Lectori: Marina Otelea & Adrian Onu

Genomica curs 1

DATE GENERALE: • obiective • derulare • modalitate de evaluare a cunostiintelor

SCURTA RECAPITULARE A NOTIUNILOR DE BAZA DE

GENETICA SI BIOLOGIE MOLECULARA: • clasificarea genelor • functiile genelor • mecanismul celular de sinteza a proteinelor

GENOMICA: • Definitie, scurt istoric • Elemente de diferentiere fata de genetica • Principalele ramuri ale genomicii

Genomica – curs 1

Descrierea metodelor de baza utilizate in genomica si integrarea lor in conceptele medicinii actuale privind diagnosticul si tratamentul bolilor Analiza aplicarii metodelor genomicii in practica medicala Interpretarea datelor obtinute prin tehnicile de laborator utilizate in genomica si prin accesarea programelor de analiza de date

Studiul genomicii face parte din componenta de formare in biotehnologie care se adreseaza:

Intelegerii fenomenului biologic in ansamblul sau

Utilizarii acestor cunostiinte in: Definirea noilor modalitati de depistare, Elaborarea noilor metode de diagnostic, Evaluarea prognosticului bolilor, Selectia si Dezvoltarea de noi metode de terapie

PRIN DERULAREA CURSULUI PRIN APLICATII PRACTICE

Cursul va asigura: Definirea domeniului de studiu al

genomicii si a ramurilor sale: epigenomica, genomica functionala, farmacogenomica, transcriptomica.

Recunoasterea si caracterizarea principalelor metode moleculare si bioinformatice utilizate in genomica: principii de baza, metodologie, rezultate, interpretare

Utilizarea metodelor genomicii in stabilirea etiologiei, diagnosticul, evaluarea prognosticului si in tratamentul bolilor

Respectarea principiilor eticii in practica genomicii

Aplicatiile vor asigura: Experimentarea tehnicilor de

laborator de baza utilizate in genomica

Demonstrarea utilizarii unor programe informatice in genomica

Interpretarea eficacitatii metodelor genomice comparativ cu alte metode de laborator in stabilirea diagnosticului si prognosticului

Evaluarea datelor unui studiu clinic pe baza criteriilor medicinii bazate pe dovezi

a) Activităţile evaluate şi ponderea fiecăreia : • 5o% în timpul anului, astfel: 25% lucrare de laborator 25% lucrare de control la ½ semestrului.

• 50% examen b) Cerinţele minimale pentru promovare:

• Parcurgerea tuturor lucrărilor de laborator; • Obţinerea a 50% din punctaj pentru laborator; • Obţinerea a 50% din punctaj la lucrarea de control; • Obţinerea a 50% din examenul final.

c) Calculul notei finale:

• prin rotunjirea punctajului final

Genomica curs 1

Genomul include toate structurile celulare care contin informatie genetica intr-un organism viu.

1. Genomul nuclear include:

• totalitatea celor 46 cromozomi

• 30 000 – 40 000 gene

• approx. 3 miliarde de perechi de baze O pereche de baze are 0.00000000034 metri. Tiparit in format Times New Roman 12,

secventele intregului genom s-ar intinde pe 5000 km Secventa ADN este identica TUTUROR indivizilor apartinand speciei umane in

proportie de 99.9% - fiecare din nou suntem doar 0.1% unici Cum se pot diferentia celulele din diferite tesuturi?

• Housekeeping genes - gene a caror exprimare este esentiala pentru functionarea majoritatii tipurilor celulare

• Factori de transcriptie cu specificitate de tesut - proteine care fac ca o gena sa fie exprimata numai intr-un anumit tesut.

2. Genomul mitocondrial: are 16 569 perechi de baze si doar 37 de gene. Genele

mitocondriale au rol in sinteza ATP-azelor.

ADN este un polimer liniar, neramificat, in care subunitatile monomerice sunt 4 nucleotide distincte din pdv chimic, legate intre ele in orice ordine in lanturi cu lungimi de sute, mii si chiar milione de unitati de lungime. Fiecare nucleotid al polimerului ADN are 3 componente:

• 2’ deoxiroboza • o baza azotata (T, A, G,C) • un grup fosfat

In formarea polinucleotidului , nucleotidele individuale sunt legate intre ele prin legaturi fosfodiesterice intre atomii de carbon 5′- si 3′-. Reactia de polimerizare presupune eliminarea a 2 grupari fosfat (β- si γ) de la un nucleotid si inlocuirea gruparii hidroxil atasate de carbonul 3′- al celui de al doilea nucleotid. Cele doua capete ale nucleotidului sunt din pdv chimic distincte, una avand o grupare trifosfat areactiva atasata la carbonul 5′(capatul 5′) si o alta grupare areactiva hidroxil atasata la carbonul 3′ (capatul 3′).

Polinucleotidul are o directie chimica, exprimata fie 5′→3′ (in jos ) fie 3′→5′ (in sus). Consecinta polaritatii fosfodiester –ului de legatura este aceea ca reactia chimica necesara extinderii polimerului de ADN in directia 5′→3′ este diferita de reactia chimica necesara extinderii in directia 3′→5′.

Toate ADN-polimerazele naturale pot face doar sinteza in directia 5′→3′ . Aceeasi limitare apare si pentru ARN-polimeraze, enzimele care fac copii ARN pornind de la moleculele de ADN.

Sinteza AND-ului se face in directia 5′→3′, cu adaugarea unui nou nucleotid la carbon 3′, la capatul polinucleotidului existent. Gruparile fosfat β- si γ- ale nucleotidului sunt eliberate sub forma de molecula pirofosfat.

regula imperecherii bazelor: A-T, C-G Dublu helix orientat spre dreapta Cele doua catene sunt opuse ca directie Helix-ul e stabilizat prin 2 tipuri de inter-reactii chimice:

• Legaturi de H intre perechile de baze de pe cele 2 catene

• Interactiile hidrofobe (π−π) intre perechile de baze adiacente

Replicarea este semiconservativa si sinteza de lanturi ADN este semidiscontinua

Asimetria sintezei celor doua catene in timpul replicarii ADN.

Reactia este catalizata de ADN-polimeraza (vezi Tabel 1)

α β γ δ ε

Locatie Nucleara Nucleara Mitocondriala Nucleara Nucleara

Functie Sinteza si priming-ul catenei secundare

Reparare ADN

Replica ADN mitocondrial

Sintetizeaza catena principala

Repara ADN

3′ → 5′ exonucleaza

Nu Nu Da Da Da

Tipuri de ADN-polimeraza

Haplotip - un grup de alele, de obicei mostenite impreuna Alele: una din doua sau mai multe versiuni de secventa genetica

(gene) intr-o locatie specifica a genomului. Locus: Locatia specifica cromozomiala a genei sau a altei

secvente ADN de interes. Gena - un segment de ADN ce contine informatia biologica

necesara codificarii unui ARN si/sau a unei molecule polipeptidice

Exon - o regiune codanta in interiorul unei gene discontinue Intron -o regiune non-codanta in interiorul unei gene discontinue Codon – un triplet de nucleotide care codifica pentru un singur

aminoacid SNP (polimorfism nucleotidic unic): o forma comuna de variatie

in secventa genetica din cadul genomului uman Enhancer (amplificator) o secventa reglatoare care creste rata

transcrierii unei gene sau unui grup de gene localizate la o distanta in oricare din directiile lantului ADN.

Promoter - secventa de nucleotide, in amonte (upstream) de locus-ul genei, de care se leaga ARN-polimeraza pentru a initia transcrierea.

Insulator - segment al ADN care actioneaza ca o granita intre doua domenii functionale.

Primer: o molecula (sub forma unui lant scurt de ARN sau ADN) a carui prezenta este necesara in formarea unei alte molecule (sub forma unui lant mai lung de ADN).

CROMOZOM

HAPLOTIP

ALELE

GENA

INTRON EXON

CODON

SNP

PROMOTOR

AMPLIFICATOR

INSULATOR

Pentru aprox. ½ din genele umane functia este cunoscuta. Cea mai mare parte din gene codifica proteine; - 25% sunt implicate in exprimarea, replicarea si mentinerea genomulu - 20% specifica componente ale cailor de semnalizare ale transductiei care regleaza exprimarea genomului sau moduleaza raspunsul la semnale externe celulei - 17.5% codifica enzime necesare functionarii celulelor - restul sunt legate de transportul compusilor in interiorul si in exteriorul celulei, plicaturarea proteinelor in structura lor tridemensionala corecta, raspunsul imun, sinteza de proteine structurale ale citoscheletului - < 2500 specifica diferite tipuri de ARN non codant

Schema proceselor intracelulare care conduc la sinteza proteinelor

Gena discontinua = gena a carei informatie necesara sintezei proteinei este impartita in mai multi exoni, separati intre ei de introni

Segmente de gena = parti ale genei, care inainte de a fi exprimate trebuie sa fie legate de alte segmente genice dintr-o alta parte a locusului genei respective

Pseudogena este o parte nonfunctionala a unei gene, de obicei una a carei secventa de nucleotide s-a modificat atat de mult incat nu mai poate fi citita

Diferentele intre genomurile individuale sunt datorate in mare masura single nucleotide polymorphisms (SNP), pozitii in genom in care unii indivizi au un nucleotid (e.g. A) si altii au un nucleotid diferit (e.g. G).

Au fost identificate peste 1.4 million de SNP, in medie 1 la fiecare 2.0 kb de secventa.

In medie, tot la lungimi de 2 kb exista un microsatelit (numit si un tandem scurt repetat = short tandem repeat sau STR) care este o serie de nucleotide repetate (e.g. CACACACA) in care numarul de repetitii este variabil la diferiti indivizi.

Sunt SNP si microsateliti nu au nici un efect (cunoscut) asupra functionalitatii genomului, dar multi altii au. S-au descris deja 60000 de SNP care au impact asupra activitatii genelor, determinand variatiile care dau unicitatea fiecarui individ.

Secventa pentru Hb adulta normala Secventa pentru Hb patologica

Hb normala Hb patologica

Celule rosii normale Hb A

Celule rosii patologice HbS

Defectul genetic duce la substituirea acidului

glutamic cu valina formarea Hb S. • In conditii normale de oxigen, este o mutatie benigna. • In conditii de oxigen scazute, HbS se polimerizeaza. Forma deoxy Hb

expune o zona hidrofoba pe partea proteica a moleculei. Reziduurile hidrofobe ale valinei in pozitia 6 a lantului β al Hb se pot asocia cu aceasta, determinand agregarea moleculelor de HbS si formarea de precipitate.

Manifestarile clinice: • Anemia cu pusee de hemoliza

• Crize vaso-ocuzive • Sechestrare splenica

• Crize algice, embolii, etc.

Controlul primar al transcriptiei are loc in regiunea ADN-ului numita promoter, care ocupa o pozitie “upstream” (in directia 5) fata de partea genei care va fi transcrisa in ARN (regiunea protein-codanta a genei).

O mare varietate de proteine diferite recunosc secventele specifice de ADN in regiunea promoter-ului si se leaga de ADN, fie pentru a favoriza, fie pentru a bloca legarea ARN - polimerazei

ARN-ul este transcris ca lant unic complementar in secventa de baze cu un lant (lantul matrita) al genei. Numerosi si variati factori de transcriptie (TF) sunt necesari pentru a lega secventele promoter-ului din imediata vecinatate a genei, pentru ca sa poata pozitiona si ghida ARN polimeraza care va face transcriptia. Sinteza lantului este initiata cu un α nucleozid trifosfat si alungirea lantului se realizeaza prin aditii succesive de reziduuri nucleozid monofosfat furnizate de rNTPs la capatul 3′ OH.

In consecinta, capatul 5′ va avea un grup α trifosfat, care poate apoi suferi modificari (ex. prin capping) iar capatul 3′ va avea o grupare hidroxil libera. Secventa de ARN este in mod normal identica cu catena sens a genei (exceptand U care inlocuieste T) si complementara cu lantul matrita.

• ARN mesager (ARNm), sunt transcripturi ale genelor codante care sunt translatate in proteine • ARN ribozomal (ARNr) component al ribozomilor • ARN de transfer (ARNt) molecule mici care transporta amino acizi catre ribozomi, asigurand ca acestia sa fie legati in ordinea specificata de secventa de nucleotide a ARNm. • ARN nuclear mic (snARN sau U-RNA) bogat in uridina este implicat in

procesarea ARNm • ARN mic nucleolar (sno RNA) are un rol in procesarea ARNr. • ARN mic citoplasmatic (scRNA), un grup ce include molecule cu mai multe functii, partial cunoscute.

Genomica – curs 1

“For the newly developing discipline of mapping/sequencing (including analysis of the information) we have adopted the term GENOMICS. We are indebted to T. H. Roderick of the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) for suggesting the term. The new discipline is born from a marriage of molecular and cell biology with classical genetics and is fostered by computational science. “

Cartografierea (mapping) determina localizarea genelor pe cromozomi si pozitia lor relativa unele fata de altele Secventierea genelor presupune stabilirea ordinii nucletodelor in interiorul genelor, adica cartografierea pana la maximum de detaliu. Cele doua operatiuni sunt interrelationate.

Gena

Cromozom

Hibridizare

Genomica

Arii principale (descrise initial de McKusick si Ruddle) : Cartografierea genelor si a fragmentelor ADN prin diferite metode, inclusiv dezvoltarea

de metode noi Secventierea acizilor nucleci ai genelor sau a altor portiuni de interes din genom Descrierea distributiilor cromozomiale si spatiale ale familiilor de gene si ale genelor

care au secvente comune de acizii nucleici sau de aminoacizi Analiza comparativa a genomurilor pentru a evidentia proprietati structurale,

functionale, sau de evolutie a speciilor Pattern-uri de organizare in interiorul genomului care funizeaza dovezi despre

reglarea genelor si dezvoltare Metode pentru clonare genomica, cartografiere de restrictie si secventiere de ADN Metode informatice si descrierea de algoritmi pentru manipularea datelor privind ADN

si proteinele Mijloace novatoare de representare si corelare a secventiei ADN, clivajului

endonucleazelor de restrictie si a cartografierii genelor pe cromozomi pentru intelegerea ierarhiei structurii cromozomului

Analiza legaturii datelor genetice in urmarirea informatiei privind bolilor ereditare Dezvoltarea de tehnici experimentale,informatice, si de management al bazelor de date

cu larga aplicabilitate pentru a obtine date ale organizarii genomului uman ca si de ilustrare a studiilor paralele ale genomurilor altor organismelor inferioare pe scara evolutiei

Genomics – EDITORIAL –

A New Discipline, A New Name, A New Journal Victor A. McKusick and Frank H. Ruddle GENOMICS 1, 1-2 (1987)

Genomica este o ramura a biotehnologiei care utilizeaza tehnicile geneticii si biologiei moleculare pentru cartografierea genetica si secventierea ADN-ului unor seturi de gene sau a intregului genom al unor organisme selectate, organizand resultatele in baze de date; aplicabilitatea datelor genomicii apartine medicinii si biologiei.

Genomica studiaza structura genelor pana la detalierea SNP, functionalitatea lor inclusiv interactiunea dintre ele si integrarea lor intr-un ansamblu in corelatie cu factorii de mediu care le influenteaza exprimarea.

Daca genetica studiaza alcatuirea cromozomilor si modificarile majore aparute la

nivelul lor care fie determina un caracter fenotipic definit, fie o boala unifactoriala, (am putea sa o asimilam cu anatomia si anatomia functionala) genomica studiaza genele in totalitatea si mai ales in dinamica lor (fiziologia si fiziopatologia). In aceeasi masura in care nici fiziologia nu s-a putut dezvolta fara anatomie, nici genomica nu s-a putut dezvolta fara genetica.

Saltul de la genetica la genomica s-a putut face doar prin aparitia tehnicilor experimentale de identificare simultana a unui numar enorm de parametrii (de ordinul zecilor de mii) precum si a celor informatice care sa permita procesarea acestor date care nu mai au un caracter experimental intuitiv.

SCOPUL GENOMICII Intelegerea legaturii dintre - Secventa DNA Biologie/BOALA (Genotip) (Fenotip) MEDIU

ATTCGCATGGACC C

A

GENETICA GENOMICA

Localizeaza gene Determinare a bolii Identificare de gene Studiul portiunilor

“functionale” care codifica anumite proteine

Rezultate clinic (la nivel individual) relevante

Identifica interactiuni Asocierea de riscuri Studiul intregului genom Studiul tuturor portiunilor (SNP

40% in regiunile intergenice si 40% in introni non codanti)

Rezultate populationale relevante Rezultate clinice in stabilirea

prognosticului, selectia tratamentului

OMS: Genetica studiaza ereditatea iar Genomics studiaza genele si functiile lor prin tehnici specifice. Principala diferenta intre cele doua este ca genetica investigheaza functionalitatea si structura unei gene individuale in timp ce genomica abordeaza toate genele precum si inter relatiile dintre el cu scopul de a identifica influenta lor reciproca asupra functionarii, cresterii si dezvoltarii organismului.

GENETICA GENOMICA

Studiul cariotipului Metode citochimice Marcare radioactiva

Biologie moleculara + informatica

Tehnici de secventiere a ADN si de interpretare bioinformatica a rezultatelor

Amplificarea genica Analiza acizilor nucleici pe

baza hibridizarii

Validarea datelor este primul pas in prelucrare. In functie de metoda si de tipul de studiu folosit se aplica: • metode de statistica generala (ex: Procentul probelor

genotipate din totalul probelor lucrate, ratele de eroare inconsistente cu o transmisie normala a cromozomilor intre membrii familiei,etc).

• Identificarea probelor eronate si indepartarea lor (ex. Proportie mult mai mare de heterozigoti decat cea asteptata,)

• Identificarea unei calitati deficitare a SNP-urilor si inlaturarea acestor probe (Hardy Weinberg Equilibrium (HWE), valoare p < 10-4 to 10-6)

Validarea rezultatelor.

• In bazele de date deja existente • In practica experimentala (ex. prin tehnici de clonare) • In cercetarea clinica (studii caz control prin studii

prospective)

Principiul Hardy–Weinberg statueaza ca atat alelele cat si frecventa genotipurilor intr-o populatie ramane constanta - adica in echilibru - de la o generatie la alta daca nu apar influente disturbante. Exemple de influente disturbante sunt imperechere non-random, mutatii, selectie, o populatie limitata numeric, probe apartinand unei populatii care contine generatii care se intrepatrund (overlapping generations).

E important de stiut ca astfel de influente pot sa apara oricand. Altfel spus, in mod natural, echilibrul perfect Hardy–Weinberg este imposibil.

Echilibrul genetic este insa un status ideal care ofera

o referinta fata de care se poate masura schimbarea/variatia.

Genomica structurala – descrie arhitectura in detaliu a alcatuirii genelor si cromozomilor

Genomica functionala – caracterizarea genelor si a ARNm precum si a lantului

de evenimente celulare care duc la la formarea produsilor proteici. Genomica comparativa - se ocupa de evolutia relatiilor intre gene si proteine

la diferite specii. Farmacogenomica – studiaza rolul variatiilor genetice mostenite sau dobandite

in raspunsul organismului la administrarea medicamentelor precum si identificarea noilor tinte biologice de actiune a medicamentelor, a modalitatilor de producere a medicamentelor si vaccinurilor.

Transcriptomica – studiul ARNm celular si a proceselor in care acesta este

implicat Metagenomica. Domeniu care studiaza structuri, functii si interactiuni dinamice

ale comunitatilor microbiene prin metode independente de metodele de cultura clasica, ce deriva din metodele de secventiere a ADN-ului. Include definirea profilului exprimarii genice la nivelul ARN-ului (meta-transcriptomica), al proteinelor (meta-proteomica) si al metabolismului comunitatii microbiene (metabolomica).

Modificari epigenetice: • Modificari ale ADN celular produse prin metilarea lui. Procesul este catalizat de

ADN metiltransferaze si poate fi, uneori, reverisibil. • Modificarea histonelor (proteine care se leaga de AND pentru a forma cromatina.

Gradul de plicaturare a cromatinei permite - sau impiedica – transcriptia.

Fenomene epigenetice: • paramutatia, imprinting, silencing , inactivarea cromozomului X, s.a

Epigenetica studiaza modificarile mostenite in exprimarea genetica sau in fenotipul

celular determinate de alte mecanisme decat cele care presupun modificari in secventa de ADN, cum sunt metilarea ADN-ului si dezacetilarea histonelor

Epigenomica – se ocupa cu studiul global al modificarilor epigenetice la nivelul

intregului genom. Ambele studiaza modificarile epigenetice, prima ocupandu-se in special de

modificarile restranse, locus specifice, si cea de a doua de caracterizarea in anasamblu a genomului (prin metode precum SAGE = analiza seriala a exprimarii genice, electroforeza bi-dimensionala, etc).

Proiectele genomice importante derulate in National Center for Biotechnology Information, cum sunt: • BioProject (fostul Genome Project) • Genome • Epigenomics • Baza de date de nucleotide, etc

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/genomes-maps

Proiectul de secventiere a intregului genom uman a debutat in anii ’90 prin efortul conjugat al echipelor de cercetatori din SUA, Marea Britanie, Franta, Germania si China.

Primele concluzii publicate:

- Genomul uman este de 25 de ori mai mare decat cele secventiate anterior

- Genele sunt mai complexe, desi nu sunt decat de cateva ori mai multe decat la alte

eucariote

- Sute de gene par sa fie rezultatul transferului orizontal de la bacterii in evolutia

filogenetica, dar multe sunt in prezent inactive

- Duplicarea unor segmente de cromozomi (in special in regiunea pericentromerica

si subtelomerica) este mult mai frecventa decat la alte specii

- Cele mai multe mutatii in meioza apar la barbati, in comparatie cu femeile

- Ratele de combinare sunt mai mari in regiunile distale ale cromozomilor, si la

nivelul bratelor scurte

- 30,000-40,000 de gene codante si 1.4 milioane de SNP

Scopul final al “ingineriei “genomului si

proteomului este acela de a dezvolta un model al celulei reale impreuna cu identificarea programului celular responsabil pentru diferite comportamente in variate medii intra- si extracelulare.