88
Curs 9 2012

Curs 9 2012

Embed Size (px)

DESCRIPTION

biomol

Citation preview

Page 1: Curs 9 2012

Curs 9 2012

Page 2: Curs 9 2012

• Microarray• In 1987, s-a utilizat sticla in locul membranelor de

nitroceluloza sau nylon pentru producerea testelor de diagnostic.

• In schimbul evaluarii unui singur biomarker studiile de genomica functionala sunt capabile sa furnizeze date despre intregul transcriptom al celulelor studiate.

• Genomica functionala, utilizand tehnica microarray, poate furniza informatii asupra expresiei simultane a mii de gene sau chiar a intregului genom uman. Profilul de expresie genica al unui tip de celule ii determina functionalitatea, fenotipul si raspunsul la terapie.

Page 3: Curs 9 2012

• Tehnologia microarray a permis identificarea unor seturi de gene supra si sub exprimate in diferite patologii: cancerul de san, cancerul de prostata, cancerul pulmonar, precum si in dereglarea anumitor procese fiziologice: inducerea apoptozei si raspuns la terapie. Utilizarea microarray-urilor, in cercetarea biomedicala, nu se limiteaza doar la deteminarea profilului de expresie genica, fiind deasemenea folosite pentru detectia SNP-urilor (single nucleotide polymorphism), aberatiilor de metilare, detectia splicing-ului alternativ, detectia de patogeni, amplificare genica, detectia genelor de fuziune.

Page 4: Curs 9 2012

• Cu tehnologii de colorare imbunatatite si abilitatea de a depozita picaturi foarte mici de tinta pe un substrat de sticla, macrotestarea a evoluat in microtestare.

• Zeci de mii de tinte pot fi scanate simultan pe o arie foarte mica prin minimizarea picaturilor de depozitat (Fig 6-22).

• Sistemele de depozitare automata pot plasa mai mult de 80,000 de pete pe un substrat de sticla de marimea unei lame de microscop.

Page 5: Curs 9 2012
Page 6: Curs 9 2012

• Microarray-ul este o matrice solida miniaturizata pe care sunt depozitate intr-o ordine bine stabilita mii de fragmente de acizi nucleici.

• Principiul de baza al tehnicii microarray este similar principiului Southern blot-(hibridare ADN-ADN), respectiv Northern blot (hibridare ARN-ADN) si se bazeaza pe complementaritatea secventelor genice de a se recunoaste intre ele si de a detecta prezenta sau absenta ADN-ului sau al ARN-ului de interes, folosind o serie de detectori radiologici, fluorogenici sau chemiluminiscenti.

• cDNA-ul sau cARN-ul, sintetizat prin reactia de revers transcriptie de pe mARN-ul extras din proba de interes, este marcat fluorescent si hibridizat pe suprafata arrayului.

Page 7: Curs 9 2012

• Cuantificarea nivelelor de expresie se bazeaza pe faptul ca intensitatea semnalului fluorescent al fiecarui spot este direct proportionala cu cantitatea de mARN prezenta in proba analizata, care a hibridizat in spotul respectiv.

• Tehnica microarray compara nivelele de expresie a unei gene in doua conditii diferite (ex. cancer vs normal).

• La sfarsitul anilor ’90 au fost realizate sisteme robotizate sofisticate capabile sa pozitioneze fragmente de ADN pe suporturi de sticla la o densitate imposibil de realizat prin procese manuale.

• Pat Brown si colab. au fost primii care au dezvoltat tehnologia microarray de mare densitate.

• Din acel moment a inceput o adevarata dezvoltare a acestor tehnologii atat la nivel academic cat si comercial.

Page 8: Curs 9 2012

• Platformele actuale de microarray difera intre ele prin tipul de sonda utilizata (suportul de hibridare de pe suprafata array), design (membrana de nylon, lama de sticla, chip array), tehnologia de fabricare a sistemelor de tip array (printare sau depunere), protocoalele de marcare si hibridare (monocolore sau bicolore).

• In domeniul evaluarii expresiei genice sunt utilizate mai multe platforme microarray care se bazeaza pe utilizarea suporturilor array ce contin cDNA sau oligonucleotide.

Page 9: Curs 9 2012

• Un sistem cDNA microarray cuprinde o colectie de mii de sonde care, in general, corespund produsiilor PCR apartinand unor banci de cDNA.

• Primul pas in producerea cDNA microarray-urilor este selectarea din bazele de date publice (UniGene, RefSeq, GenBank) a secventelor ce urmeaza a fi pozitionate pe array, urmata de amplificarea prin PCR a genelor de interes, folosind primeri specifici, si purificarea produsilor PCR.

• Fragmentele astfel obtinute sunt depozitate, in pozitii bine determinate, pe suprafata array-ului, prin depunere robotizata.

Page 10: Curs 9 2012

• Spoturile sunt separate de zone libere cu distante similare, ajungandu-se la densitati de 20.000 spoturi/cm2.

• Arrayurile pot fi din nylon, nitroceluloza sau sticla.• Dimensiunile zonelor de depozitare (spoturilor) au

diametre de aproximativ 100-200 m • Aceasta tehnologie permite producerea la un cost

relativ redus a arrayurilor personalizate pentru fiecare studiu, cu un numar moderat de spoturi.

• Un avantaj al sistemelor cDNA microarray este posibilitatea producerii arrayurilor cu structuri clonate care nu au fost inca secventiate, ceea ce poate facilita descoperirea de noi gene.

Page 11: Curs 9 2012

• Dezavantajul sistemului microarray cDNA consta in dificultatea mentinerii si utilizarii unor colectii voluminoase de clone de cDNA.Procesarea Imaginilor cDNA Microarray

• Tehnica aceasta are la baza hibridizarea acizilor nucleici, prin care se intelege tendinta a doua molecule simple DNA de a se uni intr-o structura dublu helix.

• Dupa hibridizare suprafata de sticla este scanata folosind excitatii laser pentru a determina cantitatea de probe DNA dublu inlantuite care s-a format in urma hibridizarii.

Page 12: Curs 9 2012

• Radiatiile luminoase emise in urma excitatiei laser sunt captate si astfel este obtinuta o imagine cDNA microarray.

• Dimensiunile si continutul unui astfel de microchip sunt: 8000 de gene printate pe o suprafata de 2x4 cm, cu diametrul unei probe de 75-100 µ m si 150 µ m distanta dintre probe.

• In cele ce urmaza vor fi prezentate principalele etape ale unui experiment microarray care are ca rezultat obtinerea unei imagini microarray:

• - prepararea microarray–ului

Page 13: Curs 9 2012

• • - prepararea unei probe AND complementar

etichetate cu un marker fluorescent • - hibridizarea - scanarea microarray-ului • - analiza datelor • In urma unui astfel de experiment se obtine o vasta

cantitate de informatie sub forma unor imagini microarray.

• Pentru a putea extrage informatii, aceste imagini sunt supuse unei serii de transformari specifice procesarii de imagini. Procesarea imaginilor microarray poate fi impartita in 3 etape.

Page 14: Curs 9 2012

• Prima etapa poarta numele de adresare (gridding) si are rolul de a asocia fiecarui spot din imagine un set de coordonate.

• Cea de-a doua etapa poarta numele de segmentare si consta in clasificarea pixelilor fie ca fundal fie ca informatie utila.

• Ultima etapa calculeaza valorile intensitatii fiecarui spot si estimeaza valorile intensitatilor din fundal.

Page 15: Curs 9 2012
Page 16: Curs 9 2012
Page 17: Curs 9 2012
Page 18: Curs 9 2012
Page 19: Curs 9 2012

• In aceasta tehnologie, fiecare pozitie de pe lama este atasata de un elecrod care poate fi programat sa atraga si sa concentreze proba marcata.

• Prin cresterea conditiilor de hibridizare separat pentru fiecare pata, rezolutia nucleotidei simple este posibila chiar si pe fragmente mai lungi de proba.

Page 20: Curs 9 2012
Page 21: Curs 9 2012
Page 22: Curs 9 2012
Page 23: Curs 9 2012

• Sinteza tintei fotolitografice. • O masca (stanga) permite activarea la lumina

de pe cip.• Cand o nucleotida este adugata, doar

punctele activate il vor atasa covalent (centru).

• Procesul este repetat pana secventele dorite sunt generate la fiecare pozitie pe cip (dreapta.)

Page 24: Curs 9 2012
Page 25: Curs 9 2012

• Prepararea sondelor pentru analiza matricilor necesita etichetarea fluorescenta a sondei test ca micromatrici si alte matrici de densitate mare sunt citite prin sisteme de detectie fluorescenta automata.

• Cea mai frecventa metoda de marcare folosita pentru ARN este sinteza cADN sau copiile ARN cu incorporarea nucleotidelor marcate.

• Pentru ADN, este folosita random priming sau nick translation.

Page 26: Curs 9 2012

• Pentru analizele de expresie a genelor, probele tinta imobilizate in cipuri sunt hibridizate cu mARN etichetat din celulele tratate sau diferite tipuri de celule pentru a evalua activitatea expresiei genelor reprezentate pe cip.

• Matricile folosite in aceasta aplicatie sunt clasificate ca matrici de expresie (12).

• Acestea masoara producerea sau transcriptia relativa a proteinelor din probe netratate sau normale (Fig. 6-26)

Page 27: Curs 9 2012

• DGGE exploateaza diferentele in denaturare dintre o molecula de ADN normala si una mutagena cauzate chiar de o singura nucleotida diferita in secventa.

• Atractia dintre baze succesive in acelasi ADN (stacking) poate afecta denaturarea ADN-ului bicatenar (11-13).

• Pentru DGGE fragmentele de ADN bicatenar in lungime de 200-700 bp sunt preparate prin amplificarea PCR a secventelor de testat sau prin digestia cu enzyme de restrictie.

• Fragmentele sunt reperate din geluri de poliacrilamida ce contin un gradient de concentrare de uree si formamida.

• O solutie 100% denaturanta este 7M uree si 40% formamida.

Page 28: Curs 9 2012

• Gradientii variaza intre 15% - 90% denaturanti, deobicei concentratia se trece de la o concentratie denaturanta mica si se ajunge la o concentratie mare in partea de sus a gelului.

• Gelurile de gradient pot fi preparate manual sau cu echipamente speciale (gradient makers).

• In timp ce fragmentele de ADN bicatenar se misca prin gel, cresc conditiile de denaturare, secventele atingand punctul de denaturare, iar catenele complementare incep sa denatureze.

Page 29: Curs 9 2012

• Domenii ale secventelor cu diferite caracteristici de topire, denatureaza la puncte diferite in gradient.

• Formarea zonelor monocatenare ale duplexului denaturant incetineste migratia fragmentului prin matricea de gel din punctul de denaturare initial.

• Chiar si o diferenta de o nucleotida intre doua molecule de ADN rezulta in denaturarea celor doua molecule la pozitii diferite in cadrul gelului.

• Banda de ADN mutagen, isi schimba pozitia in gel in comparatie cu banda de ADN normal.

• Separarea completa a catenei este prevenita prin intercalarea naturala sau artificiala a unor secvente bogate in GC (GC clamps).

• Acestea pot fi plasate la capetele produselor PCR prin folosirea primerilor cu coada la capatul 5’ si o coada GC 40bp 5’.

Page 30: Curs 9 2012

• Doua orientari de gradient sunt folosite in DGGE. Gradientul poate creste orizontal dealungul gelului;

• perpendicular pe directia de migrare a probei. • In vechea configuratie, o mixtura de probe este incarcata

intr-o singura fanta, fiind observata o curba sigmoida de migrare, ce corespunde caracteristicilor denaturante ale secventei.

• Acest tip de gradient este folosit in stabilirea unor conditii mult mai bine definite folosite in DGGE paralel.

• DGGE necesita un volum semnificativ de munca preparatorie pentru a optimiza conditiile de detectie a mutatiilor particulare ale genelor.

• In primul rand se realizaza fragmente de restrictie, produsele PCR sunt folosite pentru DGGE.

Page 31: Curs 9 2012
Page 32: Curs 9 2012

• Primerii sunt alesi astfel incat regiunea pentru screening a mutatiilor sa aiba una sau doua domenii de topire discrete (inafara de clemele GC), deoarece mai mult de doua domenii pot da un model complex dificil de interpretat.

• Domeniul GC ar tebui pozitionat adiacent la cel mai inalt domeniu de topire.

• Designul primerilor si caracteristicile de topire ale produsului rezultat necesita inspectia secventei ce terbuie examinata pentru mutatii.

• Gradientul optim si conditiile de rulare ale gelului trebuie deasemenea stabilite.

• Initial, secventele de proba sunt separate pe un gradient intins(20-80% formamida)pentru a gasi zona unde migrarile secventei sunt mult mai distincte.

• Aceasta zona va defini un gradient mai restrains (30-55%)pentru a fi folosit in testul actual.

Page 33: Curs 9 2012

• Conditiile de rulare pe gel trebuie strict controlate pentru rezultate reproductibile.

• Daca timpul de rulare sau temperatura nu sunt optime, decelarea secventelor diferite poate fi pierduta.

• Se poate realiza si DGGE parallel folosind un gradient mai mic; • probele sunt incarcate in linii simple si analizate prin

compararea liniilor. • Deoarece concentratiile mai mari de ADN sunt folosite pentru

acest test, detectarea cu bromura de etidiu este suficienta pentru a vizualiza rezultatele electroforezei.

• Regiunile specifice cu zone mari de secvente pot fi vizualizate prin transferul benzilor din gelul DGGE pe o membrana de nitroceluloza urmata de contactul cu sonde pentru secventa specifica (transferul Southern).

• Gelurile SSCP, DGGE sunt analizate prin compararea benzilor specimenelor de test, ce difera de cele din secventele de control.

Page 34: Curs 9 2012

• DGGE a fost folosit in detectarea mutatiilor genelor supresoare ale tumorilor (14), clonalitate (15) si polimorfismul populational (16).

• In DGGE genomic (17) fragmentele de restrictie ale ADN-ului genomic sunt separate pe un gel de gradient si apoi transportate si cercetate ca transfer Southern, orice zone din genom pot fi cercetate pentru mutatii.

• Similare in design cu DGGE sunt Doua metode : electroforeza in gel cu gradient constant (CDGE(18-19)) si electroforeza in gel cu gradient cu temperatura temporala (TTGE)20,21).

• CDGE necesita determinarea initiala a concentratiilor de denaturare optime pentru o mutatie a unei tinte particulare.

• Aceasta poate fi constata prin DGGE perpendicular sau prin folosirea programelor de calculator proiectate sa prezica caracteristicile de topire ale unei secvente de nucleotide pentru o paleta de conditii de temperatura si denaturare.

Page 35: Curs 9 2012

• Proba este rulata la combinatia optima de concentratie de denaturare si temperatura.

• Cum parametrii trebuie setati in acest fel, CDGE este folosita mai degraba in detectarea mutatiilor cunoscute decat screeningul mutatiilor necunoscute.

• CDGE a fost extins la electroforeza capilară cu denaturare constanta ce creste viteza si rularea separarii. (22)

• CDGE a fost folosit in detectarea mutatiilor in genele cancerului (23).

• TTGE este similara cu CDEG dupa concentratiile specifice de formamida si uree folosite in denaturarea duplexului ADN.

• In TTGE, spre deosebire de CDGE, diferentele in denaturare sunt revelate prin cresterea lenta a temperaturii gelului in timpul migratiei, ex: 63 grade – 68 grade C la 1.7 grade C/h.

Page 36: Curs 9 2012

• Acest lucru da o paleta mai intinsa de conditii de denaturare astfel incat fragmentele ce necesita compozitii diferite de denaturare prin CDGE sau pot fi revelate pe un singur gel, ca TTGE.

• Aceasta tehnica a fost folosita in cancer (24,25), genetica (26,27) si aplicatii industriale (28,29).

• Hibridizarea oligomerilor alele-specifici sau ASO• Hibridizarea specifica a alelelor sau ASO, se bazează pe

diferente ale temperaturii de topire a secventelor scurte de aprox. 20 baze cu una sau doua perechi necomplementare sau fara nici o complementaritate.

• La conditii si temperaturi specifice de hibridizare (stringenta), sonda monocatenara nu se va lega la o secventa tinta apropiata cu una sau doua baze necomplementare, pe cand o sonda perfect complementara va hibridiza cu tinta.

Page 37: Curs 9 2012

• ASO este o metoda dot blot, similara cu transferul Southern folosind tinte imobilizate si sonde marcate, prezente in solutie.

• A fost folosita pentru cercetarea mutatiilor cunoscute ca aparitie frecventa; spre exemplu in mutatiile BRCA1 si BRCA2 frecvent observate in cancerului de san (30) si mutatiile genei p16 in melanomul familial (31).

• Procedura incepe cu amplificarea regiunii genei de interes prin PCR.

• Dupa ce produsul PCR este identificat si transferat pe nitroceluloza sau membrane de naylon, membranele sunt umezite intr-o solutie de denaturare puternic salina NaOH.

Page 38: Curs 9 2012

• ADN-ul de pe membrane este neutralizat cu acid diluat si aplicat permanent pe membrana prin atasare prin reticulare cu ultraviolete.

• Sondele marcate, complementare secventelor mutante sunt hibridizate apoi transferate pe membrane in reactii separate sub conditii de stringenta specifice. (Fig. 9-3).

• Unele protocoale recomanda adaugarea sondelor nemarcate dirijate de secvente de tinte marcate in ordinea cresterii specificitatii de legare (32.)

• Hibridizarea poate dura 2-12 ore.

Page 39: Curs 9 2012

• Dupa hibridizare, sondele libere sunt indepartate prin clatirea membranelor, iar semnalul sondei este detectat deasupra punctelor ce contin secvente complementare sondei (Fig. 9-4)

• Aceasta metoda a fost folosita in testarile clinice pentru detectarea mutatiilor specifice si polimorfism precum si pentru tipizarea organismelor.

• ASO este folosita totodata ca metoda de rutina in laboratoarele clinice pentru tipizarea tesuturilor.

Page 40: Curs 9 2012

• Pentru analiza mutatiilor, sondele mutante si normale sunt imobilizate in membrana.

• Secventa de testat este amplificata prin PCR cu un primer normal si unul biotinilat.

• Produsele biotinilate sunt expuse apoi sondelor imobilizate sub conditii setate astfel incat doar secventa complementara exacta sa fie hibridizata.

• Produsele nelegate sunt spalate si indepartate, iar cele care raman legate sunt detectate cu un fragment FAB anti-biotin peroxidaza din hrean si expuse substratului cromogenic.

Page 41: Curs 9 2012

• Generarea unei reactii de culoare indica legarea unui test ADN la proba normala sau mutanta.

• Aceasta metoda a fost propusa pentru detectarea mutatiilor cu aparitie frecventa precum factorul V Leiden. (33)

• Typingul HLA de alele multiple la un singur specimen este realizata deasemenea prin aceasta metoda.

Page 42: Curs 9 2012

• Analiza curbei de topire• Ca DGGE si metodele similare, analiza curbei de

topire/fuziune (MCA) exploateaza caracteristicile de denaturare dirijate de secventa si asamblare ale duplexurilor ADN (34)

• Metoda este foarte folosita ca etapa postamplificare in real-time PCR (35,36).

• Ampliconii PCR generati in prezenta colorantilor fluorescenti specific-ADN, precum bromura de etidiu, SYBR verde sau LC Verde sunt incalziti la o rata de aproximativ 0.3grade C/sec.

• Colorantii, specifici ADN-ului bicatenar, produc initial un semnal inalt deoarece ADN-ul este bicatenar la temperatura joasa.

• Cum temperatura creste, duplexurile ADN incep sa se separe in monocatene pierd colorantii.

Page 43: Curs 9 2012

• Diferentele de secventa rezulta in caracteristici de topire diferite si TmS pentru fiecare secventa.

• Tm este adesea ilustrat ca un varf, schitand derivatul (viteza de descrestere) fluorescentei vs. temperatura.

• Rezultatele sunt interpretate de amplasamentul varfului de temperatura respectand temperatura pe axa X.

• Specimenele cu secvente identice ar trebui sa produca acelasi varf la Tm asteptate, in timp ce specimenele continand secvente diferite vor produce doua sau mai multe varfuri (Fig. 9-6)

• MCA din produsele PCR folosind coloranti nonspecifici este un mod simplu si cost-effective de screening al secventelor.

• Acesti coloranti nu sunt specifici secventei, totusi nu se fac diferenta intre ampliconii tinta si produsele straine din reactia PCR, precum dimerii primerilor si ampliconii amorsati gresiti.

Page 44: Curs 9 2012

• Desi proba tinta ar trebui sa fie identificata dupa Tm-ul ei, asemenea benzi de artefacte pot complica curba de topire si creea confuzii in interpretare.

• Specificitatea poate fi crescuta prin folosirea analizei curbei de topire de inalta rezolutie (HR-MCA) (37-39)

• Aceasta metoda foloseste transferul de energie de rezonanta fluorescenta (FRET) a sondei ce hibridizeaza una langa alta dealungul pozitiei secventei de analizat.

• Sondele emit fluorescenta doar atunci cand se leaga la secventa tinta deoarece fluorescenta FRET se bazeaza pe transferul de energie dintr-o molecula donor fluorescenta (fluor) intr-o sonda cu o molecula acceptor fluorescenta in cealalta sonda.

• Odata cu cresterea temperaturii, sondele dizociaza la un Tm specific. Cand sondele se disociaza de tinta, donorul nu mai este apropiat de acceptor iar fluorescenta scade.

Page 45: Curs 9 2012

• Daca secventa tinta are o secventa necomplementară intre tinta si sonda, legaturile de hidrogen sunt perturbate intre cele doua catene ale dublului helixului.

• Necomplementaritatea descreste temperatura de disociere, in comparatie cu secventele potrivite sau complmenentare.

• Un Tm mai scazut decat cel al sondei si al complementului acesteia, indica prin urmare prezenta unei mutatii, sau diferenta secventei dintre secventa de sonda cunoscuta si secventa test.

• FRET este cel mai frecvent realizata cu doua sonde; au fost dezvoltate si sistemele cu o singura sonda .

• Sonda simpla a fost proiectata sa emita fluorescenta mult mai difuz cand se hibridizeaza la tinta. Fluorescenta este pierduta prin disociere.

Page 46: Curs 9 2012
Page 47: Curs 9 2012

Fig 9-7 Analizarea curbei de topire cu probe FRET si SimpleProbe .O nepotrivire dintre tinta si proba vor

reduceTm-ul duplexului

Page 48: Curs 9 2012

• RFLP-polimorfismul lungimii fragmentelor de restrictie• Primul RFLP polimorf a fost descris in 1980. • RFLP au fost tintele moleculare originale folosite

pentru cartografia genelor, identificarea umana si testarea parentala.

• RFLP sunt observate ca si diferente in marime si numarul de fragmente generate de digestia ADN cu enzimele de restrictie (Fig. 11-1).

• Marimea fragmentelor poate varia ca rezultat al schimbarilor in secventa nucleotidica sau intre locurile de recunoastere ale unei enzime de restrictie.

• Schimbarile nucleotidice pot distruge, schimba sau crea locuri enzimatice de restrictie, alterand numarul de fragmente.

Page 49: Curs 9 2012

• Primul pas in utilizarea RFLP este de a construi o harta a enzimelor de restrictie a regiunilor de ADN investigate.

• Tipuri de alterari ale secventelor ADN ce schimba lungimea fragmentului de restrictie. De exp o secventa normala are un loc EcoR1 (GAATTC).

• Substitutia unei singure baze (mutatie punctiforma), poate distruge locul EcoR1 sau poate creea un nou loc de restrictie dar si insertii, duplicatii sau deletii de orice numar de baze (de la a treia la a cincea linie).

• Inseratiile, duplicatiile si deletiile dintre doua locuri de restrictie schimba marimea fragmentului fara a afecta locurile de restrictie. )

Page 50: Curs 9 2012

50

SNPs, RFLPs, point mutations

GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC

GAATTC GAATTC GAGTTC GAATTC GAATTCGACTTC

Pt mutSNP

RFLPSNP

RFLPPt mutSNP

SNP

Page 51: Curs 9 2012

• O data ce se cunoaste harta de restrictie, numarul si marimea fragmentelor de restrictie ale unei regiuni de testare ADN taiata cu enzime de restrictie , sunt comparate cu numarul si marimea fragmentelor bazate pe harta de restrictie.

• Polimorfismele sunt detectate prin observarea numarului fragmentelor si marimile diferite de cele asteptate de la harta de restrictie de referinta.

• Intr-o secventa lineara de ADN, pierderea locului de recunoastere pentru enzima (BglII in figura) rezulta in alterarea marimii si numarului de benzi detectate dupa electroforeza pe gel

Page 52: Curs 9 2012

• Initial, typingul RFLP la oameni necesita utilizarea unei tehnici de transfer Southern (vezi Capitolul 5).

• ADN-ul a fost taiat cu enzime de restrictie, migrat prin electroforeza cu gel si transferat pe o membrana.

• Sonde formate din regiuni specifice ale ADN-ului continand potentiale RFLP au fost apoi hibridizate cu ADN-ul de pe membrana pentru a determina marimea benzilor rezultate.

• Nu toate fragmentele de restrictie sunt detectate de sonda; cu toate acestea toate cele trei polimorfisme pot fi identificate.

Page 53: Curs 9 2012

• o mutatie G-T va schimba secventa unui loc normal (+) la cel nerecunoscut de enzima (-).

• Prezenta sau absenta locurilor polimorfe este evidenta din numarul si marimea fragmentelor dupa taierea ADN-ului cu BglII.

• ADN-ul este mostenit ca si un cromozom de la fiecare parinte. • Fiecare cromozom poarta polimorfismul sau astfel incat

progenitura mosteneste o combinatie a polimorfismelor parintilor.

• Cand sunt vizualizate ca si fragmente ce hiridizeaza de o proba a unei regiuni polimorfe, modelele de banda reprezinta combinatia de RFLP mostenite de la fiecare parinte.

• Datorita recombinarii si a amestecarii la intamplare, fiecare persoana are un set unic de RFLP, jumatate mostenite paternal si jumatate maternal.

Page 54: Curs 9 2012

• Fiecare genotip va da un model de banda descriptiv• Utilizarea unui transfer Southern a unei sonde pentru RLP.• Intr-o secventa ADN, doar fragmentele cu

complementare unei sonde pot fi vizualizate. • De-a lungul multor generatii, mutatiile, recombinarile

intra si intercromozomale, conversia genelor si alte evenimente genetice au crescut diversitatea secventelor ADN-ului.

• O consecinta a acestei diversitati genetice este ca un singur loc, adică o gena sau o regiune de ADN , va avea mai multe versiuni, sau alele.

• Oamenii sunt diploizi; adica, oamenii au doua copii ale fiecarui locus. Daca aceste alele sunt la fel, locusul este homozigot; daca doua alele sunt diferite , locusul este heterozigot.

Page 55: Curs 9 2012

• Mai mult de 2000 de locuri RFLP au fost descrise in ADN-ul uman.

• Unicitatea polimorfismului la fiecare individ este baza identificarii umane la nivel molecular.

• Detectarea RFLP cu ajutorul transferului Southern a facut posibila testarea paternala si identificarea umana pentru prima data.

• Protocoalele RFLP pentru identificarea umana in majoritatea laboratoarelor din America de Nord a folosit enzima de restrictie HaeIII pentru fragmentarea ADN-ului genomic.

• Multe laboratoare europene au folosit enzima HinflI. • Aceste enzime taie ADN-ul destul de frecvent pentru a

dezvalui polimorfismele in multiple locatii din genom.

Page 56: Curs 9 2012

• Cartografierea genetica cu RFLP • Polimorfismele sunt mostenite intr-un model

mendelian si locatiile multor polimorfisme din genom sunt cunoscute.

• De aceea, polimorfismele pot fi folosite ca si semne sau markere, in genom pentru a determina locatia altor gene.

• In afara de a arata istoria clara a familiei sau identificarea directa a unui factor genetic, se poate confirma ca o boala are o componenta genetica prin demonstrarea unei asocieri genetice apropiate sau a unei legaturi cu un marker cunoscut.

• Metodele statistice formale sunt folosite pentru a determina probabilitatea ca o gena necunoscuta este localizata aproape de un marker cunoscut din genom.

Page 57: Curs 9 2012

• Cu cat un polimorfism anume este prezent le persoanele cu un fenotip al bolii, cu atat este mai probabil ca gena afectata este localizata aproape de un polimorfism.

• Acesta este baza pentru cartografierea legaturilor si una din caile prin care sunt identificate componentele genetice ale bolii.

• RFLP a fost folosit pentru a cartografia una din genele mutate in cancerul de san mostenit. 61, 62

• Urmarind familiile urmatoare cu o incidenta mare de cancer de san si ovarian, ea a gasit RFLP aproape tot timpul prezent in membrii familiei afectate.

• Din cauza ca locatia RFLP pe genom a fost cunoscuta (17q21), gena BRCA1 a fost trecuta pe harta la aceasta pozitie pe bratul lung al cromozomului 17.

Page 58: Curs 9 2012

• RFLP si testarea parentala • La organismele diploide, secventa cromozomiala

este mostenită pe jumatate de la fiecare parinte. • Acesta include polimorfismele ADN situate de-a lungul

genomului. • Avand avantajul unei combinatii unice, prin RFLP la fiecare

individ, se poate deduce contributia unui parinte cu alele pentru un fiu sau o fiica in combinatia de alele a copilului si a parintelui.

• Marimile fragmentului unui individ ca si combinatie a acelora de la fiecare parinte.

• La un test de paternitate, alelele sau marimile fragmentului unei progenituri si a mamei sunt analizate.

• Fragmentele care raman (cele care nu se portivesc mamei ) trebuie sa vina de la tata.

Page 59: Curs 9 2012

• Presupusii tati sunt identificati, sau inclusi, fapt bazat pe abilitatea de a oferi alelele ramase.

• In afara de posibile mutatii, o diferenta de o singura alela pot exclude paternitatea.

• Un test de paternitate RFLP simplificat• Din cei doi presupusi tati, doar unul a putut

furniza fragmentele ce nu proveneau de la mama. • In acest exemplu, doar doua locuri sunt aratate. • Un test de paternitate necesita analiza a cel putin

opt locuri. • Cu cat mai multe locuri sunt testate cu atat creste

probabilitatea unei identificari pozitive a tatalui.

Page 60: Curs 9 2012

• Mostenirea RFLP. • Doua regiuni genetice diferite, sau locuri, sunt

aratate, locul 1 si locul 2.• Exista mai multe versiuni sau alele pentru fiecare

loc. • A -se observa ca tatal este heterozigot la locul 1 si

homozigot la locul 2. • Alelele de la copil vor fi o combinatie de o singura

alela de la fiecare parinte. • B. Doi presupusi tati (AF) sunt testati pentru

paternitata unui copil al carui profil partial RFLP este aratat in gelul inferior.

• Alelele mamei sunt reprezentate cu verde. • Un AF (AF1) este exclus de la paternitate.

Page 61: Curs 9 2012
Page 62: Curs 9 2012

• Identificarea umana utilizand RFLP• • Prima ustensila genetica folosit pentru

identificarea umana au fost antigenii grupelor sanguine ABO.

• Cu toate ca acest tip de analiza putea fi faut in cateva minute, puterea de discriminare era mica.

• Cu doar patru grupe posibile, aceasta metoda a fost buna doar pentru excluderea (eliminare) unei persoane ca sursa de material biologic si a fost informativa doar in 15% pana la 20% din cazuri

• . Analiza locurilor HLA polimorf ar putea adauga un nivel mai mare de discriminare, cu excudere in 90% din cazuri.

• Testand atat ABO cat si HLA se poate exclude o persoana in 97% din cazuri dar tot nu ofera o identificare pozitiva.

Page 63: Curs 9 2012

• Utilizarea initiala a ADN-ului ca si unealta de identificare se baza pe RFLP detectabil prin transferul Southern.

• RFLP poate apare dintr-un numar de evenimente genetice. • Una dintre acestea este insertia sau deletia nucleotidelor dintre

locurile de restrictie. • Acest lucru apare frecvent in secventele repetate de ADN. • Repetarile tandem ale secventelor de toate marimile sunt prezent

in ADN-ul tandem de numar variabil (VNTR) sau minisateliti. • Aceste repetari sunt destul de mari astfel incat pierderea sau

castigul unei repetari poate degradata cu ajutorul electroforezei cu gel a unei digestii cu enzima de restrictie.

• Enzimele de restrictie HaeIII (locul de recunoastere GGCC) sau HinfI (locul de recunoastere GANTC), genereaza fragmente care sunt destul de mici pentru a dezintegra pe cele ce contin un numar diferit de repetari si deci dau un model informativ pentru transferul Southern.

Page 64: Curs 9 2012

• Primul sistem de profilare al ADN-ului uman a fost introdus de catre Serviciul de Stiinta Criminalistica din Anglia in 1985 folosind transferul Southern al lui Alec Jeffreys, un sistem cu locuri multiple de proba (MLP)-RFLP. 2

• Aceasta metoda utilizeaza de la trei pana la cinci probe pentru a analiza de la trei pana la cinci locuri pe acelasi transfer.

• Sondele pentru mai multe locuri in acelasi timp au produs modele care erau foarte diferite intre indivizi dar necesitau o anume experinta pentru a optimiza si interpreta.

• In 1990, sistemele cu sonde cu un singur loc (SLP) au fost stabilite in Europa si America de Nord. 3,4

• Analiza unui singur loc pe rand a dat modele mai simple in cazurile in care specimenele ar putea contine ADN de la mai mult de un singur individ.

Page 65: Curs 9 2012
Page 66: Curs 9 2012

• Metode de clivaj• Polimorfismul marimii fragmentelor de restrictie• Daca o mutatie schimba locatiei tintei enzimei de

restrictie sau schimba marimea unui fragment generat de o enzima de restrictie, analiza polimorfismului marimii fragmentului de restrictie (RFLP) poate fi folosita in detectarea alterarii secventelor.

• Pentru a realiza PCR-RFLP, regiunea din jurul mutatiei este amplificata iar mutatia este detectata prin taierea ampliconului cu enzima de restrictie corespunzatoare .

• Mutatiile pot inactiva o locatie de restrictie cu aparitie naturala astfel incat digestia produsului PCR sa rezulte in taierea ampliconului mutant dar nu si a amplicnului normal sau viceversa.

Page 67: Curs 9 2012

• Desi simplu, PCR-RFLP necesita proiectare atenta polimorfisme rare au fost raportate ca ar incurca rezultatele RFLP (94).

• Unele metode PCR-RFLP sunt folosite extins pentru detectarea mutatiilor cu aparitie preponderenta precum factorul V Leiden (95) si mutatiile HFE.

• PCR-RFLP a fost folosit deasemenea pentru typingul HLA.• PCR-RFLP poate fi multiplexat sa detecteze mai mult decat

o mutatie simultan. • Acest lucru a fost practic pentru detectarea mutatiilor in

gene separate ce afecteaza acelasi fenotip ex: factorul V Leiden si protrombina.

• Alternativ, o combinatie de SSP-PCR si PCR-RFLP este deasemenea aplicata in detectarile simultane ale mutatiilor in mai mult de un locus.

Page 68: Curs 9 2012

• Un exemplu este aratat in figura 9-22, in care o sonda desemnata sa produca o locatie de restrictie in amplicon este folosita pentru fiecare gene in PCR-ul multiplex.

• In ex. sondele sunt proiectate sa genereze o locatie HindIII in amplicon.

• Reactia PCR si asimilarea HINDIII sunt realizate in acelasi flacon iar produsele sunt separate pe o singura banda de gel (97-99).

• Aceasta procedura este folosita in analizele clinice ale factorului V Leiden si mutatiiilor protrombinei.

Page 69: Curs 9 2012

• Descoperita in 1994, mutatia Leiden (1691 A->G, R506Q) in gena factorului de coagulare V F5 (1q23) cauzeaza un fenotip hipercoagulabil (trombofilic).

• Acest genotip este prezent in forma heterozigota in 4%-7% din populatia generala iar 0.06%-0.25% din populatie este homozigota pentru aceasta mutatie.

• In cele din urma, ocurenta anuala a trombozei venoase este 1 la fiecare 1000 persoane.

• Dezordinea este tratata cu anticoagulante. Riscul trombozei creste odata cu utilizarea contraceptivelor.

Page 70: Curs 9 2012

O mutatie cadru (dreapta sus) rezulta intr-o proteina trunchiata sintetizata in vitro dintr-un produs PCR. Peptida trunchiata este revelata prin eletroforeza in gel de poliacrilamida (jos). Rezultatele sunt aratet din analiza sondei

mutant homozigot (MUT) si proba normala (NL)

Page 71: Curs 9 2012

PCR-RFLP Secventa normala (linia de sus) este convertita la locatia siteului BAMH1 (GGATCC) printr-o mutatie G>A. Prezenta mutatiilor este detectata prin testarea produsului PCR cu BAMH1. Panoul de jos modelel de gel prezise pentru probele homozigot normal, homozigot mutant si heterozigot, taiate (U) sau

netaiate cu BAMH1 (B) 

Page 72: Curs 9 2012

PCR-ul multiplex cu sonde mutagene pentru detectarea mutatiilor in factor V si protrombina. Secventele de sonda sunt proiectate sa genereze o locatie HindIII in produsul PCR daca mutatia este prezenta. Produsele PCR

protrombina si factor V sunt de marimi diferite ce pot fi decise in gel intr-o singura banda

Page 73: Curs 9 2012

• Protrombina este precursorul trombinei in etapa de coagulare si este necesara pt conversia fibrinogenului in fibrina.

• O mutatie in regiunea 3’ netradusa a genei ce codifica pt protrombina sau factorul de coagulare II, F2 (11p11-q12), rezulta intr-un risc crescut de tromboza.

• Laboratoarele pot testa atat pt mutatiile F2 cat si pentru F5.

• Ambele pot fi prezente in acelasi individ, caz in care risul trombozei este mai mare decat in mutatiile simple.

Page 74: Curs 9 2012

Plasmid

Page 75: Curs 9 2012

Insertia ADN

Page 76: Curs 9 2012
Page 77: Curs 9 2012
Page 78: Curs 9 2012

· Transformation

– cell made competent to take up DNA

– competent cells: electroporation – poke holes in membrane and calcium chloride- make cells more permeable to DNA

· Transfection

– when the cloning vector used has aspects of a virus, the host cell can be infected (transfected) to insert the recombinant molecule

· Electroporation

– the cell is placed in an electric field such that small pores are temporarily opened in the membrane. Added DNA can enter through these pores.

Page 79: Curs 9 2012

Transformare

Page 80: Curs 9 2012

Selectia

– Antibotic resistance

– · Plasmid vector contains an ampicillin resistance gene making the cell resistant.

– · Growth of transformed cells (cells receiving the plasmid) can be identified on agar medium containing (e.g.) ampicillin.

Page 81: Curs 9 2012

Transformare

Page 82: Curs 9 2012

Selectia X-gal

Page 83: Curs 9 2012

Finding the right Clone

Page 84: Curs 9 2012

Genomic Library Construction

Page 85: Curs 9 2012
Page 86: Curs 9 2012

• Competent cells: Treat the cells with calcium chloride which makes the cell membranes more permeable to DNA. This technique succeeds with species that aren't naturally competent e.g. E. coli.

• Electroporation - alternate method

Page 87: Curs 9 2012
Page 88: Curs 9 2012

• Comparat cu fragmentele de ADN, plasmidele sunt vehicole mult mai eficiente pentru transferul genelor de la o gena la alta.

• In timpul lizei celulare, plasmidele superspiralate pot intra in alte celule mult mai eficient.

• Plasmidele au fost folosite extensiv in tehnologia ADN-ului recombinant pentru introducerea unor trasaturi specifice.

• Prin manipularea plasmidelor in vitro, pot fi introduse gene specifice in celule pentru a produce noi fenotipuri sau organisme recombinante.

• Abilitatea de a exprima trasaturi genetice de la plasmide fac posibila manipularea fenotipului in moduri specifice.