieassociatiallasindrome
diLynch(HNPCC).Allabasediquestainstabilità,cheportaadunincrementodelrischio
dimutazioni,vièundeficitnelsistemadelmismatchrepairdelDNA(MMR),uninsieme
digeni(hMLH1ehMSH2)chepreservalastabilitàdelDNAdurantelaricombinazionee
lareplicazione,evitandol’erratoappaiamentodeinucleotidi.
13
ICCRcheoriginanodall’instabilitàdeimicrosatellitisonopiùfrequentementelocalizzati
nelcolondestroepresentanountipicoistotipomucinoso(omedullare),coninfiltrazioni
linfocitarieperitumoralieintratumorali59.
NelcasodellaHNPCC,unasindromegeneticaautosomicadominantecheinsorgeinetà
precoce(primadei50anni),conlosviluppodidiverseneoplasiemaligne,lamutazione
chenecausal’insorgenzariguarda,nel40%deicasi,hMLH1enel45%,hMSH2.
L’ipermetilazionedelleisoleCpG,presentisuipromotoridialcunigenioncosoppressori
edell’oncogeneBRAF,provocailsilenziamentodell’espressioneditaligeniedilCCRche
sisviluppaquandoquesteisoleCpGdivengonoinstabiliderivadapolipiserrati,secondo
unaprogressionecheapartiredalpolipoiperplasticoepassandoperl’adenomaserrato
portaall’adenocarcinoma60.
LamutazionediBRAF,inparticolare,avvieneprecocementenel“pathwayserrato”epuò
essereriscontratanel90%deiCCRchesisonoevolutidaadenomiserratisessili,mentre
nonèquasimaipresentenegliadenomiconvenzionali.
L’infiammazionecronicahaunruolofondamentalenell’iniziazioneenellaprogressione
delCCR.QuestaosservazioneèsupportatadallaforteassociazionetraIBDeCCRedalla
scopertadeglieffettipositivialungoterminedifarmacianti‐infiammatorinonsteroidei
(FANS)edell’aspirinanellaprevenzionedellaneoplasia61,62.
Traimeccanismidell’infiammazionechepredispongonoall’insorgenzadiCCRtroviamo
l’attivazionedeisistemianti‐apoptoticichestimolanolaproliferazionecellulare,idanni
alDNAmediantelaproduzionedispeciereattivedell’ossigeno(ROS)edispeciereattive
dell’azoto(RNS),laproduzionedifattoridicrescitaedicambiamentidiconformazione
dellemembranechefacilitanol’invasioneel’adesionecellulare63‐65.
1.4.Relazionetramicrobiotaetumoredelcolon‐retto
Unarelazionetrailmicrobiotaintestinaleeitumoridelcolon‐rettoèstataipotizzatapiù
volte,soprattuttoperilfortelegameesistentetraquestotipodineoplasiaeladieta.
Nel1975,Reddyeisuoicolleghi,scoprironochel’incidenzadiCCR,parial20%neitopi
trattatichimicamentealloscopodifarsviluppareloroiltumore,toccavail93%inquelli
convenzionalinontrattati66.
Studiepidemiologicieffettuatiinpassatohannotentatodimettereafuocoledifferenze
cheesistonoalivelloqualitativotralafloraintestinaledellepopolazioniadaltorischio
14
diinsorgenzadiCCRequelladellepopolazioniincuiquestorischioèridottoedèstato
mostratoilpossibileruolonellacancerogenesidialcunespeciebatteriche,contrapposte
adaltrespecieassociate,invece,adunridottorischiodiinsorgenzadellaneoplasia67.Lo
sviluppodimetodichedibiologiamolecolaresemprepiùefficaciharesopossibileuno
studiosicuramentepiùapprofonditodelmicrobiotaedellefunzionichesvolge,tuttavia
lacaratterizzazionedeiprocessitramiteiqualiimicrorganismisarebberocoinvoltinella
cancerogenesiètuttoradifficile,siaacausadellacomplessitàedelladuratadell’intero
processodi sviluppodei tumori siaper la grandeeterogeneitàdelmicrobiota.Questo
rendeancoradifficileeseguirestudicliniciinvivo,elamaggiorpartedeidatidisponibili
ariguardoderivadasistemisperimentalie invitro,voltiavalutareglieffettidialcuni
specificibatteri.Quellichesiottengonosonorisultatimoltocontrastanti,dalmomento
chealcunimostranounruolopro‐carcinogeneticodelmicrobiotaealtrineevidenziano
unodiametralmenteopposto.
1.4.1.Ruolopro‐carcinogeneticodelmicrobiota
Imicrorganismiintestinalipotrebberofavorirel’insorgenzadelleneoplasieinduemodi
diversi:unprimomeccanismoimplical’attivazionedelleviedisegnalazionechepassano
periTLR,portandoadun’infiammazionecronicadellamucosacheèlegataasuavolta
adunaumentodelrischiod’insorgenzadelcancro,comenelcasodeicarcinomiassociati
alleIBD.Unsecondomeccanismocoinvolgeinveceleattivitàmetabolichedelmicrobiota
intestinale,capacediprodurredelletossineconuneffettopro‐carcinogeneticodirettoo
enzimiingradodiattivareicarcinogeniingeriticonladieta.
1.4.1.1.Microbiotaedinfiammazione
Lacorrelazionetrainfiammazioneecancerogenesièbennota68‐70esembraaddirittura
chefinoal15%deitumorinell’uomosiaassociatoall’infiammazione71.
Nelcolon,unesempioditalecorrelazioneèdatodalcolitis‐associatedcancer(CAC),che
insorgeinpazientiaffettidaIBD:intalcaso,l’infiammazionecronicaprecedelosviluppo
deltumore,emediantelaproduzionediROSediRNS,inducemutazioniedannialivello
delDNA,checontribuisconoallatrasformazioneneoplasticadell’epitelio.NelCCRditipo
sporadicoèinvecepiuttostodifficilechel’infiammazionepossacostituireilsoloevento
15
scatenante,mentreèpossibileche,tramiteidannialDNAchecausa,possacontribuire
all’accumulodellealterazionicheinnescanoilprocessoneoplastico72.
Comeabbiamovistoinprecedenza,ilmicrobiotasvolgeimportantifunzioniimmunitarie
emetaboliche ed interviene nel controllo delle vie di trascrizione di alcune citochine
infiammatorie. In condizioni normali vi è un equilibrio tra la produzione di citochine
anti‐infiammatorie, come IL‐10, epro‐infiammatorie, come IL‐17,mentre le variazioni
delnumero,delladiversitàestabilitàdeibattericommensali,einparticolaredelgruppo
deiClostridi,possonoprodurreunospostamentodiquestoequilibrioversounfenotipo
aggressivopro‐infiammatorio.Questaaumentataproduzionedicitochine,tracuicisono
TNF,IL‐1eIL‐17,insiemeall’attivazionedeiTLRadoperadialcunipatogeni,produce
l’attivazionedellacascatadiNF‐kB,unfattoreditrascrizionedivarigenianti‐apoptotici
(comeBcl‐2eBcl‐xL)che,tramitel’aumentodellaproliferazionecellulareedeiprocessi
diangiogenesi,èingradodisostenerel’oncogenesi73,74.
L’influenzadeicommensalisull’infiammazioneelacancerogenesièdimostratadaalcuni
studisuitopiincui,incondizionigerm‐free,l’infiammazioneintestinaleelaformazione
ditumorisonorisultatesignificativamenteridotterispettoadanimalipostiincondizioni
dinormalità75, 76. Inoltre,questitopigerm‐freepresentavanounaltonumerodicellule
naturalkiller, linfocitiBeTcitotossicinelsangueperiferico, indicatividiunamigliore
rispostaimmunitaria.
Questistudiconfermanoilruolodelmicrobiotaneiprocessiditrasformazioneinsenso
neoplastico,anchesenontuttiibatteriinclusiinessosembranoaverelastessacapacità
dicausaretalipatologie.
1.4.1.2.Microbiotaeattivazionedeipro‐carcinogeni
Lacapacitàmetabolicadelmicrobiotaintestinalerisultafondamentalenell’attivazionee
nelladetossificazionedegliagenticarcinogeni,tuttavia,essoesprimeanchemoltienzimi
(come‐glucosidasi,‐glucuronidasi,nitroreduttasiealcooldeidrogenasi),direttamente
coinvoltinellosviluppodicerteformeneoplastiche.
Iprimistudichehannopermessodidimostrarequestocoinvolgimento,sonostatifatti
sudeitopigerm‐freechenonsviluppavanotumoriintestinaliinseguitoall’esposizione
aduncertocarcinogeno,maneiqualitalineoplasieinsorgevanoquandoitopivenivano
espostidirettamentealsuometabolitaattivo,generatodall’azionedella‐glucosidasi77.
16
Le‐glucosidasisonoenzimiappartenentiallaclassedelleidrolasi,checomesuggerisce
ilnome,idrolizzanoillegameglicosidicopresenteneicarboidrati,liberandoinogniciclo
catalitico,degliagliconi,alcunideiqualipossonoaveredeglieffettitossici.
Anchela‐glucuronidasi,unenzimaespressosoltantodaalcunibatteri(es.Clostridi)ha
uneffettonegativosull’insorgenzadeitumoriedineffetti,incampionidifecidipazienti
conCCRsonostatirilevatideivalorisignificativamentepiùelevatidiattivitàdiquesto
enzimarispettoasoggettisani78;tragliagenticarcinogeniattivatidalmicrobiotaelegati
probabilmenteall’attivitàdella‐glucuronidasivisonoalcuneamineeterocicliche,come
la2‐amino‐3metil‐imidazo[4,5‐f]chinolina(IQ),chesisviluppanoduranteilprocessodi
cotturadellacarnerossa(unfattoredirischionotoperilCCR).Questicompostiattivati
sonoingradodiformareaddottialDNAediaverequindiuneffettomutageno79,80.
Unulteriorepossibilemeccanismodicancerogenesicorrelatoalmicrobiotacoinvolgela
sintesidirettadisostanzemutagene,comeifecapenteniprodottidaiBacteroides, iROS
prodottidaEnterococcusfaecalis83,84oilsolfurodiidrogenoprodottodaimicrorganismi
solfato‐riducenti,cheprovocanodannialDNAeinduconotrasformazioneneoplastica.
Interessanteèl’osservazionechealcunicommensalicomeiBifidobatterieiLactobacilli
hannoinveceunruolooppostosuquestiagentiedantagonizzanoiloroeffettimutageni
inattivando,forse,glienzimiolegandodirettamentel’agentecarcinogenoIQ81,82.
1.4.2.Ruoloanti‐carcinogeneticodelmicrobiota
Negliultimianniglistudiscientificisisonorivoltispecialmenteversoilruoloprotettivo
cheimicrorganismisvolgononelcontrollodeiprocessiintrinseciepiteliali.
Lacomplessainterazionechec’ètraladieta,ilnormalemicrobiotaintestinaleelasalute
hapromossolosviluppodistrategie,comel’usodeiprobiotici,chepotesseropermettere
lacrescitaselettivadialcunimicrorganismiadazionebenefica.
Nonostantenonvisiaancoraunconsensounanimesulruolodefinitodeiprobioticinella
prevenzionedelCCR,èriconosciutochealcuniceppipossonoaveredeglieffettibenefici
sulleattivitàmetabolichedeltrattogastrointestinaleechepossonostimolarelarisposta
immunitariadell’ospite.
Imeccanismimedianteiqualiiprobioticieiprebioticisarebberoingradodicoadiuvare
laprevenzione/terapiadeitumorigastrointestinalinonsonostatiancorachiariti,anche
esoprattuttoinconsiderazionedelfattocheilmicrobiotapuòinterferireadiversilivelli
17
nellasequenzaadenoma‐carcinoma:nellasuafaseprecocediiniziazione,alcunespecie
batteriche,siadirettamenteacausadiunamaggiorefitnesssiaindirettamentemediante
lacompetizioneconaltrespeciepericolose,sonoingradodiridurre laconcentrazione
dellemolecolecarcinogenetichenellumecolico.Inunostadiopiùtardivo,icommensali
potrebberocontrollarelaproliferazionedellecelluledisplasticheregolandoeinducendo
l’apoptosi,siadirettamenteconlaproduzionedimolecole(es.SCFA)siaindirettamente
tramitelastimolazionedelsistemaimmunitario.
L’apoptosièuncomplessoprocessomultistepimportanteperl’omeostasidellamucosa
intestinale.Inquestacascatadisegnaliintracellulari,cheportaallamorteprogrammata
dellacellula,sonocoinvoltevariemolecole,tracuilecaspasi,chehannounruolochiave.
Nellafaseinizialedellacascataintervienelacaspasi9,dettacaspasiiniziatrice,laquale
attivadiversecaspasieffettrici(es.caspasi3)cheagiscononellefasifinali.Unaperdita
diefficaciaditaleviadisegnalazioneporterebbeadunmalfunzionamentodelprocesso
apoptotico,conproliferazionecellulareincontrollata,finoallatrasformazionemaligna.
In lineaconquesteconsiderazioniè ilmodellosperimentalemessoapunto invivo sui
topiedescritto inunostudiopubblicatorecentemente85: i topi, trattati conunregime
terapeuticoabasediquattroantibioticiingradodieliminarepartedellaloromicroflora
intestinale,mostravanounariduzionedell’apoptosirispettoaicontrolli.Questirisultati
eranoconfermatidaunsecondostudioinvitro,incuideicampionidimucosaintestinale
incubaticonspecieprobioticheeestrattifecalipresentavanounamaggioreespressione
digenipro‐apoptotici(caspasi3e9),deglistessicampioninontrattaticoiprobiotici85.
Alivellointraluminale,iprobioticiprevengonolacolonizzazionedellamucosadaparte
deibatteripatogenimedianteunmeccanismodiesclusionecompetitivachesirealizza
conilconsumodinutrienti,lasaturazionedeisitidiadesione,laproduzionedisostanze
antimicrobicheelastimolazionedell’organismoospiteasintetizzarneasuavolta,come
defensine,catelicidineelectineditipoC86.
Inoltre,iprobioticipossonoinibirel’azionedeglienzimibattericidellamicroflora,iquali
sonoresponsabilidell’attivazionedipro‐carcinogeni,comeazoreduttasi,nitroreduttasi
e‐glucosidasi87,88opossonoinattivaremutageniecarcinogeni,legandosidirettamente
adessieprevenendocosìlalorointerazioneconlecelluledelcolon.
LaproduzionedegliSCFAapartiredaicarboidratinondigeribilièunaltromeccanismo
tramitecuiilmicrobiotasvolgeun’azioneanti‐carcinogena.GlieffettibeneficidegliSCFA
sonostatirivelatidastudiincuipopolazioniconunabassaincidenzadipolipicolorettali
18
eCCR(es.africane)hannomostratoun’altaconcentrazionediSCFAnellefeci89,90.
TragliSCFA,quellomaggiormentedotatodiazionianti‐carcinogeneèilbutirrato,cheè
prodotto principalmente a livello del colonprossimale, dovedeterminauna riduzione
delpH,favorendocosìlacrescitadiceppidiLactobacilliacido‐resistenti.
Alcunistudihannodimostratocheilbutirratoinibiscelaproliferazionecellulare,induce
l’apoptosidellecelluletumorali91,92; inoltre,essopuòridurrel’espressionedell’enzima
cicloossigenasi(oCOX‐2)nellelineecellularitumorali93,94ediindurrequelladiunaltro
enzima,laglutatione‐s‐transferasidell’ospite,adazionedetossificante.
Rilevantisonoancheglieffettisulsistemaimmunitario,sucuiiprobioticisonoingrado
diesercitareun’attivitàimmunomodulatoria,graziealriconoscimentodicertemolecole
presentisullalorosuperficie,ipathogen‐associatedmolecularpatterns(PAMP),daparte
deirecettoriTLR2eTLR9,inparticolarmodo.Ilsegnaleintracellularecheneconsegue
stimolalaproduzionedicitochineingradodicoordinarelespecificherispostedicellule
infiammatorieediregolarel’attivitàdiquelleimmunocompetenti95‐99.
Studirecentihannodimostratochel’enzimaCOX‐2èimplicatonellosviluppodelleIBDe
delCCR100:perl’induzioneditaleenzimaènecessarial’attivazionediTLR4,unrecettore
associatoalCAC101,102,inoltre,un’iperespressionediTLR4,rilevatanelcolondipazienti
affettidaIBDedinmodellisperimentalidicolite,stimolal’attivazionediNF‐kB,ilquale
asuavoltainducel’espressionediCOX‐2103.
Unostudio,inparticolare,haevidenziatochediversespeciediprobioticisonoingrado
diinibirel’attivazionediNF‐kBlegataaTLR4,eciòpotrebbedeterminareunariduzione
dell’espressionediCOX‐2103.
1.4.3.Modifichealivellodell’ospite
Unadellestrategieutilizzatedall’ospiteperproteggereilmicrobiotaconsistenelridurre
icontatti tra lasuperficieepitelialeed imicrorganismi, limitandocosì l’infiammazione
tissutaleelatraslocazionedeigermipotenzialmentepatogeni.Questastrategiaèattuata
grazieall’azionedi celluleepiteliali,muco, immunoglobulineA,peptidiantimicrobicie
celluleimmunitarie,definitinelloroinsiemecome“mucosalfirewall”104.
Ilmuco,inparticolare,vieneprodottodallecellulecaliciformimucipareecostituiscelo
scudoprimariocontroibatteripatogeni.Inoltre,tuttelecelluleepitelialiintestinalisono
in grado di produrre peptidi antimicrobici capaci di attaccare la membrana cellulare
19
battericaedistruggerla105.Tratuttiquestipeptidi,unruolofondamentaleèsvoltodalle
defensine, componenti essenziali del sistema immunitario innato dell’ospite, che sono
sintetizzateesecretedacellulecostantementeesposteaibatteriambientali;ledefensine
presentanoresiduicarichipositivamente,ingradodilegarsiallemembranedinumerosi
batteri(soprattuttoGRAM‐)edidistruggerle,esercitandocosìun’azioneantibatterica.
All’internodellalorostrutturacontengono6residuidicisteinaedinbaseallaposizione
deiresiduisonoclassificateinduegrandifamiglie,le‐ele‐defensine.Le‐defensine
sonopiùabbondantinellecelluleepitelialipolmonari,cutaneeedurogenitali,mentrele
‐defensinesonosintetizzatedaineutrofili(HNP1‐4)edallecellulediPanethintestinali
(HD‐5eHD‐6).Incerticasi,questemolecolevengonoespressecostitutivamente,mentre
inaltricasiènecessarial’attivazionedipatternrecognitionreceptors(PRR)perlaloro
produzione.IPRRsonodeirecettoridimembranapresentisullasuperficiedellecellule
epitelialidellamucosa,capacidiriconosceredeglispecificiantigenipresentisuibatteri
patogeni.InquestogruppodirecettoritroviamoiTLR,perilriconoscimentodimolecole
extracellulariediNod‐likereceptors(NLR),perquelleintracellulari.
Comedettoprecedentemente,gliantigenichevengonoriconosciutisonodefinitiPAMPe
includonoillipopolisaccaride(LPS),ipeptidoglicani,ilipidi,elelipoproteine.Illegame
deiPAMPconiPRRprovocal’attivazionedifattoriditrascrizione(es.NF‐kB)cheinduce
laproduzionedicitochinepro‐infiammatorieel’attivazionedeiLinfocitiT.
L’espressionedelle‐defensineHD‐5eHD‐6potrebbeaumentareinrispostaadalcuni
stimoliinfiammatori,comeavvienenellemalattieinfiammatoriecronicheintestinali106.
Interessante è risultato il riscontro di un aumento della quantità di‐defensine nella
mucosa,nelsieroenelle fecidipazientiaffettidaCCR, tantodaesserepropostocome
metodicadi screeningprecoceper il tumore107‐110.Nonèancorachiaro ilmeccanismo
allabasediquestavariazionedellaquantitàdi‐defensine,maèpossibilecheessasia
direttamentecorrelataconlaproliferazionedicelluledisplasticheeconseguentemente
conlalorotrasformazioneinsensoneoplastico.
1.5.Metodidistudiodelmicrobiota
Attualmente sono disponibili moltemetodologie di studio del microbiota umano, che
vannodaapproccipiùtradizionali,comequellicolturali,atecnologiedisequenziamento
delDNAdinuovagenerazione.
20
L’avventoditecnichedibiologiamolecolaresemprepiùefficaci,inparticolare,haaperto
nuove“strade”inquestosettoredellaricerca,facendoaumentaresemprepiùl’interesse
deiricercatoriperilmicrobiotaumano.Ciononostante,consideratalavarietàditecniche
adisposizione,èfondamentalecomprendereivantaggiintrinseciedilimitidiciascuna
diesse,cosìdaconsentirelasceltadellapiùadattadautilizzare.
1.5.1.Metodiclassici
1.5.1.1.Coltureinbatch
Perpiùdiunsecoloimicrobiologihannoutilizzatodellemetodichecolturalitradizionali
inlaboratorio,checonsentonodiisolareestudiaresingolecoloniebatterichealloscopo
didescriverelelorocaratteristichefenotipicheelelorocapacitàmetaboliche.
Grazieaquestotipodiapproccioèstatopossibilecoltivareoltre1000speciebatteriche
distinte,isolatedalsolotrattogastrointestinaleumano130.
Laformapiùsemplicedicoltivazionebattericaconsistenell’incubarecampioniosingoli
ceppidiunaspeciediinteresseinunterrenodicolturacompleto,ossiacontenentetutte
lesostanzenutrientiperquelbatterio,oselettivo,ovveroprivodiqualchenutriente(che
consenta,appunto,laselezionedeiceppiingradodisopravvivereancheinsuaassenza).
Questotipodicolture,definiteinbatch,permettonoairicercatoridiparagonaregruppi
battericidiinteresse,sullabasedeilorotassidicrescitaedellaproduzionedimetaboliti
sudiversisubstratioancora,delleinterazionispecie‐specifichechesiformano131.
Moltibatteridelmicrobiota,adesempio,sonoanaerobiobbligati,perciòpossonoessere
rallentatinellacrescitaoeliminatideltuttofornendoossigenoallecolture132opossono
esserefavoritinellacrescitaeffettuandolalorocoltivazioneincamereanaerobiche133.
Inoltre,lacoltivazionedispeciebattericheintestinaliparticolarmenteesigentidalpunto
divistanutritivopuòessereottimizzatautilizzandoterrenicontenentifluididibovinoo
estrattidifeciomiscelediacidigrassiacatenacorta134,135.
Lecoltureinbatchpresentanoovviamentedellelimitazioni:innanzitutto,irisultatisono
ottenibilisoloperbreviperiodiditempoecomunquefinoadesaurimentodellesostanze
nutritivepresentinelterrenodicolturaoallaformazioneinessodisottoprodottitossici
perlespeciebatterichediinteresse,chenelimitanolacrescita136.Inoltre,l’allestimento
diunacolturabattericapuòessereanchemoltocostoso,poichépuòrendersinecessario
21
l’utilizzodimoltiterrenidicolturadifferenti,perrecuperareilnumeropiùaltopossibile
dispeciebattericheall’internodiuncampione.
1.5.1.2.Colturecontinue
Unmetodopiùsofisticatodicolturabattericaconsistenell’usodisistemidefinitiapertio
incontinuo,comeifermentatori:diversamentedallecoltureinbatch,inunfermentatore
èpossibileintrodurrecontinuamentefattoridicrescitaenutrienti,rimuovendoaltempo
stessodalterrenodicoltura,tramiteappositisistemididrenaggio,isottoprodottitossici
sintetizzatidaibatterieleeventualicellulemorte.
Tuttiisistemidicolturaincontinuoraggiungonounlorostatodiequilibriocheconsente
alricercatorediesercitareunmaggiorecontrollosullecondizionidicrescitadellaspecie
battericadiinteresse,peruntempopiùlungo137.
Questotipodisistemiècomunementeutilizzatoperstudiareilmicrobiotacaratteristico
delcoloneduncertonumerodigruppidiricercausafermentatoridiultimagenerazione
neiqualièpossibileeseguirecoltureconfasidicrescitasequenzialiedistinte,alloscopo
diriprodurreimolticambiamentiambientalicheimicrorganismisubiscononeltransito
all’internodeltrattogastrointestinale138.
1.5.1.3.Modellianimali
Lespeciebatterichediinteressepossonoancheesserecoltivateemantenuteinmodelli
animali,comeèsuccessofinoapocotempofaperibatterifilamentosisegmentati,iquali
hannodimostratodiavereimportantieffettipro‐infiammatorineitopi139.
Itopigerm‐freerappresentanounvalidoesempiodimodelloanimale:comesuggerisce
illoronome,sonoanimalideltuttoprividimicrorganismisiainternamentechealivello
cutaneo,eperquestaloropeculiaritàsonoparticolarmenteutiliperlostudiodeibatteri
dellamicroflora.Essi,infatti,possonoessereinoculatifacilmenteconceppidiinteressee
consentonodistudiarelerelazionibatterio‐ospiteebatterio‐batterioinmodosemplice
eintuitivo.
Moltoutilinellostudiodelmicrobiotamasoprattuttodelcontributogeneticochequesto
offrealproprioospitesonoancheitopiknockout,animaligeneticamentemodificatiallo
scopodivalutareglieffettidellasoppressionedell’espressionediuncertogene.
22
Questasoppressioneèdettaknockoutgenicoedèmoltoutileperstudiareleinterazioni
tralecomponentigenetichedell’ospiteedelmicrobiota140.
Unosvantaggiodiusareimodellianimalièche,mentrelacomposizionedellamicroflora
alivellodiphylumsembraesseresimilaretragliesseriumanieglialtrianimali,alivello
dispecieeceppivièunadivergenzanotevole,dovutaprobabilmentealledifferenzeche
esistononellaloroanatomia/fisiologiaeneilororegimialimentari140.
Infine,unalimitazionenell’utilizzodeimodellianimali,edinparticolare,diquellimurini
perlostudiodelmicrobiotanascedallacoabitazionedeglianimali:neitopi,infatti,sono
frequentigliepisodidicoprofagia(ingestionediescrementi),cheportanoadunrapido
trasferimentodeibatteridaunanimaleall’altro,stravolgendocompletamenteirisultati
chesiottengono141.
1.5.2.Metodibasatisulsequenziamento
Direcente,lostudiodelmicrobiotaèstatocompletamenterivoluzionatodallosviluppo
diinnovativetecnichedibiologiamolecolare,comeilsequenziamentodelDNA,divenute
oggidecisamentepiùeconomicherispettoaglianniprecedenti.
Ilsettoredellabiologiamolecolareèincostantesviluppoesiarricchiscecontinuamente
dimacchinaripiùefficaci,capacidi“leggere”miliardidisequenzediDNAedicomparare
tralorosegmentidiDNAanchemoltolunghi,esemprepiùpiccoli,tantodapoteressere
inseritinellaportaUSBdiuncomputer142.
Ilvantaggioprincipalediquestotipodiapproccioèchesiottengonorisultaticompletie
moltoesaustivisuundeterminatocampione,fornendounavisionepanoramicadiquello
cherappresentainterminimicrobiologicieinoltre,essendomenolaboriosorispettoalle
tecnichemicrobiologicheclassiche,èpossibileeffettuarericerchesulargascala,evento
impensabileinpassato:nesonounesempioilProgettoGenomaUmanoedilpiùrecente
progettoMetaHIT143.
1.5.2.1.Sequenziamentodell’RNAribosomiale
Unapprocciocomunebasatosulmetododelsequenziamentoconsistenell’eseguiredelle
indaginisualcunigenimarcatoriuniversali,chefornisconounapanoramicadellespecie
batterichepresentinelmicrobiota.
23
Igenimarcatoriuniversaliusatipiùfrequentementesonoquellicontenutinell’RNAdelle
subunitàribosomialiminori,dette16Se18Sneibatteriearcheobatterieneglieucarioti
rispettivamente.All’internodiquestigenisonopresentisequenzealtamenteconservate
nellediversespeciebatterichee/ochesonospessoesclusivediundeterminatogruppo
battericoogenere144,maanchesequenzepiuttostovariabili.
Questotipodisequenziamentosfruttaleregionimaggiormenteconservate,infatti,dopo
l’estrazionedelmaterialegeneticodalcampioneditessutoumano,igenimarcatorisono
amplificaticolmetododellareazioneacatenadellapolimerasi(oPCR)usandosequenze
diinnesco,definiteprimer,moltospecificheperleregionialtamenteconservate.
L’obiettivofinaleèquellodicreareunpoolmistodiprodottidiamplificazionechesono
derivatidalmaggiornumeropossibiledispeciebattericheinclusenelcampionebioptico
echevengonosuccessivamentesequenziati.
Idatirisultantisonopoiraggruppatiinunitàtassonomicheoperative(OTU),organizzati
indifferenticlusterdisimilaritàdisequenza,edovrebberorispecchiare,conragionevole
approssimazione,l’insiemeeterogeneodeigruppibattericiinclusinelcampione.Èutile
sottolineare,tuttavia,chelagrandevariabilitànelnumerodicopiedell’RNAribosomiale
deidiversiceppibattericifasìcheirisultatinonsianopropriamentequantitativi145,cioè
chenondianoinformazioniriguardoallequantitàdibatteripresenti.
Inoltre,lasogliadisimilaritàdisequenzastabilitaperdeterminareleOTUèarbitrariae
soggettiva,efadiscostareirisultatiottenutidallarealecomposizionedigeneribatterici
presentinelcampione.
Indipendentementedallasogliadisimilaritàstabilita,leOTUpossonoessereconfrontate
consequenzepresentiindatabasecomeSILVA,RDPedEzTaxon,alloscopodiassegnare
lorounaclassificazionetassonomica146.
Ilsequenziamentodell’RNAribosomialepuòessereutilizzatoancheperanalizzareigeni
menodiffusiall’internodelmicrobiota,giacchénonubiquitariedespressisolodaalcune
dellespeciebatterichecontenuteinesso:unesempiodiciòècostituitodaigeniespressi
daimicrorganismipresentinelcoloncheproduconobutirratoeproprionato147.
1.5.2.2.Sequenziamentocompletodelgenoma
IlprimogenomabattericocompletamentesequenziatoèstatoquellodelGram‐negativo
Haemophilusinfluenzae,nel1995148,tramitel’usodelMetododiSanger149.
24
Daallora,ilmiglioramentodelletecnichedisequenziamentodelDNAhaconsentitodelle
analisigenomichecompleteestremamenterapideeaduncostopiùbasso150.
Datalagrandeefficienzadeimacchinaridisequenziamentodiultimagenerazione,come
Illumina,èormaipossibileeffettuareilcontemporaneosequenziamentodimoltigenomi
battericinellastessasessione:l’approccioèbasatosullatecnicadellaPCRMultiplex,una
variantedellaPCRcheconsented’identificareinmodorapidodelezionie/oduplicazioni
inungrandegene.DiversamentedallaPCR,laPCRMultiplexusapiùsetdiprimerinuna
unicamisceladireazione,portandoall’amplificazionediampliconidivariedimensioni.
AnalizzandopiùgeniinununicociclodiPCR,leinformazioninecessariepossonoessere
acquisiteinuntempoestremamentepiccolo,conuncospicuorisparmioeconomico.
QuestotipodiapproccioèstatoadottatoanchenelProgettoGenomaUmano,unaricerca
internazionaleilcuiobiettivoprincipaleèstatoquellodiidentificareequindilocalizzare
suicromosomi(mappare)igenidelnostrogenoma.
Ilprogettoèiniziatonel1990edancheseunaprimabozzadelgenomaèstatarilasciata
nel2000,sièdovutoattenderefinoal2003peravereirisultaticompleti,dacuisievince
cheilgenomaècostituitoapprossimativamenteda21000geniedèlungocirca3200Mb
aventifunzionidiverse:48Mbsonocodificanti(1,5%),1152Mbdefinisconoilcosiddetto
gene‐relatedDNA,uninsiemediintroniepseudogeni(36%)elerestanti2000Mbvanno
acostituireilDNAintergenico,incuiritroviamosequenzeripetuteinterspersechiamate
LINE(21%),SINE(15%),LTR(9%),trasposoni(3%),sequenzeripetuteintandemdette
microsatelliti(3%)edunapiccolapercentualedialtritipi.
1.5.2.3.Metagenomica
Unlimitedelmetododisequenziamentocompletodelgenomaèrappresentatodalfatto
cheibatteridiinteressedevonoesserenecessariamenteprimacoltivati,cosìdaottenere
unaquantitàdiDNAsufficienteperlesuccessiveanalisi,tuttavia,lamaggiorpartedelle
speciebatterichepresentinelmicrobiotanonèstatoancoracoltivatoinlaboratorio151.
Questoproblemaèstatobypassatograzieall’avventodellametagenomica,unametodica
checonsenteairicercatoridiricavaresequenzegenomichediinteressedalDNAestratto
dauncampioneambientale;inseguito,essitentanodiconfrontarebioinformaticamente
lesequenzeottenutedalDNAestrattoconaltrettantesequenzenoteespressedasingole
speciebatteriche,escludendoquellechenonsonorilevantiperlostudio.
25
Lametagenomicafuapplicataperlaprimavoltaallostudiodelmicrobiotanel2006152e
daalloraèstatautilizzataindiverseoccasioni.Èunatecnicamoltopotente,conlaquale
èpossibiledeterminareaccuratamentelacapacitàfunzionalediunacomunitàbatterica
diinteresse,tuttavia,lacomplessitàdeglihabitatbattericiintestinali(es.colon)richiede
unenormelavorodisequenziamentoperotteneredatisufficientiacomporreunquadro
rappresentativodeimicrobipresentiallorointerno.
Perquestesuecaratteristiche,lametagenomicaèanchelasolatecnicamediantelaquale
èpossibilemonitorarelecomunitàvirali,definiteviromi,presentinelcorpoumano,dato
chenonesistono,aoggi,genimarcatoriuniversaliespressidaivirusinmodoubiquitario
eutilizzabilialloscopocomequellidell’RNAribosomialenelcasodeibatteri153.
Esistono,ovviamente,dellelimitazioniall’usodellametagenomica:inparticolare,questo
tipodiapproccioèmoltopiùesosodialtripoichésesivoglionoelaborareefficacemente
idatiraccoltiènecessariofarricorsoadinfrastrutturebioinformatichespecializzate.
Ciò,imponeairicercatoridilimitareledimensionideicampionidaanalizzare,rendendo
proibitivi,nellamaggiorpartedeicasi,studimetagenomicisulargascala.
1.5.2.4.Sequenziamentodasingolacellula
Ilsequenziamentodasingolacellula(SCG)èunametodicaemergenteecomplementare
allametagenomica,checonsistenell’isolamentodisingolecellulebatterichedacampioni
ambientalienellasuccessivaamplificazionedellorointerogenoma,alloscopodisapere
chefunzionispecificheèingradodiesprimere.
Questotipodiapprocciohaunsensosoprattuttoquandovienecombinatocontecniche
diselezionecellulare,comel’ibridazionefluorescenteinsitu(FISH)154e/olamarcatura
congliisotopistabili,checonsentonoalricercatoredirecuperare,potenzialmente,delle
cellulebatterichechederivanodaunospecificobackgroundfilogeneticoochesvolgono
unaparticolarefunzione.
Unlimiteall’utilizzodiquestametodicaèrappresentatodallapossibilecontaminazione
dellaridottaquotadiDNAchepuòessereestrattadaunasolacellula,chepuòinterferire
conglistrumentiimpiegatiperlasuaamplificazione,determinandounadecodificazione
parzialedelgenoma155.
Nonostantequestosuolimite,direcente,ilsequenziamentodasingolacellulahatrovato
applicazionenellacaratterizzazionedibatteriappartenentiaphylapocoesplorati,come
26
TM7eChloroflexi156eingenerale,puòessereusatoinassociazioneconlametagenomica
perl’ampliamentodeidatabasediriferimento157.
1.5.2.5.Metatrascrittomica
Lametatrascrittomica,comesuggerisceilnome,èlostudiodeitrascrittidiunacomunità
batterica,chehacomeobiettivol’identificazionedellefunzionisvoltedaimicrorganismi
chelacompongono,inundatomomentoedincertecondizioniambientali,diversamente
dallametagenomicachenestabilisceilpotenzialefunzionalecomevaloreassoluto.
Questatecnicaconsisteinnanzituttonell’isolamentodiRNAdauncampioneambientale
enelsuosuccessivoutilizzoperlacreazionedi“librerie”dicDNAretro‐trascritti.Questi
possonoesserepoisequenziatieconfrontaticondatabasegenomicidiriferimento.
Lametatrascrittomicaètecnicamentemoltopiùimpegnativadellametagenomicapoiché
richiedeulteriorifasidilavorazionerispettoaquesta,checonsistonosianellacreazione
dicDNAsianell’eliminazionedegliRNAribosomialidell’ospiteebattericidalcampione
diinteresse,dovecostituisconolaclassediRNAmaggiormenterappresentata158.
Leanalisidelmicrobiotaumanosvoltetramitel’approcciodellametatrascrittomicasono
resepiùcomplessedalfattocheattualmentenonesistonomoltidatabasediriferimento
perigenomideibatteriinclusinelmicrobiota.
Unlimitefondamentaledellametatrascrittomicarisiedenelfattocheacausadellabreve
emivitadegliRNAmessaggero(misurabileinpochiminuti)159,responsabilidelprocesso
ditrascrizionedegliRNA,irisultatiottenutitramitequestoapprocciopotrebberoessere
pocorappresentatividelleattivitàbatterichesvolteinsitu.Ciòsignifica,adesempio,che
l’attivitàtrascrizionalebattericariscontrataincampionifecalipotrebbeesserediscorde
conl’espressionegenicadeglistessibatteriinundistrettocomeilcolonprossimale.
1.5.3.Metodimolecolari
1.5.3.1.DNAFingerprinting
NegliultimiannisonostatesviluppatenumerosetecnichedifingerprintingdelDNA,che
consentonodiotteneremarcatorigeneticiuniversaliutiliallostudiodeigenomibatterici
equindi,dellespeciepresentiinundeterminatomicrohabitat(es.colon).
27
Questetecnichesfruttanounacaratteristicadelgenomadituttiimicrorganismi,ovvero
ipolimorfismidalunghezzadeiframmentidirestrizione(RFLP):inprimis,dalcampione
diinteressesiestraeesipurificailDNA,insecundistaleDNAèsezionatoinframmenti
tramiteenzimidirestrizione(endonucleasi),cheeseguonoitaglisoloincorrispondenza
diparticolarisequenzenucleotidiche,specificheperognienzima.
Iframmentidirestrizionevengonoquindiseparatiperlunghezzamedianteelettroforesi
sugeldiagarosioepoi,tramitelatecnicadiibridazionedelSouthernblotsiidentificano
lebandegeneratedall’ibridazioneconsondedisequenzanotamarcateradioattivamente
otramitefluorocromi.Ledifferenzetraigenotipisonoevidenziatedalnumerodibande
cheappaionoutilizzandolastessasondaperl’ibridazione,cheèasuavoltadeterminato
dalnumerodisitiditagliopresentinellasequenzaconsiderata.
Illimiteprincipaledell’analisidegliRFLPècherichiedeunagrandequantitàdimateriale
dipartenzaeche,ancheinvirtùdiciò,producegeneralmentepochebande.
UnaltrometodoestremamentesensibileperindividuareipolimorfismidelDNAèdetto
amplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP).Adispettodelnome,questoapproccio
èusatoperevidenziarelapresenzadiunpolimorfismopiuttostochelasualunghezza.
LadifferenzasostanzialetralaAFLPelaRFLP,chestaincentivandomoltissimol’utilizzo
dellaprimatecnica,adiscapitodellaseconda,risiedenelfattocheallafasedidigestione
delDNAconunoopiùenzimidirestrizionesegueunafasenellaqualelesemi‐sequenze
direstrizionesuiframmentiappenacreatisonolegateadeglispecificiadattatori,ovvero
frammentidiDNAasequenzanota.Perquestomotivo,laAFLPconsentediindividuare
contemporaneamentediversipolimorfismiinvarieporzionigenomicheestadiventando
rapidamenteunodegliapproccipiùutilizzatiperstimareladiversitàgenomicasianelle
popolazionibattericheinvitrocheinvivo.
1.5.3.2.DNAmicroarray
UnmicroarraydiDNA,meglionotocomegenechip,consisteinunagrigliamicroscopica
disondediDNAattaccateadunsupportosolido,comevetro,plastica,ochipdisilicio.
Questimicroarraysfruttanounatecnicadiibridazione“inversa”,checonsistenelfissare
tuttelesonde(definiteprobe)diDNAsulsupportosolidoenelmarcarel’acidonucleico
daidentificareeconsentonodicontrollaresimultaneamentegliRNAprodottidamigliaia
digeni,alloscopodivalutarelevariazionidellaloroespressione160.
28
Imicroarrayfilogenetici,definitispessophylochips,sonomoltoutilizzatinellostudiodei
batteripresentinelmicrobiota:questiconsistonoessenzialmenteinunarraycontenente
brevioligonucleotidi(ilcuitarget,solitamente,èrappresentatodagliRNAdellasubunità
ribosomialeminore),chesonoselezionatiinmododaincluderelagammatassonomica
deimicrorganismichesiipotizzasianopresentiinundatocampioneambientale161.
IlDNAvieneestrattodalcampionediinteresse,gliRNAribosomialivengonoamplificati
emarcaticonunfluorocromoedinfineibridizzaticontroilmicroarray,cosicchéquando
deglispotdiDNAdelmicroarraypresentanounsegnalefluorescentesiavràilriscontro
chelagammatassonomicasceltaincludequelladellespeciebatterichedelcampione.
Unlimiteimportantediquestotipodiapproccioèche,diversamentedallevarietecniche
disequenziamentocasuale,sipuòrilevareunnumerocontenutodibatteri,ovveroquelli
lacuigammatassonomicaèinclusanellesondeattaccatealmicroarray.Fortunatamente
sonoormaidisponibiliarraycomprendentilagammatassonomicacompletadellespecie
batterichepresentiinparticolarimicrohabitatassociatiall’organismoumano,comesono
l’intestinooilcavoorale162,163.
1.5.4.Metodiquantitativi
Comprendonoduetecnichemolecolarilargamenteutilizzate,ovverolaPCRquantitativa
(oanchedettaReal‐timePCR)el’ibridazionefluorescenteinsitu(FISH),checonsentono
un’enumerazione/quantificazionedeigruppibattericipresentinelmicrobiota.
1.5.4.1.PCRquantitativa(oReal‐timePCR)
ÈunatecnicabasatasullamisurazionedellafluorescenzaemessadaunDNAdiinteresse
durantel’amplificazionemediantePCR:laquantitàdisegnalegeneratoeiltassoalquale
talesegnalesiaccumula,all’aumentaredelnumerodiciclidiPCR,consentedieffettuare
unamisurazionedellaquantitàdiDNAtargetpresentenelcampione.
Questatecnicaèspessoimpiegataperquantificareilnumerototaledicellulebatteriche
contenuteinuncampione,mapuòancheconsentirelaquantificazionedellepopolazioni
presentiindiversigruppibatterici,utilizzandounaseriediprimerspecifici164.
LaquantificazioneeseguitamediantelaReal‐timePCRèpiuttostoprecisa,dalmomento
chepossonoessereaccuratamenteconteggiatedensitàcellularidell’ordinedi101‐103.
29
UnalimitazionedellaReal‐timePCRècheconsentedimonitoraresoloigruppibatterici
percuisonostaticostruitideglispecificiprimerepertanto,igruppiesclusinonsaranno
quantificati,amenochenonsianoutilizzatisetdiprimermultipli.
1.5.4.2.Ibridazionefluorescenteinsitu(FISH)
Questatecnicaprevedechelecellulebattericheinesamesianoprimafissateutilizzando
agentichimici(es.laformaldeide)einseguitosianoresepermeabili,cosìdaconsentirne
l’accessoallesondeoligonucleotidichemarcateconfluorescente.
Questioligonucleotidihannounalunghezzadicirca15‐30bpesonocreaticomunemente
peridentificareleregionidiRNAribosomialedigruppifilogeneticiprescelti1165.
LesondeibridanoaqualsiasisequenzadirRNAadessecomplementare,edalmomento
cheiribosomisonoabbondantiedistribuitiuniformementenellacellulabatterica,fanno
visualizzaresubito,tramitemicroscopiaaepifluorescenza,lecellulechehannomostrato
unsegnalepositivo166.LaFISH,oltreadessereunapproccioquantitativo,hailvantaggio
fondamentale,dunque,diconsentirel’osservazionedicellulediinteresseinsitu,concui
èpossibiledefinireconragionevoleaccuratezza,adesempio, laspecificacomposizione
digruppibattericipresentisullasuperficiedellemucose.
Tuttavia,cisonoanchealcuneimportantilimitazioniall’utilizzodellaFISH:èunatecnica
moltomenosensibiledaunpuntodivistaquantitativorispettoallaReal‐timePCR,visto
cheèessenzialeunelevatonumerodicellule(nell’ordinedelle106perml)nelcampione
perrenderepossibileilloroconteggiovisivoall’internodelcampomicroscopico.
1.5.5.Metodifunzionali
1.5.5.1.Metaproteomica
Lametaproteomicaèlostudiodell’insiemedelleproteine/peptidiprodottidacomunità
batterichemiste167ecometale,fornisceinformazionifunzionalisudiesse,consentendo
aimicrobiologidimonitorarelemodificazioninell’espressionedelleproteineall’interno
delmicrobiota,inrispostaacambiamentidellenormalicondizioniambientali.
Questoapproccioprevedecheleproteinesianoprimaestrattedalcampioneambientale
d’interesseechesianopoiseparateperlalorocaratterizzazionemediantespettrometria
30
dimassaeperillorosuccessivoraffrontocondatibioinformaticidiriferimentopresenti
neiprincipalidatabase168.Inunrecentepassatoleproteine/peptidieranocomunemente
separatimediantel’elettroforesisugel169,mentreattualmentesonoseparatiutilizzando
lacromatografialiquida,duetecnichechecondividonolostessoprincipio,dalmomento
cheseparanoleproteineinbasealloropuntoisoelettrico.
Lametaproteomicaoffredeivantaggirilevantirispettoallametatrascrittomica,giacché
avendocomeobiettivoleproteineanzichégliRNAmessaggero,fornisceunapanoramica
piùampiaerappresentativadelleattivitàfunzionalisvoltedalmicrobiota,dandoanche
unaspiegazioneaiprocessidimodificazionepost‐traslazionali170.
Inoltre,leproteine/peptidisonoanchecomunementepiùstabilidegliRNAmessaggeroe
daciòneconseguecheirisultatiraggiuntinonsonopiùcondizionatianchedallavelocità
concuiicampionivengonoelaborati.
Questotipodiapproccio,tuttavia,mostraancheunaseriedilimitazionichenonlofanno
preferirealletecnologiebasatesulDNA:attualmente,infatti,ancheselasuarisoluzione
stamigliorando,lametaproteomicanonpuòdiscriminarechepochemigliaiadeimilioni
diproteine/peptidichepotrebberoesserepresenti,nellostessotempo,inuncomplesso
microbiotadiuncampionediinteresse171.
Ciòsignificache,adoggi,solamenteleproteineprodottedaimembripiùrappresentativi
delmicrobiotapossonoessererecuperateinmisuraragionevole172.
1.5.5.2.Metabolomica
Lametabolomicaèlostudiodeimetabolitipresentiinunospecificocampionealtempo
dicampionamento.Comelametaproteomica,dunque,essapermettedivalutarel’attività
funzionalesvoltadaunacomunitàbattericatramiteilmonitoraggiodirettodeiprodotti
finalidelsuometabolismo173.
Questotipodiapproccioprevedecheimetaboliti,ingenereisolatidacampionicorporei
qualiurina,feciesangue,sianostimatiutilizzandodiversetecnologie,comelarisonanza
magneticanucleare(NMR)elamicroscopia/spettrometriadimassa174.Ilrisultatofinale
diquestiapproccièunaseriedispecificispettri(opicchi)diassorbimento,chederivano
dallagammadimetabolitipresentinelcampione175.
Unalimitazionefondamentalediquestametodicaèchepuòesseredifficiledeterminare
conprecisionequalespeciebattericastiaproducendoquelparticolaremetabolita.
31
Siètentatomolteplicivoltedicorrelarelaproduzionedimetaboliticonlacomposizione
battericadiuncertocampione,tuttavia,gliapproccimetagenomiciimpiegatialloscopo
possonoessereresiinefficacidallapresenzadiDNAderivatodaspeciemortioinattive.
Inoltre,moltimetaboliti,comegliacidigrassiacatenacorta,sonorapidamenteassorbiti
dall’ospite,ilchesignificacheilivellidiproduzionenonpossonoessereaccuratamente
definitioattribuitiadunaparticolarespeciebatterica176.
Infine,comesuccedeperlametaproteomica,ilimitidirisoluzionefannosìchesipossa
monitorareaccuratamentesolounpiccolosottoinsiemedellavastagammadimetaboliti
chepossonoesserepresentiinuncomplessocampionecomelefeci177.
1.5.5.3.Marcaturaconisotopistabili
Unaltroapprocciofunzionalemoltoapplicatoallostudiodelmicrobiotaèlamarcatura
congliisotopistabili(SIP).Taletecnicaprevedechelecomunitàmicrobichediinteresse
sianoincubatesusubstraticontenentiisotopistabili,come13C,15Ne18O.Aquestopunto
lespeciechesonoingradodicresceresulsubstratofornito,incorporerannoimarcatori
degliisotopinellalorobiomassacellulare,chepotràpoiessereesaminataindividuando
glielementichelacompongono,comeilDNA/RNA,leproteineogliacidigrassiderivati
daifosfolipidi,cherisulterannotuttimarcatiovviamente.
Neiprimistudiquestatecnicaèstatausata“intandem”conapprocciditipomolecolare
equantitativo(comeRFLPeFISH),alloscopodicontraddistinguerelespeciebatteriche
cheeranoingradodiutilizzareattivamentesubstratimarcaticomel’oligofruttosio178.
Unlimiteimportantediquestatecnicaèsenzadubbioilcostoelevatosiadeimacchinari
utilizzatisiadeimaterialioccorrentiedinparticolare,deisubstratimarcati.
Inoltre,lamarcaturacongliisotopistabilirichiedecheibattericrescanoinpresenzadei
substratimarcatiche,pertanto,nonpossonoessereincorporatidacellulee/oorganismi
vitali.Ciòsignificachelecomunitàbatterichedastudiarevannomantenuteincondizioni
artificialidilaboratorio,nonconsentendocosìdiottenererisultatiingradodiriflettere
completamentel’attivitàsvoltadalmicrobiotainvivo179.
32
2.ScopodellatesiConsideratalagrandeeterogeneitàdeirisultatiottenutisinorarelativamenteairapporti
tramicrobiotaecancerogenesicolica,èragionevolepensarecheilricorsoallamedicina
traslazionale,tramiteilsuoapprocciomultidisciplinareealtamentecollaborativo,possa
favorireunutilizzopiùefficaceespecificodiquestibatterineltrattamentodelleIBD.
Atalriguardo,ilruolodimodelli“transizionali”appropriati,ovveropiùrappresentativi
dellecondizionichesiverificanoinvivorispettoaitradizionalisistemiinvitro,potrebbe
esseredigranderilevanza,favorendolatransizione,appunto,diquestimodelliinveree
proprieapplicazionicliniche.
Loscopodiquestatesièstatoquellodicaratterizzareesviluppareunmodello“exvivo
organculture”semplice,economicoeriproducibile,chepossaessereusatonellostudio
delleinterazionimicrofloraintestinale‐ospite,conparticolareriferimentoall’alterazione
delnormaleequilibrioesistentetramicrobiotaemeccanismimolecolariproliferativie/o
infiammatorialivellodellamucosacolica.
33
3.Materialiemetodi
3.1.Pazienti
Nellostudiosonostatiinclusi74pazienti,sottopostiacolonscopiacompletaperdiverse
indicazionicliniche(comepolipiadenomatosie/oretto‐colitiulcerose)pressoilreparto
diEndoscopiaDigestivadell’AziendaOspedalieraS.AndreadiRoma.
Ipazientichehannoaderitoallostudio,approvatodallaCommissioneEticalocale,hanno
rilasciatoilloroconsensoinformato,secondoledisposizionidileggevigenti.
3.2.Campionibioptici:ilmodellosperimentaleexvivo
Durantelacolonscopiadeipazientiinclusinellostudiosonostateraccoltealcunebiopsie
dasegmentisani(prossimaleedistale)epatologicidellamucosadelcolon.
Lebiopsie,appenaprelevate,sonostatesottopostealavaggioconsoluzionefisiologicae
pesate,perevitaredifferenzeconsistentitraicampioni.
Al finedivalutarel’adesivitàdivariespeciebattericheprobiotichesudiversisegmenti
sanidimucosadelcolonequindi,perconfronto,sualcunisegmentipatologicisonostate
raccolte,da18pazienti,altrettantebiopsiedapolipiadenomatosideltrattoretto‐sigma
e,percontrollonegativo,damucosasanaadiacente.
Successivamente,lebiopsiesonostatepostein200lditerrenoRoswellParkMemorial
Institute(RPMI),intubiFalconda2ml,dovesonostatiaggiunti20l(il10%delvolume
totale)diunasoluzioneottenutadallarisospensionedi0,2gdiformulazionimonospecie
(LactobacillusrhamnosusGGoLGG)emultispecie(contenenti8ceppidiversi)dibatteri
probioticiinpolverein1mldiPBSoppure,percontrollonegativo,inunostessovolume
diPBSsenzaalcunprobiotico.
Infine,itubicontenentilebiopsiesonostatiincubatia37°Cper2ore.
Alterminedell’incubazione,lebiopsiesonostaterecuperateesottoposteadueulteriori
lavaggiconilPBS,perrimuoverelespeciebatterichenonaderenti.Inseguito,lebiopsie
sonostateposteinunostabilizzante(RNALater)finoalsuccessivopassaggio.
34
LebiopsiesonostateomogeneizzateedaquesteèstatoestrattoilDNAtotale,analizzato
mediantePCR,utilizzandodeiprimerspecificiperdiversespecieprobiotiche,alloscopo
distabilirelaconcentrazionemucosalerelativadiduespecieinclusenellaformulazione
multispecie(B.infantiseS.thermophilus)ediLactobacillusrhamnosusGG.
Alloscopodivalutareglieffettiprodottisullamucosaintestinaledaiprobioticiutilizzati
nellostudio,interminidiespressionedimolecolepro‐infiammatorie(es.‐defensine)e
pro‐apoptotiche(es.caspasi),èstatoimpiegatounprotocolloanalogoaquellodescritto
precedentemente:da51pazientisonostateprelevate33biopsiedapolipiadenomatosi
delretto‐sigmae48biopsiedamucosasana.
Lebiopsie,sonostatequindiprocessateafrescooposte,ancheinquestocaso,interreno
RPMI,maconl’aggiuntadel10%diunasoluzionediterrenocondizionatoperprobiotici
(preparato in accordo con le proceduredescritte in letteratura) oppure, per controllo
negativo,del10%diPBS.
Iltempod’incubazionedellebiopsieèstatoallungatoacirca6ore,alloscopodivalutare
l’induzionedell’espressionegenica.Questotempononèstatoprolungatoulteriormente
poichéa12e24oreèstataosservatafrequentementeunacontaminazionedeicampioni
eladegradazionedell’RNA.
Infine,dallebiopsieèstatoestrattol’RNAtotale,cheèstatoretrotrascrittoincDNAepoi
analizzatotramitePCRutilizzando,inquestocaso,primerspecificiperdiversemolecole
pro‐infiammatorie(‐defensineHD5eHD6)epro‐apoptotiche(caspasi3e9).
3.3.EstrazionedelDNA/RNA
L’estrazionediDNAediRNAtotaledallebiopsieèstataeseguitautilizzandoikitQIAmp
mini‐DNAeRNAeasyminiprep(Qiagen,Valencia,CA)rispettivamente,inaccordoconle
indicazionifornitedalproduttore.
Primadelsuoimpiego,l’RNAtotaleottenutomedianteestrazione,èstatoretrotrascritto
incDNA,utilizzandoilkitGeneAmpRNAPCR(AppliedBiosystems,FosterCity,CA),come
daindicazionidelproduttore.
Laconcentrazioneeilgradodipurezzadegliacidinucleiciestrattisonostatideterminati
mediantelaletturadeidiversicampioniallospettrofotometroGeneQuantproRNA/DNA
Calculator(AmershamPharmaciaBiotechInc.,Piscataway,NJ).Icampionisonopoistati
portatituttiallastessaconcentrazione.
35
3.4.Real‐timePCR
LereazionidiReal‐timePCRsonostateeseguiteutilizzandouniCycleriQReal‐TimePCR
DetectionSystem,inunvolumedi20l,costituitoda16ldiSYBRGreenPCRSupermix
(Bio‐RadLaboratoriesInc.,Hercules,CA)e4ldiDNA/RNA.
Perognisetdiprimerutilizzatoèstatomantenutoilrelativoprofilotermicoconsigliato
ecomenormalizzatorideivaloriottenutinellereazionisonostatisceltiigenicostitutivi
(ohousekeeping)GADPHe‐actina:laquantitàdeibatteriaderentineicampionièstata
espressa,inmodosemi‐quantitativo,comepercentualerelativarispettoalvaloreminore
ottenutonellareazioneconsiderata.
LaqualitàdellereazionieffettuateèstatavalutatamedianteilcontrollodellaMeltCurve
edicampioniconMeltCurveanomalarispettoaglistandarde/oaglialtricampionisono
statiscartati.
Infine,iprodottidireazionedellaPCRsonostatifattimigraresuungelperelettroforesi
al2%diagarosio,conl’aggiuntadibromurodietidioperpoterlivisualizzare.
3.5.Statistica
Lecomparazionitragruppi,perl’adesivitàbattericael’espressionedellecitochine,sono
stateeseguitemedianteiltestdelchiquadrooiltdiStudentperdatiappaiati.
Lasignificativitàstatisticaèstataconsideratapervaloridip<0.05.
L’analisistatisticaèstataeseguitatramiteilsoftwareMedCalc(versione12.5)perPC.
36
4.Risultatieconclusioni
4.1.Risultati
Loscopodiquestatesièstatoquellodicaratterizzareesviluppareunmodello“exvivo
organculture”semplice,economicoeriproducibile,chepossaessereusatonellostudio
delleinterazionimicrofloraintestinale‐ospite,conparticolareriferimentoall’alterazione
delnormaleequilibrioesistentetramicrobiotaemeccanismimolecolariproliferativie/o
infiammatorialivellodellamucosacolica(Fig.1).
Fig.1.Rappresentazioneschematicadelmodellopresentatonellostudio.
Lacaratterizzazionediquestomodellohaprevistolosviluppoditretematiche:
lealterazionideirapportitramicrobiotaedospiteneipolipiadenomatosi,ovvero
inunacondizioneclinicaprecancerosacomunedeltrattogastrointestinale;
37
lapossibileassociazioneesistentetraquestealterazionieiprocessiinfiammatori
cheavvengonoalivellodellamucosaintestinale;
l’eventualeutilizzoterapeuticodeibatteriprobioticiinquestoambitoclinico.
Riguardoallealterazionidell’equilibriomicrobiota‐ospiteèstatavalutatainprimoluogo
l’adesivitàdeiprincipalibatteriprobioticiaivarisegmentidimucosacolicasana(distale
eprossimale),eciòchesièpotutonotareèchelespecieprobioticheaderisconoinmodo
specificoaivarisegmentidellamucosadelcolon(Fig.2).
Fig.2.Adesivitàrelativadeibatteriprobioticiaiverisegmentidimucosacolicasana.
Inparticolare,incubandoicampionibiopticiconformulazionimultispeciedeiprobiotici
maggiormentecaratterizzati,abbiamoosservatocheduedellespeciepresentiall’interno
delcomposto(ovveroBifidobacteriuminfantiseStreptococcusthermophilus)aderiscono
meglioallamucosadelcolonprossimalecheaquelladelcolondistale(Fig.2).
Unterzobatteriopresentenellaformulazione,cioèLactobacillusacidophilus,nonèstato
riscontratoalivellodellamucosa,dimostrandolasuaincapacitàdiaderireallamucosa
delcolonnellecondizioniutilizzatenell’esperimento(Fig.2,datononmostrato).
Successivamente,abbiamovalutatol’adesivitàdiLactobacillusrhamnosusLGG,unadelle
specieprobiotichemaggiormentecaratterizzate,osservandocomeessotendeadaderire
38
inmodopiùmarcato(2:1)alcolondistalerispettoalprossimale.Talerisultatoconferma
laprecedenteosservazionechelediversespecieprobioticheaderisconoaisegmentisani
dellamucosadelcoloninmanieraspecifica(Fig.3).
Fig.3.AdesivitàrelativadelbatterioLactobacillusrhamnosusGGaivarisegmentidimucosacolicasana.
Sullabasedeirisultatiottenutisullamucosasanadelcolon,abbiamodecisodivalutare
lepossibilidifferenzediadesivitàdeibatteriprobioticisullamucosadelcolonnormalee
patologica,conparticolareriferimentoaquelladipolipiadenomatosi:abbiamoraccolto
biopsiedaentrambiitipidimucosaeleabbiamoincubatedinuovoconleformulazioni
mono‐emultispeciediprobioticiimpiegateneitestprecedenti,osservandosempreuna
significativariduzionedell’adesivitàdeiprobioticisullamucosadapolipoadenomatoso
rispettoaquellanormale.Nelcasodellamucosapatologica,pertanto,ledifferentispecie
batterichesembranoavereuncomportamentosimile(Fig.4).
Fig.4.Confrontonell’adesivitàbattericasullamucosacolicasanaedapolipoadenomatoso.
Questorisultatoèstatoquindiconfermatoinunsecondoesperimentoinvivo,subiopsie
raccolteinfasedicolonscopiaedirettamenteprocessateperl’estrazionedelDNAtotale
39
elasuaquantificazionetramiteReal‐timePCR,conprimerspecificiperilDNAbatterico
totale.Ineffetti,comesievincedallaFigura5,lacapacitàdiadesionebattericaèrisultata
significativamentepiùbassa(diben20volte)sullamucosadelcolonpatologicarispetto
aicontrollidamucosasana(Fig.5).
Fig.5.Confrontonell’adesivitàbattericasullamucosacolicasanaedapolipoadenomatosoinvivo.
Questedifferenzediadesivitàbattericatralamucosacolicasanaedipolipiadenomatosi
possonoesserespiegatedallaosservazionechenellebiopsiedapoliposihaunaumento
dellasecrezionedialcunemolecoleanti‐batteriche,le‐defensineHD5eHD6.
Questatendenzaèstataconfermatasiatramitel’analisideitrascrittiperleduemolecole
siamediantesaggioimmunoistochimico,conilqualeèstatopossibilevisualizzarecome
ledue‐defensinesonoscarsamentepresentialivellodellamucosacolicasana,mentre
sonoabbondantementerappresentateinquelladapolipoadenomatoso(Fig.6).
Èopportunosottolinearechelacorrelazionetraladiminuzionedell’adesivitàbattericae
l’aumentodellasecrezionedi‐defensineosservatenellamucosadipolipiadenomatosi
èpuramenteteorica,dalmomentochenonsonostatieseguititestspecificiariguardo.
L’aumentodellasecrezionedellemolecolepro‐infiammatoriecheèstatoosservatonelle
biopsiedapolipoadenomatosocihaspintoacercaredicomprenderesepotesseesserci
un’associazionetralealterazioniriscontrateneirapportimicrobiota‐ospiteediprocessi
infiammatoricheavvengononormalmentealivellodellamucosa.
Atalproposito,abbiamovolutoesplorareselapre‐incubazioneconacidoacetilsalicilico
(ovverounamolecolaanti‐infiammatoria)deicampionibioptici,trattaticomedescritto
inprecedenza,cioèincubaticonformulazionidiLGGprimadiessereprocessati,potesse
ripristinarel’adesivitàbattericasullamucosadeipolipiadenomatosi.
40
Effettivamente,lapre‐incubazionedidueoredellebiopsieconacidoacetilsalicilicopare
ripristinarelacapacitàdiLGGdiaderireallamucosadipolipo,riducendosensibilmente
ledifferenzediadesivitàosservateprecedentementeerendendoletrascurabili(Fig.7).
Fig.6.Aumentodellasecrezionedi‐defensinenellamucosadapolipoadenomatosorispettoaquella
sana,valutatatramiteanalisideitrascritti(AeB)esaggioimmunoistochimico(CeD).
Fig.7.L’incubazionedellebiopsieconacidoacetilsalicilicoripristinalacapacitàdiadesione
delprobioticoLGGallamucosadeipolipiadenomatosi.
41
Èopportunosottolinearechequest’ultimodato,inconsiderazionedelpiccolocampione
dibiopsieutilizzatoedellanecessitàdireplicaregliesperimentieffettuati,èdaritenersi
preliminare,manonmenoimportanteaifinidellostudio.
Ilterzoedultimoscopodelnostrostudioèstatoquellodivalutareunpossibileimpiego
deibatteriprobioticineiprocessiinfiammatoriintestinali,inconsiderazionedeirisultati
descrittifinora.Cisiamochiestipertantoseèpossibileinterveniresuquestadisbiosiche
siriscontranellamucosadeipolipiadenomatosirispettoallamucosasanaedapplicando
ilnostromodellosperimentale,abbiamocercatodicapireselespecieprobioticheenello
specificoLactobacillusrhamnosusLGG,possaaveredellecaratteristichetalidarenderlo
proponibileperquestoscopo.
Abbiamovalutato,quindi,ilsuopossibileeffettoanti‐infiammatoriosubiopsieprelevate
dacolondistaleeprossimaledipazienticoninfiammazioniattive(es.coliteulcerosa).
Nellebiopsie,incubateconformulazionidelbatterioprobiotico,sièregistrataunanetta
riduzionedell’espressionediunaimportantemolecolapro‐infiammatoria,cioèilfattore
dinecrositumorale(TNF),cheèattribuibileaunpossibileeffettoanti‐infiammatorio
delbatterioprobioticoLGG(Fig.8).
Fig.8.Effettoanti‐infiammatoriodelbatterioprobioticoLGG:riduzionedell’espressione
diTNFnellamucosacolicadipazienticoncoliteulcerosainfaseattiva.
LostessoeffettodiLGGsiosservaanchenelcasodiun’altramolecolapro‐infiammatoria
bencaratterizzata,l’interleuchina‐17(IL‐17),soprattuttoalivellodelcolondistale,come
dimostralaFigura9.L’effettoapparepuòmoderato,invece,nelcolonprossimale.
42
Fig.9.Effettoanti‐infiammatoriodelbatterioprobioticoLGG:riduzionedell’espressione
diIL‐17nellamucosacolicadipazienticoncoliteulcerosainfaseattiva.
Infine,applicandonuovamenteilnostromodellosperimentaleexvivo,abbiamovalutato
ilpossibileeffettoanti‐proliferativodiquestobatterioprobiotico:atalescopo,abbiamo
incubatobiopsiedapazienticoninfiammazioniinfaseattivaconlastessaformulazione
diLGGutilizzataneiprecedentiesperimentiedabbiamoosservato,ineffetti,unaumento
dell’espressionediduemolecoleimportantinelprocessoapoptotico,lecaspasi3e9,che
apparepiùevidenteperlaprima(60%)cheperlaseconda(15%)(Fig.10e11).
Fig.10.Effettoanti‐proliferativodelbatterioprobioticoLGG:aumentodell’espressione
dellecaspasi3nellamucosacolicadipazienticoncoliteulcerosainfaseattiva.
43
Fig.11.Effettoanti‐proliferativodelbatterioprobioticoLGG:aumentodell’espressione
dellecaspasi9nellamucosacolicadipazienticoncoliteulcerosainfaseattiva.
Riassumendoirisultatiottenutidurantelostudio,sipuòconcluderecheibatteridefiniti
probioticiaderisconoallamucosacolicanormaleinmanieraspecie‐specifica.
Lamucosadipolipiadenomatosi,invece,producemolecoleanti‐batteriche,ledefensine
emostranelcontempo,unariduzionedellacapacitàdiadesionedapartedeibatteri.
Questatendenzapuòessereinvertitamediantel’utilizzodimolecoleanti‐infiammatorie
comel’acidoacetilsalicilico,cheèingradodiripristinarel’adesivitàdeiprobiotici.
Infine,ibatteriprobiotici(einparticolareLactobacillusrhamnosusLGG),possonoavere
uneffettoanti‐infiammatorioedanti‐proliferativosullamucosadelcolon,esicandidano
perquestoadavereunruoloneltrattamentodeglistatiinfiammatoriintestinali.
4.2.Conclusioni
Damoltianniènotoilruolochelamicroflorabattericaintestinaleomicrobiota,svolge
nelmantenimentodell’omeostasidell’organismoumano,masolo recentemente,grazie
all’utilizzoditecnichecolturaliedibiologiamolecolaresemprepiùperformanti,sisono
registratiprogressinotevolinellostudiodellamicrofloraendogena.Unrapidosviluppo
dicosìtantemetodiche,tuttavia,determinaunnotevoleproblemanellainterpretazione
deirisultati,portandoallanecessitàdisvilupparemodellidisempliceutilizzo.
L’interessedelmondoscientificoèfocalizzatosulleinterazionitramicrobiotaintestinale
eospite,conparticolareriguardoallecondizionifisiologicheepatologichechepossono
44
causarel’alterazionedellacomposizioneedelnumerodeibatteripresentinell’intestino
dell’uomo.D’altrocanto,numerosistudihannogiàsuggeritol’utilizzodibatteriprovvisti
dieffettibeneficisullasalutedell’uomooprobiotici,neltrattamentodialcunecondizioni
patologiche(es.ladiarreainfettiva,lasindromedell’intestinoirritabile,IBSelemalattie
infiammatoriecronicheintestinali,IBD).
Atalproposito,assumeunanotevoleimportanzal’approfondimentodeglistudisulruolo
delmicrobiotaintestinalenellacancerogenesidellamucosadelcolon,dallaformazione
deipolipi adenomatosi finoaquelladel carcinomacolon‐rettale, allo scopodi ridurne
l’insorgenzae/ol’incidenzanell’uomo.
Lamedicinatraslazionale,attraversolacontinuainterazionetraimodellisperimentalie
lecondizioniinvivopuòaiutareiricercatoriachiariremegliogliaspettidell’interazione
microbiota‐ospite,conparticolareriferimentoallerelazionitrailmicrobiotaeiprocessi
infiammatorieneoplastici.
Inrelazioneaquesteconsiderazioni,ilnostrostudiohaavutoloscopodicaratterizzare
esviluppareunmetodoexvivosemplice,riproducibileedeconomicoperlavalutazione
delleinterazionimicrobiota‐ospite.Inparticolare,l’adesioneeglieffettisullamucosadei
probioticipossonoessereanalizzatimediantel’applicazionediquestometodo.
Lostudioèstatoincentratosullelesioniprecancerose,cioèipolipiadenomatosi,poiché
questipotrebberorappresentareunmomentochiavedelprocessoneoplasticoedhanno
destato,sinoaquestomomento,minoreinteresseneiricercatoririspettoalCCRoaaltre
formetumorali,risultando,pertanto,menocaratterizzate.
Irisultatidiquestostudiopotrannocontribuireadampliarelanostraconoscenzasulle
complesseinterazionidinamichetrailmicrobiotaintestinaleediprocessiinfiammatori
edicarcinogenesicolica,conimportantipossibiliapplicazioni,nonsoltantopuramente
conoscitive,maclinico‐pratiche,interminididiagnosiprecoceediterapia.Èauspicabile
chelamiglioreconoscenzadellecaratteristicheedelleproprietàdelmicrobiota,edelle
possibilitàdimanipolazionedellostesso,possanoportare,inunprossimofuturo,aduna
miglioregestionedelCCRcherimane,malgradoiprogressiriguardoadiagnosiprecoce
etrattamento,unadelleprincipalicausedimortalitànelmondooccidentale.
45
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