Zeitschrift ftir Kinderheilkunde, Bd. 76, S. 4--26 (1955).

Aus der Kinderklinik der Westfalisehen Wilhelms-Universitat Mtinster (Direktor. Prof. Dr. Dr. It. M~I)

und der Kinderklinik der St/idtisehen Krankenanstalten Krefe]d (Chefarz~: Prof. Dr. H.-R. W~DE~AN~).

Cytologische Untersuchungen fiber die Alder-Anomalie der Leukocyten ~ ~ .

Von

WILHELM KOSENOW und HANS-RUDOLF WIEDEI~IANN.

Mit 14 Textabbildungen.

(Eingegangen am 28. September 1954.)

A. Einleitung. Das klinische und cytologische Interesse ffir die naeh A L ] ) ~ benannte

Granulationsanomalie der Leukocy~en ist eher noch gewaehsen, seitdem UNDRITZ, WIEDEMANN sowie ULLt~ICt{ U. WIEDEMANlg ~uf die weit- gehende Ubereinstimmung dieser Variet~t mit der bei Pfaundler-Hur]er- seher Krankheit vorkommenden Leukocytengranulierung (J/0aOENS, REILLY, BRUGSOIt, WIEDEMANN 11. a.) hingewiesen und ffir all diese mit einer Dysostosis enehondralis vergese]lsehafteten Granulationsver~nde- rungen den Terminus ,,Alder-Anomalie" vorgeschlagen haben. Da das Wesen dieses Merkmals noch keineswegs aufgek]~rt ist, andererseits aber yon seiner richtigen Einsch~tzung wertvolle Aufsch]fisse fiber die Natur jener Krankheitsbilder erwartet werden kSnnen, verdienen hiimatologische Untersuchungsver/ahren, die neue Erkenntnisse fiber Form und physiko- chemische Eigenschaften der genannten Granula versprechen, besondere Berfieksiehtigung.

])ber derartige Versuehe ist in letzter Zeit vor allem yon ULLalCI~ und WIEDEMANlg in Zusammenarbeit mit UNDRITZ und LAVES berichtet worden. Die eigenen Ih'fifungen, die diese Beobachtungen erganzen und erweitern sollen, wurden bei den gleiehen, an Pf~undler-Hurlerscher Krankheit leidenden Patienten, dem Gesehwisterp~r Kliire und Elisabeth L., durehgeffihrt, deren klinisches Bild einschlieBlich der konstant nach- gewiesenen Granulationsanomalie ausffihrlich in der genannten Arbeit ULLRIGHS uIld WIEDEMANNS geschi]dert wurde.

* tIerrn Prof. Dr. H. VooT zum 80. Geburtstag gewidmet. ** Die Untersuchungen wurden yon der Deutschen Forsehungsgemeinsehaft

untersttitzt und auszugsweise bereits auf der Tagung der Nordwestdeutschen Ges. f. Kinderheilkunde am 30. u. 31. 1. 54 in Bremen mitgeteilt.

Cytologisehe Untersuchungen fiber die Alder-Anomalie der Leukoeyten. 5

Bei beiden Kindern ergab die Differenzierung der weigen Blutk6rperehen zur Zeit der hier referierten Untersuehungen - - bei normaler Gesamtzahl - - folgende Werte (je 400 Zellen ausgez~thlt):

1. Kliire L. (geb. 20 .1 .44) Eos. 2O/o, Segm. 47O/o (Verhaltnis der 1, 2, 3, 4 - - u n d mehrfaeh segmentierten Kerne zueinander wie 1 :2 :8 :3) , Ly. 44~ Mono. 7%;

2. Elisabeth L. (geb. 1~. 3.45) Eos. 3%, Segm. 35%, Ly. 53%, Mono. 9%. S~mtliehe neutrophilen und eosinophilen Leukoeyten sowie fast Mle Monoeyten,

n ieht iedoeh die Lymphoeyten, der naeh May-Grfinwald-Giemsa 3 bzw. 20 min bei pg 6,8--7 gef~rbten, luf t t roekenen Ausstriehe zeigen hinsiehtlieh ihrer Granu- lationen sehr auffillige Ver~inderungen, die hier, obwohl sehon anderenorts erw~ihnt,

Abb. la. Abb. 1 a un4 b. Die Alder-Granulation im May-Gri~nwald-Giemsa-Prdparat.

Abb. la. 3 Neutrophile und 1 3/Ionoeyt mit deutlieh vergr6berter, 1 Lymphocyt ohne aufffdlige Granulierung.

zum besseren Verst/~ndnis der fibrigen Ergebnisse noeh einmal kurz gesehildert seien. Da sieh in dieser Beziehung bei beiden Pat ien ten stets vSllig identische Be- funde ergaben, wird der Einfaehheit halber hierfiber im Folgenden zusammen- fassend, ohne namentl iche Trennung, berichtet.

Die Granula der Neutrophilen weisen gegenfiber norma]en Leukoeyten eine deut- lieh vergr6berte, wenn auch zumeist gleiehm~gig gerundete Form auf und sind in ihrer Lagerung oft so dight angeordnet, dag die Kernsegmente teilweise vSllig ver- deekt werden (Abb. 1 a). Ihre rotviolette bzw. blauviolette, azurophile Farbe er- inner t am ehesten noeh an diejenige der sog. toxisehen Granula, ist aber zweifellos noch intensiver als diese.

W/~hrend die Lymphocyten-Granula weder in Form noeh in Farbe yon dem normalen Bild abweiehen, ist der fiberwiegende Teil der Monocyten ebenfalls yon einer /~hnlieh metaehromatisehen K5rne]nng fiberzogen, deren Zahl und Farb- intensi t~t welt fiber die Verh/~ltnisse normaler Monocyten bei kombinierter May- Griinwald-Giemsa-Teehnik hinausgeht (Abb. la) .

Sehr bemerkenswert ist dann vor Mlem das Bild der Eosinophilen, die hier ,,eine besonders grobbroekige, grSgenm/~gig ungleiehe, g]eiehfalls basophile, sehwarz- violette und hie und da etwas graugrfinliehe - - niemals rote - - KSrnelung '~ (ULL- ~IC~ u. WI~DEMA~) besitzen. Zuweilen en ts teh t naeh dem Farbbi ld sogar der

6 WILHELM KOSE~OW und HANS-RUDOLF WIEDEMANN :

Eindruek, als w~ren zweierlei Arten von Granula, n/~mlieh sehw~rzviolette und sehmutzig graugrfin gefarbte, vorhanden (Abb. 1 b). Jedoeh dfirfte es sieh dabei, und hierffir sprieht aueh ihre Gleiehheit in Form und Gr6ge, nur um quantitativ unter- sehiedliche, durch die Gegebenheiten des lufttroekenen Ausstriehes differente Farb- einlagerungen handeln. Die Eosinophilen-Granula sind jedenfalls auf Grund dieser

Eigenschaften mfihelos yon denen normaler Vergleiehszellen zu unterseheiden. Ihre Meta- ehromasie ist jedoeh so stark, daft besondere Differenzierungsverfahren (s. unter Tell C) her- angezogen werden mfissen, um diese Zellen fiberhaupt als einwandfreie Eosinophile zu identifizieren. Aus den gleiehen Griinden ist ihre Abgrenzung gegenfiber basophilen Leuko- eyten ausgesproehen schwierig. Bei den eigenen Untersuehungen gelang dies - - ebenso wie ULL- RIC~ U. WIED~MKN~ in Zusammenarbeit mit U~DRITZ - - lediglieh im Toluidinblaupr~parat mit geniigender Sieherheit (s. Abb. 13).

Anges i ch t s d ieser auf f~ l l igen B e f u n d e

m u B t e es r e i zvo l l e r sche inen , die aba r t i g

Abb. lb. Eosinophiler Leukocyt. g r a n u l i e r t e n Ze l len b e i d e r P a t i e n t e n a u e h Sehr g robe , ve r sch ieden g r o g e u n d im Vitalpriiparat u n d m i t Hi l fe n e u e r e r

farbintensive KSrnelung. histochemischer Fgrbemethoden zu un t e r -

suehen , u m a u f d i e s e Weise we i t e r e E i n b l i c k e in Ges t a l t u n d Z u s a m m e n -

s e t z u n g der g r a n u l g r e n E l e m e n t e e rha l t en .

B. Cytologische U n t e r s u e h u n g e n a m Supravi ta lpr~ipara t ~. Venenblut, mit I-Iilfe yon Vetren ungerinnbar gemacht, wurde aus /~ul~eren

Griinden ffir die Dauer yon 2--3 Stunden eisgekfihlt aufbewahit und erst dann mit diimlen Tropfen zu den einzelnen Untersuchungen in paraffin~bgedichtete Deckglas- pr/~parate verbracht. Die nach dieser Zeit noch volle Vita]it~t der wei$en Blutzellen liel~ sich ]eicht aus der amOboiden Beweglichkeit der Segmentkernigen schlieBen.

1. Nativblut ohne Farbsto~zusatz. a) Hell/eld: Technik: 1 Tropfen unverdfinnten Blutes unter einem Deckglas aus-

gebreitet. Zweiblenden-ttellfeldkondensabor. Die Neutrophilen erscheinen unauff~illig granuliert (Abb. 2), w~hrend die Eosino-

philen infolge einer plumpen, st/~rker liehtbrechenden KSrnelung deutlich erkennbar werden.

b) Dunlcel/eld: Dem Hellfeld entspreehende Verh~ltnisse. (Immersions-Dunkel- feldkondensor D 1,20 A Leitz).

e) Phasen]contrast: Technilc: MSgliehst diinn ausgebreiteter, unvermischter Bluts- tropfen. Phasenkontr~steinriehtung (Heine.Kondensor) der Fa. Leitz/Wetzlar.

Der ungestSrte Bewegungsablau/zeigt bei den Leukoeyten den gleiehen Gestalt- wandel, wie er yon der amSboiden Bewegung normaler Zellen her bekannt ist (KosE~ow).

Die Granulierung der neutrophilen Segmentkernigen ist fiberall feinkSrnig und - - je nach der mikroskopisehen Ebene - - blausehwarz, grau oder heller ge~:~rbt (Abb. 3a). Aueh an l~nger aufbewahrten, also bereits sterbenden oder sehon toten Zellen mit entspreehenden Kernveranderungen (ZOLLI~GE~) finden sich keine

1 Siehe auch Tabelle 1.

Cytologische U n t e r s u c h u n g e n fiber die Alde r -Anomal ie der Leukocy ten . 7

Fo rm- oder F a r b u n t e r s c h i e d e gegenfiber den neu t roph i l en G r a n u l a eines ebenso b e h a n d e l t e n Vergleichspr~tparates.

Abb. 2. Nativblut ohne Farbstoffzusatz. Hell]eldbeobachtung. Zahlreiche neutrophfle Leukocyten mit unauff~lliger Granulierung.

Abb. 3a. Abb. 3 b, Abb. 3a und b. Nativblut ohne Farbstoffzusatz. Phasenkontrasl. a Neutrophiler, segment- kerniger Leukoeyt in am6boider Bewegung. Unatfff~llig feink6rnige Granulierung. b Eosino- phfler Leukocyt. Sehr plumpe, mmdlieh geformte, teilweise besonders dunkle PlasmagTanula.

Die P l a s m a k S r n e r der eos inophi len L e u k o c y t e n impon ie ren dagegen sofort als besonders p lumpe , rund l i ch geformte , grauschwgrz] ich oder hel]grau geffirbte, teil- weise hel] u m r a n d e t e K o r p u s k e l n besondere r Art . Sie werden d a m i t n i eh t n u r le icht

8 WILHELM KOSENOW und I~ANS-RUDOLF WIEDEMANN :

yon den neutrophilen Leukoeyten des gleiehen Patienten, sondern such yon eosino- philen Zellen gesunder Vergleichspersonen, und zwar starker a]s ira gewShnlichen Licht- und Dunkelfeldmikroskop, unterscheidbar (Abb. 3b).

2. Nativblut mit Farbsto~zusatz. a) Acridinorange (Fluorescenzbild): Technik: 1. •iirbung bei geringer Blutverdi'~n-

nung: Blut- und Farbstoffl/Ssung 1 : 5--10000 in 0,875~ NaC1-LSsung (PJt 6--7) im VerhMtnis 5:1 gemischt, bei Zimmertemperatur 5--10 rain gefgrbt und in dtinnen Tropfen unter einem grSBeren Deckglas ausgebreitet. 2. i~iirbung mit alkoholischer

Fluorochromlgsung: 0,5%ige Aer.- LSsung mit einem Glasstab suf gut gereinigtem Objekttri~ger verteilt und nach Alkoholver- dunstung mit einem Li~ppehen ausgebreitet. 1 Tropfen Nativ- blut, Deckglas. - - Kohlenbogen- lampe des Panphot. Fil ter: BG 12, OG 5, 3~oiges Kupfersulfst.

Wi~hrend sieh die KSrnelung der neutrophilen Reihe und der Monoeyten weder in Farbe noeh in Form yon derjenigen normaler Vergleichszellen unterscheidet, weisen die Eosinophilen such hier besonders grol?e, zumeist rund- ]iehe Granulaformen auf, deren ebenfalls orangerote Farbe bei fortgesetzter Blauliehtexpcsition etwas l~nger als bei den Neutro-

Abb. 4. Nativblut mit Farbstof~zusatz. Acridinorange- philen erhalten bleibt. Der Kern Fdrbung. Fluorescenzbild. 5 )Teutrophile und 1 Eosi- dieser Zellen nimmt, wie das auch nophiler. IKeine wesentliehen Unterschiede gegen-

fiber normalen Vergleichszellen. yon normslen Eosinophilen be- kannt ist, quantitativ weniger

Farbstoff auf und zeigt daher eine Grfinfluorescenz yon geringerer Intensit~t als derjenige der fibrigen Granuloeyten (Abb. 4).

b) Janusgrii,n (Hell/eld): Teehnik: Vorbereitender Farbstoffausstrich mit einer 0,2~ alkoholisehen JanusgrfinlSsung, sodann feuchtes Deckglaspr/~parat, 30 rain F/~rbedauer bei Zimmertemperatur.

Neutrophile Granuloeyten, Lymphoeyten, Monocyten: Keine Auff/~lligkeiten. Eosinophile: Auf~erordentlich grobe, tiefblau gef/~rbte Granula yon rundlicher Form. (Abb. 5a).

c) Neutralrot (Hell/eld): Technik: Wie bei Janusgrfin, jedoch mit 0,1 bzw. 0,25O/oiger alkoholischer NeutralrotlSsung.

Der Befund entspricht weitgehend dem der Janusgriin-Fi~rbung, d. h. es finden sich nur in den eosinophilen Leukocyten besonders grob geformte, dunkelbraun- rStlich gef/~rhte Granula, deren Aussehen hier jedoch st/s Ms beim Acridinorange yore Bild der fibrigen 1N'eutrophilen und such der normMen Eosinophilen abweicht (Abb. 5 b).

Diskussion.

Bei s u p r a v i t a l e r B e o b a c h t u n g y o n L e u k o c y t e n mi~ e rwiesener Alder - scher G r a n u l a t i o n s a n o m a l i e ze ig t sich b e m e r k e n s w e r t e r w e i s e , dab

Cytologisehe Untersuehungen tiber die Alder-Anomalie der Leukoeyten. 9

1. die im gewShnlichen, panoptiseh gef/~rbten Ausstrich so deutlich vergrSberte und farblich ver/~nderte Granulierung der Neutrophilen und Monocyten weder im nativen Blut noeh nach Zusatz vorl basisehen Farb- stoffen besonders auffgllig hervortrit t . Diese Feststellnng gilt nieht nnr ftir die norm~le tIellfeldbeobaehtung, sondern aueh fiir die fibrigen Ver- fahren, wie Dunkelfeld, Phasenkontrast nnd Fluorescenzanalyse. Sie

Tabelle 1. Verhalten der Alder-Granulatior~ bei der cytologischer~ Untersuchung im Supravitalpriiparat. (N~here Einzelheiten im Text.)

I

Mikr oskopisches Verfahren I Neutrophile Eosinophile i I

Hell/eld keine plump geformt, Abweichungen starker licht-

brechend Nativblut

ohne Farbstoff-

Zusatz

Dunkel/eld

Phasen]contrast

Nativblut mit

Farbstoff- Janusgriin Zusatz (Hellfeld)

Acridinorange (Fluoreseenz-

bild)

Neutrdlrot (Hellfeld)

plump u. rund geformt, grau- schwarz oder

hellgrau gefarbt

besonders grog ?

grob geformt, tiefblau gef/irbt

grob geformt, stark gef~rbt

iVio;oooyten

keine Abweiehungen

erstreckt sich aul3erdem sowohl auf die Form der einzelnen Granula als auch auf ihr Farbverhalten unter den verschiedensten oben aufgef/ihrten Bedingungen.

2. Ganz anders verhalten sieh demgegentiber die eosinophilen Leuko- eyten, t i ler imponiert sehon im ungef/~rbten Pr~parat, und zwar beson- ders unter dem Phasenkontrasgmikroskop, die KSrnelung als besonders grob geformt und farblieh abweiehend yon derjenigen ,,normaler" Eosino- philer. Der gleiehe Eindruek findet sieh ferner in ~thnlieher Weise bei der Amvendung basiseher Farbstoffe, und zwar besonders bei Janusgriin und NeutrMrot, best~tigt.

In einem Nat ivbtutpr~parat l~l~t sich demnaeh eine Gr~nulations- anomalie der Leukoeyten naeh ALDER und RSILLY bestenfalls bei auL merksamer Betraehtung der eosinophilen Leukocyten erkennen, abet aueh bier nut bei sorgfgltiger Beurteilung mehrerer Exemplare dieser Zellart.

]0 WILHELM KOS]EI~0W und ~-IAI~S-I~UDOLF WIEDEMANI~ :

Andererseits beweist gerade das Fehlen morphologischer Abweichungen bei der sog. neutrophilen Granul ierung, dab es sieh hier nieht , wie m a n naeh dem Auss t r ich-Eindruck ve rmu ten kSnnte, um eine Ver~nderung der Granula/orm, u n d zwax auch n icht zus~tzlich, handel t . Es mfissen vielmehr Abweichungen anderer, vor allem wohl chemischer Art vorliegen,

Abb. 5 a. Abb. 5 b. Abb. 5 a und b. Nalivblut mit Farbstoffzusatz. Hell/ddbeobachtung. a Janusgr~n.Fdrbung. Eosinophfler rnit grob geformter, tiefblau gefg, rbter Granulierung. b Neutralrol.Fdrbung. 2 neutrophile Leukocyten ohne auff~llige Granulierung, ] eosinophiler mit groben, dunkel-

braun-rStlich gefarbten Granul~.

die sich zudem bei cytologischen Untersuchungen , wie unsere Beobach- tungen mi t basischen Supravital-Farbstoffen wenigstens fiir die neutro- philen Granu locy tenundd ieMonocy tengeze ig t haben, v e r m u t l i c h i n erster Linie an Ausstrichzellen verfolgen ]assen.

C. Cytologische Unte r suehungen am Blutausstrichpr~iparat 1.

Die folgenden Versuche kniipfen an das einleitend geschilderte Bild der panop- tischen May-Grfinwald-Giemsa-F/~rbung an. Um unnOtige Wiederholungen zu ver- meiden, sei hier auf diese Beschreibung (S. 5) ausdriicklich verwiesen. - - Zur ver- gleichenden Beurteilung der Ergebnisse jeder einzelnen F/~rbung sind stets Pr~parate gesunder Probanden oder solche mit Vermehrung eosinophiler oder toxisch granu- lierter Leukocyten herangezogen worden, die im Folgenden nut im Bedarfsfalle eigene Erw~hnung finden.

1. Der Einflu/3 des Fixierers au/ die Fiirbbarkeit der Alder-Granula.

Wenn UNDRITZ sowie ULLRlCH u n d WIEDESIA:N~T hervorheben, dab die Metachromasie der abno rmen ~qeutrophi len-Granulat ion bei ein- facher Giemsa-Farbung weniger s tark als bei kombinier ter Pappenheim- Technik ausgepragt ist, so k a n n dies e inmal an dem zusi~tz]ichen Farb- stoffangebot der May-Gri inwald-LSsung, d a n n aber auch an der bei einfacher Giemsa-Farbung v0rangehenden Methyla lkohol-Einwirkung

1 Siehe auch Tabelle 2.

Cytologische Untersuehungen fiber die A]der-Anomalie der Leukoeyten. 11

l iegen. Z u r K1/~rung d iese r b e r e i t s g r u n d s ~ t z l i c h w i c h t i g e n F r a g e h a b e n

w i t z u n ~ c h s t e ine R e i h e y o n Fix ierungsversuchen a n g e s t e l l t .

a) Kombinierte May-Gri~nwald-Giemsa-Fiirbung wie oben~ ]edoch nach voran- gehender 3--5 mini~tiger Methanolfixierung. Wesentliche Unterschiede gegeniiber der gewShnlichen Pappen- heim-F/~rbung (s. oben) : Granula der Neutrophilen et - was farbintensiver als beim Gesunden, jedoch welt we- niger s tark als bei den glei- ehen Zellen ohne vorherige Methanolfixierung (Abb. 6 a u. b). Eosinophilen-KSrne- lung verwaschen grau, we- niger metaehromatisch, aber formal gegenfiber normalen Ze]len gleicher Spezies deut- lich vergr6bert (Abb. 6c). Monocyten- Granula nicht mehr erkennbar.

Ebenfalls vorfixierte Leu- kocyten mi t sog. toxischer Granulation zeigen im Ver- gleich hierzu keinen derar- tigen Farbrtickgang, wfih-

Abb. 6a. Abb. 6a c. Der Einflu• der Alkoholfixierung a~f die F~rbbarkeit der Alder-Granula. a Segmentkernige Leu- kocyten im gewShnlichen May-Gri~nwald-Giemsa-Aus- strich, b Kombinierte May-Griinwald-Giemsa-F/~rbung nach vorangehender 3--5minfitiger Methanol]ixierung. ~Veniger starke Granulaf&rbung in den neutrophilen Leukocyten. c t~ombinJerte l~ay- Griinwald- Giemsa-F/~r- bung nach vor~ngehender 3--5minfitiger Methanol- ]ixierung. Eosinophiler mit verwaschen graublau gef/~rb-

Let, grober Granulierung.

Abb. 6b. Abb. 6c.

rend die KOrnehng normaler Eosinophiler die Farbe der Ery throcyten ann immt und dami t deutlich yon Alder-Eosinophilen unterscheidbar b]eibt.

b) Giemsa-Fiirbung nach vorangehender , verschieden langer Methanolfixierung. Technik: Neben den Pr/ iparaten der beiden Pfaundler-Hurler-Patienten wurden so]ehe mi t toxischer Granulation, bedeutender Eosinophilie und vOllig normalen Leukocyten jeweils 1�89 3, 5 und 10 min mi t Methanol fixiert und dann 20 rain lang nach Giemsa (13 Tropfcn auf 10 cm 8 Aq. dest., p~ 6,8--7) gef/~rbt. Dabei zeigt sich, dab die L/inge der Fixierung innerhalb der gew~hlten Abst~nde keinen wesent- lichen EinfiuB auf d~s Endergebnis ausfibt und dab dieses im Prinzip schon nach 1 ~ minfitiger Einwirkung erkennbar wird. Eine zeitliehe Gruppierung ist daher - -

12 WILHELM KOSENOW und HANS-RUDOLF WIEDEMAIgN:

trotz gelegentlich vorkommender, geringer Unterschiede - - bei der folgenden Be- sprechung nicht erforderlieh.

Die Alder-Granulierung der Neutrophilen zeigt bier ebenfalls - - bei teilweise eher feinkSrniger Anordnung - - eine wesentliche Verminderung der Farbintensit~t gegen- fiber dem M~y-Grfinwa]d-Giemsa-Bild der gleiehen Zellen, wenngleich ihre rot- violette Farbe auch zweffellos starker Ms beim normalen Vergleiehsl0r~par~t aus~ gepr~gt ist. Auch die eosinophilen KSrner haben ihre schwurzviolette F~rbe verloren und jetzt mehr ein schmutzig-grauviolettes oder graublasses Aussehen angenommen. Diese Farbe unterscheidet sie, abgesehen yon den deutlich grSberen Kernen, aber auch unter diesen Bedingungen noch yon den dann norma]erweise rStlich gefarbten eosinophilen Granula.

Die Monocyten-Granulierung ist, wie unter a erw~hnt, in keinem der Pr~p~rate mehr zu erkennen.

Anders verhalten sich dagegen toxiseh granulierte Leukocyten, die hier auch nur eine geringere und im Vergleich zu den Alder-lkTeutrophilen auf ]eden Fall schw~ehere Abweichung yon dem Farbbild des nicht vorfixierten Paploenheim- Pr~loarates aufweisen.

c) Giemsa/iirbung nach vorangehender Formolfixierung von 5 rain Dauer. Technilc: Fixierung der lufttrockenen Ausstriehe in den I)~mpfen einer 40~ Formal- dehydlSsung. Abspfilen mit Aq. dest. F~irbung wie unter b.

Alder-Granulierung der Monocyten, Neutro- und Eosinophilen nahezu vollst~indig erhalten, wenngleieh etwas blasser und bl~iulicher als im Pappenheim-Praparat. Normale eosinophfle Granu]a erscheinen auch unter diesen Umst~nden rot- farbener tingiert.

cl) Giemsa-.FCirbung nach vorangehender Formol-Al]co/~lfixierung. Techni]~: Fixie- rung der luft trockenen Ausstriche in einem Gemiseh yon 1 Tell 40~ Formal- dehydlSsung und 3 Teflen 96~oigem Aethylalkohol. F~irbung wie unter b.

Alder-Granulation: wie unter e)beschrieben, aber noch mehr dem Farbbild der panoptisehen Teehnik angenahert.

Dis/~ussion.

Die fiir die Alder-Anomalie charakterist ische Metachromasie der Granu]a yon Neutrophi len, Eosinophflen und Monocyten kommt nu r bei Anwendung der kombin ie r t en May-Gr i inwald-Giemsa-Fi i rbung zur typi- schen Darste]lung, und zwar auch nu r dann , wenn sie an luf t t rockenen, nicht alkoholfixierten Auss t r ichen vorgenommen wird. Vorausgehende Methanolfixierung beseitigt d_agegen die starke Azurophilie weitgehend, so dab die Anomalie als solche nu r noch an tier GrSBe der Eosinophilen- Granula und deren verwaschen grauer und nicht - - wie normalerweise - - rStlicher F~trbung e rkennbar wird. Das Ausma~ dieses Farbwechsels, das m a n in gleicher Weise an alkoholfixierten Giemsa-Pr~para ten feststellen kann , ist st~irker als bei ebenso vorbehandel ter toxischer Neutrophi len- Granul ie rung u n d daher u. U. als Untersche idungsmerkmal beider Gra- nu]a -Ar ten zu verwerten.

Die kennzeichnende farbstoffbindende Substanz der Alder -Granula l~l~t sich demnach bei Alkoholfixierung nur d a n n in vollem Umfang dar- stellen, wenn in ihrem V e r l a u f - wie das bei der May-Grfinwald-Vor- f~rbung der Fal l ist - - gleichzeitig tier Farbstoff angeboten wird.

Cytologische Untersuchungen tiber die Alder-Anomalie tier Leukocyten. 13

Da andere Fixierungsmit te l , wie Formal inds und FormolMkohol- LSsung, demgegeniiber keine starke FarbeinbuBe herbeifiihren, daf t ma n wohl folgern, dab die Alder -Granuherung un te r anderem eine Substanz enth~lt , die nach Luf t t rocknung in reinem Methylalkohol, n icht so sehr dagegen in niederprozentigem, formolgemischtem ~thy la lkohol 16slich ist oder zum mindes tea ihrer sog. azurophilen Reakt ionsgruppen be- r aub t wird. Die Vermutung, dab es sich dabei zum Tei] um lipoidhaltige Komplexe handeln k6nnte , wird ferner durch ihre weitgehende Konser- vierung in Formol und dutch allgemeine Fet t fgrbemethoden, wie z. B. die Sudanschwarz-B-Reakt ion, nahegelegt.

2. Cytochemischer Lipoidnachweis mit Sudanschwarz B. Technil': Die Sudanschwarz-B-Fgrbung wurde in der yon STORTI U. Pm~GI~I

(briefliche Mitteilung) modifizierten Methode von S~EEI~aN u. STONEY folgender- magen durchgefiihrt:

5--10minfitige Fi~rbung in einer aus den StammlSsungen I (PhenollSsung) und II (0,3~ alkoholische Sudanschwarz-B-L6sung) hergestellten Mischung. An- schlieBend kurzes Waschen in absolutem sowie 70~ Alkoho] und Wasser. Gegenf~rbung nach Giemsa.

In derarL vorbehandelten Ausstrichen zeigen norrnalerweise alle neutrophilen und eosinophilen Leukocyten eine starke, die Monocyten eine weniger zahlreiche sudanophile Granulierung, deren braunschwarze F/~rbung durch ihren Geh~lt an Phospholipoiden bedingt sein soll.

Abb. 7 a. Abb. 7 b. Abb. 7 a mad b. LipoidIdrbung rail Sudan schwarz B. a Eositxophiler mit besonders plurapen, schwarz gerandeten Granula. b Zwei Monocyten mit sehr zahlreicher lind gTober, slldanophiler

t~6rnelung.

Die Alder-Granula der Neutrophilen sind wie bei normalen Leukocyten braun- schwarz gef~rbt und sehr dicht gelagert, ~ber zum (geringen i) Unterschied yon diesen (und auch yon den toxischen Granu]a) etwas gr5ber geformt und verwaschener gezeichnet. Besonders plump erscheinen auch bei dieser F~trbung die eosinophi~en KSrner mit ihrer gleichfalls br~unschwarzen Umrandung (Abb. 7 a). Sie werden da- dutch leicht yon den Neutrophilen unterscheidbar, obgleich sie im ganzen dunkler

14 WILHELM KOS~OW und HA~S-RU])OI.F WI~DEMA~ :

als die normalerweise im Zentrum starker aufgehellten Eosinophilengranula wirken. Auch die sudanophile Monocyten-Kfrnelung ist eindeutig grfber als sonst iiblich ausgepr~gt (Abb. 7b). Dies kann jedoeh nich~ als spezifisehes Merkmal gewertet werden, da derart granulierte Zellen im Sudanprap~rat bei st~rkerer Monocytose ebenfalls vorkommen.

L~nger aufbew~hrte, gef~rbte Pr~parate beider Patienten zeigen fibrigens ein etwas schnelleres Nachl~ssen der braunsehwarzen Farbintensit~t als Vergleiehs- ausstriche gesunder Probanden.

Diskussion.

Das Ergebnis der cytochemischen Sudanschwarz-B-F~rbung beweist zweifel]os, dab die Alder-Granu]ation der Neutrophilen, Eosinophilen und Monoey~en ]ipoidhaltige Strukturen - - vermutlich sogar in reieher Menge - - besitzt. Wenngleich gewisse Unterschiede in der Farbintensits gegen- fiber normalen Vergleichszellen sowohl bei den Neutrophilen und Mono- oyten als auch besonders bei den Eosinophilen vorhanden sind, so impo- nieren diese dooh nieht in dem Mal~e wie nach der Pappenheimfitrbung. Andererseits erlaubt diese Feststellung noeh nicht, einen unterschiedlichen Gehalt an Fetten und fetthaltigen Stoffen ganz abzulehnen, da Diffe- renzen im F~rbton hier nut eine verschieden st~rke Farbstoffeinlagerung, nicht jedoch ohne weiteres chemisehe Verschiedenheiten anzeigen (RoM~is).

3. Cytochemischer Kohlenhydratnachweis.

a) Perjodsiiure-Leulcofuchsin-Reaktion (PdS-Realction). Da zu den Stoffwechselgruppen mit positiver PAS-Reaktion auch die sauren Muco- polysaccharide gehfren, die man neuerdings als wesentlichen Gehal~ eines

Abb. 8. Per]odsdure-Leuko]uchsin-Reaktion. ]',Teutrophile Leukocyten mit rStlicher, teilweise gekSrnter Pl~smaf~rbe.

in den Alder-Granula vermehrt gespeicherten Komplexes diskutiert, und andererseits mit der gleichen Fgrbung auch die yon LINDSAY, t:~EILLY und Mitarbeitern als mSgliche Speicherungsursache postulierten Poly- saccharide (Glykogen) erfal3t werden, erscheint die Durchffihrung dieser cytochemisehen Reaktion besonders angezeig~.

Cytologisehe Untersuehungen fiber die Alder-Anomalie der Leukoeyten. 15

TechniC: Fixierung lufttrockener Ausstriche in Formold/impfen. Durehf/ihrung der Perjodsaure-Leukofuchsinreaktion nach den Angaben y o n HOTCHKISS, mit und ohne Gegenfarbung der Kerne mit Malachitgriin.

Ergebnis: Die neutrophilen Leukocyten der beiden Pfaundler-Hurler-Kranken zeigen eine je naeh der Zellgr6ge weehselnd intensive rosarot-violette Plasmafarbe, die nur gelegentlieh (z. T. beim Vorhandensein heller granul/~rer Aussparungen) als diffus verteilt erkennbar wird, zuweilen aber - - wie auch normMerweise - - einen k6rnigen Eindruck erweckt. Die Entseheidung darfiber, ob eine mehr granulgre oder eine diffuse Farbstoffspeieherung vorliegt, ist also ausgesprochen sehwierig, obgleich der letztgenannte Eindruek (s. aueh ROBI~EA~X, BAZIN u. DELAUNAY) durehaus vor- herrschen kann. Keinesfalls jedoeh ist in den fraglichen Ze]len unserer Patienten eine fiber das normale Mag hinausgehende Farbspeieherung eingetreten (Abb. 8). Das gilt in gleicher Weise wohl aueh fiir die Eosinophilen, obwohl hier durch die sehmutzig-graue Eigenfarbe der groben Granu!a (entgegen den hell-granul/~ren Aus- sparungen normaler Vergleichszellen) eine diffuse Plasmaf/~rbung nicht sicher aus- zumachen ist. Die 3. Zellspecies, die Monocyten, weist zuweilen einen zart rosa- violetten Farbsehimmer im Cytoplasma auf und bleibt damit ebenfalls im Bereich einer normMen Reaktion.

b) Fermentative Behandlung mit Testis-Hyaluronidase. LAVES ha t da rauf hingewiesen, dab bereits naeh 30 min w/~hrender Hydrolyse mit Tes t i s -Hyaluronidase eine Anfgrbung der neutrophi len Granula t ion dureh May-Gri inwald-Giemsa nicht mehr erfolgt u n d dab sich die abnorme Alder -Granu la t ion neutrophi ler Leukocyten vSllig gleichsinnig verh/~it. Er ve rmute t auf Grund dieser Befunde, dab zwisehen ihnen keine we- sentl ichen Unterschiede bestehen und dab die Alder -Granula , ,neben

Abb. 9a. Abb. 9b. Abb. 9a und b. Giemsa-F/~rbung naeh Inkuba t ion alkoholfixierter Ausstr iche in Hyaluro- nidase-LOsung. (Vgl. Abb. 10). a Neut rophi le r und NConoeyt m i t g ranulaf re iem, , , Ieerem" Cytoplasma. b Eosinophiler m i t wei tgehend erhal tenen, bl~ulichviolet t gef/~rbten und

p lump ge fo rmten Granula . (lg/~heres siehe Text .)

RNS einen Protein- u n d vor allem einen Polysacchar idante i l" enth/~lt, ,,der einem Hyalurons~urees ter entspr icht" .

Technik: Der tIyaluronidase-Effekt wurde bei den eigenen Untersuehungen in folgender Anordnung geprfift: alkoholfixierte, lufttrockene Ausstriehe kamen fro" die Dauer yon 20--30 rain in eine Fermentmisehung yon 500 VRE Hyal. (Luronase

16 W~LHEL~ KOSEN0W und I-IA~s-RuDoLF WIEDEMANN.*

,,Bayer") in 20 cm a physiol. NaC1-LSsung bei 370 und wurden anschtiefiend mit GiemsM6sung wie fiblieh 20 rain naehgef~rbt. In vOllig gleieher Weise wurden auger- dem Vergleichspr~parate der Einwirkung reiner physiol. NaC1-L6sung, einer ebenso bezw. viel starker konzentrierten I-Iylaluronidase-Aq. dest.-Misehung und einer reinen Aq. dest.-Charge ausgesetzt. Die Zeit yon 20--30 min, die auch von LAVES genannt wird, erwies sieh ebenso wie die Fermentkonzentration in dieser Form als vSllig ausreichend.

ErgeSnis: W~hrend die Kerne der Neutrophilen nach einer derartigen Vorbe- handhmg h6chstens etwas aufgeloekert, im allgemeinen abet sehr gut erhalten sind, hat ihr Cytoplasma eine zart rOtliche Farbe angenommen und ist v611ig frei yon granul~ren Elementen (Abb. 9a). Ebenso verh~lt es sieh mit den Monocyten, deren Plasma gleichfalls heller als im nicht inkubierten Giemsa-PrS.parat wirkt (Abb. 9a). Im Gegensatz hierzu erscheinen jedoch die Eosinophilen-Gr'&nula weit- gehend erhalten, yon plumper Form und nach wie vor blaulieh-violetter Farbe (Abb. 9b).

Im Vergleich hierzu zeigen Leukoeyten mit toxischer Granulation ein vSllig den Alder-Neutrophilen entsprechendes Verhalten, w~hrend die Granula normaler Eosinoplgler heller rStlieh und nicht so metaehromatisch gefarbt aussehen. Aueh hier also eine bemerkenswerte Differenz zwischen normalen und Alder-Esoinophilen!

Der eingetretene Effekt entspr ieht zum mindes ten bei der neutro- philen Granul ie rung den yon LAves mitgeteilte~t Befundetx u n d darf daher wohl mi t diesen vergliehen werden, obgleieh uns n~here Einzel- hei ten fiber L6sungsmit te l und Konzen t r a t i on der Ferment lSsung aus den LAvEs'schen Arbe i ten n ieh t b e k a n n t geworden sind.

Diese Fests te l lung ersehein~ uns um so wiehtiger, weil wir fiber- rasehenderweise bei gleieher Versuchsanordnung ohne Hyaluronidase ,

Abb. 10. Giemsaf~irbung n a c h I n k u b a t i o n a lkohol f ix ie r te r Auss t r i ehe in physiologischer NaCI-L6sung. 2 n e u t r o p h i l e L e u k o c y t e n m i t ebenfal ls g r a n u l a f r e i e m , , , l ee rem" C y t o p l a s m a .

(Vgl. Abb . 9, n~theres siehe Text . )

also mi t reiner physiologischer NaCt-L6sung, absolut identisehe Ergeb- nisse erzielt haben (Abb. 10), so dab die oben gesehilderten qua l i ta t iven

Cytologische Untersuchungen fiber die Alder-Anomalie der Leukocyten. 17

Ausstrichver/~nderungen - - jedenfalls bei unserem Vorgehen - - unter keinen Umstiinden einer Hyaluronidase-Wirkung zugeschrieben werden kSnnen. Da sich dieser ,,Kochsalze]/elct" in allen Fgllen mit Sicherheit reproduzieren lieg und stets zu den yon LAVES abgebildeten Anderungen der granul~ren F~rbbarkeit fiihrte, waren wir bestrebt, den Wirkstoff in einem anderen LSsungsmittel anzubieten und nahmen hierzu Aqua dest. mit gleieher oder st~rkerer Fermentkonzentration.

Abb. 11. Giemsaf~trbmlg naeh entspreehender Vorbehandlung alkoholfixierter Ausstr iehe in Hyaluronidase-Aqua dest.-L6sung. (Vgt. ~bb . 9). Neutrophi ler uncl eosinophiler Leukoeyt .

Die Gr~nulafhrbbarkei t besser erhalten. (N~heres siehe Text . )

Dabei ergab sich nun tin anderes Bild : die Neutrophilengranu]a waren hier wesentlich besser als in Kochsalzl5sung erhalten und entweder genau so oder etwas geringer als in einem entsprechenden, nicht exloonierten Giemsa-Pr~loarat gef/irbt (Abb. 11). W~hrend die Eosinophilen mit ihrer groben, dunkel-violetten KSrnelung keine Unterschiede gegeniiber NaC1- Pr~paraten boten, war an den Monocyten, ebenso wie im normalen Ver- gleichspraparat, wieder eine zarte P]asmabasophilie zu bemerken. Er- wahnenswert wiire noch, dab sich siimtliche eben genannten Befunde auch in ]ermentlreiem Aqua dest. vSllig identisch reproduzieren liegen.

Diskussion. Der Versuch, mit Hilfe der Perjodsiiure-Leukoluchsin-Realction in den

Alderzellen cytochemisch eine vermehrte Speicherungvon Polysacchariden bzw. sauren oder neutralen Mucopolysacchariden nachzuweisen, fiihrt zu keinem positiven Ergebnis. Wenn man yon der groben, schmutzig grau- farbenen, vermutlich aber nicht durch die spezifische Farbreaktion be- dingten Eosinophilengranulierung absieht, so verhalten sich alle frag- lichen Zellarten f/~rberisch genau so wie diejenigen normaler Verg]eichs- pr~iparate.

Auch die AuflSsung der Alder-Granulation neutrophiler Leukocyten durch Testi.s-Hyaluronidase (LAVES) kann nach eigenen Erfahrungen

Z. Kinderhe[lk. , Bd. 76. 2

18 WILheLM KOSE~OW und HA~s-R~DoLF WIEDEMAN~ :

n icht als Beweis ffir eine ve rmehr t e Speicherung yon Hyalurons~ure- es te rn angesehen werden, da die Ergebnisse dieser Reak t ion , wie im einzelnen gezeigt wird, sich im gleichen AusmaB auch du tch eine ferment- freie, reine physiol . Kochsa lz l5sung erzielen lassen und somit - - zumin- des t in der yon uns e ingeha l tenen Versuchsanordnung - - als n ich t fer- m e n t a t i v bed ing t zu bewer ten sind.

Es war im Ver lauf dieser Versuche also n ich t m5glich, einen e inwand- freien Hya lu ron idase -Ef f ek t nachzuweisen. Sie haben aber gezeigt, da6 die fa rbs tof fb indende Subs tanz der A lde r -Gra nu l a neu t roph i l e r Leuko- cy ten ebenso wie die normale r und tox isch granuHerter Neu t roph i l e r in NaCl-L5sung bei en t sprechender Expos i t i onsdaue r und naeh vorher iger Alkoholf ixat ion vSllig in LSsung geht und dab sie andererse i t s in A q u a dest . 1 viel - - und dies im Gegensatz zu den tox ischen Granu la - - yon ihrer me t ach roma t i s chen FKrbba rke i t einbii l] t . Es liel~ sich ferner zeigen, daf~ die Alder-Eosinophilzn auch u n t e r diesen Umst / inden anders als nor- male Zellen der gleichen Spezies reagieren und sowoh] ihre p lumpe F o r m als auch ihre schmutz ig -g raub lau-v io le t t e F a r b e weitgeherld be ibeha l t en .

6. Cytochemischer Nucleoproteidnachweis.

Die s t a rke Basophilie der A lde r -Granuhe rung , die ja u. a. zun/ichst einell e rhShten Gehal t an sauren Mucopolysacchar iden v e r m u t e n l~l~t, regt nun wei terh in vor al lem zur Ans te l lung his tochemischer Nucleo- p ro t e id -Reak t i onen an, da die Nucleins/~uren in gleicher Weise als wesent- liches S u b s t r a t der me t ach roma t i s chen l~/ i rbbarkei t b e k a n n t sind. I m R a h m e n tier eigenen Un te r suchungen wurden zu diesem Zweck die Ver- d a u b a r k e i t m i t e inem Harnribonucleasekomplex und die Nuclealreaktion, nach F ~ L G E ~ durehgeff ihr t .

a) Fermentative Behandlung mit einem ttarn-,,Ribonucleasekomplex". Bezfiglich Theorie und Anwendungsgeb ie t dieser t~eakt ion bzw. der um- s t r i t t enen F rage ihrer Spezifit/~t sei au f die Arbe i t en yon LAves , TgOMA u. OBE~DO~SS~ verwiesen, deren K e n n t n i s bier - - aus Gri inden der t~aumersparn is - - vorausgese tz t werden darf .

Technik: Gewinnung des ,,Ribonucleasekomplexes ~ aus Harn in der von LAVES angegebenen Technik. Erw/~rmung der EnzymlOsung im Wasserbad auf 56 ~ Sodann Inkubation methanolfixierter Blutausstriche fiir die Dauer yon 15 rain. Giemsa- Nachfarbung.

Ergebnis: Das Kernchromatin s/~mtlicher Alder-Neutrophilen ist in typischer Weise bis auf ein filigranartig gezeichnetes Restgerfist - - ebenso wie bei normalen und toxisch granulierten Leukocyten--herausgelSst. Auchbeziiglich des Granula- verhaltens finden sich (mit dem ~ormalen) identische Verhgltnisse: stellenweise erkennbare granulgre Aufhellungen, jedoch keine eigentliche Kornfgrbung mehr Alle Monocyten zeigen demgegeniiber gut erhaltene Kerne und ein granulafreies

1 Diese Feststellung gilt fiir frtihestens 8 Std nach der Entnahme fixierte, dann mindestens 1 Tag und maximal 3 Monate aufbewahrte Ausstriche, eine Bedingung, der selbstverst/tndllch auch die erwghnten Vergleichspr/~parate unterworfen wurden,

Cytologische Untersuehungen tiber die Alder-Anomalie der Leukoeyten. 19

nieht mehr basophiles Cytoplasma. Aueh an dem Kern der Alcler-Eosinophilen ist, wie yon normalen Esoinophilen her bekannt , keinerlei Hydrolysewirkung zu erkennen. Ihre groben, verwaschen gezeiehneten Granula besitzen eine grau-blau- viole~te Farbe und weiehen hiermit deutlieh von den sch/~rfer gezeichneten, bl/~u- lich umrandeten und in der Mitre aufgehellten Granula norm~ler Vergleiehsze]len ab (Abb. 12a--e) .

])as sowohl im Kern- als aueh im GranulaverhMten yon den Neutrophilen - - in Paralle]e zum Normalen - - abweiehende Aussehen der Eosinophi]en erleichert ihr

Abb. 12 b.

Abb. 12a. Abb. 12e. Abb. 12a---c. Giemsaf&rbung naeh fermantativer Behandlung mit einem I-Iarm-,,Ribonu- klease-Komplex" (LAvEs). a Lymphoeyt, 2 Neutrophile. Weitgehende Kernhydrolyse und Verlust tier Granulaf&rbung in den Neutrophilen. b Monoeyt. Cytoplasma granulafrei. Kern erhalten, e Eosinophiler. Kern unversehrt. Granula grob, verwaschen gezeiehnet.

Auffinden in diesem Praparat ungemein und trggt auBerdem sehr zu der notwendi- gen, eingangs bereits erw~hnten Identifizierung dieser Zellen bei.

Gleiehzeitig angestellte Verdauungsversuehe mit derselben Enzyml6sung an [ormolfixierten Ausstriehpriiparaten lieBen die eharakteristische Kernhydrolyse der Neutrophilen v611ig vermissen und ergaben stellenweise eine - - wenn aueh geringe - - Anfiirbbarkeit der granulgren Elemente. Diese Befunde zeigen, dab die dem sog. ,,Ribonueleasekomplex" zugesehriebene, hydrolytisehe Ver~nderung in dem bekann- ten AusmaB nur an alkoholfixierten und daher in ihrer Struktur besonders ver- ~nderten Zelleiweigbestandteilen wirksam wird.

b) Thymonucleinsiiurenachweis mit der Feulgenfiirbung. Z u r P r i i f u n g

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d e r u m g e k e h r t e W e g , d e r e ine r d i r e k t e n Anf /~rbung, gew~h l t .

Technik: Behandlung formolfixierter Ausstriche mit der Feulgensehen Nucleal- f~rbung nach den Angaben yon WtIITBY U. B~ITTO~.

Ergebnis: Kernfarbe und -struktur aller fragliehen Alderzellen nicht von der- jenigen normaler VergleiehszeUen unterscheidbar. Keine Granulatinktion.

2*

20 WILHELH KOSENOW und I-IANs-I~uDOLF WIEDEMANI~!:

Diskussion. Die enzymatische Behandlung mit einem Harn-,,Ribonucleasekomplex" (LAvEs)

ergibt bei Alder-Neutrophilen und Monocyten ein dem Normalen vSllig entsprechen- des l~esultat, und zwar sowohl bezfiglich der Kernhydrolyse, als auch des Ver- lustes der Granulaf~trbbarkeit. Lediglich die Eosinophilen lassen auch unter diesen Bedingungen eine yon gesunden Vergleichszellen etwas abweichende F~r- bung erkennen.

Da fiir das Gelingen der Reaktion, wie eigene Versuche mit formolgehi~rteten Ausstrichen gezeigt haben, eine vorangehende Alkoholfixation yon entscheidender Bedeutung ist, muB diese in ihrer f~rbb~rkeitsmindernden Eigenschaft bei der Be- urteilung des Granulaverhaltens roll beriicksichtigt werden. In dieser Beziehung sind ferner n~ch den unter C/3/b geschilderten Erfahrungen die reine Flfissigkeits- einwirkung und diejenige des in der Enzym]Ssung noch vorhandenen Salzgehaltes

(evtl. auch des Hitzeeinfiusses) in Rech- hung zu steilen, woffir u. a. der hierbei eintretende und durch Alkohol allein in dem Ma~e nicht zu provozierende Farb- verlust der toxischen Granula sprechen kSnnte.

Aus unseren Versuchen, ein- schlie~lich tier Feulgen-F~trbung, lassen sich demnach beztiglich der chemischen S t ruk tu r Alder-granu- lierter neut rophi ler Leukocyten und

A b b . 13. Toluidinblau]drbung. B a s o p h i l e r uncl neutrophiler Leukocyt. Beachte die Monocyten keine wesentlichen Un- stark metachromatische, dicht gelagerte

G r a n u l i e r u n g d e r ~Ylastzelle ! te rscheidungsmerkmale ablei ten. Le- diglich das Verhal ten der Eosinophi-

]en scheint da rau f h inzudeuten , dab ein gro~er Tell ihrer basophilen Granu]af~rbbarkei t ffir den g e n a n n t e n Fe rmen tkomplex n icht angreif- bar bleibt u n d daher vermut l ich auch n icht nucleins~ure- bzw. nucleo- pro te idbedingt ist, sofern die Reak t ion einen solchen Rfickschlul~ fiber- haup t zul~il~t.

5. Toluidinblau/grbung. Zur Prfifung der metachromat i schen F~irbb~rkeit k a n n ferner die

Toluid inblauf i i rbung herangezogen werden, die UND~ITZ ffir die Ident i - fizierung yon Blur- und Gewebsbasophilen angegeben hat .

TechniC: F~rbung lufttrockener Ausstriche mit ges~ttigter Tohidinblau-Metha- nol-LOsung nach den Angaben yon UI~DI~ITZ (Hiimatologische T~feln ,,Sandoz" S. 28).

Ergebnis: Die Granula der Alder-Neutrophilen und Monocyten haben zum grSl3ten Tefl entweder keinerlei Farbstoff angenommen oder zeigen vereinzelt eine deutliche, blaufarbene Tinktion. Sie unterscheiden sich damit nur wenig yon norm~len neutrophilen und toxischen Granula entsprechender Vergleichspr~pa- rate. Die Alder-Eosinophilen weisen demgegenfiber insofern etwas st~rkere Diffe- renzen auf, als sich ein Teil ihrer plumpen Granula blauviolett anf~rbt und dies normalerweise nnter glelchen Bedingungen nicht in dem MaBe der Fall zu seln pfiegt.

Cytologische Untersuchungen fiber die Alder-Anomalie der Leukocyten. 21

Eine Abgrenzung yon Mastzellen, wie sie UNI)I~ITZ bei der gleichen F/~rbung infolge der stark metachromatischen, dichteren Granu]ierung dieser Zellen gelang, ist auch uns ~uf Grund der mehr r6tlich-violetten Granulafarbe im allgemeinen gut m6glich gewesen (Abb. 13).

Diskussion.

Die e twas s t~rkere Metachromasie der eosinophilen und teilweise auch der neu t roph i len K6rne lung im To lu id inb l aup r~pa ra t ]/~l]t in s t ruk tu r - ana ly t i scher Hins ich t ]ediglich den SchluB zu, dab Baus te ine mi t st/~r- keren oder zahlre icheren S~urevalenzen (Mucopolysaechar ide ?) vor- liegen mfissen, - - eine Vermutung , die ja auch mi t der bei anderen Reak t i onen auff~llig ges te iger ten basophf len F/~rbbarkei t gut fiber-

Abb. 14a. Abb. 14b.

Abb. l ~ a und b. P e r o x y d a s e - R e a k t i o n . a Monocyt und neut rophi ler Leukocy t m i t in tensiv gef/~rbter, grober Granul iernng. b Eosinophiler m i t sehr groben, s t a rk gei/ irbten Grannla .

e ins t immt . I n dJagnost ischer Hins ich t wird durch die Toul id inblau- Methode aul3erdem eine sonst k a u m durchff ihr bare Abgrenzung der Mastzellen erm6glicht .

6. Peroxydase-Reaktion.

Technik: Fixierung und F~irbung hfttrockener A~sstriche nach der Vorschrift von HALLMAN~ (Klinische Chemie und Mikroskopie S. 362), jedoch mit dem Unter- schied, dab sich an die Naehf~rbung mit Azur I I noch eine solche mit Giemsa- L6sung (13 Tr. auf 10 cm ~ Aq. dest.) ftir die Dauer yon 15 min anschloB.

Es war zu e rwar ten , dal3 diese F/ i rbung, die schon normalerweise die Granu]a der Neut rophi len , Eos inophi len und lV[onocyten in besonderem Mal~e zur Dars te l lung br ingt , auch die Alder-Granulation mit s t / i rkster F a r b a n l a g e r u n g abb i lden wfirde.

Tats/~chlich weisen bereits die Monocyten in ihrem Cytoplasma besonders grobe peroxydasepositive, grannl~Ie Schollen auf (Abb. 14a). Daneben enthalten aber auch die Neutrophilen eine sehr dicht ge]agerte, intensiv gef/~rbte und sehr grobe Granu- lierung, die - - ebenso wie bei den Monocyten - - durch ihre plumpe Form etwas yon dem Bild normaler Vergleiehszellen abweicht (Abb. ]4a). Dieses vergr6berte Aus-

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24 WILHEL~I KOSE~OW und HA~s-RuDoL~ WIED]~MA12~N :

sehen hat weiterhin zur Folge, dall der Unterschied zwischen den Neutrophilen und den gleichfalls sehr groben, aber ebenso intensiv gef~irbten eosinophilen Granula weniger grog ist (Abb. 14b), wiihrend sich normalerweise beide Granula-Arten durch die feinkSrnige Anordnung der Neutrophilen sehr viel leichter abtrennen lassen.

Diskussion.

Die Alder-Granulation ste]lt sich bei der Peroxydase-Reaktion intensiv gefiirbt und in besonders grober Form dar. Das Gesamtbild erinnert da- durch sehr an das der Sudan-F~rbung, jedoch mit dem Unterschied, dal~ die GrSl3en- und Farbdifferenzen zwischen eosinophilen und neutrophilen Granula in diesem Falle etwas geringer ausfallen. Auch hier t r i t t abet die Abweichung vom normalen Granulabild der Leukocyten rdcht so eindrueksvoll hervor, wie bei der einfachen May-Grfinwald-Giemsa- F~rbung.

Zusammenfassung. Die vorliegenden Ergebnisse stfitzen sieh auf cyto!ogisehe Unter-

suchungen an vita]en und Ausstrieh-Leukocyten (Neutrophile, Eosino- phile, Monoeyten, Lymphoeyten) yon zwei Geschwistern mit Alderscher Grc~nulationsanomalie bei Dysostosis multiplex (Pfaundler-Hurlerseher Krankheit) . Sie lassen sieh in folgenden Festste]lungen kurz zusammen- fassen :

Die abnorme Granulierung der Neutrophilen, Eosinophilen und Mono- cyten kommt sehr eindrueksvo]l sehon im gewShnliehen, nach May-Gr~n- wald-Giemsa ge/iirbten Ausstrichprdparat zur Darstellung und erscheint hier nicht nur farblich, sondern auch in der Form yon der Cytoplasma- k6rnelung normaler Zellen verschieden. Mit Hilfe vitaler Beobachtungs- methoden (Hell/eld-, Dunkel/eld-, Phasenkontrast- und Fluorescenzmi]cro- skop) l~I~t sich jedoch nachweisen, dab nur bei den Eosinophilen, nicht aber bei den Neutrophilen und Monocyten, eine mikroskopisch fa[3bare Abweichung der Form vorliegt. Bei den /ibrigen, vor allem /arbliehen Di//erenzen mu~ es sich dagegen um physiko-chemisehe Strukturunter- schiede handeln, die zudem vorwiegend erst unter den Bedingungen des getrockneten und fixierten Ausstnches zur Geltung kommen.

Es erweist sich, dal~ die/arbsto//bindende Substanz nur wenig durch Aqua dest., sehr stark aber durch physiol. NaCl-LSsung auswaschbar ist und dal~ sie vor allem bei den Eosinophilen auf Grund deren f~irberischer Eigensehaften fiber st~irkere oder zahlreiehere saure Valenzen verffigen muB. Die angestellten cytochemischen Untersuchungen legen aul3erdem die Vermutung nahe, dal~ die Alder-Granula einen hSheren Lipoidgehalt (dureh Alkoho] extrahierbar, mit Sudansehwarz B f~rbbar) aufweisen, w~hrend sieh hinsichtlich des Kohlenhydrat- und Nucleoproteidgehaltes keine wesentlichen Abweiehungen yon normalen Zellen ergeben haben.

Cytologische Untersuehungen fiber die Alder-Anomalie der Leukoeyten. 25

Diese Fes ts te l lungen gel ten allerdings nur fiir die hier ve rwand ten Me-

thoden und st i i tzen sich demnach auf recht grebe, sub jek t iv beur te i lbare Farbdifferenzen. Es ist zu vermuten , dab hier neuere Verfahren - - wie

die rad ioak t ive E t ike t t i e rung oder mikrospekt rometr i sche bzw. mikro-

e lektrophoret ische Unte r suchungen der Granulaf rakt ion - - n~here Auf- kl~rung bringen werden.

Vom pralctisch-hgmatologischen Standpunk t aus erscheint besonders

wichtig, dab in all unseren Versuchen die eosinophilen Granula ein fast

immer abart iges Form- und Fa rbve rha l t en gezeigt haben, wghrend dem-

gegeniiber bei den Neutrophilen nur in einze]nen F~llen Differenzen nach-

weisbar gewesen sind. Fi i r die Diagnose der Alder-Anomalie ist daher in

erster Linie - - wie auch schon von UND~ITZ sowie WIEDE~AN~ und

ULL~IC~ be ton t wurde - - das Aussehen der eosinophilen L eukocy t en (Nat ivblu t , May-Grf inwald-Giemsa-Ausst r ich , Toluidinblau u . a . ) yon

entscheidender Bedeutung. Ers t danach wird man zur Beur te i lung die

sog. Neut roph i len a n d die Monocyten (evtl. Ruth, falls ebeafal ls be- teiligt, die Lymphocy ten ) heranziehen.

Die Abgrenzung der anoma]en Neut rophi len-Granu] ierung yon den

~hn]ichen toxischen Granula der Leukocy ten gelingt in der Rege] schon

im May-Grf inwald-Giemsa-Ausst r ich leicht, wenn man das Aussehen der

Eosinophi len ebenfalls beri icksichtigt , ferner die F~irbung entsprechend

var i ier t (z. B. durch Alkohol-Vorbehandlung) oder aber Gelegenheit hat ,

mehrere, in zei t l ichem Abs tand angefer t igte Ausstr iche diagnostisch zu bewerten.

L i t e r a t u r .

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Priv.-Doz. Dr. WILHEL~ KOS]~OW, Mfinster i. W., Kinderklinik der Westf~lischen Wilhelms-Universit~t.

1 Die VerSffentliehung H. G. WOLFS ,Zur Frage der Alder-Anomalie der Leukoeyten" (Z. Kinderheilk. 7,~, 27--36 (1954) erschien naeh Fertigstellung der vorliegenden - - dureh ~uBere Umst~nde in ihrem Erscheinen stark verz6gerten - - Abhandlung und konnte daher nicht mehr berficksiehtigt werden.