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Facoltà di Medicina e Psicologia Dipartimento di Scienze Medico‐Chirurgiche e di Medicina Traslazionale DOTTORATO DI RICERCA IN ONCOLOGIA (XXIX CICLO) Curriculum Oncologia Digestiva Sviluppo di un modello “ex vivo organ culture” per la valutazione del microbiota intestinale: applicazioni in Oncologia Digestiva Dottorando Coordinatore Dott. Claudio Lanini Prof. Giovanni Ramacciato Relatore Coordinatore Curriculum Dott. Cristiano Pagnini Prof. Gianfranco Delle Fave Anno Accademico 2015‐2016

Curriculum Oncologia Digestiva · Curriculum Oncologia Digestiva Sviluppo di un modello ... di batteri provvisti di effetti benefici sulla salute dell’uomo o probiotici, nel trattamento

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FacoltàdiMedicinaePsicologiaDipartimentodiScienzeMedico‐ChirurgicheediMedicinaTraslazionale

DOTTORATODIRICERCAINONCOLOGIA(XXIXCICLO)CurriculumOncologiaDigestiva

Sviluppodiunmodello“exvivoorganculture”perlavalutazionedelmicrobiotaintestinale:

applicazioniinOncologiaDigestiva

Dottorando CoordinatoreDott.ClaudioLanini Prof.GiovanniRamacciatoRelatore CoordinatoreCurriculumDott.CristianoPagnini Prof.GianfrancoDelleFave

AnnoAccademico2015‐2016

II

III

Indice

1.Introduzione 1

1.1.Ilmicrobiotaintestinale 1

1.1.1.Definizione 1

1.1.2.Composizioneelocalizzazione 2

1.1.3.Sviluppoemodificazioni:ilmicrobiotanelneonatoenell’adulto 3

1.1.4.Funzioni 4

1.2.Probioticieprebiotici 5

1.2.1.Probiotici:definizioneefunzioni 5

1.2.2.Prebiotici:definizioneefunzioni 7

1.3.Cancerogenesidellamucosacolica 8

1.3.1.Polipiintestinali 8

1.3.1.1.Definizioneecaratteristiche 8

1.3.1.2.Polipinon‐neoplastici 8

1.3.1.3.Polipineoplasticioadenomi 9

1.3.2.Carcinomacolo‐rettale 10

1.3.2.1.Epidemiologiaeprognosi 10

1.3.2.2.Eziologiaefattoridirischio 10

1.3.2.3.Storianaturaleealterazionimolecolari 11

1.4.Relazionetramicrobiotaetumoredelcolonretto 13

1.4.1.Ruolopro‐carcinogeneticodelmicrobiota 14

1.4.1.1.Microbiotaedinfiammazione 14

1.4.1.2.Microbiotaeattivazionedeipro‐carcinogeni 15

1.4.2.Ruoloanti‐carcinogeneticodelmicrobiota 16

IV

1.4.3.Modifichealivellodell’ospite 18

1.5.Metodidistudiodelmicrobiota 19

1.5.1.Metodiclassici 20

1.5.1.1.Coltureinbatch 20

1.5.1.2.Colturecontinue 21

1.5.1.3.Modellianimali 21

1.5.2.Metodibasatisulsequenziamento 22

1.5.2.1.Sequenziamentodell’RNAribosomiale 22

1.5.2.2.Sequenziamentocompletodelgenoma 23

1.5.2.3.Metagenomica 24

1.5.2.4.Sequenziamentodasingolacellula 25

1.5.2.5.Metatrascrittomica 26

1.5.3.Metodimolecolari 26

1.5.3.1.DNAfingerprinting 26

1.5.3.2.DNAmicroarray 27

1.5.4.Metodiquantitativi 28

1.5.4.1.PCRquantitativa(oReal‐timePCR) 28

1.5.4.2.Ibridazionefluorescenteinsitu(FISH) 29

1.5.5.Metodifunzionali 29

1.5.5.1.Metaproteomica 29

1.5.5.2.Metabolomica 30

1.5.5.3.Marcaturaconisotopistabili 31

2.Scopodellatesi 32

3.Materialiemetodi 33

3.1.Pazienti 33

V

3.2.Campionibioptici:ilmodellosperimentaleexvivo 33

3.3.EstrazionedelDNA/RNA 34

3.4.Real‐timePCR 35

3.5.Statistica 35

4.Risultatieconclusioni 36

4.1.Risultati 36

4.2.Conclusioni 43

5.Bibliografia 45

1

1.IntroduzioneDamoltianniènotoilruolochelamicroflorabattericaintestinaleomicrobiota,svolge

nelmantenimentodell’omeostasidell’organismoumano,masolorecentemente,tramite

l’utilizzoditecnichecolturaliedibiologiamolecolaresemprepiùefficienti,sisonoavuti

progressinotevolinellostudiodellamicrofloraendogena.

L’interessedellacomunitàscientificaèstatofocalizzatosulleinterazionitramicrobiota

intestinaleeospite1,conparticolareriguardoallecondizionifisiologichee/opatologiche

chepossonocausareun’alterazionedellacomposizioneedelnumerodeimicrorganismi

presentinell’intestinoumano.D’altrocanto,numerosistudihannogiàpropostol’utilizzo

dibatteriprovvistidieffettibeneficisullasalutedell’uomooprobiotici,neltrattamento

di alcune condizioni patologiche, quali la diarrea infettiva, la sindrome dell’intestino

irritabile(IBS)elemalattieinfiammatoriecronicheintestinali(IBD).

Atalproposito,assumeunanotevoleimportanzal’approfondimentodeglistudisulruolo

delmicrobiotaintestinalenellacancerogenesidellamucosadelcolon,dallaformazione

deipolipi adenomatosi finoaquelladel carcinomacolon‐rettale, allo scopodi ridurne

l’insorgenzae/ol’incidenzanell’uomo.

1.1.Ilmicrobiotaintestinale

1.1.1.Definizione

Permicrobiotaintestinalesiintendel’insiemedeimicrorganismi,deilorogeniedeiloro

metaboliti,presentineltrattogastrointestinaleumano2.

Asecondadeltipodirapportocheilmicrobiotarealizzaconilproprioospiteparleremo

dimicrorganismisimbionti,commensalie/opatobionti:nelprimocaso,siailmicrobiota

che l’individuo traggono un vantaggio dalla loro associazione, nel secondo caso, sono

soltanto imicrorganismia trarrevantaggiodall’associazionecon l’ospite, senza recare

ad esso né danni né benefici ed infine, nel terzo caso, i batteri, innocui in condizioni

normali,possonoindurreundannoall’ospiteincondizionipatologiche.

2

All’internodeltrattogastroenterico,lefontidinutrimentodelmicrobiotasonocostituite

essenzialmentedallesostanzeingeriteconladietadall’individuoedavariecomponenti

presentialivellodellamucosaintestinale,comemucoecelluleepitelialisfaldate.

Normalmente,ilsistemaimmunitariodell’individuoelamicrofloraintestinalesitrovano

inunacondizionediequilibriodinamicoche, incasodialterazionedellacomposizione

dellamicroflora,puòessereperturbatoesarebbeassociatoconlacomparsadipatologie

gastroenteriche,comecolonirritabile,malattieinfiammatoriecroniche,diverticolitee/o

cancrodelcolonesistemiche,comeallergie,obesità,diabeteditipo2edaterosclerosi3.

1.1.2.Composizioneelocalizzazione

Grazieallosviluppodinuovetecnichedibiologiamolecolarebasatesulsequenziamento

dellasubunità16Sdell’RNAribosomiale,iricercatorihannopotutoidentificarenonché

classificareicostituentidellamicrofloraintestinale.

Questo complesso ecosistema comprende sia specie autoctone, ovveromicrorganismi

commensali acquisiti alla nascita o, come recentemente ipotizzato, trasferiti in fase

prenataledallamadrealfetopoichégiàpresentinelliquidoamniotico,nellaplacentao

nelsanguedelcordoneombelicale111‐113,siaspecietransitoriediorigineambientale9.

Inoltre,inaccordoconlalocalizzazione,ilmicrobiotaintestinaleècostituitosoprattutto

dabatterianaerobi10,siafacoltativicheobbligati:traiprimiannoveriamoLactobacillie

Streptococchi,EnterococchieEnterobatteriacee,mentrenelsecondogrupporitroviamo

BifidobatterieClostridi11.

Nell’individuoadulto,iphylabattericipiùrappresentatinellamicrofloraintestinalesono

Firmicutes,72%,Bacteroidetes,20%eActinobacteriaeProteobacteria,5‐8%12.Alprimo

phylumappartengonopiùdi200generidiversi,tracuiBacilli,CocchieClostridi,mentre

nelsecondosonoracchiusipiùdi20generi,tracuiBacteroidesePrevotella13.Nelgruppo

degliActinobacteriaritroviamoiBifidobatteri,mentreinquellodeiProteobacteriasono

compreseleEnterobatteriaceeedEscherichiacoli.

Nel complesso, la popolazionemicrobica gastrointestinale includedalle 500 alle 1000

speciedifferenti,appartenentia14famiglieea45generi,edistribuitesuun’areatotale

dicirca300m2diintestino.Intotale,lecellulebatterichechecostituisconolamicroflora

intestinalesono1014,unnumero10volte superioreaquellodelle celluleeucariotiche

umane4: èperquesto che ilmicrobiota intestinaleumanocontieneunnumerodi geni

3

almeno100voltesuperioreaquellodeigenichecostituisconoilgenomaumanoesipuò

considerareunveroepropriogenomasupplementareperl’ospite,dettomicrobioma5.

Ilmicrobiotaintestinale,cheincludeoltreil70%deimicrorganismipresentinelcorpo

umano6,varianotevolmentealivelloquantitativoequalitativonelledifferentiporzioni

del tratto gastrointestinale ed in particolare, la densità batterica aumenta in modo

esponenziale passando dalla porzione superiore a quella inferiore dell’intestino.Nello

stomacoenelduodenosiregistraunaminoredensitàbatterica(101‐103CFU/g),mentre

neltenue(digiunoeileo),questadensitàaumenta(104‐107CFU/g),perpoiraggiungere

ilsuopicconelcolon(1011‐1012CFU/g)7.

Le variazioni qualitative e quantitative che si registrano lungo tutto il tubo digerente

dipendonodafattoribatterici(es.capacitàdiadesioneeattivitàmetabolica)edafattori

legatiall’ospite,chesisuddividonoinfattoriestrinseci(es.dieta,assunzionedifarmacie

fattoriambientali)edintrinseci(es.pH,motilitàetempoditransito,muco,acidigastrici

esecrezionigastrointestinaliepresenzadiossigeno)8.

Così, ilcolonpresentaun’altadensitàbattericaacausadeltransito lentodelmateriale

ingerito,maanchedelbassopotenzialeredoxcaratteristicodiquestotrattoedèdunque

l’unicaporzionediintestinoincuilamicroflorasistabilizzainmanierapermanente.

Viceversa,lapopolazionebattericaèscarsanellostomacoacausadelpHestremamente

acidodell’ambientegastricoedè costituita soprattuttodaLactobacilli, Streptococchi e

Lieviti,cherisiedononellostratodimucosacherivestel’epiteliogastrico.

Ancheilduodenoèscarsamentecolonizzatodallamicrofloraacausadeltransitorapido

delciboingerito,dellasecrezionedeifluidibiliariepancreatici,cheeliminanogranparte

dei microrganismi presenti e dell’effetto dell’attivitàmotoria propulsiva dell’intestino

cheneimpediscelacolonizzazionestabiledellume.

1.1.3.Sviluppoemodificazioni:ilmicrobiotanelneonatoenell’adulto

Lacolonizzazionedeltrattogastrointestinaledapartedelmicrobiotainiziaalmomento

dellanascitaecontinuaconl’avanzaredell’etàfinoacostituireunamicrofloraspecifica

perogni individuo14.Èunprocessocomplesso,chenellesuefasipiùprecocicoinvolge

diversifattorichepossonoverificarsidurantelanascita(es.tipodiparto)oppuredopo

lanascita (es. tipodi allattamento),maancheprimadellanascitae sonocollegati alle

condizionidisalutematerne(es.stresseutilizzodiantibiotici)114.Infatti,sebbeneilfeto

4

siadaconsideraresteriledurante lasuavitauterina, lapresenzadibatterinel liquido

amniotico, nella placenta o nel sangue contenuto nel cordone ombelicale suggerisce

l’esistenzadiunatrasmissionemadre‐fetodicommensaliancheintalefase111‐113.

Dunque, anche il tipodiparto influenzanotevolmente la composizionedelmicrobiota

dei neonati, ovvero i nati con parto naturale hanno una flora simile a quella vaginale

materna15,mentrequellinaticonpartocesareohannounaflorasimileaquellacutanea

materna16,presentandounridottonumerodiBacteroideseBifidobatteri,edunnumero

maggiorediClostridi.

Unaltrofattoredeterminantenellosviluppodellafloraintestinaleduranteilprimoanno

divitadelneonatoèlamodalitàdialimentazione:nelneonatoallattatoalsenolafloraè

costituitaprevalentementedaBifidobatteri18, la cui crescitaèpromossadai complessi

oligosaccaridipresentinellattematerno,mentrenellafloradelneonatonutritoconlatte

artificialepossonoesserepresentispessoanchespeciepotenzialmentepatogenecome

Escherichiacoli eClostridiumdifficile, normalmente controllatedagli elementipresenti

nellattematerno,comelattosio,glicoproteine,glicolipidieoligosaccaridi17.

Neiprimitreannidivitasiverificauncambiamentocostantedelmicrobiota,cheriflette

unafineregolazionedell’espressionegenicaall’internodellostesso115.Successivamente

laflorabattericarimanesostanzialmentestabile,sebbenepossanoverificarsicomunque

dellevariazioniinessa,adesempioaseguitodiuncambiamentodelleproprieabitudini

alimentariodell’insorgenzadipatologie.

1.1.4.Funzioni

Lamicrofloraintestinalesvolgediversefunzionichecontribuisconoalmantenimentodi

unostatodisalutebuonodell’individuo,tracuiquellemetaboliche,troficheedidifesa

edhaunruolo importanteanchenellaregolazionedell’immunitàedell’infiammazione

sistemica19.Perquantoriguardal’attivitàmetabolica,ènotochelafloracontribuiscealla

produzionedellevitamineKeB12,dellabiotinaedell’acidofolico,oltreadintervenire

nelmetabolismodegliacidibiliariedellabilirubina,andandoaformaregliacidibiliari

secondarimediantedeconiugazioneedeidrossilazionediquelliprimari.

Ilmicrobiotapartecipaanchealprocessodifermentazionesaccarolitica,tramiteilquale

ipolisaccaridinondigeribilicomecellulosa,gommeepectinesonoconvertitiinsostanze

volatili(es.anidridecarbonica)eacidigrassiacatenacortaoSCFA(es.acidopropionico

5

eacidobutirrico).GliSCFAmiglioranol’assorbimentodicalcio,magnesioeferro,sono

fondamentalinelmantenereun’acidificazioneottimaledelpHintestinale,checostituisce

unefficientesistemadidifesacontroipatogeni20,elaloroproduzionestimolalacrescita

elaproliferazione/differenziazionedellecelluleintestinaliepiteliali.L’acidobutirricoè

laprincipalefontedienergiadellecelluleepitelialidelcolonehaun’azioneantitumorale

(modulandolacrescitaedifferenziazionenellelineecellularitumoraliepitelialiinvitroe

favorendoilritornoadunfenotipononneoplastico,attraversoilbloccodell’espressione

dellacicloossigenasi‐2el’induzionediapoptosiinadenomiecarcinomadelcolon21‐22).

Perquantoriguardal’attivitàdidifesaedimodulazionedelsistemaimmunitario,laflora

residentecostituisceunavalidalineadiresistenzaallacolonizzazionedapartedibatteri

esogeni,indirettamente,competendoperilorositidiattaccosull’orlettoaspazzoladelle

celluleepitelialiintestinaliedirettamente,producendosostanzeantibatteriche23.

Sistemaimmunitarioemicrobiotasonoinperenneequilibriotraloro:quandolamucosa

intestinaleinnescailsistemaimmunitarioinnatotramiteiToll‐likereceptorsoTLR,che

riconosconoeleganovariemacromolecolemicrobiche(es.lipopolisaccaride,flagellinae

peptidoglicano),sudiessasiavviaunacascatadisegnalicheportanoallaproduzionee

alrilasciodipeptidi,citochineefagocitichecontribuisconoalladifesadell’organismo.

Èutilequindicheilsistemaimmunitariointestinalenonreagiscainmodoincontrollato

almicrobiota,cosìdascongiurarelapossibilitàdisvilupparemalattieautoimmuni.

Lostudiodelmicrobiotaedelruolochericoprenell’ambitodellasaluteumanahaspinto

iricercatoriacercaredimodificarequestomicrohabitat,tramitel’utilizzodiantibioticio

lavariazionedelladieta,masoprattuttolasomministrazionedibatteriprobiotici.

1.2.Probioticieprebiotici

1.2.1.Probiotici:definizioneefunzioni

Iltermineprobiotico,cheèstatoconiatodaLillyeStillwellnel196528,nascedall’unione

della preposizione latina pro (“a favore di”) e dell’aggettivo greco βιωτικός (“biotico”)

contenenteilsostantivoβίος(“vita”)116,pertantoessosignifica“afavoredellavita”.

InbasealladefinizionedelricercatoreingleseFullerdel1989,l’OMSdefinisceprobiotici

tutti“queimicrorganismiviventiche,sesomministratiinquantitàadeguate,esercitano

uneffettopositivosullasalutedell’ospiterafforzandol’ecosistemaintestinale”24‐26.

6

Ilprimoateorizzaresuunruoloprotettivodeibatteriviviassunticonladietafuilrusso

EliMetchnikoff,premioNobelperlamedicinanel1908proprioperquestascoperta:egli

studiòlavitaeleabitudinialimentarideipastoricaucasici,enotandoquantofacessero

largousodilattefermentato,vollevalutareisuoieffettibeneficisullasaluteumana.

Iprobioticiperesseretalidevonorispettarecerteproprietà,ovverodevonoessere:

sicuriperl’impiegonell’uomo;inEuropaunutileriferimentoinquestosensopuò

essere la lista delle specie batteriche qualificate presuntivamente come sicure

dall’AutoritàEuropeaperlaSicurezzaAlimentareoEFSA,ossiachenonrisultano

portatricidiantibiotico‐resistenzeacquisitee/otrasmissibili;

attivievitalialivellogastrointestinale,inquantitàtalidagiustificareglieventuali

effettibeneficiosservatiinstudidiefficacia;

ingradodipersistereemoltiplicarsinell’intestinoumano,ossiadevonoresistere

all’elevataaciditàdeisucchigastrici,pancreaticiedellabile;

capacidiconferirebeneficifisiologiciosservatitramitestudieffettuatiseguendo

lelineeguidadettatedellaFAO/OMS.

SullabaseditalicaratteristichesonoconsideratimicrorganismiprobioticiiLactobacilli

(es.Lactobacillusacidophilus,casei,lactisebulgaricus)eiBifidobatteri(es.Streptococcus

thermophiluseBifidobacteriumbifidum)29.

È inoltre importantesottolinearecomeglieffettibiologiciprodottidaiprobioticisiano

ceppo‐specifici,tantochel’utilizzodiunnuovoceppobatterico,ancheseappartenente

adunaspeciegiàimpiegata,richiedeunanuovavalutazionedellasicurezzaedefficacia.

Nelsuoinsiemelaclassedeiprobioticisvolgemolteedimportantifunzioninell’ambito

delmantenimentodiunostatodisalutebuonodell’individuo27.

Innanzitutto,poichéiLactobacillisonoingradodiconvertireil lattosioinacidolattico

(fermentazionelattica),laloroassunzionepuòaiutaregliindividuiintollerantiaquesto

zuccheroadigerirnepiùdiquantoriuscirebberoaltrimenti117.Questoeffettobeneficoè

possibilegraziealrilasciodapartediquestibatteridell’enzima‐galattosidasi,ingrado

discindereillattosionellesuecomponentipiùdigeribiliglucosioegalattosio.

Comeindicatodamoltemeta‐analisi118‐123,iprobioticibloccanoefficacementeladiarrea

associataagliantibioticioAAD,unacondizionepatologicache,causandoun’alterazione

delmicrobiota,producedeicambiamentinelmetabolismodeicarboidrati,conilridotto

7

assorbimentodiacidigrassiacatenacortaeunaconseguentediarreaosmotica.Questo

processo,inoltre,puòfavorirelaproliferazionedipatogenicomeClostridiumdifficile.

ILactobacillisonopoiconsideratiutiliancheneltrattamentonegliadultidelleinfezioni

sostenutedaHelicobacterpylori, in associazione ai farmaci chevengononormalmente

utilizzatiperlasuaeradicazione;inparticolare,dastudirecentièemersochel’aggiunta

diyogurtcontenentiprobioticiallatriplaterapiaconvenzionale,nonostantelasciiltasso

dieradicazionedelbatterioinvariato,siaingradodiridurrelafrequenzadistomatitee

costipazionecorrelateallasuapresenzanellostomaco124.

Moltepatologiegastrointestinalicomelasindromedelcolonirritabile,ilinfomieanche

l’obesitàtrovanounapossibilecausanell’alterazionedelmicrobiota125,tantodaindicare

comestrategiaterapeuticaadiuvantel’usodeiprobioticiassunticonl’alimentazione126.

Infine,èstatodimostratoinstudidilaboratoriochealcuniLactobacilli(es.Lactobacillus

bulgaricus)hannouneffettoanti‐mutageno,dovutopresumibilmentealla lorocapacità

dilegarsialleammineeterocicliche,prodotteduranteilprocessodicotturadeicibidalle

sostanzecancerogenecontenutenellacarne127.Studisuglianimalihannodimostratoche

alcuniceppidiLactobacillipossonoavereuneffettoprotettivoneiconfrontideltumore

alcolonneiroditori,mentrequellieffettuatisull’uomosonoancorainsufficientiespesso

discorditraloro127.Lamaggiorpartediessihadimostratocheiceppibattericiutilizzati

possonoaveredeglieffettianti‐tumoralimediantelariduzionedell’attivitàdiunenzima

notocolnomedi‐gluconoridasi,chepuògenerarecarcinogenialivellointestinale128.

1.2.2.Prebiotici:definizioneefunzioni

LaFAOdefinisceprebiotico“uncostituentedeglialimentinonvitaleenondigerito,che

conferiscebeneficiallasalutetramiteunamodulazionedelmicrobiotaintestinale”30.

Tralediversesostanzechepossonoessereconsideratedeiprebioticiritroviamolefibre

idrosolubili,‐glucaniefructani,glioligofruttosaccaridioFOS,deiqualiilpiùstudiatoè

l’inulina,eillattulosio.Lalorofunzioneèquellasostenerelacrescitaelaproliferazione

diunaopiùspeciebatteriche“buone”nelcolon,capacidimodularel’equilibrioesistente

nellamicrofloraintestinaleendogena31.

Molticibicheassumiamonormalmentecontengonoprebiotici,comefrumentoegerme

digrano,miele,aglioecipollaelegumi,edinoltre,essisonopresentiancheneiprincipali

alimentifermentaticomeilpane,lapizzaenaturalmenteloyogurt.

8

Iprebiotici,insiemeaglispecificiprobioticipercuirappresentanoilnutrimento,danno

origineai cosiddettiprodotti simbiotici, chedimostranodi solitoun’efficaciamaggiore

rispettoaquelladelleduesostanzeassuntesingolarmente32.

1.3.Cancerogenesidellamucosacolica

1.3.1.Polipiintestinali

1.3.1.1.Definizioneecaratteristiche

Ipolipiintestinalisonoprotuberanzepatologichechesporgononellumedell’intestinoe

chesolitamenteprendonooriginedallamucosasottostante.

Alivellodeltrattogastrointestinalesilocalizzanocomunementenelcolon,mapossono

ritrovarsianchenell’esofago,nellostomacoenelpiccolointestino.

Daunpuntodivistamorfologicopossonoessereditiposessileopeduncolato:nelprimo

casohannounastrutturacupoliformeconnessaaduna largabasedi impianto,mentre

nel secondocasoappaionocome lesioni fungiformi, costituitedauna testapiùgrande

delpeduncolo33.

Istologicamente,invece,ipolipisidividonoinnon‐neoplasticieneoplastici34,35.

1.3.1.2.Polipinon‐neoplastici

Sisuddividonoinpolipiinfiammatori,polipiiperplasticiepolipiamartomatosi.

Ipolipiinfiammatori,comesuggerisceilnome,originanodallecicatrizzazionidilesioni

infiammatorie,sonocostituitidaunacomponenteghiandolare,presenteinproporzioni

variabili,edaunostromainfiltratodacelluleinfiammatorieesonospessoriscontrabili

inpatologieinfiammatoriecronichedell’intestino.

Ipolipiiperplasticisonoipiùfrequenti,sidiagnosticanoprincipalmenteinetàavanzata

(intornoai50anni),hannooriginedaproliferazionisecondariedellamucosaadalterato

turnoverepiteliale/stromaleelalorosedeprimariad’insorgenzaèilcolondistale,dove

appaionocomeescrescenzedidimensioneinferioread1cm.

Èopportunosottolinearecheipolipiiperplasticinonsonolesioniprecancerose,tuttavia

possonodiventarlesecompaionosudiessifocidiatipiacitologicaestrutturale.

9

Sirealizzacosìil fenotipomistoiperplastico‐adenomatoso,chepuòevolvereinseguito

inadenocarcinoma.

Ipolipiamartomatosi,infine,possonoesseresporadicioassociatiasindromigenetiche

(es.lasindromediPeutz‐Jegherselapoliposigiovanile)edeivaripolipinon‐neoplastici

sonoquelliaminoreriscontropercentuale.Essiderivanodallaproliferazionedidiverse

componentidellamucosa(es.lemiocellulelisce,iltessutostromaleequelloghiandolare

mucosecernente)ebenchélelorosediprevalentid’insorgenzasianoilcolonel’intestino

tenue,talvoltasonoriscontrabilianchenellostomaco.

Ilrischioditrasformazioneneoplasticadiquestipolipiènulloobasso.

1.3.1.3.Polipineoplasticioadenomi

Ipolipineoplastici,oadenomi,sononeoplasieintraepitelialiditipobenignocircoscritte

allamembranabasale(noninvasive)echederivanodallecelluleepitelialidellecripte36.

Laloroincidenzaaumentaall’aumentaredell’età,tantochesonopiùfrequentidopoi50

anni37,38epossonoessereosservatimediantelacolonscopia,unesamediagnosticoche

consentediidentificareeventualilesioniprecancerose,comeipolipiadenomatosi.

Questotipodipolipihadelledimensionivariabilichevannoda0,3ai10cmdidiametro

esicontraddistingueperunacertaatipiacitologicaestrutturale,ovveropuòpresentare

displasiadigradopiùomenoelevato.Ilrischiodicancerizzazioneaumentainbasealle

dimensioniealgradodiatipiastrutturale.

Ipolipineoplasticidelgrossointestinosiclassificanoinadenomipolipoidiconvenzionali

eadenomipiatti,adenomiserratieadenomiserratisessili.

Gliadenomipiatti,inbaseallaloroarchitettura,sonosuddivisiintubulari,tubulo‐villosi

evillosi,secondounordinedecrescentedifrequenzaecrescentediatipiastrutturale.

Ipolipiserraticondividonolaloroarchitettura“dentellata”conipolipineoplastici,che

caratterizzasoltantolasuperficiediquestiultimi,mentresiestendeatuttalalunghezza

dellaghiandola,compresalacripta,nelpoliposerrato39esilocalizzanoprincipalmente

nelcolonsinistro,alcontrariodeicosiddettipolipiserrati‐sessilichesonolocalizzatipiù

frequentementenelcolondestro.

Gliadenomisonoperlamaggiorpartedeicasiasintomatici,matalvoltapossonocausare

anemiadastillicidioematicooematocheziao,qualorasianodigrandidimensioni,sono

causadidoloriaddominaliepersinodiun’occlusioneintestinale.

10

1.3.2.Carcinomacolo‐rettale

1.3.2.1.Epidemiologiaeprognosi

Ilcarcinomacolo‐rettale(CCR)oadenocarcinomaèunaneoplasiaepitelialemalignache

haderivazioneghiandolareedèmoltofrequenteneipaesioccidentali,doveèiltumore

piùdiagnosticatodopoquellopolmonarenell’uomoequellomammarionelladonna.

Rappresentalasecondacausadimortecancro‐relata40elasuaincidenzadifferiscetrale

diverseareegeografichemondiali,variandodai45casi/100.000/annoinNordAmerica

eAustraliaai3‐6casi/100.000/annoinAsiadelSudeinNord‐Africa,mentreinEuropa

sihaun’incidenzaintermediastimatain36casi/100.000/anno41.

InItaliasistimacheogniannovenganoeffettuatecirca48.000nuovediagnosidiCCRe

che16.000personemuoianoacausadellecomplicanzelegateaquestaneoplasia.

IlCCRcolpisceconunaleggeraprevalenzailsessomaschileelasuaincidenzaaumenta

conl’aumentaredell’età,tantochelamaggiorpartedeicasi,circail90%,èdiagnosticata

dopoi50anni,mentrerisultamoltorarosottoi45anni.

Nell’ultimoquartodisecolo,neipaesiindustrializzati,sièregistrataunanettariduzione

dell’incidenzadiCCRedellamortalitàlegataadesso,cheèdovutamoltoprobabilmente

allapossibilitàdieseguirediagnosipiùprecocigraziealladiffusaadesioneaiprogrammi

discreeningeadunamaggioreefficaciadeitrattamentimediciechirurgici.

Viceversa,neipaesiinviadisviluppo,sirilevauncostanteaumentodicasidicarcinoma

colo‐rettale,nonostantelasuaincidenzarimangaglobalmentepiùbassa.

LaprognosidelCCRèinfluenzatadallostadioraggiuntodallamalattiaalmomentodella

diagnosi,tantochelasopravvivenzaglobalea5anniinpazientiaffettidaquestotumore

neipaesiindustrializzatièdel65%inmedia129,considerandochelamaggiorpartedelle

diagnosiavvieneallostadioIIIdellamalattia.Èquindichiarocheunadiagnosiprecoce

puòincidereinmododeterminantesull’esitodiuneventualetrattamentochirurgicoe/o

terapeuticoepiùingenerale,suldecorsodellamalattia.

1.3.2.2.Eziologiaefattoridirischio

Lamaggiorpartedeicarcinomicolo‐rettali (oltre90%)èdioriginesporadica,mentre

circail5%èditipoereditario42edinsorgenelcontestodivariesindromigeneticamente

determinate(es.lasindromediLynchelapoliposiadenomatosafamiliare)43,44.

11

Nonostantel’eziologiadeltumoredelcolon‐rettosiaancorasconosciuta,ilsuocarattere

multifattorialesuggeriscechefattoriambientaliesuscettibilitàgeneticapossanoavere

unruolopreponderantenellagenesidiquestotumore.

TraifattorifavorentilosviluppodelCCRritroviamounadietariccadigrassianimalie

poveradifibre,incuiadesempiosihaunconsumoeccessivodicarnirosse,soprattutto

selavorate45,unostiledivitasedentario,l’obesità46,ilfumodisigaretta47,unconsumo

eccessivodialcool48,lapresenzadidiverticolidelcolonoppuremalattieinfiammatorie

cronicheintestinali.Aquestifattorivaaggiuntoquelloforsepiùimportante,ovverol’età

avanzata,siaperl’aumentodellafrequenzadeipolipidelcolonesiaperillungoperiodo

diesposizioneacancerogeniambientalichelacaratterizza.

Traifattoriprotettivi,invece,ritroviamounadietariccadifruttaediverdura,l’attività

fisicamoderataeregolare,einoltre,comeèstatodimostratorecentemente,l’assunzione

giornalieradibassedosidiacidoacetilsalicilico(ASA)perlunghiperiodi(ovveroalmeno

6anni)odifarmacianti‐infiammatorinonsteroidei(FANS)49,50.

1.3.2.3.Storianaturaleealterazionimolecolari

Nelcorsodeglianninumerosistudihannodimostratoche,solitamente,lacarcinogenesi

del carcinomacolo‐rettaleèunprocessomultistepprogressivo,definitogeneralmente

“sequenzaadenoma‐carcinoma”51.

Ilprocesso,secondounmodellosequenzialeipotizzatoperlaprimavoltadall’americano

Vogelsteinnel1988,prevedeunafasedi“iniziazione”,nellaqualesihalatrasformazione

dell’epitelionormaleinadenoma,seguitadaunafasedi“promozione”conl’evoluzione

daadenomaacancro52.

Comesièdetto,gliadenomicostituisconoiprecursoridelCCR,tuttaviasoloil6%circa

degliadenomidegeneraincarcinomaeciòdipendedadiversifattori,tracuilavariante

istologicadeipolipiadenomatosi,ledimensioni(semaggioridi2cm)edilnumerototale

deipolipi,direttamenteproporzionalealrischioditrasformazione.

Ognitrasformazioneèconseguenzadell’accumulosequenzialedialterazionigenetichee

epigenetiche,cheagisconosuigenioncosoppressori,oncogenie/osuigenichesvolgono

unruolochiavenellariparazionedelDNA53.Nellospecifico,lealterazionigenetichesono

riconducibilinellatotalitàdeicasiadun’instabilitàcromosomica(CIN),adun’instabilità

deimicrosatelliti(MSI)eadun’instabilitàdelleisoleCpG(CIMP)54.

12

LaprimacausadiinsorgenzadelCCRfamiliareesporadicoèl’instabilitàcromosomica

(CIN),caratterizzatadaunamodificazionequantitativa(dettaaneuploidia)efunzionale

delDNA55,soprattuttoacaricodeigeniAPC,KRAS,SMAD4ep53.

L’eventoprecoceinizialedella“sequenzaadenoma‐carcinoma”èlamutazionedelgene

oncosoppressoreAPC,ilqualeinibiscela‐catenina,coinvoltanellaviadisegnalazione

intracellulareWNT.LaperditadifunzionediAPC,causatadallamutazionedientrambi

gliallelidelgenesulcromosoma5,provocal’accumulointracellularedi‐catenina,che

traslocandonelnucleo,attivalatrascrizionediqueigenipromuoventilaproliferazione

cellulare(es.c‐MYCeciclinaD1).

Nellapoliposiadenomatosafamiliare(FAP),adesempio,cioèunapatologiaautosomica

dominante,unamutazionediAPCprovocalosviluppodicentinaiadipolipiadenomatosi

nelcolon‐rettosinodallatardainfanzia,colrischiodievoluzioneinCCRinetàgiovanile

del100%(a30‐40anni).

KRASèunoncogenelacuimutazione,presentenel40%degliadenomiecarcinomi56,si

riscontranellafaseinizialedellaconversionedaadenomaacarcinoma.Èunamutazione

deltipo“gainoffunction”,cioèlaproteinaGTPasicodificatadalgeneKRASrimanenello

statoattivatoepromuovelaproliferazionecellulare57.

SMAD2eSMAD4sonoduegenioncosoppressoriche,diversamentedaKRAS,mostrano

unamutazioneditipo“lossoffunction”,cioèperdonolalorocapacitàinibitoriasulciclo

cellularedeterminandounacrescitaautonomaincontrollatadellacellulatumorale.

Infine,TP53èungeneoncosoppressorechecodificaperlaproteinap53, il“guardiano

delgenoma”,perilsuoruolochiavenelprevenireidannialDNA,mediantel’attivazione

dellasuariparazioneol’induzionedell’apoptosinellacellula.

Questotipodimutazione, tardivaerilevantenella fasedi trasformazionedaneoplasia

non‐invasiva,oNIN,dialtogradoacarcinomainfiltrante,èpresentenellamaggiorparte

deicarcinomi(inpiùdel60%),mentreèraranegliadenomi58.

L’instabilitàdeimicrosatelliti,ossiasequenzediuno,dueotrenucleotidiirregolarmente

dispersenelDNAesuscettibiliaerroridurantelareplicazione,ècoinvoltanellosviluppo

del15%deiCCRsporadiciedioltreil95%delleformeereditarieassociatiallasindrome

diLynch(HNPCC).Allabasediquestainstabilità,cheportaadunincrementodelrischio

dimutazioni,vièundeficitnelsistemadelmismatchrepairdelDNA(MMR),uninsieme

digeni(hMLH1ehMSH2)chepreservalastabilitàdelDNAdurantelaricombinazionee

lareplicazione,evitandol’erratoappaiamentodeinucleotidi.

13

ICCRcheoriginanodall’instabilitàdeimicrosatellitisonopiùfrequentementelocalizzati

nelcolondestroepresentanountipicoistotipomucinoso(omedullare),coninfiltrazioni

linfocitarieperitumoralieintratumorali59.

NelcasodellaHNPCC,unasindromegeneticaautosomicadominantecheinsorgeinetà

precoce(primadei50anni),conlosviluppodidiverseneoplasiemaligne,lamutazione

chenecausal’insorgenzariguarda,nel40%deicasi,hMLH1enel45%,hMSH2.

L’ipermetilazionedelleisoleCpG,presentisuipromotoridialcunigenioncosoppressori

edell’oncogeneBRAF,provocailsilenziamentodell’espressioneditaligeniedilCCRche

sisviluppaquandoquesteisoleCpGdivengonoinstabiliderivadapolipiserrati,secondo

unaprogressionecheapartiredalpolipoiperplasticoepassandoperl’adenomaserrato

portaall’adenocarcinoma60.

LamutazionediBRAF,inparticolare,avvieneprecocementenel“pathwayserrato”epuò

essereriscontratanel90%deiCCRchesisonoevolutidaadenomiserratisessili,mentre

nonèquasimaipresentenegliadenomiconvenzionali.

L’infiammazionecronicahaunruolofondamentalenell’iniziazioneenellaprogressione

delCCR.QuestaosservazioneèsupportatadallaforteassociazionetraIBDeCCRedalla

scopertadeglieffettipositivialungoterminedifarmacianti‐infiammatorinonsteroidei

(FANS)edell’aspirinanellaprevenzionedellaneoplasia61,62.

Traimeccanismidell’infiammazionechepredispongonoall’insorgenzadiCCRtroviamo

l’attivazionedeisistemianti‐apoptoticichestimolanolaproliferazionecellulare,idanni

alDNAmediantelaproduzionedispeciereattivedell’ossigeno(ROS)edispeciereattive

dell’azoto(RNS),laproduzionedifattoridicrescitaedicambiamentidiconformazione

dellemembranechefacilitanol’invasioneel’adesionecellulare63‐65.

1.4.Relazionetramicrobiotaetumoredelcolon‐retto

Unarelazionetrailmicrobiotaintestinaleeitumoridelcolon‐rettoèstataipotizzatapiù

volte,soprattuttoperilfortelegameesistentetraquestotipodineoplasiaeladieta.

Nel1975,Reddyeisuoicolleghi,scoprironochel’incidenzadiCCR,parial20%neitopi

trattatichimicamentealloscopodifarsviluppareloroiltumore,toccavail93%inquelli

convenzionalinontrattati66.

Studiepidemiologicieffettuatiinpassatohannotentatodimettereafuocoledifferenze

cheesistonoalivelloqualitativotralafloraintestinaledellepopolazioniadaltorischio

14

diinsorgenzadiCCRequelladellepopolazioniincuiquestorischioèridottoedèstato

mostratoilpossibileruolonellacancerogenesidialcunespeciebatteriche,contrapposte

adaltrespecieassociate,invece,adunridottorischiodiinsorgenzadellaneoplasia67.Lo

sviluppodimetodichedibiologiamolecolaresemprepiùefficaciharesopossibileuno

studiosicuramentepiùapprofonditodelmicrobiotaedellefunzionichesvolge,tuttavia

lacaratterizzazionedeiprocessitramiteiqualiimicrorganismisarebberocoinvoltinella

cancerogenesiètuttoradifficile,siaacausadellacomplessitàedelladuratadell’intero

processodi sviluppodei tumori siaper la grandeeterogeneitàdelmicrobiota.Questo

rendeancoradifficileeseguirestudicliniciinvivo,elamaggiorpartedeidatidisponibili

ariguardoderivadasistemisperimentalie invitro,voltiavalutareglieffettidialcuni

specificibatteri.Quellichesiottengonosonorisultatimoltocontrastanti,dalmomento

chealcunimostranounruolopro‐carcinogeneticodelmicrobiotaealtrineevidenziano

unodiametralmenteopposto.

1.4.1.Ruolopro‐carcinogeneticodelmicrobiota

Imicrorganismiintestinalipotrebberofavorirel’insorgenzadelleneoplasieinduemodi

diversi:unprimomeccanismoimplical’attivazionedelleviedisegnalazionechepassano

periTLR,portandoadun’infiammazionecronicadellamucosacheèlegataasuavolta

adunaumentodelrischiod’insorgenzadelcancro,comenelcasodeicarcinomiassociati

alleIBD.Unsecondomeccanismocoinvolgeinveceleattivitàmetabolichedelmicrobiota

intestinale,capacediprodurredelletossineconuneffettopro‐carcinogeneticodirettoo

enzimiingradodiattivareicarcinogeniingeriticonladieta.

1.4.1.1.Microbiotaedinfiammazione

Lacorrelazionetrainfiammazioneecancerogenesièbennota68‐70esembraaddirittura

chefinoal15%deitumorinell’uomosiaassociatoall’infiammazione71.

Nelcolon,unesempioditalecorrelazioneèdatodalcolitis‐associatedcancer(CAC),che

insorgeinpazientiaffettidaIBD:intalcaso,l’infiammazionecronicaprecedelosviluppo

deltumore,emediantelaproduzionediROSediRNS,inducemutazioniedannialivello

delDNA,checontribuisconoallatrasformazioneneoplasticadell’epitelio.NelCCRditipo

sporadicoèinvecepiuttostodifficilechel’infiammazionepossacostituireilsoloevento

15

scatenante,mentreèpossibileche,tramiteidannialDNAchecausa,possacontribuire

all’accumulodellealterazionicheinnescanoilprocessoneoplastico72.

Comeabbiamovistoinprecedenza,ilmicrobiotasvolgeimportantifunzioniimmunitarie

emetaboliche ed interviene nel controllo delle vie di trascrizione di alcune citochine

infiammatorie. In condizioni normali vi è un equilibrio tra la produzione di citochine

anti‐infiammatorie, come IL‐10, epro‐infiammatorie, come IL‐17,mentre le variazioni

delnumero,delladiversitàestabilitàdeibattericommensali,einparticolaredelgruppo

deiClostridi,possonoprodurreunospostamentodiquestoequilibrioversounfenotipo

aggressivopro‐infiammatorio.Questaaumentataproduzionedicitochine,tracuicisono

TNF,IL‐1eIL‐17,insiemeall’attivazionedeiTLRadoperadialcunipatogeni,produce

l’attivazionedellacascatadiNF‐kB,unfattoreditrascrizionedivarigenianti‐apoptotici

(comeBcl‐2eBcl‐xL)che,tramitel’aumentodellaproliferazionecellulareedeiprocessi

diangiogenesi,èingradodisostenerel’oncogenesi73,74.

L’influenzadeicommensalisull’infiammazioneelacancerogenesièdimostratadaalcuni

studisuitopiincui,incondizionigerm‐free,l’infiammazioneintestinaleelaformazione

ditumorisonorisultatesignificativamenteridotterispettoadanimalipostiincondizioni

dinormalità75, 76. Inoltre,questitopigerm‐freepresentavanounaltonumerodicellule

naturalkiller, linfocitiBeTcitotossicinelsangueperiferico, indicatividiunamigliore

rispostaimmunitaria.

Questistudiconfermanoilruolodelmicrobiotaneiprocessiditrasformazioneinsenso

neoplastico,anchesenontuttiibatteriinclusiinessosembranoaverelastessacapacità

dicausaretalipatologie.

1.4.1.2.Microbiotaeattivazionedeipro‐carcinogeni

Lacapacitàmetabolicadelmicrobiotaintestinalerisultafondamentalenell’attivazionee

nelladetossificazionedegliagenticarcinogeni,tuttavia,essoesprimeanchemoltienzimi

(come‐glucosidasi,‐glucuronidasi,nitroreduttasiealcooldeidrogenasi),direttamente

coinvoltinellosviluppodicerteformeneoplastiche.

Iprimistudichehannopermessodidimostrarequestocoinvolgimento,sonostatifatti

sudeitopigerm‐freechenonsviluppavanotumoriintestinaliinseguitoall’esposizione

aduncertocarcinogeno,maneiqualitalineoplasieinsorgevanoquandoitopivenivano

espostidirettamentealsuometabolitaattivo,generatodall’azionedella‐glucosidasi77.

16

Le‐glucosidasisonoenzimiappartenentiallaclassedelleidrolasi,checomesuggerisce

ilnome,idrolizzanoillegameglicosidicopresenteneicarboidrati,liberandoinogniciclo

catalitico,degliagliconi,alcunideiqualipossonoaveredeglieffettitossici.

Anchela‐glucuronidasi,unenzimaespressosoltantodaalcunibatteri(es.Clostridi)ha

uneffettonegativosull’insorgenzadeitumoriedineffetti,incampionidifecidipazienti

conCCRsonostatirilevatideivalorisignificativamentepiùelevatidiattivitàdiquesto

enzimarispettoasoggettisani78;tragliagenticarcinogeniattivatidalmicrobiotaelegati

probabilmenteall’attivitàdella‐glucuronidasivisonoalcuneamineeterocicliche,come

la2‐amino‐3metil‐imidazo[4,5‐f]chinolina(IQ),chesisviluppanoduranteilprocessodi

cotturadellacarnerossa(unfattoredirischionotoperilCCR).Questicompostiattivati

sonoingradodiformareaddottialDNAediaverequindiuneffettomutageno79,80.

Unulteriorepossibilemeccanismodicancerogenesicorrelatoalmicrobiotacoinvolgela

sintesidirettadisostanzemutagene,comeifecapenteniprodottidaiBacteroides, iROS

prodottidaEnterococcusfaecalis83,84oilsolfurodiidrogenoprodottodaimicrorganismi

solfato‐riducenti,cheprovocanodannialDNAeinduconotrasformazioneneoplastica.

Interessanteèl’osservazionechealcunicommensalicomeiBifidobatterieiLactobacilli

hannoinveceunruolooppostosuquestiagentiedantagonizzanoiloroeffettimutageni

inattivando,forse,glienzimiolegandodirettamentel’agentecarcinogenoIQ81,82.

1.4.2.Ruoloanti‐carcinogeneticodelmicrobiota

Negliultimianniglistudiscientificisisonorivoltispecialmenteversoilruoloprotettivo

cheimicrorganismisvolgononelcontrollodeiprocessiintrinseciepiteliali.

Lacomplessainterazionechec’ètraladieta,ilnormalemicrobiotaintestinaleelasalute

hapromossolosviluppodistrategie,comel’usodeiprobiotici,chepotesseropermettere

lacrescitaselettivadialcunimicrorganismiadazionebenefica.

Nonostantenonvisiaancoraunconsensounanimesulruolodefinitodeiprobioticinella

prevenzionedelCCR,èriconosciutochealcuniceppipossonoaveredeglieffettibenefici

sulleattivitàmetabolichedeltrattogastrointestinaleechepossonostimolarelarisposta

immunitariadell’ospite.

Imeccanismimedianteiqualiiprobioticieiprebioticisarebberoingradodicoadiuvare

laprevenzione/terapiadeitumorigastrointestinalinonsonostatiancorachiariti,anche

esoprattuttoinconsiderazionedelfattocheilmicrobiotapuòinterferireadiversilivelli

17

nellasequenzaadenoma‐carcinoma:nellasuafaseprecocediiniziazione,alcunespecie

batteriche,siadirettamenteacausadiunamaggiorefitnesssiaindirettamentemediante

lacompetizioneconaltrespeciepericolose,sonoingradodiridurre laconcentrazione

dellemolecolecarcinogenetichenellumecolico.Inunostadiopiùtardivo,icommensali

potrebberocontrollarelaproliferazionedellecelluledisplasticheregolandoeinducendo

l’apoptosi,siadirettamenteconlaproduzionedimolecole(es.SCFA)siaindirettamente

tramitelastimolazionedelsistemaimmunitario.

L’apoptosièuncomplessoprocessomultistepimportanteperl’omeostasidellamucosa

intestinale.Inquestacascatadisegnaliintracellulari,cheportaallamorteprogrammata

dellacellula,sonocoinvoltevariemolecole,tracuilecaspasi,chehannounruolochiave.

Nellafaseinizialedellacascataintervienelacaspasi9,dettacaspasiiniziatrice,laquale

attivadiversecaspasieffettrici(es.caspasi3)cheagiscononellefasifinali.Unaperdita

diefficaciaditaleviadisegnalazioneporterebbeadunmalfunzionamentodelprocesso

apoptotico,conproliferazionecellulareincontrollata,finoallatrasformazionemaligna.

In lineaconquesteconsiderazioniè ilmodellosperimentalemessoapunto invivo sui

topiedescritto inunostudiopubblicatorecentemente85: i topi, trattati conunregime

terapeuticoabasediquattroantibioticiingradodieliminarepartedellaloromicroflora

intestinale,mostravanounariduzionedell’apoptosirispettoaicontrolli.Questirisultati

eranoconfermatidaunsecondostudioinvitro,incuideicampionidimucosaintestinale

incubaticonspecieprobioticheeestrattifecalipresentavanounamaggioreespressione

digenipro‐apoptotici(caspasi3e9),deglistessicampioninontrattaticoiprobiotici85.

Alivellointraluminale,iprobioticiprevengonolacolonizzazionedellamucosadaparte

deibatteripatogenimedianteunmeccanismodiesclusionecompetitivachesirealizza

conilconsumodinutrienti,lasaturazionedeisitidiadesione,laproduzionedisostanze

antimicrobicheelastimolazionedell’organismoospiteasintetizzarneasuavolta,come

defensine,catelicidineelectineditipoC86.

Inoltre,iprobioticipossonoinibirel’azionedeglienzimibattericidellamicroflora,iquali

sonoresponsabilidell’attivazionedipro‐carcinogeni,comeazoreduttasi,nitroreduttasi

e‐glucosidasi87,88opossonoinattivaremutageniecarcinogeni,legandosidirettamente

adessieprevenendocosìlalorointerazioneconlecelluledelcolon.

LaproduzionedegliSCFAapartiredaicarboidratinondigeribilièunaltromeccanismo

tramitecuiilmicrobiotasvolgeun’azioneanti‐carcinogena.GlieffettibeneficidegliSCFA

sonostatirivelatidastudiincuipopolazioniconunabassaincidenzadipolipicolorettali

18

eCCR(es.africane)hannomostratoun’altaconcentrazionediSCFAnellefeci89,90.

TragliSCFA,quellomaggiormentedotatodiazionianti‐carcinogeneèilbutirrato,cheè

prodotto principalmente a livello del colonprossimale, dovedeterminauna riduzione

delpH,favorendocosìlacrescitadiceppidiLactobacilliacido‐resistenti.

Alcunistudihannodimostratocheilbutirratoinibiscelaproliferazionecellulare,induce

l’apoptosidellecelluletumorali91,92; inoltre,essopuòridurrel’espressionedell’enzima

cicloossigenasi(oCOX‐2)nellelineecellularitumorali93,94ediindurrequelladiunaltro

enzima,laglutatione‐s‐transferasidell’ospite,adazionedetossificante.

Rilevantisonoancheglieffettisulsistemaimmunitario,sucuiiprobioticisonoingrado

diesercitareun’attivitàimmunomodulatoria,graziealriconoscimentodicertemolecole

presentisullalorosuperficie,ipathogen‐associatedmolecularpatterns(PAMP),daparte

deirecettoriTLR2eTLR9,inparticolarmodo.Ilsegnaleintracellularecheneconsegue

stimolalaproduzionedicitochineingradodicoordinarelespecificherispostedicellule

infiammatorieediregolarel’attivitàdiquelleimmunocompetenti95‐99.

Studirecentihannodimostratochel’enzimaCOX‐2èimplicatonellosviluppodelleIBDe

delCCR100:perl’induzioneditaleenzimaènecessarial’attivazionediTLR4,unrecettore

associatoalCAC101,102,inoltre,un’iperespressionediTLR4,rilevatanelcolondipazienti

affettidaIBDedinmodellisperimentalidicolite,stimolal’attivazionediNF‐kB,ilquale

asuavoltainducel’espressionediCOX‐2103.

Unostudio,inparticolare,haevidenziatochediversespeciediprobioticisonoingrado

diinibirel’attivazionediNF‐kBlegataaTLR4,eciòpotrebbedeterminareunariduzione

dell’espressionediCOX‐2103.

1.4.3.Modifichealivellodell’ospite

Unadellestrategieutilizzatedall’ospiteperproteggereilmicrobiotaconsistenelridurre

icontatti tra lasuperficieepitelialeed imicrorganismi, limitandocosì l’infiammazione

tissutaleelatraslocazionedeigermipotenzialmentepatogeni.Questastrategiaèattuata

grazieall’azionedi celluleepiteliali,muco, immunoglobulineA,peptidiantimicrobicie

celluleimmunitarie,definitinelloroinsiemecome“mucosalfirewall”104.

Ilmuco,inparticolare,vieneprodottodallecellulecaliciformimucipareecostituiscelo

scudoprimariocontroibatteripatogeni.Inoltre,tuttelecelluleepitelialiintestinalisono

in grado di produrre peptidi antimicrobici capaci di attaccare la membrana cellulare

19

battericaedistruggerla105.Tratuttiquestipeptidi,unruolofondamentaleèsvoltodalle

defensine, componenti essenziali del sistema immunitario innato dell’ospite, che sono

sintetizzateesecretedacellulecostantementeesposteaibatteriambientali;ledefensine

presentanoresiduicarichipositivamente,ingradodilegarsiallemembranedinumerosi

batteri(soprattuttoGRAM‐)edidistruggerle,esercitandocosìun’azioneantibatterica.

All’internodellalorostrutturacontengono6residuidicisteinaedinbaseallaposizione

deiresiduisonoclassificateinduegrandifamiglie,le‐ele‐defensine.Le‐defensine

sonopiùabbondantinellecelluleepitelialipolmonari,cutaneeedurogenitali,mentrele

‐defensinesonosintetizzatedaineutrofili(HNP1‐4)edallecellulediPanethintestinali

(HD‐5eHD‐6).Incerticasi,questemolecolevengonoespressecostitutivamente,mentre

inaltricasiènecessarial’attivazionedipatternrecognitionreceptors(PRR)perlaloro

produzione.IPRRsonodeirecettoridimembranapresentisullasuperficiedellecellule

epitelialidellamucosa,capacidiriconosceredeglispecificiantigenipresentisuibatteri

patogeni.InquestogruppodirecettoritroviamoiTLR,perilriconoscimentodimolecole

extracellulariediNod‐likereceptors(NLR),perquelleintracellulari.

Comedettoprecedentemente,gliantigenichevengonoriconosciutisonodefinitiPAMPe

includonoillipopolisaccaride(LPS),ipeptidoglicani,ilipidi,elelipoproteine.Illegame

deiPAMPconiPRRprovocal’attivazionedifattoriditrascrizione(es.NF‐kB)cheinduce

laproduzionedicitochinepro‐infiammatorieel’attivazionedeiLinfocitiT.

L’espressionedelle‐defensineHD‐5eHD‐6potrebbeaumentareinrispostaadalcuni

stimoliinfiammatori,comeavvienenellemalattieinfiammatoriecronicheintestinali106.

Interessante è risultato il riscontro di un aumento della quantità di‐defensine nella

mucosa,nelsieroenelle fecidipazientiaffettidaCCR, tantodaesserepropostocome

metodicadi screeningprecoceper il tumore107‐110.Nonèancorachiaro ilmeccanismo

allabasediquestavariazionedellaquantitàdi‐defensine,maèpossibilecheessasia

direttamentecorrelataconlaproliferazionedicelluledisplasticheeconseguentemente

conlalorotrasformazioneinsensoneoplastico.

1.5.Metodidistudiodelmicrobiota

Attualmente sono disponibili moltemetodologie di studio del microbiota umano, che

vannodaapproccipiùtradizionali,comequellicolturali,atecnologiedisequenziamento

delDNAdinuovagenerazione.

20

L’avventoditecnichedibiologiamolecolaresemprepiùefficaci,inparticolare,haaperto

nuove“strade”inquestosettoredellaricerca,facendoaumentaresemprepiùl’interesse

deiricercatoriperilmicrobiotaumano.Ciononostante,consideratalavarietàditecniche

adisposizione,èfondamentalecomprendereivantaggiintrinseciedilimitidiciascuna

diesse,cosìdaconsentirelasceltadellapiùadattadautilizzare.

1.5.1.Metodiclassici

1.5.1.1.Coltureinbatch

Perpiùdiunsecoloimicrobiologihannoutilizzatodellemetodichecolturalitradizionali

inlaboratorio,checonsentonodiisolareestudiaresingolecoloniebatterichealloscopo

didescriverelelorocaratteristichefenotipicheelelorocapacitàmetaboliche.

Grazieaquestotipodiapproccioèstatopossibilecoltivareoltre1000speciebatteriche

distinte,isolatedalsolotrattogastrointestinaleumano130.

Laformapiùsemplicedicoltivazionebattericaconsistenell’incubarecampioniosingoli

ceppidiunaspeciediinteresseinunterrenodicolturacompleto,ossiacontenentetutte

lesostanzenutrientiperquelbatterio,oselettivo,ovveroprivodiqualchenutriente(che

consenta,appunto,laselezionedeiceppiingradodisopravvivereancheinsuaassenza).

Questotipodicolture,definiteinbatch,permettonoairicercatoridiparagonaregruppi

battericidiinteresse,sullabasedeilorotassidicrescitaedellaproduzionedimetaboliti

sudiversisubstratioancora,delleinterazionispecie‐specifichechesiformano131.

Moltibatteridelmicrobiota,adesempio,sonoanaerobiobbligati,perciòpossonoessere

rallentatinellacrescitaoeliminatideltuttofornendoossigenoallecolture132opossono

esserefavoritinellacrescitaeffettuandolalorocoltivazioneincamereanaerobiche133.

Inoltre,lacoltivazionedispeciebattericheintestinaliparticolarmenteesigentidalpunto

divistanutritivopuòessereottimizzatautilizzandoterrenicontenentifluididibovinoo

estrattidifeciomiscelediacidigrassiacatenacorta134,135.

Lecoltureinbatchpresentanoovviamentedellelimitazioni:innanzitutto,irisultatisono

ottenibilisoloperbreviperiodiditempoecomunquefinoadesaurimentodellesostanze

nutritivepresentinelterrenodicolturaoallaformazioneinessodisottoprodottitossici

perlespeciebatterichediinteresse,chenelimitanolacrescita136.Inoltre,l’allestimento

diunacolturabattericapuòessereanchemoltocostoso,poichépuòrendersinecessario

21

l’utilizzodimoltiterrenidicolturadifferenti,perrecuperareilnumeropiùaltopossibile

dispeciebattericheall’internodiuncampione.

1.5.1.2.Colturecontinue

Unmetodopiùsofisticatodicolturabattericaconsistenell’usodisistemidefinitiapertio

incontinuo,comeifermentatori:diversamentedallecoltureinbatch,inunfermentatore

èpossibileintrodurrecontinuamentefattoridicrescitaenutrienti,rimuovendoaltempo

stessodalterrenodicoltura,tramiteappositisistemididrenaggio,isottoprodottitossici

sintetizzatidaibatterieleeventualicellulemorte.

Tuttiisistemidicolturaincontinuoraggiungonounlorostatodiequilibriocheconsente

alricercatorediesercitareunmaggiorecontrollosullecondizionidicrescitadellaspecie

battericadiinteresse,peruntempopiùlungo137.

Questotipodisistemiècomunementeutilizzatoperstudiareilmicrobiotacaratteristico

delcoloneduncertonumerodigruppidiricercausafermentatoridiultimagenerazione

neiqualièpossibileeseguirecoltureconfasidicrescitasequenzialiedistinte,alloscopo

diriprodurreimolticambiamentiambientalicheimicrorganismisubiscononeltransito

all’internodeltrattogastrointestinale138.

1.5.1.3.Modellianimali

Lespeciebatterichediinteressepossonoancheesserecoltivateemantenuteinmodelli

animali,comeèsuccessofinoapocotempofaperibatterifilamentosisegmentati,iquali

hannodimostratodiavereimportantieffettipro‐infiammatorineitopi139.

Itopigerm‐freerappresentanounvalidoesempiodimodelloanimale:comesuggerisce

illoronome,sonoanimalideltuttoprividimicrorganismisiainternamentechealivello

cutaneo,eperquestaloropeculiaritàsonoparticolarmenteutiliperlostudiodeibatteri

dellamicroflora.Essi,infatti,possonoessereinoculatifacilmenteconceppidiinteressee

consentonodistudiarelerelazionibatterio‐ospiteebatterio‐batterioinmodosemplice

eintuitivo.

Moltoutilinellostudiodelmicrobiotamasoprattuttodelcontributogeneticochequesto

offrealproprioospitesonoancheitopiknockout,animaligeneticamentemodificatiallo

scopodivalutareglieffettidellasoppressionedell’espressionediuncertogene.

22

Questasoppressioneèdettaknockoutgenicoedèmoltoutileperstudiareleinterazioni

tralecomponentigenetichedell’ospiteedelmicrobiota140.

Unosvantaggiodiusareimodellianimalièche,mentrelacomposizionedellamicroflora

alivellodiphylumsembraesseresimilaretragliesseriumanieglialtrianimali,alivello

dispecieeceppivièunadivergenzanotevole,dovutaprobabilmentealledifferenzeche

esistononellaloroanatomia/fisiologiaeneilororegimialimentari140.

Infine,unalimitazionenell’utilizzodeimodellianimali,edinparticolare,diquellimurini

perlostudiodelmicrobiotanascedallacoabitazionedeglianimali:neitopi,infatti,sono

frequentigliepisodidicoprofagia(ingestionediescrementi),cheportanoadunrapido

trasferimentodeibatteridaunanimaleall’altro,stravolgendocompletamenteirisultati

chesiottengono141.

1.5.2.Metodibasatisulsequenziamento

Direcente,lostudiodelmicrobiotaèstatocompletamenterivoluzionatodallosviluppo

diinnovativetecnichedibiologiamolecolare,comeilsequenziamentodelDNA,divenute

oggidecisamentepiùeconomicherispettoaglianniprecedenti.

Ilsettoredellabiologiamolecolareèincostantesviluppoesiarricchiscecontinuamente

dimacchinaripiùefficaci,capacidi“leggere”miliardidisequenzediDNAedicomparare

tralorosegmentidiDNAanchemoltolunghi,esemprepiùpiccoli,tantodapoteressere

inseritinellaportaUSBdiuncomputer142.

Ilvantaggioprincipalediquestotipodiapproccioèchesiottengonorisultaticompletie

moltoesaustivisuundeterminatocampione,fornendounavisionepanoramicadiquello

cherappresentainterminimicrobiologicieinoltre,essendomenolaboriosorispettoalle

tecnichemicrobiologicheclassiche,èpossibileeffettuarericerchesulargascala,evento

impensabileinpassato:nesonounesempioilProgettoGenomaUmanoedilpiùrecente

progettoMetaHIT143.

1.5.2.1.Sequenziamentodell’RNAribosomiale

Unapprocciocomunebasatosulmetododelsequenziamentoconsistenell’eseguiredelle

indaginisualcunigenimarcatoriuniversali,chefornisconounapanoramicadellespecie

batterichepresentinelmicrobiota.

23

Igenimarcatoriuniversaliusatipiùfrequentementesonoquellicontenutinell’RNAdelle

subunitàribosomialiminori,dette16Se18Sneibatteriearcheobatterieneglieucarioti

rispettivamente.All’internodiquestigenisonopresentisequenzealtamenteconservate

nellediversespeciebatterichee/ochesonospessoesclusivediundeterminatogruppo

battericoogenere144,maanchesequenzepiuttostovariabili.

Questotipodisequenziamentosfruttaleregionimaggiormenteconservate,infatti,dopo

l’estrazionedelmaterialegeneticodalcampioneditessutoumano,igenimarcatorisono

amplificaticolmetododellareazioneacatenadellapolimerasi(oPCR)usandosequenze

diinnesco,definiteprimer,moltospecificheperleregionialtamenteconservate.

L’obiettivofinaleèquellodicreareunpoolmistodiprodottidiamplificazionechesono

derivatidalmaggiornumeropossibiledispeciebattericheinclusenelcampionebioptico

echevengonosuccessivamentesequenziati.

Idatirisultantisonopoiraggruppatiinunitàtassonomicheoperative(OTU),organizzati

indifferenticlusterdisimilaritàdisequenza,edovrebberorispecchiare,conragionevole

approssimazione,l’insiemeeterogeneodeigruppibattericiinclusinelcampione.Èutile

sottolineare,tuttavia,chelagrandevariabilitànelnumerodicopiedell’RNAribosomiale

deidiversiceppibattericifasìcheirisultatinonsianopropriamentequantitativi145,cioè

chenondianoinformazioniriguardoallequantitàdibatteripresenti.

Inoltre,lasogliadisimilaritàdisequenzastabilitaperdeterminareleOTUèarbitrariae

soggettiva,efadiscostareirisultatiottenutidallarealecomposizionedigeneribatterici

presentinelcampione.

Indipendentementedallasogliadisimilaritàstabilita,leOTUpossonoessereconfrontate

consequenzepresentiindatabasecomeSILVA,RDPedEzTaxon,alloscopodiassegnare

lorounaclassificazionetassonomica146.

Ilsequenziamentodell’RNAribosomialepuòessereutilizzatoancheperanalizzareigeni

menodiffusiall’internodelmicrobiota,giacchénonubiquitariedespressisolodaalcune

dellespeciebatterichecontenuteinesso:unesempiodiciòècostituitodaigeniespressi

daimicrorganismipresentinelcoloncheproduconobutirratoeproprionato147.

1.5.2.2.Sequenziamentocompletodelgenoma

IlprimogenomabattericocompletamentesequenziatoèstatoquellodelGram‐negativo

Haemophilusinfluenzae,nel1995148,tramitel’usodelMetododiSanger149.

24

Daallora,ilmiglioramentodelletecnichedisequenziamentodelDNAhaconsentitodelle

analisigenomichecompleteestremamenterapideeaduncostopiùbasso150.

Datalagrandeefficienzadeimacchinaridisequenziamentodiultimagenerazione,come

Illumina,èormaipossibileeffettuareilcontemporaneosequenziamentodimoltigenomi

battericinellastessasessione:l’approccioèbasatosullatecnicadellaPCRMultiplex,una

variantedellaPCRcheconsented’identificareinmodorapidodelezionie/oduplicazioni

inungrandegene.DiversamentedallaPCR,laPCRMultiplexusapiùsetdiprimerinuna

unicamisceladireazione,portandoall’amplificazionediampliconidivariedimensioni.

AnalizzandopiùgeniinununicociclodiPCR,leinformazioninecessariepossonoessere

acquisiteinuntempoestremamentepiccolo,conuncospicuorisparmioeconomico.

QuestotipodiapproccioèstatoadottatoanchenelProgettoGenomaUmano,unaricerca

internazionaleilcuiobiettivoprincipaleèstatoquellodiidentificareequindilocalizzare

suicromosomi(mappare)igenidelnostrogenoma.

Ilprogettoèiniziatonel1990edancheseunaprimabozzadelgenomaèstatarilasciata

nel2000,sièdovutoattenderefinoal2003peravereirisultaticompleti,dacuisievince

cheilgenomaècostituitoapprossimativamenteda21000geniedèlungocirca3200Mb

aventifunzionidiverse:48Mbsonocodificanti(1,5%),1152Mbdefinisconoilcosiddetto

gene‐relatedDNA,uninsiemediintroniepseudogeni(36%)elerestanti2000Mbvanno

acostituireilDNAintergenico,incuiritroviamosequenzeripetuteinterspersechiamate

LINE(21%),SINE(15%),LTR(9%),trasposoni(3%),sequenzeripetuteintandemdette

microsatelliti(3%)edunapiccolapercentualedialtritipi.

1.5.2.3.Metagenomica

Unlimitedelmetododisequenziamentocompletodelgenomaèrappresentatodalfatto

cheibatteridiinteressedevonoesserenecessariamenteprimacoltivati,cosìdaottenere

unaquantitàdiDNAsufficienteperlesuccessiveanalisi,tuttavia,lamaggiorpartedelle

speciebatterichepresentinelmicrobiotanonèstatoancoracoltivatoinlaboratorio151.

Questoproblemaèstatobypassatograzieall’avventodellametagenomica,unametodica

checonsenteairicercatoridiricavaresequenzegenomichediinteressedalDNAestratto

dauncampioneambientale;inseguito,essitentanodiconfrontarebioinformaticamente

lesequenzeottenutedalDNAestrattoconaltrettantesequenzenoteespressedasingole

speciebatteriche,escludendoquellechenonsonorilevantiperlostudio.

25

Lametagenomicafuapplicataperlaprimavoltaallostudiodelmicrobiotanel2006152e

daalloraèstatautilizzataindiverseoccasioni.Èunatecnicamoltopotente,conlaquale

èpossibiledeterminareaccuratamentelacapacitàfunzionalediunacomunitàbatterica

diinteresse,tuttavia,lacomplessitàdeglihabitatbattericiintestinali(es.colon)richiede

unenormelavorodisequenziamentoperotteneredatisufficientiacomporreunquadro

rappresentativodeimicrobipresentiallorointerno.

Perquestesuecaratteristiche,lametagenomicaèanchelasolatecnicamediantelaquale

èpossibilemonitorarelecomunitàvirali,definiteviromi,presentinelcorpoumano,dato

chenonesistono,aoggi,genimarcatoriuniversaliespressidaivirusinmodoubiquitario

eutilizzabilialloscopocomequellidell’RNAribosomialenelcasodeibatteri153.

Esistono,ovviamente,dellelimitazioniall’usodellametagenomica:inparticolare,questo

tipodiapproccioèmoltopiùesosodialtripoichésesivoglionoelaborareefficacemente

idatiraccoltiènecessariofarricorsoadinfrastrutturebioinformatichespecializzate.

Ciò,imponeairicercatoridilimitareledimensionideicampionidaanalizzare,rendendo

proibitivi,nellamaggiorpartedeicasi,studimetagenomicisulargascala.

1.5.2.4.Sequenziamentodasingolacellula

Ilsequenziamentodasingolacellula(SCG)èunametodicaemergenteecomplementare

allametagenomica,checonsistenell’isolamentodisingolecellulebatterichedacampioni

ambientalienellasuccessivaamplificazionedellorointerogenoma,alloscopodisapere

chefunzionispecificheèingradodiesprimere.

Questotipodiapprocciohaunsensosoprattuttoquandovienecombinatocontecniche

diselezionecellulare,comel’ibridazionefluorescenteinsitu(FISH)154e/olamarcatura

congliisotopistabili,checonsentonoalricercatoredirecuperare,potenzialmente,delle

cellulebatterichechederivanodaunospecificobackgroundfilogeneticoochesvolgono

unaparticolarefunzione.

Unlimiteall’utilizzodiquestametodicaèrappresentatodallapossibilecontaminazione

dellaridottaquotadiDNAchepuòessereestrattadaunasolacellula,chepuòinterferire

conglistrumentiimpiegatiperlasuaamplificazione,determinandounadecodificazione

parzialedelgenoma155.

Nonostantequestosuolimite,direcente,ilsequenziamentodasingolacellulahatrovato

applicazionenellacaratterizzazionedibatteriappartenentiaphylapocoesplorati,come

26

TM7eChloroflexi156eingenerale,puòessereusatoinassociazioneconlametagenomica

perl’ampliamentodeidatabasediriferimento157.

1.5.2.5.Metatrascrittomica

Lametatrascrittomica,comesuggerisceilnome,èlostudiodeitrascrittidiunacomunità

batterica,chehacomeobiettivol’identificazionedellefunzionisvoltedaimicrorganismi

chelacompongono,inundatomomentoedincertecondizioniambientali,diversamente

dallametagenomicachenestabilisceilpotenzialefunzionalecomevaloreassoluto.

Questatecnicaconsisteinnanzituttonell’isolamentodiRNAdauncampioneambientale

enelsuosuccessivoutilizzoperlacreazionedi“librerie”dicDNAretro‐trascritti.Questi

possonoesserepoisequenziatieconfrontaticondatabasegenomicidiriferimento.

Lametatrascrittomicaètecnicamentemoltopiùimpegnativadellametagenomicapoiché

richiedeulteriorifasidilavorazionerispettoaquesta,checonsistonosianellacreazione

dicDNAsianell’eliminazionedegliRNAribosomialidell’ospiteebattericidalcampione

diinteresse,dovecostituisconolaclassediRNAmaggiormenterappresentata158.

Leanalisidelmicrobiotaumanosvoltetramitel’approcciodellametatrascrittomicasono

resepiùcomplessedalfattocheattualmentenonesistonomoltidatabasediriferimento

perigenomideibatteriinclusinelmicrobiota.

Unlimitefondamentaledellametatrascrittomicarisiedenelfattocheacausadellabreve

emivitadegliRNAmessaggero(misurabileinpochiminuti)159,responsabilidelprocesso

ditrascrizionedegliRNA,irisultatiottenutitramitequestoapprocciopotrebberoessere

pocorappresentatividelleattivitàbatterichesvolteinsitu.Ciòsignifica,adesempio,che

l’attivitàtrascrizionalebattericariscontrataincampionifecalipotrebbeesserediscorde

conl’espressionegenicadeglistessibatteriinundistrettocomeilcolonprossimale.

1.5.3.Metodimolecolari

1.5.3.1.DNAFingerprinting

NegliultimiannisonostatesviluppatenumerosetecnichedifingerprintingdelDNA,che

consentonodiotteneremarcatorigeneticiuniversaliutiliallostudiodeigenomibatterici

equindi,dellespeciepresentiinundeterminatomicrohabitat(es.colon).

27

Questetecnichesfruttanounacaratteristicadelgenomadituttiimicrorganismi,ovvero

ipolimorfismidalunghezzadeiframmentidirestrizione(RFLP):inprimis,dalcampione

diinteressesiestraeesipurificailDNA,insecundistaleDNAèsezionatoinframmenti

tramiteenzimidirestrizione(endonucleasi),cheeseguonoitaglisoloincorrispondenza

diparticolarisequenzenucleotidiche,specificheperognienzima.

Iframmentidirestrizionevengonoquindiseparatiperlunghezzamedianteelettroforesi

sugeldiagarosioepoi,tramitelatecnicadiibridazionedelSouthernblotsiidentificano

lebandegeneratedall’ibridazioneconsondedisequenzanotamarcateradioattivamente

otramitefluorocromi.Ledifferenzetraigenotipisonoevidenziatedalnumerodibande

cheappaionoutilizzandolastessasondaperl’ibridazione,cheèasuavoltadeterminato

dalnumerodisitiditagliopresentinellasequenzaconsiderata.

Illimiteprincipaledell’analisidegliRFLPècherichiedeunagrandequantitàdimateriale

dipartenzaeche,ancheinvirtùdiciò,producegeneralmentepochebande.

UnaltrometodoestremamentesensibileperindividuareipolimorfismidelDNAèdetto

amplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP).Adispettodelnome,questoapproccio

èusatoperevidenziarelapresenzadiunpolimorfismopiuttostochelasualunghezza.

LadifferenzasostanzialetralaAFLPelaRFLP,chestaincentivandomoltissimol’utilizzo

dellaprimatecnica,adiscapitodellaseconda,risiedenelfattocheallafasedidigestione

delDNAconunoopiùenzimidirestrizionesegueunafasenellaqualelesemi‐sequenze

direstrizionesuiframmentiappenacreatisonolegateadeglispecificiadattatori,ovvero

frammentidiDNAasequenzanota.Perquestomotivo,laAFLPconsentediindividuare

contemporaneamentediversipolimorfismiinvarieporzionigenomicheestadiventando

rapidamenteunodegliapproccipiùutilizzatiperstimareladiversitàgenomicasianelle

popolazionibattericheinvitrocheinvivo.

1.5.3.2.DNAmicroarray

UnmicroarraydiDNA,meglionotocomegenechip,consisteinunagrigliamicroscopica

disondediDNAattaccateadunsupportosolido,comevetro,plastica,ochipdisilicio.

Questimicroarraysfruttanounatecnicadiibridazione“inversa”,checonsistenelfissare

tuttelesonde(definiteprobe)diDNAsulsupportosolidoenelmarcarel’acidonucleico

daidentificareeconsentonodicontrollaresimultaneamentegliRNAprodottidamigliaia

digeni,alloscopodivalutarelevariazionidellaloroespressione160.

28

Imicroarrayfilogenetici,definitispessophylochips,sonomoltoutilizzatinellostudiodei

batteripresentinelmicrobiota:questiconsistonoessenzialmenteinunarraycontenente

brevioligonucleotidi(ilcuitarget,solitamente,èrappresentatodagliRNAdellasubunità

ribosomialeminore),chesonoselezionatiinmododaincluderelagammatassonomica

deimicrorganismichesiipotizzasianopresentiinundatocampioneambientale161.

IlDNAvieneestrattodalcampionediinteresse,gliRNAribosomialivengonoamplificati

emarcaticonunfluorocromoedinfineibridizzaticontroilmicroarray,cosicchéquando

deglispotdiDNAdelmicroarraypresentanounsegnalefluorescentesiavràilriscontro

chelagammatassonomicasceltaincludequelladellespeciebatterichedelcampione.

Unlimiteimportantediquestotipodiapproccioèche,diversamentedallevarietecniche

disequenziamentocasuale,sipuòrilevareunnumerocontenutodibatteri,ovveroquelli

lacuigammatassonomicaèinclusanellesondeattaccatealmicroarray.Fortunatamente

sonoormaidisponibiliarraycomprendentilagammatassonomicacompletadellespecie

batterichepresentiinparticolarimicrohabitatassociatiall’organismoumano,comesono

l’intestinooilcavoorale162,163.

1.5.4.Metodiquantitativi

Comprendonoduetecnichemolecolarilargamenteutilizzate,ovverolaPCRquantitativa

(oanchedettaReal‐timePCR)el’ibridazionefluorescenteinsitu(FISH),checonsentono

un’enumerazione/quantificazionedeigruppibattericipresentinelmicrobiota.

1.5.4.1.PCRquantitativa(oReal‐timePCR)

ÈunatecnicabasatasullamisurazionedellafluorescenzaemessadaunDNAdiinteresse

durantel’amplificazionemediantePCR:laquantitàdisegnalegeneratoeiltassoalquale

talesegnalesiaccumula,all’aumentaredelnumerodiciclidiPCR,consentedieffettuare

unamisurazionedellaquantitàdiDNAtargetpresentenelcampione.

Questatecnicaèspessoimpiegataperquantificareilnumerototaledicellulebatteriche

contenuteinuncampione,mapuòancheconsentirelaquantificazionedellepopolazioni

presentiindiversigruppibatterici,utilizzandounaseriediprimerspecifici164.

LaquantificazioneeseguitamediantelaReal‐timePCRèpiuttostoprecisa,dalmomento

chepossonoessereaccuratamenteconteggiatedensitàcellularidell’ordinedi101‐103.

29

UnalimitazionedellaReal‐timePCRècheconsentedimonitoraresoloigruppibatterici

percuisonostaticostruitideglispecificiprimerepertanto,igruppiesclusinonsaranno

quantificati,amenochenonsianoutilizzatisetdiprimermultipli.

1.5.4.2.Ibridazionefluorescenteinsitu(FISH)

Questatecnicaprevedechelecellulebattericheinesamesianoprimafissateutilizzando

agentichimici(es.laformaldeide)einseguitosianoresepermeabili,cosìdaconsentirne

l’accessoallesondeoligonucleotidichemarcateconfluorescente.

Questioligonucleotidihannounalunghezzadicirca15‐30bpesonocreaticomunemente

peridentificareleregionidiRNAribosomialedigruppifilogeneticiprescelti1165.

LesondeibridanoaqualsiasisequenzadirRNAadessecomplementare,edalmomento

cheiribosomisonoabbondantiedistribuitiuniformementenellacellulabatterica,fanno

visualizzaresubito,tramitemicroscopiaaepifluorescenza,lecellulechehannomostrato

unsegnalepositivo166.LaFISH,oltreadessereunapproccioquantitativo,hailvantaggio

fondamentale,dunque,diconsentirel’osservazionedicellulediinteresseinsitu,concui

èpossibiledefinireconragionevoleaccuratezza,adesempio, laspecificacomposizione

digruppibattericipresentisullasuperficiedellemucose.

Tuttavia,cisonoanchealcuneimportantilimitazioniall’utilizzodellaFISH:èunatecnica

moltomenosensibiledaunpuntodivistaquantitativorispettoallaReal‐timePCR,visto

cheèessenzialeunelevatonumerodicellule(nell’ordinedelle106perml)nelcampione

perrenderepossibileilloroconteggiovisivoall’internodelcampomicroscopico.

1.5.5.Metodifunzionali

1.5.5.1.Metaproteomica

Lametaproteomicaèlostudiodell’insiemedelleproteine/peptidiprodottidacomunità

batterichemiste167ecometale,fornisceinformazionifunzionalisudiesse,consentendo

aimicrobiologidimonitorarelemodificazioninell’espressionedelleproteineall’interno

delmicrobiota,inrispostaacambiamentidellenormalicondizioniambientali.

Questoapproccioprevedecheleproteinesianoprimaestrattedalcampioneambientale

d’interesseechesianopoiseparateperlalorocaratterizzazionemediantespettrometria

30

dimassaeperillorosuccessivoraffrontocondatibioinformaticidiriferimentopresenti

neiprincipalidatabase168.Inunrecentepassatoleproteine/peptidieranocomunemente

separatimediantel’elettroforesisugel169,mentreattualmentesonoseparatiutilizzando

lacromatografialiquida,duetecnichechecondividonolostessoprincipio,dalmomento

cheseparanoleproteineinbasealloropuntoisoelettrico.

Lametaproteomicaoffredeivantaggirilevantirispettoallametatrascrittomica,giacché

avendocomeobiettivoleproteineanzichégliRNAmessaggero,fornisceunapanoramica

piùampiaerappresentativadelleattivitàfunzionalisvoltedalmicrobiota,dandoanche

unaspiegazioneaiprocessidimodificazionepost‐traslazionali170.

Inoltre,leproteine/peptidisonoanchecomunementepiùstabilidegliRNAmessaggeroe

daciòneconseguecheirisultatiraggiuntinonsonopiùcondizionatianchedallavelocità

concuiicampionivengonoelaborati.

Questotipodiapproccio,tuttavia,mostraancheunaseriedilimitazionichenonlofanno

preferirealletecnologiebasatesulDNA:attualmente,infatti,ancheselasuarisoluzione

stamigliorando,lametaproteomicanonpuòdiscriminarechepochemigliaiadeimilioni

diproteine/peptidichepotrebberoesserepresenti,nellostessotempo,inuncomplesso

microbiotadiuncampionediinteresse171.

Ciòsignificache,adoggi,solamenteleproteineprodottedaimembripiùrappresentativi

delmicrobiotapossonoessererecuperateinmisuraragionevole172.

1.5.5.2.Metabolomica

Lametabolomicaèlostudiodeimetabolitipresentiinunospecificocampionealtempo

dicampionamento.Comelametaproteomica,dunque,essapermettedivalutarel’attività

funzionalesvoltadaunacomunitàbattericatramiteilmonitoraggiodirettodeiprodotti

finalidelsuometabolismo173.

Questotipodiapproccioprevedecheimetaboliti,ingenereisolatidacampionicorporei

qualiurina,feciesangue,sianostimatiutilizzandodiversetecnologie,comelarisonanza

magneticanucleare(NMR)elamicroscopia/spettrometriadimassa174.Ilrisultatofinale

diquestiapproccièunaseriedispecificispettri(opicchi)diassorbimento,chederivano

dallagammadimetabolitipresentinelcampione175.

Unalimitazionefondamentalediquestametodicaèchepuòesseredifficiledeterminare

conprecisionequalespeciebattericastiaproducendoquelparticolaremetabolita.

31

Siètentatomolteplicivoltedicorrelarelaproduzionedimetaboliticonlacomposizione

battericadiuncertocampione,tuttavia,gliapproccimetagenomiciimpiegatialloscopo

possonoessereresiinefficacidallapresenzadiDNAderivatodaspeciemortioinattive.

Inoltre,moltimetaboliti,comegliacidigrassiacatenacorta,sonorapidamenteassorbiti

dall’ospite,ilchesignificacheilivellidiproduzionenonpossonoessereaccuratamente

definitioattribuitiadunaparticolarespeciebatterica176.

Infine,comesuccedeperlametaproteomica,ilimitidirisoluzionefannosìchesipossa

monitorareaccuratamentesolounpiccolosottoinsiemedellavastagammadimetaboliti

chepossonoesserepresentiinuncomplessocampionecomelefeci177.

1.5.5.3.Marcaturaconisotopistabili

Unaltroapprocciofunzionalemoltoapplicatoallostudiodelmicrobiotaèlamarcatura

congliisotopistabili(SIP).Taletecnicaprevedechelecomunitàmicrobichediinteresse

sianoincubatesusubstraticontenentiisotopistabili,come13C,15Ne18O.Aquestopunto

lespeciechesonoingradodicresceresulsubstratofornito,incorporerannoimarcatori

degliisotopinellalorobiomassacellulare,chepotràpoiessereesaminataindividuando

glielementichelacompongono,comeilDNA/RNA,leproteineogliacidigrassiderivati

daifosfolipidi,cherisulterannotuttimarcatiovviamente.

Neiprimistudiquestatecnicaèstatausata“intandem”conapprocciditipomolecolare

equantitativo(comeRFLPeFISH),alloscopodicontraddistinguerelespeciebatteriche

cheeranoingradodiutilizzareattivamentesubstratimarcaticomel’oligofruttosio178.

Unlimiteimportantediquestatecnicaèsenzadubbioilcostoelevatosiadeimacchinari

utilizzatisiadeimaterialioccorrentiedinparticolare,deisubstratimarcati.

Inoltre,lamarcaturacongliisotopistabilirichiedecheibattericrescanoinpresenzadei

substratimarcatiche,pertanto,nonpossonoessereincorporatidacellulee/oorganismi

vitali.Ciòsignificachelecomunitàbatterichedastudiarevannomantenuteincondizioni

artificialidilaboratorio,nonconsentendocosìdiottenererisultatiingradodiriflettere

completamentel’attivitàsvoltadalmicrobiotainvivo179.

32

2.ScopodellatesiConsideratalagrandeeterogeneitàdeirisultatiottenutisinorarelativamenteairapporti

tramicrobiotaecancerogenesicolica,èragionevolepensarecheilricorsoallamedicina

traslazionale,tramiteilsuoapprocciomultidisciplinareealtamentecollaborativo,possa

favorireunutilizzopiùefficaceespecificodiquestibatterineltrattamentodelleIBD.

Atalriguardo,ilruolodimodelli“transizionali”appropriati,ovveropiùrappresentativi

dellecondizionichesiverificanoinvivorispettoaitradizionalisistemiinvitro,potrebbe

esseredigranderilevanza,favorendolatransizione,appunto,diquestimodelliinveree

proprieapplicazionicliniche.

Loscopodiquestatesièstatoquellodicaratterizzareesviluppareunmodello“exvivo

organculture”semplice,economicoeriproducibile,chepossaessereusatonellostudio

delleinterazionimicrofloraintestinale‐ospite,conparticolareriferimentoall’alterazione

delnormaleequilibrioesistentetramicrobiotaemeccanismimolecolariproliferativie/o

infiammatorialivellodellamucosacolica.

33

3.Materialiemetodi

3.1.Pazienti

Nellostudiosonostatiinclusi74pazienti,sottopostiacolonscopiacompletaperdiverse

indicazionicliniche(comepolipiadenomatosie/oretto‐colitiulcerose)pressoilreparto

diEndoscopiaDigestivadell’AziendaOspedalieraS.AndreadiRoma.

Ipazientichehannoaderitoallostudio,approvatodallaCommissioneEticalocale,hanno

rilasciatoilloroconsensoinformato,secondoledisposizionidileggevigenti.

3.2.Campionibioptici:ilmodellosperimentaleexvivo

Durantelacolonscopiadeipazientiinclusinellostudiosonostateraccoltealcunebiopsie

dasegmentisani(prossimaleedistale)epatologicidellamucosadelcolon.

Lebiopsie,appenaprelevate,sonostatesottopostealavaggioconsoluzionefisiologicae

pesate,perevitaredifferenzeconsistentitraicampioni.

Al finedivalutarel’adesivitàdivariespeciebattericheprobiotichesudiversisegmenti

sanidimucosadelcolonequindi,perconfronto,sualcunisegmentipatologicisonostate

raccolte,da18pazienti,altrettantebiopsiedapolipiadenomatosideltrattoretto‐sigma

e,percontrollonegativo,damucosasanaadiacente.

Successivamente,lebiopsiesonostatepostein200lditerrenoRoswellParkMemorial

Institute(RPMI),intubiFalconda2ml,dovesonostatiaggiunti20l(il10%delvolume

totale)diunasoluzioneottenutadallarisospensionedi0,2gdiformulazionimonospecie

(LactobacillusrhamnosusGGoLGG)emultispecie(contenenti8ceppidiversi)dibatteri

probioticiinpolverein1mldiPBSoppure,percontrollonegativo,inunostessovolume

diPBSsenzaalcunprobiotico.

Infine,itubicontenentilebiopsiesonostatiincubatia37°Cper2ore.

Alterminedell’incubazione,lebiopsiesonostaterecuperateesottoposteadueulteriori

lavaggiconilPBS,perrimuoverelespeciebatterichenonaderenti.Inseguito,lebiopsie

sonostateposteinunostabilizzante(RNALater)finoalsuccessivopassaggio.

34

LebiopsiesonostateomogeneizzateedaquesteèstatoestrattoilDNAtotale,analizzato

mediantePCR,utilizzandodeiprimerspecificiperdiversespecieprobiotiche,alloscopo

distabilirelaconcentrazionemucosalerelativadiduespecieinclusenellaformulazione

multispecie(B.infantiseS.thermophilus)ediLactobacillusrhamnosusGG.

Alloscopodivalutareglieffettiprodottisullamucosaintestinaledaiprobioticiutilizzati

nellostudio,interminidiespressionedimolecolepro‐infiammatorie(es.‐defensine)e

pro‐apoptotiche(es.caspasi),èstatoimpiegatounprotocolloanalogoaquellodescritto

precedentemente:da51pazientisonostateprelevate33biopsiedapolipiadenomatosi

delretto‐sigmae48biopsiedamucosasana.

Lebiopsie,sonostatequindiprocessateafrescooposte,ancheinquestocaso,interreno

RPMI,maconl’aggiuntadel10%diunasoluzionediterrenocondizionatoperprobiotici

(preparato in accordo con le proceduredescritte in letteratura) oppure, per controllo

negativo,del10%diPBS.

Iltempod’incubazionedellebiopsieèstatoallungatoacirca6ore,alloscopodivalutare

l’induzionedell’espressionegenica.Questotempononèstatoprolungatoulteriormente

poichéa12e24oreèstataosservatafrequentementeunacontaminazionedeicampioni

eladegradazionedell’RNA.

Infine,dallebiopsieèstatoestrattol’RNAtotale,cheèstatoretrotrascrittoincDNAepoi

analizzatotramitePCRutilizzando,inquestocaso,primerspecificiperdiversemolecole

pro‐infiammatorie(‐defensineHD5eHD6)epro‐apoptotiche(caspasi3e9).

3.3.EstrazionedelDNA/RNA

L’estrazionediDNAediRNAtotaledallebiopsieèstataeseguitautilizzandoikitQIAmp

mini‐DNAeRNAeasyminiprep(Qiagen,Valencia,CA)rispettivamente,inaccordoconle

indicazionifornitedalproduttore.

Primadelsuoimpiego,l’RNAtotaleottenutomedianteestrazione,èstatoretrotrascritto

incDNA,utilizzandoilkitGeneAmpRNAPCR(AppliedBiosystems,FosterCity,CA),come

daindicazionidelproduttore.

Laconcentrazioneeilgradodipurezzadegliacidinucleiciestrattisonostatideterminati

mediantelaletturadeidiversicampioniallospettrofotometroGeneQuantproRNA/DNA

Calculator(AmershamPharmaciaBiotechInc.,Piscataway,NJ).Icampionisonopoistati

portatituttiallastessaconcentrazione.

35

3.4.Real‐timePCR

LereazionidiReal‐timePCRsonostateeseguiteutilizzandouniCycleriQReal‐TimePCR

DetectionSystem,inunvolumedi20l,costituitoda16ldiSYBRGreenPCRSupermix

(Bio‐RadLaboratoriesInc.,Hercules,CA)e4ldiDNA/RNA.

Perognisetdiprimerutilizzatoèstatomantenutoilrelativoprofilotermicoconsigliato

ecomenormalizzatorideivaloriottenutinellereazionisonostatisceltiigenicostitutivi

(ohousekeeping)GADPHe‐actina:laquantitàdeibatteriaderentineicampionièstata

espressa,inmodosemi‐quantitativo,comepercentualerelativarispettoalvaloreminore

ottenutonellareazioneconsiderata.

LaqualitàdellereazionieffettuateèstatavalutatamedianteilcontrollodellaMeltCurve

edicampioniconMeltCurveanomalarispettoaglistandarde/oaglialtricampionisono

statiscartati.

Infine,iprodottidireazionedellaPCRsonostatifattimigraresuungelperelettroforesi

al2%diagarosio,conl’aggiuntadibromurodietidioperpoterlivisualizzare.

3.5.Statistica

Lecomparazionitragruppi,perl’adesivitàbattericael’espressionedellecitochine,sono

stateeseguitemedianteiltestdelchiquadrooiltdiStudentperdatiappaiati.

Lasignificativitàstatisticaèstataconsideratapervaloridip<0.05.

L’analisistatisticaèstataeseguitatramiteilsoftwareMedCalc(versione12.5)perPC.

36

4.Risultatieconclusioni

4.1.Risultati

Loscopodiquestatesièstatoquellodicaratterizzareesviluppareunmodello“exvivo

organculture”semplice,economicoeriproducibile,chepossaessereusatonellostudio

delleinterazionimicrofloraintestinale‐ospite,conparticolareriferimentoall’alterazione

delnormaleequilibrioesistentetramicrobiotaemeccanismimolecolariproliferativie/o

infiammatorialivellodellamucosacolica(Fig.1).

Fig.1.Rappresentazioneschematicadelmodellopresentatonellostudio.

Lacaratterizzazionediquestomodellohaprevistolosviluppoditretematiche:

lealterazionideirapportitramicrobiotaedospiteneipolipiadenomatosi,ovvero

inunacondizioneclinicaprecancerosacomunedeltrattogastrointestinale;

37

lapossibileassociazioneesistentetraquestealterazionieiprocessiinfiammatori

cheavvengonoalivellodellamucosaintestinale;

l’eventualeutilizzoterapeuticodeibatteriprobioticiinquestoambitoclinico.

Riguardoallealterazionidell’equilibriomicrobiota‐ospiteèstatavalutatainprimoluogo

l’adesivitàdeiprincipalibatteriprobioticiaivarisegmentidimucosacolicasana(distale

eprossimale),eciòchesièpotutonotareèchelespecieprobioticheaderisconoinmodo

specificoaivarisegmentidellamucosadelcolon(Fig.2).

Fig.2.Adesivitàrelativadeibatteriprobioticiaiverisegmentidimucosacolicasana.

Inparticolare,incubandoicampionibiopticiconformulazionimultispeciedeiprobiotici

maggiormentecaratterizzati,abbiamoosservatocheduedellespeciepresentiall’interno

delcomposto(ovveroBifidobacteriuminfantiseStreptococcusthermophilus)aderiscono

meglioallamucosadelcolonprossimalecheaquelladelcolondistale(Fig.2).

Unterzobatteriopresentenellaformulazione,cioèLactobacillusacidophilus,nonèstato

riscontratoalivellodellamucosa,dimostrandolasuaincapacitàdiaderireallamucosa

delcolonnellecondizioniutilizzatenell’esperimento(Fig.2,datononmostrato).

Successivamente,abbiamovalutatol’adesivitàdiLactobacillusrhamnosusLGG,unadelle

specieprobiotichemaggiormentecaratterizzate,osservandocomeessotendeadaderire

38

inmodopiùmarcato(2:1)alcolondistalerispettoalprossimale.Talerisultatoconferma

laprecedenteosservazionechelediversespecieprobioticheaderisconoaisegmentisani

dellamucosadelcoloninmanieraspecifica(Fig.3).

Fig.3.AdesivitàrelativadelbatterioLactobacillusrhamnosusGGaivarisegmentidimucosacolicasana.

Sullabasedeirisultatiottenutisullamucosasanadelcolon,abbiamodecisodivalutare

lepossibilidifferenzediadesivitàdeibatteriprobioticisullamucosadelcolonnormalee

patologica,conparticolareriferimentoaquelladipolipiadenomatosi:abbiamoraccolto

biopsiedaentrambiitipidimucosaeleabbiamoincubatedinuovoconleformulazioni

mono‐emultispeciediprobioticiimpiegateneitestprecedenti,osservandosempreuna

significativariduzionedell’adesivitàdeiprobioticisullamucosadapolipoadenomatoso

rispettoaquellanormale.Nelcasodellamucosapatologica,pertanto,ledifferentispecie

batterichesembranoavereuncomportamentosimile(Fig.4).

Fig.4.Confrontonell’adesivitàbattericasullamucosacolicasanaedapolipoadenomatoso.

Questorisultatoèstatoquindiconfermatoinunsecondoesperimentoinvivo,subiopsie

raccolteinfasedicolonscopiaedirettamenteprocessateperl’estrazionedelDNAtotale

39

elasuaquantificazionetramiteReal‐timePCR,conprimerspecificiperilDNAbatterico

totale.Ineffetti,comesievincedallaFigura5,lacapacitàdiadesionebattericaèrisultata

significativamentepiùbassa(diben20volte)sullamucosadelcolonpatologicarispetto

aicontrollidamucosasana(Fig.5).

Fig.5.Confrontonell’adesivitàbattericasullamucosacolicasanaedapolipoadenomatosoinvivo.

Questedifferenzediadesivitàbattericatralamucosacolicasanaedipolipiadenomatosi

possonoesserespiegatedallaosservazionechenellebiopsiedapoliposihaunaumento

dellasecrezionedialcunemolecoleanti‐batteriche,le‐defensineHD5eHD6.

Questatendenzaèstataconfermatasiatramitel’analisideitrascrittiperleduemolecole

siamediantesaggioimmunoistochimico,conilqualeèstatopossibilevisualizzarecome

ledue‐defensinesonoscarsamentepresentialivellodellamucosacolicasana,mentre

sonoabbondantementerappresentateinquelladapolipoadenomatoso(Fig.6).

Èopportunosottolinearechelacorrelazionetraladiminuzionedell’adesivitàbattericae

l’aumentodellasecrezionedi‐defensineosservatenellamucosadipolipiadenomatosi

èpuramenteteorica,dalmomentochenonsonostatieseguititestspecificiariguardo.

L’aumentodellasecrezionedellemolecolepro‐infiammatoriecheèstatoosservatonelle

biopsiedapolipoadenomatosocihaspintoacercaredicomprenderesepotesseesserci

un’associazionetralealterazioniriscontrateneirapportimicrobiota‐ospiteediprocessi

infiammatoricheavvengononormalmentealivellodellamucosa.

Atalproposito,abbiamovolutoesplorareselapre‐incubazioneconacidoacetilsalicilico

(ovverounamolecolaanti‐infiammatoria)deicampionibioptici,trattaticomedescritto

inprecedenza,cioèincubaticonformulazionidiLGGprimadiessereprocessati,potesse

ripristinarel’adesivitàbattericasullamucosadeipolipiadenomatosi.

40

Effettivamente,lapre‐incubazionedidueoredellebiopsieconacidoacetilsalicilicopare

ripristinarelacapacitàdiLGGdiaderireallamucosadipolipo,riducendosensibilmente

ledifferenzediadesivitàosservateprecedentementeerendendoletrascurabili(Fig.7).

Fig.6.Aumentodellasecrezionedi‐defensinenellamucosadapolipoadenomatosorispettoaquella

sana,valutatatramiteanalisideitrascritti(AeB)esaggioimmunoistochimico(CeD).

Fig.7.L’incubazionedellebiopsieconacidoacetilsalicilicoripristinalacapacitàdiadesione

delprobioticoLGGallamucosadeipolipiadenomatosi.

41

Èopportunosottolinearechequest’ultimodato,inconsiderazionedelpiccolocampione

dibiopsieutilizzatoedellanecessitàdireplicaregliesperimentieffettuati,èdaritenersi

preliminare,manonmenoimportanteaifinidellostudio.

Ilterzoedultimoscopodelnostrostudioèstatoquellodivalutareunpossibileimpiego

deibatteriprobioticineiprocessiinfiammatoriintestinali,inconsiderazionedeirisultati

descrittifinora.Cisiamochiestipertantoseèpossibileinterveniresuquestadisbiosiche

siriscontranellamucosadeipolipiadenomatosirispettoallamucosasanaedapplicando

ilnostromodellosperimentale,abbiamocercatodicapireselespecieprobioticheenello

specificoLactobacillusrhamnosusLGG,possaaveredellecaratteristichetalidarenderlo

proponibileperquestoscopo.

Abbiamovalutato,quindi,ilsuopossibileeffettoanti‐infiammatoriosubiopsieprelevate

dacolondistaleeprossimaledipazienticoninfiammazioniattive(es.coliteulcerosa).

Nellebiopsie,incubateconformulazionidelbatterioprobiotico,sièregistrataunanetta

riduzionedell’espressionediunaimportantemolecolapro‐infiammatoria,cioèilfattore

dinecrositumorale(TNF),cheèattribuibileaunpossibileeffettoanti‐infiammatorio

delbatterioprobioticoLGG(Fig.8).

Fig.8.Effettoanti‐infiammatoriodelbatterioprobioticoLGG:riduzionedell’espressione

diTNFnellamucosacolicadipazienticoncoliteulcerosainfaseattiva.

LostessoeffettodiLGGsiosservaanchenelcasodiun’altramolecolapro‐infiammatoria

bencaratterizzata,l’interleuchina‐17(IL‐17),soprattuttoalivellodelcolondistale,come

dimostralaFigura9.L’effettoapparepuòmoderato,invece,nelcolonprossimale.

42

Fig.9.Effettoanti‐infiammatoriodelbatterioprobioticoLGG:riduzionedell’espressione

diIL‐17nellamucosacolicadipazienticoncoliteulcerosainfaseattiva.

Infine,applicandonuovamenteilnostromodellosperimentaleexvivo,abbiamovalutato

ilpossibileeffettoanti‐proliferativodiquestobatterioprobiotico:atalescopo,abbiamo

incubatobiopsiedapazienticoninfiammazioniinfaseattivaconlastessaformulazione

diLGGutilizzataneiprecedentiesperimentiedabbiamoosservato,ineffetti,unaumento

dell’espressionediduemolecoleimportantinelprocessoapoptotico,lecaspasi3e9,che

apparepiùevidenteperlaprima(60%)cheperlaseconda(15%)(Fig.10e11).

Fig.10.Effettoanti‐proliferativodelbatterioprobioticoLGG:aumentodell’espressione

dellecaspasi3nellamucosacolicadipazienticoncoliteulcerosainfaseattiva.

43

Fig.11.Effettoanti‐proliferativodelbatterioprobioticoLGG:aumentodell’espressione

dellecaspasi9nellamucosacolicadipazienticoncoliteulcerosainfaseattiva.

Riassumendoirisultatiottenutidurantelostudio,sipuòconcluderecheibatteridefiniti

probioticiaderisconoallamucosacolicanormaleinmanieraspecie‐specifica.

Lamucosadipolipiadenomatosi,invece,producemolecoleanti‐batteriche,ledefensine

emostranelcontempo,unariduzionedellacapacitàdiadesionedapartedeibatteri.

Questatendenzapuòessereinvertitamediantel’utilizzodimolecoleanti‐infiammatorie

comel’acidoacetilsalicilico,cheèingradodiripristinarel’adesivitàdeiprobiotici.

Infine,ibatteriprobiotici(einparticolareLactobacillusrhamnosusLGG),possonoavere

uneffettoanti‐infiammatorioedanti‐proliferativosullamucosadelcolon,esicandidano

perquestoadavereunruoloneltrattamentodeglistatiinfiammatoriintestinali.

4.2.Conclusioni

Damoltianniènotoilruolochelamicroflorabattericaintestinaleomicrobiota,svolge

nelmantenimentodell’omeostasidell’organismoumano,masolo recentemente,grazie

all’utilizzoditecnichecolturaliedibiologiamolecolaresemprepiùperformanti,sisono

registratiprogressinotevolinellostudiodellamicrofloraendogena.Unrapidosviluppo

dicosìtantemetodiche,tuttavia,determinaunnotevoleproblemanellainterpretazione

deirisultati,portandoallanecessitàdisvilupparemodellidisempliceutilizzo.

L’interessedelmondoscientificoèfocalizzatosulleinterazionitramicrobiotaintestinale

eospite,conparticolareriguardoallecondizionifisiologicheepatologichechepossono

44

causarel’alterazionedellacomposizioneedelnumerodeibatteripresentinell’intestino

dell’uomo.D’altrocanto,numerosistudihannogiàsuggeritol’utilizzodibatteriprovvisti

dieffettibeneficisullasalutedell’uomooprobiotici,neltrattamentodialcunecondizioni

patologiche(es.ladiarreainfettiva,lasindromedell’intestinoirritabile,IBSelemalattie

infiammatoriecronicheintestinali,IBD).

Atalproposito,assumeunanotevoleimportanzal’approfondimentodeglistudisulruolo

delmicrobiotaintestinalenellacancerogenesidellamucosadelcolon,dallaformazione

deipolipi adenomatosi finoaquelladel carcinomacolon‐rettale, allo scopodi ridurne

l’insorgenzae/ol’incidenzanell’uomo.

Lamedicinatraslazionale,attraversolacontinuainterazionetraimodellisperimentalie

lecondizioniinvivopuòaiutareiricercatoriachiariremegliogliaspettidell’interazione

microbiota‐ospite,conparticolareriferimentoallerelazionitrailmicrobiotaeiprocessi

infiammatorieneoplastici.

Inrelazioneaquesteconsiderazioni,ilnostrostudiohaavutoloscopodicaratterizzare

esviluppareunmetodoexvivosemplice,riproducibileedeconomicoperlavalutazione

delleinterazionimicrobiota‐ospite.Inparticolare,l’adesioneeglieffettisullamucosadei

probioticipossonoessereanalizzatimediantel’applicazionediquestometodo.

Lostudioèstatoincentratosullelesioniprecancerose,cioèipolipiadenomatosi,poiché

questipotrebberorappresentareunmomentochiavedelprocessoneoplasticoedhanno

destato,sinoaquestomomento,minoreinteresseneiricercatoririspettoalCCRoaaltre

formetumorali,risultando,pertanto,menocaratterizzate.

Irisultatidiquestostudiopotrannocontribuireadampliarelanostraconoscenzasulle

complesseinterazionidinamichetrailmicrobiotaintestinaleediprocessiinfiammatori

edicarcinogenesicolica,conimportantipossibiliapplicazioni,nonsoltantopuramente

conoscitive,maclinico‐pratiche,interminididiagnosiprecoceediterapia.Èauspicabile

chelamiglioreconoscenzadellecaratteristicheedelleproprietàdelmicrobiota,edelle

possibilitàdimanipolazionedellostesso,possanoportare,inunprossimofuturo,aduna

miglioregestionedelCCRcherimane,malgradoiprogressiriguardoadiagnosiprecoce

etrattamento,unadelleprincipalicausedimortalitànelmondooccidentale.

45

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