Curs 4 Anul III Enzime Si Proteine

Embed Size (px)

Citation preview

  • 8/22/2019 Curs 4 Anul III Enzime Si Proteine

    1/6

    Biotehnologia enzimelor si proteinelor

    Curs 4

    Tehnologia de obtinere a proteinelor furajere din metanol

    Dintre materiile prime care s-au impus pana in prezent ca substrat pentru obtinereaS.C.P., metanolul se situeaza pe unul din primele locuri, datorita avantajelor sale tehnologice

    si economice; mai ieftin si mai disponibil decat alte materii prime, cu un domeniu de

    intrebuintare mai restrans decat glucidele si etanolul, mai putin periculos decat metanul ,perfect miscibil cu apa, metanolul continua sa ramana in atentia specialistilor, evolutia

    pretului sau de cost putand fi influentata de utilizarea lui in industria concentratelor proteice.

    Microorganisme utilizate

    Deoarece exista atat drojdii cat si bacterii capabile sa asimileze metanolul, prima

    problema ce apare este una legata de alegerea tipului de microorganism utilizat pentruobtinerea biomasei proteice.

    Tabelul 14Bacterii si fungi capabile sa metabolizeze metanolul

    Bacterii Methylobacter

    Methylococcus

    Methylomonas

    Klebsiella

    Fungi Tricoderma lignorum

    Tabelul nr. 15

    Comparatie intre caracteristicile proceselor de obtinere a S.C.P. cu drojdii si bacterii.

    PARAMETRUL DROJDII BACTERII

    Temperatura optima (C) 28- 38 37- 40

    Timp de dublare (ore) 3,9 1,8

    Proteina totala (%) 52 86

    Productivitatea 0,39 0,5-0,6

    Tabelul nr.17

    Drojdii capabile sa metabolizeze metanolul

    Hansenula capsulata Torulopsis glabrata T. methanosorbosa

    H. minuta T. nemodendra Pichia pastorisH. nonfermentans T. nitratophilia P. pinus

    H. philodendria T. pinus P. halophyla

    H. polymorpha Candida boidinii

    H. glicozyma Candida methanolica

    Tabel nr. 18

    Caracteristicile unor microorganisme crescute pe metanol

    1

  • 8/22/2019 Curs 4 Anul III Enzime Si Proteine

    2/6

    MICROORGANISM TIMP DE

    DUBLARE (ORE)TEMPERATURA

    OPTIMA

    RANDAMENT

    CELULE/ MEOH

    Cloeckera sp. Nr.2201 9 30 0,29 g

    Torulopsis glabrata 8 30 0,45 g

    Candida boidinii 28 0, 29- 0,24 g

    H. polymorpha DL-1 3 37-42 0,37 g

    Metabolismul metanolului

    Oxidarea catabolica a metanolului poate fi reprezentata prin reactiile:

    CH3 OH CH2O HCOOH CO2x xH2 y yH2 z zH2

    Atat in cazul utilizarii drojdiilor cat si in cazul bacteriilor, prima etapa consta in

    transformarea metanolului la formaldehida. La drojdii aceasta transformare este catalizata de

    o alcool oxidaza si necesita oxigen in timp ce la bacterii metanolul este dehidrogenat.

    In cazul drojdiilor, in urma oxidarii metanolului se formeaza H2O2.CH3OH + O2 CH2O2 + H2O2

    Descompunerea H2O2 formata in urma reactiei de mai sus este realizata de catalaza,drojdiile ce cresc pe metanol avand o activitate catalazica net superioara celor ce cresc pe alte

    substraturi asa cum se observa si din tabelul urmator:

    Tabelul nr.20 Activitatea catalazica a drojdiei C.boidinii in functie de sursa de carbonutilizata

    Sursa de carbon Faza exponentiala Faza stationara

    etanol 18 320

    glucoza 70 310

    metanol 1450 1430

    *exprimata in U/mg proteina

    Intermediarul cheie in oxidarea metanolului este formaldehida (este posibil ca o partedin formaldehida sa fie formata prin oxidarea metanolului de catre H 2O2prin intermediul

    catalazei). O parte din formaldehida este oxidata mai departe la acid formic si apoi la Co 2,

    pentru obtinerea energiei necesare reactiilor de asimilatie, in timp ce restul este transformat

    in compusi.- Oxidarea formaldehidei la acid formic

    La majoritatea bacteriilor metilotrofe, reactia este catalizata de o aldehida

    dehidrogenaza. Exista doua posibilitati:- utilizarea unei aldehid-dehidrogenaze NAD-independente

    - utilizarea unei aldehide dehidrogenaze NAD si glutation (GSH) dependenteHCHO + NAD + H2O (GSH) HCOOH + NADH2Intermediarul cheie in oxidarea metanolului este formaldehida

    Procedeul Udhe-Hoechst

    Microorganism : bacterie Metyilomonas clara obligat metilotrofa

    2

  • 8/22/2019 Curs 4 Anul III Enzime Si Proteine

    3/6

    Mediul de cultura (sintetic): H3PO4 = 0,17%; Na2SO4 = 0,017%; K2 SO4 = 0,11%;

    MgSO4 = 0,017%; Fe2(SO4)3 H2O = 0,007%; CaCO3 =

    0,01% (metanolul si amoniacul se introduc separat)

    Temperatura : 39C PH: 6,8

    Conditii de operare: operare sterila, in flux continuu D = 0,3 0,5 h -1

    Recirculare Me OH: max = o,oo5%; YX/S = 0,5 g celule/g Me OH;

    Productivitatea: 3-5 kg/m3h;

    Bioreactor: air lift; consum specific energetic (transferul oxigenului) = 0,5 kW/kg O2

    La iesirea din fermentator, biomasa este floculata electro-termic, separata princentrifuge orizontale si apoi uscata prin atomizare.

    Preparare materii Sterilizare Fermentatie Floculare Centrifugare Uscareprime Conditiona

    aer exhaustat

    CH3OH

    NH3

    H3PO4

    Sol. minerala

    Comprimare aer

    Recirculare

    Procedeul I.C.I.

    3

  • 8/22/2019 Curs 4 Anul III Enzime Si Proteine

    4/6

    Firma I.C.I. utilizeaza ca producator de biomasa proteica bacteria Methylophilus

    methylotrophus. Sursa de azot este amoniacul. Asa cum se observa din figura nr.19, exista

    doua cai prin care azotul amoniacal poate fi incorporat in biomasa:

    NH4+ ADP + Pi

    (GS)Glutamat Glutamina

    (GOGAT)

    Glutamat+ 2-oxoglutarat+

    NADP NADPH

    NH4+

    (GS) = glutamin sintetaza

    (GOGAT) = glutamat sintetaza

    (GDH) = glutamat dehidrogenaza

    Bacteria mentionata nu sintetizeaza GDH, pentru fixarea NH4+ calea Gs /GOGAT,

    mai putin eficienta din punct de vedere energetic. La alegerea microorganismului s-au luat in

    considerare urmatoarele criterii:- stabilitatea culturii;

    - siguranta utilizarii produsului;

    - valoarea nutritiva a produsului;- randamentul biochimic si necesarul de oxigen;

    - caldura degajata si temperatura optima de crestere;

    - productivitatea.Aplicand tehnologia ADN recombinant s-a reusit clonarea si exprimarea genetica ce

    codifica sinteza GDH de laE. coli la Methylophylus methylotrophus ; prin aceasta metoda

    randamentul de substrat a crescut cu 4-7%, atingandu-se o valoare de 0,64 g/l.

    Mediul este sterilizat cu abur la 140C, aerul si NH3 gazos ca si CH3OH fiind

    sterilizare prin filtrare; pH-ul este mentinut la 6,7, temperatura la 37C. Se lucreaza in sistem

    continuu la D = 0,1 0,2 h-1, pastrandu-se in fermentator o concentratie celulara de 30- 40 g/l

    (substanta uscata) pentru usurarea fazei de separare. Deoarece la acesta concentratie celulara

    consumul de oxigen este foarte mare (10 kg O2/kW). La un volum al inoculului de 20ml seajunge la concentratia de trecere pe continuu in aproximativ 30 de ore. Prima sarja a fost

    pornita in decembrie 1979.

    Fermentator Evacuare

    aer

    4Separare Uscare prin

    pulverizare

    Macinare

  • 8/22/2019 Curs 4 Anul III Enzime Si Proteine

    5/6

    amoniac

    granule in vrac pulbere in saci

    alcoolmetilic

    subst.

    nutritive

    Figura nr. 20 Diagrama procesului industrial de proteine monocelulare utilizat de firma I.C.I.

    Fermentatorul utilizat de firma I.C.I. are un volum geometric de 2100 m3, a fost

    construit la Dunquerque si transportat pe apa in Anglia la Billingham.

    Studiile efectuate la nivel de pilot au relevat faptul ca neasigurarea profilului dedistributie al metanolului duce la o scadere a randamentului de substrat de la 0,64 la o, 45

    g/g. De aceea fermentatorul este prevazut cu 19 sicane (sub forma de placi perforate), iar

    introducerea metanolului se face prin 6- 8000 de gauri (datele privitoare la proiectul unui noufermentator cu volum de 5500 m3 arata ca se preconiza introducerea metanolului prin 20 000

    de puncte).Aceasta pentru ca metanolul este toxic si trebuie distribuit uniform fara sa

    formeze puncte cu concentratie mare in metanol.Viteza de circulatie a fazei lichide in zona ascendenta este de aproximativ 0,5m/s, in

    zona descendenta de 3 4 m/s. Presiunea la baza fermentatorului este de 4,5 bari, iar la

    varful sau de 2 2,5 bari. Pentru separare se procedeaza la incalzirea si la acidularea

    biomasei (pentru flocularea acesteia in jurul bulelor de aer) ce parasesc lichidul. Efluentullimpede separat la partea inferioara este recirculat. Concentratia atinsa in urma flotatiei este

    de 10 12%. Pentru a nu fi necesara resterilizarea efluentului, aceasta faza este condusa in

    conditii aseptice. Dupa flotatie urmeaza o centrifugare. Biomasa cu o concentratie deaproximativ 20% substanta uscata este supusa apoi operatiei de uscare. Inaintea uscarii se

    trateaza crema pentru cresterea pH-ului si apoi este amestecata cu produs uscat. Uscarea

    propriu-zisa se realizeaza prin atomizare. Materialul uscat este colectat in cicloane (o parteeste recirculat) transport pneumatic.

    Gazul rezultat de la uscare este trecut prin scrubere si apoi printr-un condensator. Oparte din el este recirculat si amestecat cu gazele naturale utilizate in arzatoare, iar cealalta

    parte este eliminata in atmosfera.

    5

  • 8/22/2019 Curs 4 Anul III Enzime Si Proteine

    6/6

    iesire gaz

    Htotal = 60 m

    Hlg = 45 55mDbaza = 7 m

    D draft = 6,6 m

    Masa de lucru = 600Volum de lucru = 1500 m3

    Q aer = 90 000 Nm3/h

    D varf = 11 mNr. placi perforate = 19Dist. intre placi = 2 m

    Q = 9300 Nm 3h-1

    aer comprimat

    14 20 t CH3 OH h-1

    250 t mediuh-1

    Schema fermentatorului I.C.I.

    6

    5000-8000 injectii