Ćwiczenie 7-8. Spektrofluorymetria w badaniach oddziaływań biomakromolekuł z ligandami

Absorbcja światła przez niektóre cząsteczki związana jest z emisją promieniowania o

innej długości fali. Proces ten, nazywany fluorescencją stanowi podstawę spektrofluorymetrii - techniki pomiarowej, której wysoka czułość jest wykorzystywana dla śledzenia subtelnych zmian stężenia i właściwości makrocząsteczek biologicznych. 7-8.1. Spektroskopia fluorescencyjna - podstawy teoretyczne

Oddziaływanie fotonów z molekułami powoduje wzbudzenie elektronów walencyjnych, czyli ich przejście z orbitali stanu podstawowego do orbitali stanu wzbudzonego. Wzbudzone elektrony nie pozostają w takim stanie zbyt długo, lecz spontanicznie powracają do bardziej stabilnego stanu podstawowego. Dla większości cząsteczek taki proces relaksacji wiąże się z przekazaniem energii do molekuł rozpuszczalnika lub innych cząsteczek znajdujących się w roztworze. Niektóre wzbudzone molekuły powracają jednak do stanu podstawowego emitując nadmiar energii w postaci światła. Proces taki, nazywany fluorescencją, pokazany jest schematycznie na Rys. 1.

Rys. 1. Diagram obrazujący proces fluorescencji Prosta pionowa strzałka obrazuje absorpcję fotonu, w wyniku której cząsteczka zostaje

pobudzona. Pobudzona cząsteczka traci energię wibracyjną w wyniku zderzeń z innymi cząsteczkami znajdującymi się w roztworze. Proces taki jest bardzo szybki i powoduje przejście cząsteczki na niższy poziom wibracyjny w stanie S, co pokazuje falista strzałka. Molekuła może następnie uwolnić energię świetlną, powracając do stanu podstawowego (strzałka w postaci linii przerywanej). Światło emitowane posiada dwie istotne cechy: (1) większą długość fali (niższa energia) niż światło pobudzające. Przyczyną tej różnicy jest utrata części energii na rzecz rozpuszczalnika; (2) emitowane światło składa się z fal o różnej długości. Jest to spowodowane dużą ilością poziomów energii wibracyjnej stanu

podstawowego, na których może się znaleźć każda z fluoryzujących molekuł. Tak jak w przypadku widma absorpcyjnego, dla każdej substancji fluoryzującej obserwuje się charakterystyczne dla niej maksimum fluorescencji, czyli długość fali, dla której fluorescencja jest największa. Widmo fluorescencyjne składa się ze światła o różnych długościach fal zgrupowanych wokół maksimum emisji. W każdym przypadku długości fal światła emitowanego są większe niż długość fali światła wzbudzającego. Jest to tzw. przesunięcie stokesowskie:

∆E = hνex - hνem = hc(1/λex – 1/λem), (1)

gdzie νex – częstotliwość fali absorbowanej, νem – częstotliwość fali emitowanej, h – stała Plancka. W przypadku, gdy pochłaniająca kwant światła cząsteczka jest już w stanie wzbudzonym, w widmie fluorescencji mogą pojawić się tzw. linie antystokesowskie, czyli długości fal krótsze niż długość fali światła wzbudzającego. Wielkość przesunięcia stokesowskiego odzwierciedla polarność środowiska otaczającego cząsteczkę fluoryzującą. Przejściu cząsteczki fluorogennej do stanu wzbudzonego towarzyszy zmiana jej momentu dipolowego, co pociąga za sobą polaryzację powłok elektronowych cząsteczek rozpuszczalnika, indukcyjne przesunięcie ich atomów oraz polaryzację orientacyjną. Strata energii na te procesy daje w efekcie przesunięcie maksimum fluorescencji w kierunku fal dłuższych, które będzie tym większe im większa jest różnica momentów dipolowych cząsteczki fluorogennej w stanie wzbudzonym i stanie podstawowym, im większa jest polaryzowalność cząsteczek rozpuszczalnika oraz ich moment dipolowy oraz im większa jest możliwość zmiany orientacji cząsteczek rozpuszczalnika w czasie trwania stanu wzbudzonego cząsteczki fluorogennej (około 10-15 s). Przesunięcie stokesowskie będzie zatem największe dla cząsteczek fluorogennych o długim czasie życia stanu wzbudzonego, znajdujących się w rozpuszczalniku o dużej przenikalności elektrycznej i małej lepkości.

Ponieważ cząsteczka znajdująca się w stanie wzbudzonym może powrócić do stanu podstawowego tracąc energię w wyniku kolizji z innymi cząsteczkami lub w wyniku emisji światła, to wydajność fluorescencji danego układu zależy od względnej intensywności tych konkurencyjnych procesów. Intensywność fluorescencji określa się zwykle poprzez tzw. wydajność kwantową Q. Z definicji, Q jest stosunkiem liczby wyemitowanych fotonów do liczby fotonów zaabsorbowanych. Oszacowanie wydajności kwantowej pozwala często na określenie ważnych cech danego układu fluoryzującego. Intensywność fluorescencji zależy od czynników wewnętrznych i zewnętrznych.

Czynniki wewnętrzne, takie jak liczba dostępnych poziomów wibracyjnych, sztywność cząsteczki, mają znaczenie głównie dla rozważań teoretycznych. Dla biochemika korzystającego ze spektroskopii fluorescencyjnej, duże znaczenie praktyczne mają natomiast czynniki zewnętrzne wpływające na Q. Pomiar zmian Q będących rezultatem kontrolowanych w warunkach eksperymentalnych modyfikacji czynników zewnętrznych pozwalają często na uzyskanie istotnych informacji o strukturze makrocząsteczek lub naturze oddziaływań molekularnych pomiędzy małymi cząsteczkami - ligandami - a białkami lub kwasami nukleinowymi. Obniżenie lub zwiększenie wydajności kwantowej można osiągnąć m.in. w wyniku zmian stałej dielektrycznej rozpuszczalnika. Fluorescencja wielu związków fluoryzujących ulega wygaszeniu w roztworach wodnych, a silnemu zwiększeniu w środowiskach niepolarnych. Takim środowiskiem jest np. wnętrze białka globularnego. Efekt wygaszania fluorescencji może także zostać osiągnięty w wyniku obecności w środowisku ciężkich anionów i kationów (I-, Br-, Cs+, Cu2+ i in.) oraz substancji paramagnetycznych (np. tlen, rodniki nitroksylowe, jony Mn2+). Jednocześnie ze zmniejszeniem wydajności kwantowej, gaszenie fluorescencji prowadzi do zmniejszenia czasu życia cząsteczki w stanie wzbudzonym. Czas ten w przypadku braku zewnętrznego „wygaszacza” wynosi τ = 1/kfl,

gdzie kfl jest stałą szybkości przejścia promienistego S1 → S0. Jeżeli zachodzą procesy wewnątrzcząsteczkowe, to τ0 = 1/(kfl + kc), natomiast w obecności wygaszacza, τ = 1/(kfl + kc + kmq), gdzie kc to sumaryczna stała szybkości procesów wewnątrzcząsteczkowych, km – stała szybkości procesu gaszenia, a q jest stężeniem wygaszacza. Opisem matematycznym zjawiska wygaszania jest równanie Sterna i Volmera:

τ0/τ = 1 + kmτq = Q0/Q (2)

gdzie Q0 i Q to odpowiednio wydajności kwantowe fluorescencji w nieobecności i w obecności wygaszacza. Zjawisko wygaszania fluorescencji jest powszechnie wykorzystywane w badaniach biologicznych i biochemicznych 7-8.2. Aparatura do pomiarów fluorescencyjnych

Podstawowym urządzeniem pomiarowym jest spektrofluorymetr. Zawiera on źródło światła, dwa monochromatory, komorę próbki i detektor (Rys. 2). Układ aparatu jest podobny jak w spektrofotometrze, z dwoma istotnymi wyjątkami. Pierwszą różnicą jest obecność dwóch monochromatorów - jednego koniecznego dla wyboru fali wzbudzenia i drugiego, dla analizy długości fali światła emitowanego. Po drugie, detektor jest umiejscowiony pod kątem (zwykle 90°) do promienia wzbudzającego. Dzięki takiemu układowi eliminuje się wpływ światła przechodzącego przez próbkę. Po wzbudzeniu molekuł próbki, fluorescencja emitowana jest we wszystkich kierunkach, a pomiar jej intensywności jest możliwy dzięki fotodiodzie. Źródłem światła jest najczęściej ksenonowa lampa łukowa, emitująca promieniowanie w zakresie 200 - 1400 nm. Światło jest kierowane przez układ optyczny do monochromatora wzbudzenia, który umożliwia wybór określonej długości fali lub przemiatanie w szerszym zakresie długości fal światła wzbudzającego.

ys. 2. Schemat ideowy spektrofluorymetru

Światło wzbudzające przechodzi następnie do komory próbki zawierającej kiuwetę

R

fluorescencyjną z roztworem próbki. Z uwagi na geometrię układu optycznego, kiuwety fluorymetryczne posiadają cztery ścianki boczne przepuszczające światło. Gdy promień światła wzbudzającego pada na próbkę, molekuły substancji tam zawartej ulegają wzbudzeniu

i niektóre z nich emitują światło. Światło emitowane w kierunku prostopadłym do promienia padającego jest analizowane za pomocą monochromatora emisyjnego W większości przypadków analiza ta polega na pomiarze intensywności fluorescencji przy danej długości fali. Monochromator kieruje do detektora jedynie światło o zadanej długości fali. Fotopowielacz służy jako detektor do pomiaru intensywności światła. Prąd proporcjonalny do intensywności światła padającego generowany w fotopowielaczu jest mierzony przez odpowiedni układ elektryczny. Nowsze aparaty przekazują jako sygnał wyjściowy prąd proporcjonalny do stosunku światła emitowanego do światła padającego na próbkę. Fluorymetry są aparatami do pomiarów fluorescencji przy z góry określonych

-8.3. Zastosowanie pomiarów fluorymetrycznych w badaniach biologicznych

Dwa typy pomiarów są najczęściej wykonywane we fluorymetrii: pomiar względnej intensy

Qx/Qstd = Fx/Fstd, (3) gdzie:

x - wydajność kwantowa próbki rdu

du.

Niektóre biocząsteczki fluoryzują, czyli są fluorogenne. Zdolność do fluorescencji wykazu

na

wartościach długości fali światła wzbudzającego i światła emitowanego. Aparaty te, w miejsce monochromatorów posiadają filtry optyczne przepuszczające światło monochromatyczne. W najprostszej wersji fluorymetr wyposażony jest tylko w jedną parę filtrów, w wersji bardziej zaawansowanej występuje od kilku do kilkunastu par filtrów wymiennych. To ostatnie rozwiązanie jest stosowane we fluorymetrycznych czytnikach mikropłytek 7

wności fluorescencji i pomiar wydajności kwantowej. W pierwszym przypadku, w wyniku pomiaru fluorescencji próbki wyjściowej ustawia się wartość „zero” lub 100% intensywności fluorescencji, a następnie wprowadza zaburzenie do układu próbki (zmiana pH, dodanie jakiegoś czynnika chemicznego, zmiana siły jonowej lub polarności rozpuszczalnika) i mierzy zmianę intensywności fluorescencji w stosunku do stanu wyjściowego. W tym typie doświadczenia wartości długości fali światła wzbudzającego i emitowanego są wstępnie ustalane. Pomiar wydajności kwantowej jest procesem bardziej złożonym. Instrument musi zostać wykalibrowany przed pomiarem. Do tego celu używa się najczęściej standardów fluorescencyjnych - roztworu siarczany chininy w 1 M H2SO4 (Q = 0.70) lub roztworu fluoresceiny w 0.1 M NaOH (Q = 0.93). Mierzy się intensywność fluorescencji standardu i próbki a wydajność kwantową dla badanej próbki oblicza się z proporcji:

QQstd - wydajność kwantowa standaFx - intensywność fluorescencji próbki Fstd - intensywność fluorescencji standar

ją aminokwasy z pierścieniami aromatycznymi w łańcuchach bocznych (tyrozyna, fenyloalanina i tryptofan), toteż białka zawierające te aminokwasy są fluorogenne. Fluorogenne są zasady purynowe i pirymidynowe w kwasach nukleinowych oraz niektóre koenzymy, np. NAD+ i FAD. Zjawisko wewnątrzpochodnej fluorescencji jest często wykorzystywane do badania zmian konformacyjnych w białkach i lokalizacji centrów aktywnych enzymów. Cennych informacji może także dostarczyć zastosowanie fluorogenów zewnętrznych. Są to substancje fluoryzujące, dodawane do badanego układu. Do grona tego należy kilka głównych grup związków, takich jak: pochodne ksantenu: fluoresceina, rodamina, eozy

pochodne cyjaniny: indokarbocyjanina, tiakarbocyjanina,

: pirydyloksazol, nitrobenzoksadiazol, benzoksadiazol

łękit Nilu, Fiolet krezolowy .

ą fluorescencję po przeniesieniu do rozt

Barwnik λabs λem selektywność wiązania

ranż akrydynowy 503 530/640 DNA/RNA wiąże się do

Bromek etydyny 493 620

selektywnie wiąże się do

Hoechst 33258 350 461 o

Zewnę łady przedstawiono na Rys. 3 wykorzystuje się np. do

• grupy aminowe estry aktywne, izotiocyjaniany, hydrazydy we

alogenoketony.

ym z najczęściej używanych odczynników tego rodzaju jest izotiocyjanian fluoresceiny

pochodne naftalenu: (pochodne dansylu i prodanu) pochodne kumaryny pochodne oksadiazolu pochodne pirenu: Błekit kaskadowy. pochodne oksazyny: Czerwień Nilu, B pochodne akrydyny: proflawina, oranż akrydyny, żółcień akrydyny pochodne arylometyny: fiolet krystaliczny, zieleń malachitowa

pochodne tetrapirolu: porfiryna, ftalocyjanina, bilirubina. Wiele barwników fluoryzujących wykazuje zwiększonworów niepolarnych lub do środowiska hydrofobowego. Niektóre z tych barwników

wiążą się za specyficznymi fragmentami białek lub kwasów nukleinowych, a intensywność wypadkowej fluorescencji zależy od budowy miejsca wiązania, jak np. w przypadku fluorogenów wiążących się z kwasami nukleinowymi.

O

Chromomycyna A3 445 575 DNA, selektywnie obszarów bogatych w pary GC DNA

SYTOX Green 504 523 DNA DAPI 345 455 DNA,

obszarów bogatych w pary AT DNA, selektywnie do mniejszegrowka podwójnej helisy

trzne fluorogeny, których przykbadania oddziaływania kwasów tłuszczowych z albuminą surowicy, charakterystyki miejsc wiązania kofaktorów i substratów z enzymami lub badań nad interkalacją małych cząsteczek do podwójnej helisy DNA. Pochodne amino-metylokumaryny (AMC) stosuje się jako sztuczne substraty w pomiarach aktywności peptydaz. Biomakromolekuły nie zawierające ugrupowań fluorogennych można przekształcić w pochodne fluoryzujące w wyniku reakcji z cząsteczkami fluorogennymi zawierającymi odpowiednie, reaktywne grupy funkcyjne. Modyfikacje takie przeprowadzane są najczęściej w stosunku do białek nie zawierających reszt tryptofanylowych, a przyłączenie następuje do grup aminowych, karboksylowych lub tiolowych, jednym z wymienionych poniżej sposobów:

• grupy karboksylo karbodiimidy • grupy tiolowe maleimidy, α-h

Jedn(FITC)

Czerwień Nilu Fluoresceina Rodamina

Eozyna

Kalceina 1,8-ANS

Chlorek dansylu

Aminometylokumaryna (AMC)

Jodek propidyny

Bromek etydyny

Oranż akrydynowy

Chromomycyna A3

DAPI Hoechst 33258

SYBR Green I

Calcofluor White Lucifer Yellow

Rys. 3. Struktury niektórych fluorogenów stosowanych w badaniach biologicznych

O

COOH

HO O

O

N

N O

O

COOH

NN +Cl-

O

COOH

HO O

Br

Br

Br

Br

SO3- HN

O OH2N

CH3

N(CH3)2

SO2Cl

N(CH3)2N N 3)2(CH_+ BrN

NH2H2N

C2H5

N

SCH N

CH3

N

N

+

X-

N NH

HN NH

NHOH

H3C HN ++

+

Cl-3

N

N N

N N

N N

NN

NN

HO

HO

N

OH

OHSO3H

SO3H

H

H

H

HOO

NH

O

NH2

SO3

SO3

H2N-

-

Li+

Li+

Piren Perylen

DPH

TMA-DPH 12-AS

DiSC3(5)

Rys. 4. Struktury znaczników fluorescencyjnych wykorzystywanych w badaniach właściwości błon biologicznych

.

OO

O

OHN

SC C C C

H

H

H

H

C

H

S

N+

I-

.

N(CH3)3+

Związki fluorogene zawierające grupy hydroksylowe lub karboksylowe mogą być

przekształcane w estry. Takie pochodne estrowe łatwo dyfundują przez błony biologiczne, a we wnętrzu komórki są hydrolizowane przez esterazy, w wyniku czego generowany jest fluorogen nie mogący już opuścić komórki. Jednym z popularniejszych związków tego typu jest dioctan fluoresceiny. Acetoksymetylowy ester kalceiny (Calceine AM) jest wykorzystywany jako narzędzie do badania działania transporterów wielolekowych typu ABC, jako że jest znakomitym substratem dla tych białek, takich jak np. P-glikoproteina

Zewnętrzne fluorogeny, zwane także w tym przypadku znacznikami fluorescencyjnymi, wykorzystywane są powszechnie w badaniach błon biologicznych. Znaczniki te wiążą się z błonami kowalencyjnie lub niekowalencyjnie i z pomiarów parametrów ich fluorescencji otrzymać można informacje o strukturze i funkcji błony. Struktury niektórych znaczników przedstawiono na Rys. 4. Różne znaczniki lokują się w różnych segmentach błony. Niektóre z nich, wbudowujące się głęboko, reagują na zmiany zachodzące we wzajemnym ułożeniu łańcuchów węglowodorowych fosfolipidów, inne reagują na zmiany zachodzące na powierzchni błony. Przykładowo cząsteczka 1,8-ANS (rys. 3) nie może zanurzyć się głęboko w dwuwarstwę lipidową i pozostaje na powierzchni, natomiast piren i perylen dyfundują do obszaru łańcuchów węglowodorowych. Jodek 3,3’dipropylotiodikarbocyjaninowy DiSC3(5) stosowany jest do pomiarów potencjału błonowego, gdyż natężenie jego fluorescencji zależy od tego potencjału.

W tabeli przedstawiono zestawienie metod fluorescencyjnych stosowanych do badania błon i właściwości błon biologicznych, które mogą być badane daną metodą.

Właściwości Metoda Przejścia fazowe i separacja faz Ruchliwość lateralna lipidów i białek Oddziaływanie białek błonowych z błoną Potencjał błonowy Potencjał powierzchniowy Agregacja białek Asymetria błonowa

Pomiar natężenia fluorescencji FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), ekscymeryzacja* Transfer energii Wykorzystanie znaczników fluorescencyjnych wrażliwych na zmiany potencjału Wiązanie naładowanych znaczników fluorescencyjnych z błoną Transfer energii Wykorzystanie znaczników fluorescencyjnych nie przenikających przez błonę

*tworzenie dimerów (ekscymerów) z niewzbudzonymi cząsteczkami znacznika fluorescencyjnego przez cząsteczki tego znacznika wprowadzone do obszaru lipidowego błony, które pochłonęły kwant światła i przeszły w stan wzbudzony

Pomiary fluorymetryczne charakteryzują się dużo większą czułością niż pomiary

absorpcyjne. Z tego względu, niezwykle ważna jest dokładność i szczególna ostrożność w przygotowaniu próbek, gdyż niewielkie nawet zanieczyszczenia mogą spowodować duży błąd pomiaru. Należy bezwzględnie sprawdzić wszystkie używane rozpuszczalniki i odczynniki pod kątem obecności w nich substancji fluoryzujących. Fluorescencja tła musi być potem uwzględniana we wszystkich pomiarach. Roztwory powinny być przechowywane w ciemnych naczyniach, szczelnie zamkniętych korkami szklanymi, dla uniknięcia fotochemicznego rozkładu odczynników oraz zanieczyszczenia substancjami pochodzącymi z korków gumowych lub z tworzyw sztucznych. Należy pamiętać, że białka w rozcieńczonych roztworach wykazują tendencję do adsorpcji na ściankach naczyń szklanych, co może prowadzić do utraty substancji fluoryzujących lub zanieczyszczenia ścianek kiuwet pomiarowych. Szkło stosowane do badań fluorymetrycznych musi być szczególnie skrupulatnie myte. Roztworów nie należy długo przechowywać - w miarę możliwości należy je przygotowywać tuż przed użyciem. Wszelkie zmętnienia muszą być usunięte przed pomiarem. Ponieważ zjawisko fluorescencji silnie zależy od temperatury, wszystkie pomiary fluorymetryczne powinny być dokonywane w określonej temperaturze. W aparatach wyższej klasy, wymóg ten jest spełniony poprzez termostatowanie komory pomiarowej. 7-8.4. Eksperymenty Eksperyment 1. Badanie szybkości transportu doksorubicyny przez błony komórkowe erytrocytów Doksorubicyna (DOX) jest przeciwnowotworowym antybiotykiem antracyklinowym stosowanym w terapii ostrej białaczki szpikowej i limfoblastycznej oraz niektórych nowotworów narządowych. Transport cząsteczek antybiotyku do wnętrza komórek odbywa się na drodze dyfuzji prostej. Doksorubicyna jest związkiem fluorogennym, o długości fali wzbudzenia 490 nm a fali emisji – 590 nm. Dzięki tej właściwości możliwe jest monitorowanie szybkości transportu DOX przez błony komórkowe metodą fluorymetryczną. Materiały

1. Zawiesina erytrocytów 2. Buforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) 3. Roztwór doksorubicyny (1 mM)

Wykonanie eksperymentu

1. Ustalić liczbę komórek erytrocytów w zawiesinie przy użyciu komory Thoma 2. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do gęstości 109 komórek/ml 3. Odmierzyć po 1,35 ml zawiesiny komórek do 12 probówek Eppendorfa i umieścić

probówki w łaźni wodnej w temp. 37 °C 4. Dodać po 0,15 ml odpowiednio rozcieńczonego roztworu doksorubicyny. 5. Odwirować zawartość kolejnych probówek po 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20 i 25 min.

Pobrać próbki supernatantu nie naruszając osadu i przenieść je do osobnych probówek.

6. Zmierzyć natężenie fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 490 nm i fali emisji 590 nm.

7. Sporządzić krzywą wzorcową do fluorymetrycznego oznaczania zawartości DOX w próbie.

8. Przeliczyć zmierzone wartości natężenia fluorescencji na stężenia DOX i sporządzić wykres zależności stężenia antybiotyku od czasu inkubacji.

9. Wyznaczyć szybkość dyfuzji leku do komórki. Obliczyć zawartość DOX w komórkach po 25 min inkubacji.

Eksperyment 2. Badanie efektywności wyrzutu Rodaminy 6G przez wielolekooporne komórki drożdży Rodamina 6G jest związkiem fluorogennym będącym bardzo dobrym substratem dla białek oporności wielolekowej typu ABC, takich jak P-glikoproteina ssacza oraz pompy wielolekowe z drobnoustrojów grzybowych: Pdr5p z S. cerevisiae oraz Cdr1p i Cdr2p z Candida abicans. Energia niezbędna dla działania pomp typu ABC pochodzi z hydrolizy ATP. Komórki stosowane w eksperymencie są najpierw poddawane „głodzeniu” poprzez inkubację w obecności 2-deoksy-D-glukozy. W tych warunkach zostaje zużyta wewnątrzkomórkowa pula ATP. W etapie kolejnym komórki pozbawione ATP zostają „naładowane” związkiem fluorescencyjnym. Działanie białka typu ABC zostaje pobudzone poprzez dodanie glukozy i uruchomienie wytwarzania ATP. Materiały

1. Hodowle komórek Sacharomyces cerevisiae AD12345678 oraz ADCDR1 w podłożu YNBG

2. PBS – roztwór soli fizjologicznej (0.9% NaCl) buforowany 50 mM buforem fosforanowym, pH 6.0

3. 100 mM Roztwór 2-deoksy-D-glukozy w PBS 4. 1 mM roztwór Rodaminy 6G w PBS 5. Roztwory związków współzawodniczących lub inhibitorów aktywności białka Cdr1p

– wedle uznania prowadzącego ćwiczenie Wykonanie eksperymentu Eksperyment wykonywany jest równolegle dla dwóch rodzajów komórek. Komórki AD12345678 nie posiadają białek oporności wielolekowej, natomiast komórki ADCDR1 posiadają białko CDR1p będące pompą wielolekową typu ABC pochodzącą z drożdżaków Candida albicans.

1. Komórki drożdży pochodzące z hodowli w podłożu YNBG odwirować i dwukrotnie przemyć wodą (3000 g, 5 min, 20°C).

2. Odwirowane komórki zawiesić w PBS, pH 6.0 zawierającym 5 mM 2-deoksy-D-glukozę (2-DG), do gęstości optycznej OD660 = 0.4. Zawiesinę inkubować przez 30 min w temp. 30 °C.

3. Podczas inkubacji komórek z 2-DG otrzymać widmo absorpcyjne UV-vis i widmo emisyjne dla Rodaminy 6G.

4. Dodać roztwór Rodaminy 6G do końcowego stężenia 10 µM (na tym etapie możliwe jest także dodanie związku mającego konkurować z Rodaminą 6G) i kontynuować inkubację przez 30 min.

5. Zawiesinę odwirować, przemyć 2 × PBS i zawiesić w świeżym PBS do OD660 = 0.2 (objętość 10 ml).

6. Inkubować zawiesinę przez 5 min w temp. 30 °C, następnie dodać roztwór D-glukozy do końcowego stężenia 40 µM i kontynuować inkubację (możliwa opcja – dodanie po 9 min od dodania glukozy związku będącego inhibitorem białka Cdr1p). Natychmiast po dodaniu glukozy oraz w odstępach 3 min pobierać przez 21 min próbki zawiesiny o objętości 1 ml.

7. Każdą pobraną próbkę odwirować natychmiast po pobraniu, pobrać po 0.2 ml supernatantu i umieścić w studzience mikropłytki. Po zebraniu wszystkich próbek dokonać pomiaru fluorescencji wszystkich próbek przy długościach fal wzbudzenia i emisji określonych wcześniej.

8. Na podstawie otrzymanych wyników sporządzić wykresy zależności zmian poziomu fluorescencji w badanych próbkach od czasu

Eksperyment 3. Badanie lokalizacji cząsteczek antybiotyku z grupy makrolidów polienowych w błonie cytoplazmatycznej metodą transferu energii z użyciem znaczników fluorescencyjnych W eksperymencie wykorzystuje się dwa znaczniki fluorescencyjne lokalizujące się w różnych segmentach błony cytoplazmatycznej. Podczas eksperymentu mierzony jest efekt wygaszania fluorescencji znacznika wynikający z transferu części emitowanej energii do cząsteczek antybiotyku z grupy makrolidów polienowych. Materiały

1. Komórki Saccharomyces cerevisiae w podłożu YNBG 2. Roztwory DPH i TMA-DPH (2 mM) w dimetyloformamidzie (DMF) 3. Roztwory antybiotyku w DMSO (rodzaj i stężenie podane przez prowadzącego) 4. Roztwór buforowy: 10 mM Hepes, pH 7.0. 132 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 1 mM CaCl2,

0.5 mM MgCl2. Wykonanie eksperymentu

1. Sporządzić widma emisji DPH i TMA-DPH dla fali wzbudzenia 365 nm oraz widmo absorpcyjne dla antybiotyku. Zmierzyć wartości absorbancji (długość fali 365 nm i 427 nm) roztworów antybiotyku o stężeniach odpowiadających stężeniu (stężeniom) stosowanemu podczas pomiaru efektu transferu energii

2. Hodowlę komórek S. cerevisiae odwirować, przemyć buforem Hepes i komórki zawiesić w buforze Hepes do gęstości optycznej OD660 = 0.1 (odpowiada około 2 × 106 komórek/ml).

3. Umieścić 2 ml zawiesiny w kuwecie do pomiarów spektrofluorymetrycznych i dodać 2 µl roztworu DPH lub TMA-DPH. Rozpocząć pomiar fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 365 nm i fali emisji 427 nm, aż do ustalenia odczytu na stałym poziomie (od 3 do 25 min).

4. Po ustaleniu odczytu dodać roztwór antybiotyku (ilość określona przez prowadzącego) i kontynuować odczyt przez 30 min.

5. Dla otrzymanych odczytów obliczyć wartości charakteryzujące efektywność transferu energii. Ze wzoru:

E = 1 – (F/F0), gdzie F i F0 są intensywnościami fluorescencji emitowanej odpowiednio w obecności i nieobecności antybiotyku. Wartości F do wzoru powinny być skorygowane, zgodnie z zależnością: F = F’ × 10(A1 + A2)/2, gdzie F’ jest wartością otrzymaną bezpośrednio z pomiaru, a A1 i A2 są wartościami absorbancji roztworu antybiotyku zmierzonymi dla długości fal odpowiadających maksimum wzbudzenia i emisji dla znacznika fluorescencyjnego (365 nm i 427 nm).

6. Dokonać interpretacji otrzymanych wyników i na ich podstawie wyciągnąć wnioski dotyczące przypuszczalnej lokalizacji cząsteczek antybiotyku w błonie cytoplazmatycznej.

Eksperyment 4. Badanie wiązania kwasów tłuszczowych z albuminą w wykorzystaniem ANS jako sondy fluorescencyjnej W eksperymencie wykorzystuje się znacznik fluorescencyjny, 1,8-ANS, który wykazuje zdolność do fluorescencji po związaniu się z obszarami o charakterze hydrofobowym białek. Podczas eksperymentu mierzony jest efekt wygaszania fluorescencji 1,8-ANS w kompleksie z BSA w obecności kwasu laurynowego oraz szczawiowego. Materiały

1. 50mM bufor sodowo-fosforanowy o pH 7.4 2. 0.3 mg/ml BSA w buforze sodowo-fosforanowym o pH 7.4 3. 0.25 mM roztwór 1,8-ANS w w buforze sodowo-fosforanowym o pH 7.4 4. 0.5mM roztwór kwasu laurynowego w buforze sodowo-fosforanowym o pH 7.4 5. 0.5mM roztwór kwasu bursztynowego w buforze sodowo-fosforanowym o pH 7.4

Wykonanie eksperymentu

1. Przygotować roztwory robocze BSA w kompleksie z ANS poprzez zmieszanie 2ml wyjściowego roztworu BSA oraz 0.9ml buforu i 0.1ml wyjściowego roztworu ANS.

2. Sporządzić próbki pomiarowe zgodnie z poniższą tabelą:

lp Roboczy roztwór BSA-ANS [µl]

Roztwór kwasu laurynowego/bursztynowego

[µl]

Bufor [ml]

1 100 - 2.9 2 100 50 2.85 3 100 100 2.8 4 100 150 2.75 5 100 200 2.7 6 100 300 2.6

3. Dokonać kontrolnego pomiaru emisji roztworu BSA, wykonanego poprzez zmieszanie 2 ml roztworu wyjściowego BSA i 1ml buforu sodowo-fosforanowego BSA, dla fali wzbudzenia 366 nm w zakresie 400-600 nm.

4. Dokonać kontrolnego pomiaru emisji roztworu ANS, wykonanego poprzez zmieszanie 2.9 ml buforu sodowo-fosforanowego i 0.1ml wyjściowego roztworu ANS, dla fali wzbudzenia 366 nm w zakresie 400-600 nm.

5. Sporządzić widma emisji 1,8-ANS w kompleksie z BSA, dla fali wzbudzenia 366 nm w zakresie 400-600 nm dla roztworów sporządzonych wg schematu opisanego w pkt. 2

6. Dla otrzymanych odczytów wyznaczyć F oraz F0, gdzie F i F0 są intensywnościami fluorescencji emitowanej odpowiednio w obecności i nieobecności badanego kwasu.

7. Sporządzić wykresy zależności F/F0 poziomu fluorescencji w badanych próbkach od stężenia stosowanego kwasu.

8. Dokonać interpretacji otrzymanych wyników i na ich podstawie wyciągnąć wnioski dotyczące mechanizmu zdolności kwasu tłuszczowego – laurynowego oraz bursztynowego do wygaszania fluorescencji kompleksu BSA-ANS.