Embed Size (px)
Citation preview
1
�
IDENTIFICACIÓN COPROLÓGICA, HISTOLÓGICA Y MOLECULAR DE
CYSTOISOSPORA BELLI EN PACIENTES INFECTADOS CON EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA
Astudillo Osvaldo Germán1, Velásquez Jorge Néstor
2, di Risio Cecilia
3, Etchart Cristina
3, Chertcoff
Agustín Víctor2, Perissé Gladys Elisabet
3, Carnevale Silvana
1,4.
1 Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Avenida Vélez
Sarsfield 563, (CP 1281) Ciudad de Buenos Aires, Argentina
2 Hospital Municipal de Infecciosas “Dr. Francisco Javier Muñiz”. Uspallata 2272, (CP 1282)
Ciudad de Buenos Aires, Argentina
3 Hospital Municipal General de Agudos “Dr. José María Penna”. Pedro Chutro 3380, (CP 1437)
Ciudad de Buenos Aires, Argentina
4 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Avenida Rivadavia
1917, (CP 1033), Ciudad de Buenos Aires, Argentina
E-mail: [email protected]
Teléfono: (011) 4301 7437
2
�
RESUMEN
La infección con Cystoisospora belli causa diarrea severa, compromiso de vías biliares y
diseminación extraintestinal en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Este estudio incluyó ocho pacientes adultos con SIDA y diarrea crónica diagnosticándose
cistoisosporosis en heces (ooquistes) y/o biopsias duodenales (estadíos asexuales y sexuales en
epitelio). Se realizó la identificación a nivel molecular mediante una técnica de nested-PCR que
amplifica un fragmento del gen de la subunidad pequeña del ARN ribosomal, empleando ADN
extraído de heces y biopsias. Los amplicones fueron purificados y se efectuó la secuenciación
automática de los mismos siendo en los 8 casos idénticos a los disponibles para C. belli en
GenBank.
Este trabajo nos permitió realizar el diagnóstico de cistoisosporosis mediante análisis
coproparasitológico e histológico, optimizar el protocolo de extracción de ADN a partir de muestras
fecales y tisulares e implementar la técnica de nested-PCR para diagnóstico de Cystoisospora belli
en muestras biológicas de pacientes infectados.
Palabras clave: Cystoisospora belli, PCR, SIDA, ooquiste.
3
�
INTRODUCCIÓN
La cistoisosporosis es una infección cosmopolita en distribución, pero es más común en el trópico,
zonas subtropicales, algunas áreas del Este medio, Sudeste asiático y Sur de América (1). Los
estudios de prevalencia muestran que estas infecciones pueden ir desde el 1% hasta 18%, mientras
que en pacientes con SIDA la prevalencia está entre el 1% y el 5% en países industrializados y 15%
en países no industrializados. La severidad de la enfermedad es variable según la edad y el estado
inmunológico de los pacientes.
La infección con Cystoisospora belli (C. belli)causa diarrea autolimitada en pacientes
inmunocompetentes, mientras que puede llegar a ser severa y debilitante en los pacientes
inmunocomprometidos (2, 3). Se ha reportado que puede causar también colecistitis (4 – 6), y en
pacientes con SIDA diseminación extraintestinal (7 - 11).
El diagnóstico de cistoisosporosis se realiza en general por el hallazgo de ooquistes en el examen
de materia fecal y de diferentes estadíos en epitelio del intestino delgado o conductos biliares (3, 6,
12).
El diagnóstico de C. belli mediante técnicas moleculares ha tenido un desarrollo mínimo. Hasta el
presente se ha reportado el uso de un par de primers específicos y una sonda de hibridación
complementaria a una región de la subunidad pequeña del ARN ribosomal para la detección
mediante PCR y Southern blot en muestras de pacientes infectados (13). También existen
publicaciones de métodos moleculares para la diferenciación a nivel de especie de en el género
Cystoisospora (14).
Los objetivos de este trabajo fueron describir morfológicamente los estadíos de Cystoisospora sp.
en fluidos y tejidos de pacientes con SIDA e implementar una técnica de PCR utilizando ADN de
C. belli extraído de muestras biológicas de pacientes infectados.
4
�
MATERIALES Y MÉTODOS
Se incluyeron ocho pacientes adultos con SIDA y diarrea crónica (más de un mes de duración) en
los que se diagnosticó cistoisosporosis.
Descripción morfológica en fluídos y tejidos
La materia fecal se procesó mediante los métodos de concentración de Telemann modificado, Willis
y Sheather (15 - 17) y se realizaron extendidos de dichos concentrados que se colorearon con la
técnica de Kinyoun (18, 19). A cada paciente se le efectuó una videoesofagogastroduodenoscopía
(VEDA) con un equipo Pentax EPM 2000. Se tomaron biopsias de la porción distal del duodeno.
Dos muestras se fijaron en formalina 10% para su procesamiento por técnicas histológicas de rutina
y coloración con hematoxilina-eosina y dos muestras se fijaron en glutaraldehido tamponado, se
incluyeron en polibedaraldita y se realizaron cortes ultrafinos coloreados con Azur II.
Una de las muestras de biopsia se conservó en solución fisiológica a –20ºC para su posterior estudio
molecular.
Nested PCR para Cystoisospora belli
Las muestras de heces y biopsias fueron procesadas para la extracción de ADN, se aplicaron
métodos estándar de digestión con proteinasa K, extracción con fenol-cloroformo y precipitación en
etanol. Las muestras de biopsias fueron tripsinizadas antes de la extracción de ADN. El tampón de
lisis empleado para ambos materiales contenía Tris-HCl 100 mM pH 8, EDTA 10 mM pH 8, SDS
0.5%, NaCl 150mM, y proteinasa K 200 g/ml.
Las muestras de ADN obtenidas fueron empleadas en la amplificación génica para el diagnóstico de
Cystoisospora de acuerdo al protocolo descripto por Müller y col. (13). Basado en una técnica de
nested-PCR utilizando cebadores (primers) sobre la secuencia del gen de la subunidad pequeña del
ARN ribosomal de C. belli (GenBank accession nos. AF106935 and U94787).
5
�
El grupo de cebadores del primer ciclo fue IsoFO/IsoRO y para el segundo ciclo IsoFI/IsoRI,
descriptos por Müller y col. (13) empleados para amplificar un fragmento de 396 pares de bases
(pb).
Las mezclas de reacción fueron optimizadas utilizando tampón conteniendo sulfato de amonio. Los
pasos de amplificación fueron los descritos previamente (13).
Como control positivo de las reacciones de amplificación se empleó ADN de ooquistes previamente
purificados, como control negativo se emplearon muestras de ADN humano y se contó con un
control de reacción para descartar la posibilidad de ADN contaminante en cada reacción de
amplificación.
Los productos de amplificación se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa 2%
teñidos con bromuro de etidio bajo luz UV.
Los amplicones de cada paciente fueron recuperados de los geles de agarosa y se efectuó la
secuenciación automática de los mismos en equipo Applied Biosystems.
6
�
RESULTADOS
En el examen coproparasitológico fue posible la identificación de ooquistes de Cystoisospora. Los
mismos se presentaban con su característica forma elíptica, de 25-30 m de largo x 10-19 m de
ancho aproximadamente y con un esporoblasto en su interior (fig.1). El esporoblasto presentaba un
aspecto granular, el interior del ooquiste era transparente y con una doble pared fácil de observar.
Figura 1. Ooquiste no esporulado de Cystoisospora belli en el pellet de concentración del método
de Telemann modificado (aumento 400X).
La recuperación fue posible mediante los tres métodos de concentración empleados. La
visualización en las concentraciones por flotación permitió una tonalidad más rosada que la
observada en la centrifugación.
Las características tintoriales de la C. belli en los extendidos coloreados con Kinyoun mostraron un
esporoblasto de rojo a fucsia, con el interior del ooquiste transparente y la doble pared (fig. 2).
7
�
Figura 2. Ooquiste inmaduro de de Cystoisospora belli coloreado por la técnica de Kinyoun
(aumento 1000X).
En el epitelio duodenal, las células parasitadas se encontraron deformadas, con sus núcleos
desplazados o poco visibles, y los estadíos intracelulares de Cystoisospora se disponían en distintas
ubicaciones dentro de la misma.
Los merozoítos correspondieron a elementos con forma de banana u ovales, con núcleos con
cariosomas visibles y algunos gránulos esparcidos en el citoplasma.
Los esquizontes, dependiendo de la incidencia del corte, presentaban forma oval o redondeada con
dos o más merozoitos (fig 3).
8
�
Figura 3. Corte ultrafino de biopsia duodenal mostrando esquizonte de Cystoisospora belli con
merozoítos en su interior. Coloración Azur II (aumento 1000X).
Los macrogametocitos maduros eran de forma oval con un núcleo grande que contenía un
cariosoma prominente. El citoplasma presentaba granulaciones esféricas que se visualizaban claras
y oscuras (fig. 4 y 5).
Figura 4. Biopsia duodenal mostrando macrogametos de Cystoisospora belli. Coloración
Hematoxilina-eosina (aumento 400X).
9
�
Figura 5. Corte ultrafino de biopsia duodenal donde se observa macrogameto de Cystoisospora
belli. Coloración Azur II (aumento 1000X).
Los microgametocitos maduros se visualizaron como estructuras redondeadas con un cuerpo
residual rodeado de microgametas. Estas últimas tenían forma bacilar y su número era
extremadamente grande (fig. 6).
Figura 6. Microgametocito de Cystoisospora belli visualizado en corte ultrafino de biopsia
duodenal coloreada con Azur II (aumento 1000X).
1
0
�
En los ocho casos estudiados fue posible la amplificación del fragmento esperado de 396 pb (fig. 7).
La secuencia de los fragmentos producidos del gen 18S en los 8 casos fueron idénticos con aquéllos
reportados para C. belli.
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, donde se visualizan
productos de amplificación de 396 pb. Calle M, marcador 100 bp ladder; calles 1 a 8, muestras de
pacientes, calle 9, control positivo; calle 10, control negativo; calle 11, mezcla de reacción.
1
1
�
DISCUSION
C. belli es un protozoario perteneciente al phylum Apicomplexa, clase Coccidia, orden
Eucoccidiorida, suborden Eimeriorina, familia Sarcocystidae (3, 20).
La infección se adquiere por la ingestión de ooquistes esporulados que se desenquistan en el
intestino delgado liberando los esporozoítos que penetran en las células epiteliales. Allí se produce
la multiplicación asexual (merogonia o esporogonia) y sexual (gametogonia), dando origen a la
formación de ooquistes que son eliminados con las heces (8, 20, 21).
El estudio de materia fecal debe ser el procedimiento inicial, no invasivo, en la búsqueda de C.
belli, teniendo en cuenta que durante la fase de multiplicación asexual el examen
coproparasitológico no es adecuado. El conocimiento de las diferentes técnicas de concentración
y/o coloración permite elegir, según sus características y los recursos disponibles, el método
apropiado para cada centro de diagnóstico (22).
La VEDA con toma de las biopsias duodenales es otro método que posibilita diagnóstico específico
(23 - 25). El examen histológico de cortes ultrafinos coloreados con azur II permite visualizar los
distintos estadíos del ciclo de C. belli en el citoplasma de las células epiteliales (26). El
conocimiento y la correcta identificación de estas estructuras es imprescindible pues el hallazgo de
cualquiera de ellas es diagnóstico de cistoisosporosis (27). La indicación de la VEDA está sujeta a
variables tales como el estado general del paciente, contraindicaciones, y disponibilidad de
recursos, que pueden limitar su utilización. El estudio sistemático del duodeno con la toma de
biopsias debe ser considerado el procedimiento invasivo a tener presente en aquellos casos de
diarrea crónica en que no se llega al diagnóstico y es necesario descartar cistososporosis (24, 25).
Este trabajo nos permitió además optimizar el protocolo de extracción de ADN a partir de muestras
fecales y tisulares e implementar la técnica de nested-PCR para diagnóstico de C. belli en material
biológico de pacientes infectados con virus de la inmunodeficiencia humana.
1
2
�
La aplicación de diferentes técnicas de diagnóstico etiológico y molecular para la identificación
parasitaria en pacientes con SIDA mejora el pronóstico ya que posibilita la administración de
tratamientos específicos (4).
1
3
�
REFERENCIAS
1. Lindsay DS, Dubey JP, Blagburn L. Biology of Isospora spp. from humans, nonhuman primates
and domestic animals. Clin Microbiol Rev 1997; 10:19-34.
2. Brandborg LL, Glodberg SB, Breidenbach WC. Human coccidiosis - a possible cause of
malabsorption: the life cycle in small-bowell mucosal biopsies as a diagnostic feature. N Engl J
Med 1970; 283:1306-1313.
3. Trier JS, Moxey PC, Schimmel EM, Robles E. Chronic intestinal coccidiosis in man: intestinal
morphology and response to treatment. Gastroenterology 1974; 66:923-935.
4. Pape JW, Verdier RI, Johnson WD. Treatment and prophylaxis of Isospora belli infection in
patients with the acquired immunodeficiency syndrome. N Engl J Med 1989; 320:1044-1047.
5. Curry A, Smith HV. Emerging pathogens: Isospora, Cyclospora and microsporidia.
Parasitology 1998; 117:143-159.
6. Benator DA, French AL, Beaudet LM, Levy CS, Orenstein JM. Acalculous cholecystitis
associated with Isospora belli in a patient with AIDS. Ann Intern Med 1994; 121:663-664.
7. Restrepo C, Macher AM, Radany EH. Disseminated extraintestinal isosporiasis in a patient with
acquired immune deficiency syndrome. Am J Clin Pathol 1987; 87:536-542.
8. Comin CE, Santucci M. Submicroscopic prolife of Isospora belli enteritis in a patient with
acquired immune deficiency syndrome. Ultrastuct Pathol 1994; 18:473-482.
9. Michiels JF, Hofman P, Bernard E, St.Paul MC, Boissy C, Mondain V, LeFichoux Y, Loubiere
R. Intestinal and extraintestinal Isospora belli infection in an AIDS patient. Pathol Res Practice
1994; 190:1089-1093.
10. Velásquez JN, Carnevale S, Mariano M, Kuo LH, Caballero A, Chertcoff A, Ibáñez C, Bozzini
JP. Isosporosis and unizoite tissue cysts in patients with acquired immune deficiency síndrome.
Hum Pathol 2001; 32:500-505.
1
4
�
11. Frenkel JK, De Oliveira Silva MB, Saldanha J, De Silva ML, Correia Filho VD, Barata CH,
Lages E, Ramirez LE, Prata A. Isospora belli infection: observation of unicellular cysts in
mesenteric lymphoid tissues of a brazilian patient with AIDS and animal inoculation. J
Eukaryot Microbiol 2003; 50:682–684.
12. Camarena JJ, Borrás R, García de Lomas J. Coccidios intestinales. Cryptosporidium e Isospora.
Perea EJ (ed), Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Vol. II. Ediciones Doyma,
Barcelona. 1992; pp. 1027-1033.
13. Müller A, Bialek R, Fätkenheuer G, Salzberger B, Diehl V, Franzen C. Detection of Isospora
belli by polymerase chain reaction using primers based on small-subunit ribosomal RNA
sequences. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19:631-634.
14. Samarasinghe B, Johnson J, Ryan U. Phylogenetic analisis of Cystoisospora species at the
rRNA ITS1 locus and development of a PCR-RFLP assay. Exp Parasitol 2008; 118:592-595.
15. Telemann W. Eine methode zur erleichterung der auffindung von parasiteneiern in den faeces.
Deutsche Medizinische Wochenschrift 1901; 35:1510-1511.
16. Willis HH. A simple levitation method for the detection of hookworm ova. Med J Australia
1921; 29:375-376.
17. Sheather AL. The detection of intestinal protozoa and mange parasites by a flotation technique.
J Comp Ther 1923; 36:266-275.
18. Henriksen SA, Pohlenz JFL. Staining of Cryptosporidia by a modified Ziehl-Neelsen technique.
Acta Vet Scand 1981; 22:594-596.
19. Current WL. Techniques and laboratory maintenance of Cryptosporidium. En: Dubey JP, Speer
CA, Fayer R (ed), Cryptosporidiosis of Man and Animals. CRC Press Boca Raton, Fla. 1990;
pp. 31-49.
20. Huggins DW, Medeiros L, Melo S, Farias J, Henry A. Isosporíase: atualização / Isosporiasis:
review. Rev Patol Trop 1993; 22:71-91.
1
5
�
21. Marcial-Seoane MA, Serrano-Olmo J. Intestinal infection with Isospora belli. P R Health Sci J
1995; 14:137-40.
22. Ernest NG, Markell EK, Fleming RL, Marvin F.Demonstration of Isospora belli by acid-fast
stain in a patient with acquired immune deficiency syndrome. J Clin Microbiol 1984; 20:384-
386.
23. Colebunders R, Lusakumuni K, Nelson AM, Gigase P, Lebughe I, van Marck E, Kapita B,
Francis H, Salaun JJ, Quinn TC. Persistent diarrhoea in Zairian AIDS patients: an endoscopic
and histological study. Gut 1988; 29:1687-1691.
24. Greenson J, Belitso M, Yardle P, Batlett M. AIDS enteropathy: occult enteric infections and
duodenal mucosal alterations in chronic diarrhea. Ann Intern Med 1991; 114:366-372.
25. Kotler DP, Francisco A, Clayton F, Scholes JV, Orenstein JM. Small intestinal injury and
parasitic diseases in AIDS. Ann Intern Med 1990; 113:444-449.
26. Velásquez J, Corti M, Argento R, Lourtau L, Guarnera E, Labbé J, Rodríguez M, Cabrera M,
Chertcoff A. Diagnóstico de la infección por Isospora belli en materia fecal y en biopsias
duodenales de pacientes con SIDA. Rev Arg Infectol 1996; IX (8):6-11.
27. Kotler DP. Gastrointestinal and Nutritional Manifestations of the Acquired Immunodeficiency
Syndrome. Kotler DP (ed.). Raven Press, New York. 1990; 310 pp.
