I CORPUSCOLI DI VIRCHOWDALLA PATOLOGIA GENERALE ALLA PATOLOGIA MOLECOLARE

Direttore

Massimo CUniversità degli Studi di Foggia

Comitato scientifico

Giuseppe PUniversità degli Studi di Torino

Bruno MUniversità degli Studi del Molise

I CORPUSCOLI DI VIRCHOWDALLA PATOLOGIA GENERALE ALLA PATOLOGIA MOLECOLARE

La Patologia generale, come disciplina a sé stante, viene concepitacome tale a partire principalmente dagli studi di Rudolf Virchow edi Ilie Metchnikoff nella seconda metà del XIX secolo. Dalla scopertadei “corpuscoli del pus” e dei “macrofagi” molta strada è stata fattae, oltre l’infiammazione, essa oggi copre molti settori delle moderneMedicina e Biologia: il danno cellulare e l’adattamento dei tessuti,l’invecchiamento, la rigenerazione e la riparazione tessutale, le cellulestaminali, la tumorigenesi e l’Oncologia. Ma non solo, perché questadisciplina si è sempre di più correlata ad altre discipline come per esem-pio l’Endocrinologia e l’Immunologia, ed ha fondato la conoscenzadella fisiopatologia delle malattie dei vari apparati e sistemi. Infine, larivoluzione biotecnologica che caratterizza la fine del XX e l’inizio delXXI secolo ha arricchito la Patologia generale di nuove conoscenze alivello molecolare, permettendo di approfondire a livello sempre piùfine i meccanismi alla base delle malattie.

Questa collana mira a presentare nella maniera più vasta e comprensivapossibile tutti gli aspetti più moderni ed aggiornati della Patologiagenerale, considerata sotto i suoi più diversi approcci metodologici.

Silvia Lepore, Teresa Trotta, Sante Di Gioia,Angela Bruna Maffione, Massimo Conese

Espressione di molecole di adesione in cellulestaminali/progenitrici ematopoietiche

Correlazione con lo stato infiammatorio acuto polmonareindotto da endotossina batterica

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I edizione: aprile

Indice

Prefazionedi Emilio Jirillo

Prefazionedi Mario Romano

Capitolo IIntroduzione

.. Midollo osseo e cellule staminali, – ... Composizione e funzione delmidollo osseo, – ... Struttura del midollo osseo, – ... Biologia dellecellule staminali, – ... Modelli di struttura del sistema emopoietico, –... Compartimentalizzazione della staminalità nel sistema emopoietico, – ... Le cellule staminali midollari, – .. Regolazione del sistemaemopoietico, – ... Il concetto di “nicchia”, – ... Interfaccia cel-lula staminale–nicchia, – .. Migrazione cellulare, – ... Principidinamici della migrazione cellulare, – ... Meccanismi di migrazione cellu-lare, – ... Network chemochinico, – ... I recettori chemochinici, –... Molecole di adesione, – .. Mobilizzazione, homing e attecchimen-to di cellule staminali emopoietiche, – ... Interazione tra CD e acidoialuronico, – ... Interazione tra CXCR e CXCL, – ... Ritenzionedei progenitori emopoietici a livello midollare, – ... Mobilizzazione diprogenitori emopoietici, – .. Infiammazione, – ... L’infiammazio-ne cronica, – ... L’infiammazione acuta, – ... Lipopolisaccaride(LPS), – ... Mediatori chimici dell’infiammazione, – ... Citochi-ne, – .. Apparato respiratorio, – ... Struttura della mucosa respira-toria, – ... Bronchi principali intrapolmonari, – ... Polmoni, –... Compartimento staminale dell’apparato respiratorio, .

Capitolo IIObiettivi

Indice

Capitolo IIIMateriali e metodi

.. Animali e trattamento, – .. Lavaggio broncoalveolare (BAL), –.. Elisa Multi–array, – .. Istopatologia polmonare, – .. Estra-zione del midollo osseo da topi, – .. Selezione positiva di celluleSCA–+, – .. Marcatura con anticorpi anti–molecole d’adesione, .

Capitolo IVRisultati

.. Valutazione dell’infiammazione polmonare nel modello murino, –... Cellularità del BAL, – ... Citocentrifugati, – ... Grading isto-logico, – ... Livelli di citochine e chemochine nel BAL, – .. Molecoledi adesione su cellule staminali ematopoietiche, .

Capitolo VDiscussione

Bibliografia

Prefazionedi E J

Le vie respiratorie sono notevolmente esposte ad insulti ambientalidi vario tipo, ivi inclusi microorganismi e/o loro prodotti tossici. Ilpolmone è dotato di un robusto sistema di difesa immunitaria a livellodi mucosa respiratoria in quanto possiede un armamentario cellularecompleto che comprende cellule presentanti l’antigene (cellule den-dritiche e macrofagi), T e B linfociti e cellule innate quali granulocitie macrofagi alveolari. Tale sistema di difesa può risultare deficitario inconcomitanza di eventi esterni quali inalazione di polveri sottili, fumodi sigaretta, esposizione a sostanze chimiche e ad allergeni. Tale statodi deficit apre le porte all’ingresso di svariati patogeni dell’ambienteesterno tra cui si segnalano i batteri gram–negativi. Essi sono dotatinella loro parete esterna di una molecola complessa, le endotossineo lipopolisaccaridi (LPS), la cui frazione lipidica è responsabile dellaattività tossica dell’intera molecola. L’inalazione degli LPS scatena unarobusta reazione infiammatoria a livello di vie aeree con richiamo dineutrofili dalla periferia e stimolo di macrofagi alveolari attraversoil legame al Toll–Like receptor , che porta, a sua volta, al rilascio dicitochine e chemochine pro–infiammatorie in loco. Il continuo in-gresso di LPS conduce poi ad un processo infiammatorio cronico chetende a coinvolgere anche l’immunità adattativa con l’intervento dilinfociti T helper (h) e linfociti Th che aggravano lo stato flogisticodell’organo. Il quadro infiammatorio succitato rappresenta quantodescritto fino ad oggi dalla letteratura corrente.

L’originalità della presente tesi consiste nel fatto che in topi CBl/gli effetti acuti della instillazione endotracheale di LPS sono stati moni-torati a livello di cellule staminali progenitrici ematopoietiche(CSPE).Il midollo osseo costituisce la riserva principale di tali cellule che com-prendono le linee mielocitaria, monocitaria e linfocitaria per quantoattiene ai globuli bianchi. Di norma, in studi sperimentali, che utiliz-zano gli LPS si valutano gli infiltrati infiammatori di cellule mature

Prefazione

(granulociti, monociti e linfociti) a livello di applicazione dello sti-molo (ad esempio, polmone) e/ o a livello sistemico con particolareriguardo ad organi come il fegato e la milza che sono deputati allaneutralizzazione di tali endotossine. Nel presente elaborato, il rilasciodi citochine e di chemochine è stato determinato su liquido di lavaggiobroncoalveolare (BAL) dove prevalentemente si accumulano celluleinfiammatorie. L’espressione di molecole di adesione è stato invecedeterminato su CSPE ottenute da midollo osseo. Inoltre la presenza diCSPE è stata anche ricercata a livello di sangue periferico per verificaregli effetti sistemici di un stimolo applicato a livello delle vie aeree.L’innescarsi della risposta infiammatoria polmonare corrisponde adun aumento di CSPE midollari esprimenti elevati livelli di molecoledi adesione e tale risposta perdura fino a ore. Tra le potenziali ap-plicazioni di tale modello, si segnala che l’isolamento di CSPE a livellodi sangue periferico avrebbe anche il vantaggio di potere coltivarein vitro tali cellule e valutarne quindi la loro evoluzione maturativaverso citotipi differenti che potrebbero condizionare l’esito del pro-cesso infiammatorio. Infatti, in una evoluzione di tipo cronico di unprocesso infiammatorio vanno valutate sottopopolazioni linfocitariecome i linfociti T regolatori (TREG) che attraverso la produzione diinterleuchina (IL)– tendono a svolgere attività antiinfiammatoria. Alcontrario, le cellule Th– attraverso il rilascio di IL–, Il– e IL–tendono ad aggravare il processo infiammatorio. In sintesi, il rappor-to tra TREG e Th consente di poter prevedere l’andamento di unprocesso infiammatorio nel senso di una tendenza al suo spegnimentoo piuttosto ad una sua esacerbazione.

La coltura di CSPE nel modello succitato potrebbe anche servireper studi di drug targeting utilizzando, ad esempio, sostanze naturali(polifenoli, acido retinoico e vitamina D) che agendo sui progenitorifavorirebbero l’evoluzione dei vari citotipi verso cellule dendritichetollerogene e/o cellule TREG.

La tesi si è basata su un disegno sperimentale molto chiaro.La sperimentazione è stata condotta con rigore metodologico at-traverso l’utilizzo di metodiche ben standardizzate. I risultati so-no descritti con chiarezza di termini e ben evidenziati attraversouna iconografia ben intellegibile. La discussione si snoda attraver-so un una sequenza logica di eventi che chiarisce ed amplifica ilsignificato dei dati ottenuti.

Prefazione

In conclusione, l’effetto degli LPS a livello respiratorio attiva cellulestaminali progenitrici ematopoietiche che costituiscono un serbato-io permanente di globuli bianchi che nella fase acuta sono preva-lentemente di tipo granulocitario. Tale modello è pertanto moltoimportante in quanto potrebbe anche essere utilizzato in corso diinstillazione endotracheale cronica di LPS. Tale fatto consentirebbeanche di apprezzare la evoluzione delle CSPE nella direzione di celluledendritiche e sottopopolazioni di T linfociti utile sia per comprenderelo status infiammatorio che per studi di drug targeting.

Emilio JirilloDipartimento di Scienze mediche di base,

neuroscienze e organi di senso.

Università degli Studi di Bari “Aldo Moro”

Prefazionedi M R

Con l’affinamento delle tecniche di indagine stiamo oggi cominciandoa comprendere la complessità e le potenzialità delle cellule staminaliematopoietiche. Inizialmente ritenute deputate all’auto mantenimen-to e al differenzamento nelle cellule ematiche circolanti, queste cellulestanno mostrando invece notevole plasticità, potendo dare origineanche a cellule non ematopoietiche, ma soprattutto grande etereo-geneità e capacità di variare programma di auto mantenimento edifferenziamento. Le nostre conoscenze di questi fenomeni sono at-tualmente limitate, ma alcuni punti di grande rilevanza comincianoad essere definiti.

Lo studio di Lepore e collaboratori, riportato in questo volume af-fronta un argomento chiave della fisiopatologia delle cellule staminaliematopoietiche: l’influenza che fenomeni che coinvolgono organi etessuti distanti dal midollo possono avere sui programmi di differen-ziamento e l’immissione nel torrente circolatorio di cellule mature. Adesempio, noi tutti sappiamo che a seguito di una infezione batterica ilnumero dei globuli bianchi circolanti, soprattutto i polimorfonucleatineutrofili, aumenta e sappiamo che questo avviene in parte per mo-bilizzazione di cellule già mature, in parte per accelerata produzionedi nuove cellule. I meccanismi alla base di questi fenomeni sono peròsolo parzialmente noti.

Lepore e collaboratori dimostrano come in un modello mu-rino di danno acuto polmonare esista una relazione temporaletra un incremento nella produzione di citochine e chemochineinfiammatorie da parte dei tessuti colpiti e l’espressione di mo-lecole di adesione e loro recettori, centrali dei meccanismi di ri-tenzione/mobilizzazione, nei precursori ematopoietici. Gli autoriconcludono che la mobilizzazione di cellule staminali a seguito didanno acuto polmonare potrebbe rappresentare un meccanismo diriparazione e rigenerazione tissutale.

Prefazione

È questa una informazione rilevante poiché integra quanto giàconosciuto riguardo all’influenza che stimoli infiammatori perifericipossono esercitare sulle cellule staminali midollari. È infatti noto checitochine infiammatorie sono in grado di alterare il microambientemidollare all’interno del quale le cellule staminali emopoietiche risie-dono, la così detta “nicchia” anatomicamente localizzabile a livellodell’endostio e delle areee perivascolari. Questo favorirebbe la lorofuoriuscita dal midollo. Le osservazioni di Lepore ci dicono che cito-chine infiammatorie prodotte in periferia alterano anche il fenotipodelle cellule staminali emopietiche, rendendole più prone alla mobiliz-zazione e alla successiva migrazione nei tessuti. Questa osservazioneaggiunge un tassello ad un quadro già abbastanza complesso se si con-sidera che è stato recentemente riportato che in condizioni di stressnelle cellule staminali ematopietiche viene attivato un programmaintegrato genetico/epigenetico che porta queste cellule a secernerecitochine, le quali possono esercitare attività biologiche localmente,all’interno della stessa nicchia così come a distanza.

Questi dati sono perfettamente in linea con quanto sta emergendoda studi condotti su cellule staminali di varia origine, ad esempio lestaminali mesenchimali midollari, le cellule della gelatina di Warthondel cordone ombelicale o quelle da membrana o liquido amniotico.Questi studi sembrano indicare che aldilà di eventuali meccanismiriparatori correlati alla migrazione di cellule staminali in sede di dannoe al loro eventuale differenziamento in cellule specifiche della sede dimigrazione, evento il cui valore biologico viene messo in dubbio acausa della sua scarsa efficienza, le cellule staminali possano esercitareeffetti paracrini, inviando ai tessuti danneggiati “messaggi di riparazio-ne” e alle cellule immunocompetenti “messaggi immunomodulatori”.Questo spiegherebbe perchè la maggior parte degli effetti beneficiesercitati dalle cellule staminali in una varietà di condizioni patologichesiano riprodotti dai terreni di coltura di queste cellule.

Questo aspetto però non toglie rilevanza allo studio dei meccanismiregolatori della mobilizzazione delle cellule staminali emopoietiche,che rappresenta l’evento iniziale di un processo che porterebbe questecellule nelle sedi presso le quali potranno esercitare attività regolatorie,sia attraverso il contatto con altre cellule che con meccanismi paracrini.In questo senso molto resta ancora da comprendere riguardo ai finimeccanismi che regolano la mobilizzazione di queste cellule, ad es.

Prefazione

quali citochine/chemochine e loro recettori entrino in gioco in diversecondizioni patologiche, e quali sottotipi di cellule staminali, quelle adimensioni maggiori o a dimensioni minori descritte nello studio diLepore et al., siano di volta in volta coinvolti in questi processi.

Nel caso specifico del danno respiratorio, nonostante lo studio diLepore e coll. riproduca una condizione di patologia acuta, è verosimi-le che meccanismi simili possano verificarsi in patologie respiratoriecroniche come la broncopatia cronoca ostruttiva o la fibrosi cistica, pa-tologie caratterizzate da infezioni batteriche ricorrenti delle vie aeree.L’obiettivo primario di questi studi è naturalmente quello di compren-dere, attraverso l’analisi dei meccanismi di azione, con quali tempie modalità sia possibile utilizzare cellule staminali midollari (emopo-ietiche o mesenchimali) o da altra fonte a fini terapeutici. In questosenso, gli studi delle relazioni tra quanto avviene a livello midollare inreazione ad eventi tissutali periferici, come quello condotto da Leporee collaboratori, rappresenta una fonte preziosa di informazioni.

Mario RomanoHead Molecular Medicine

Dipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche

Università “G. D’Annunzio” Chieti–Pescara

Capitolo I

Introduzione

.. Midollo osseo e cellule staminali

... Composizione e funzione del midollo osseo

La principale funzione del midollo osseo è quella di fornire elementicellulari maturi al sangue periferico in condizioni normali e nei periodidi aumentata richiesta. Il controllo e la regolazione della produzionedi cellule vengono esercitati a livello delle cellule progenitrici.

Fin verso la fine del diciannovesimo secolo, si pensava che la sintesidelle cellule del sangue fosse prerogativa dei linfonodi o del fegato edella milza. Nel , sia Neuman () che Bizzozero () osservaronoglobuli rossi nucleati nel materiale spremuto dalle coste di cadaveriumani e proposero che il midollo osseo fosse la principale fonte dellecellule del sangue. Questo concetto fu molto contrastato da molti ema-tologi contemporanei e fu accettato per la prima volta solo dopo cheil famoso fisiologo Claude Bernad presentò e confermò le scopertedi Neuman all’Accademia delle Scienze di Parigi (). Nel decenniosuccessivo, le osservazioni del midollo osseo post mortem fruttaro-no un gran numero di informazioni sulla morfologia dei precursoriimmaturi delle cellule del sangue, ma una comprensione dinamicadella loro maturazione, proliferazione e relazione con le malattie do-vette attendere il prelievo midollare in vivo e migliori tecniche dicolorazione.

Negli ultimi trent’anni, gli studi sulla cinetica delle cellule midol-lari hanno confermato l’esistenza di una gerarchia cellulare che erastata immaginata vagamente dai grandi morfologi alla fine del secoloscorso. Questi studi hanno dimostrato che le linee cellulari sono costi-tuite da cellule terminali differenziate con sopravvivenza funzionalelimitata, in grado di proliferare durante i primi stadi dello sviluppo,

Espressione di molecole di adesione in cellule staminali/progenitrici [...]

ma senza capacità di autorinnovamento. D’altro canto una cospicuaproliferazione cellulare è in relazione alla presenza di un pool di cel-lule primordiali in grado sia di differenziarsi che di autoreplicarsi ().Il pool più primitivo consiste di cellule staminali multipotenti concapacità di continuo autorinnovamento mentre i pool più maturi sonocostituiti da progenitori cellulari uni– o bi–potenziali, con capacitàdi differenziazione ristretta ad una singola linea cellulare e con limi-tata capacità di autorinnovamento. L’attività proliferativa di questecellule comprende meccanismi di controllo retroattivo (feedback) daitessuti periferici bersaglio () e interazioni intercellulari all’interno delmicroambiente midollare ().

... Struttura del midollo osseo

La struttura del midollo osseo è costituita da cellule emopoieticheadagiate su di una trama di vasi e fibroblasti ramificati. Il nutrimentoda parte del sangue deriva da due fonti principali: l’arteria nutritivae l’arteria periostale (, ). L’arteria nutritiva attraversa la corticaleattraverso il canale nutritivo; giunta nella cavità midollare, si dividenelle arterie midollari ascendente e discendente, da cui si dipartonoradialmente dei rami diretti verso la superficie interna della corticale.Dopo essere penetrate nell’endostio, le arterie radiali diminuisconodi calibro fino alle dimensioni di capillari, che decorrono all’internodel sistema canalicolare della corticale. Qui il sangue arterioso del-l’arteria nutritiva si mescola con il sangue proveniente dal sistemacorticale dei capillari del periostio, derivati dalle arterie che irroranoi muscoli. Dopo essere ritornate nella cavità midollare, le arterie sisuddividono in una rete di sinusoidi di sostegno per le cellule emopo-ietiche. Questi sinusoidi confluiscono in un grosso sinusoide centraleda cui il sangue entra nel circolo venoso sistemico attraverso le veneemissarie. Nei mammiferi l’emopoiesi si verifica negli spazi extrava-scolari tra i sinusoidi midollari. La parete dei sinusoidi è costituita dauno strato di cellule endoteliali a livello del lume vascolare e da unostrato periluminale di cellule reticolari avventiziali che formano unrivestimento esterno incompleto. Tra questi strati di cellule è presenteuna sottile lamina basale discontinua. Le cellule endoteliali formanoun rivestimento completo della superficie più interna del sinusoide(–). La superficie avventiziale dei sinusoidi vascolari è costituita

. Introduzione

da cellule reticolari; i corpi di tali cellule sono contigui ai sinusoi-di, formando parte del loro rivestimento avventiziale (–). I loroprocessi citoplasmatici molto ramificati, avvolgono la parete esternadel sinusoide formando una guaina avventizia. Le cellule reticolarisintetizzano le fibre reticolari che insieme ai processi citoplasmaticied ai corpi cellulari costituiscono la trama reticolare del midollo. Daevidenze sperimentali si ritiene che le cellule reticolari siano un tipodi fibroblasti che possono trasformarsi in cellule adipose midollari(). Nelle guaine periarteriose nel midollo sono presenti fibre ner-vose mieliniche e amielinche; il parere prevalente è che queste fibrenervose abbiano una funzione di regolazione del tono arterioso ().I fibroblasti producono e sono rinforzati da collagene e da proteineadesive come la laminina, fibronectina e proteoglicani ().

Le fibre collagene di tipo I e III prodotte dai fibroblasti costituisco-no la struttura dei compartimenti o delle nicchie in cui sono situatele cellule ematopoietiche (). Tali cellule giacciono in cordoni tra isinusoidi vascolari. Gli eritroblasti si trovano prossimi alla superficieesterna dei sinusoidi vascolari in aggregati ben distinti, gli isolottieritroblastici (). Gli isolotti sono costituiti da uno o più strati con-centrici di eritroblasti stretti intorno ad un macrofago. Lo strato piùinterno di eritroblasti è costituito da cellule meno mature dello stratoesterno. Il macrofago centrale invia all’esterno sottili processi mem-branosi che avvolgono ogni eritroblasto e che possono fagogitaregli eritroblasti difettosi ed i nuclei espulsi. Anche i megacariociti, ilinfociti e i macrofagi si concentrano intorno ai vasi arteriosi, mentrei granulociti maturano lontano dai sinusoidi vascolari (, ).

... Biologia delle cellule staminali

Le cellule staminali rappresentano una popolazione di cellule precur-sori tissutali immature capaci di autorinnovamento o proliferazionema anche capaci di differenziazione in uno spettro di vari tipi cellulariin appropriate condizioni. In generale, esse posseggono le seguenticaratteristiche:

) alta capacità di auto–rigenerazione;) la potenzialità per una differenziazione multipotente;

Espressione di molecole di adesione in cellule staminali/progenitrici [...]

) possibilità, di essere utilizzate per l’ingegneria tissutale (ripro-grammazione);

) plasticità (ossia capacità di transdifferenziazione) ().

Sulla base del potenziale differenziativo, le cellule staminali possonoessere attualmente classificate in quattro categorie:

) totipotenti;) pluripotenti;) multipotenti;) monopotenti o oligopotenti.

Le cellule staminali totipotenti hanno la potenzialità di differenziar-si in cellule di tutti e tre i foglietti embrionali (ectodermico, mesoder-mico ed endodermico). Una cellula totipotente può differenziarsi inun organismo intero con un sistema nervoso centrale e periferico seimpiantata in un utero funzionale.

Le cellule pluripotenti possono specializzarsi in tutti i tipi di celluleche troviamo in un individuo, senza però poter dar luogo ad unorganismo intero. Le cellule multipotenti possono differenziarsi inalcuni tipi cellulari all’interno di un dato organo. Per esempio le cellulestaminali ematiche multipotenti o cellule staminali ematopoietichepossono differenziarsi in globuli rossi, globuli bianchi o piastrine. Lecellule staminali monopotenti od oligopotenti, infine, possono solodare origine ad uno o a pochi tipi di cellule specializzate. Le cellulemesenchimali, per esempio, possono differenziarsi in midollo osseo,tessuto adiposo, muscolo ed altro connettivo (). Sulla base della loroorigine e delle proprietà biologiche, le cellule staminali possono essereclassificate anche in:

) cellule staminali embrionali;) cellule staminali adulte.

Le cellule staminali embrionali derivano dal foglietto cellulare in-terno della blastocisti. Avendo una potente capacità differenziativa,una singola cellula staminale embrionale può svilupparsi in più di tipi cellulari e, quindi, in diversi tessuti od organi. Tali cellule posseg-gono la capacità di proliferare in uno stato indifferenziato per periodi

. Introduzione

prolungati in coltura e la capacità di differenziarsi in qualunque tipotissutale in condizioni favorevoli (). Le cellule staminali embrionalipossono essere raccolte da tre fonti: feti abortiti, embrioni scartatidopo fecondazione in vitro ed embrioni creati in laboratorio esclusiva-mente con lo scopo di produrre cellule staminali. Le cellule staminaliadulte sono le cellule non differenziate che esistono in un tessuto odorgano differenziato e che sono capaci di specializzarsi in cellule deltessuto od organo dal quale esse originano. La loro capacità di auto–rigenerazione permette ai tessuti ed organi di mantenere stabilità efunzione. Fonti di cellule staminali adulte includono non soltanto itessuti di rigenerazione come il midollo osseo, il sangue e l’epider-mide, ma anche tessuti come il cervello o il fegato. La loro capacitàdi proliferazione e di differenziazione è meno potente di quella dellecellule embrionali: esse sono spesso difficili da identificare, isolare epurificare e spesso non sono abbastanza numerose nell’uso clinico pertrapianto cellulare senza una espansione in vitro. Infine occorre ricor-dare che le cellule staminali adulte non si replicano indefinitamente incoltura.

... Modelli di struttura del sistema emopoietico

I meccanismi alla base della regolazione del sistema emopoietico sonoancora controversi e vedono opporsi due principali scuole di pensiero:una a favore di un modello di regolazione stocastica e, la seconda,basata su una visione piu deterministica del processo che porta allagenerazione delle diverse filiere emopoietiche ().

Il modello stocastico è stato per per la prima volta formulato daTill et al. (), i quali nel formularono l’ipotesi in base alla quale iprocessi di proliferazione e turnover della popolazione staminale sonoguidati da fenomeni stocastici e probabilistici. Pertanto, ogni cellula sipuò pensare caratterizzata da un certo valore di probabilità statistica diandare incontro ad auto–rinnovamento o differenziamento.

Tale modello è stato successivamente rielaborato ed ampliato daOgawa (–) con l’ipotesi che, all’interno dell’emopoiesi si possanodistinguere diverse gerarchie di staminalità, caratterizzate da cellulecon diverso potenziale di autorinnovamento. Questo nuovo modelloprevede inoltre la possibilita che fattori umorali (quali i fattori di cresci-ta emopoietici) possano influire sul destino differenziativo delle cellule

Espressione di molecole di adesione in cellule staminali/progenitrici [...]

staminali o, in termini statistici, modulare la curva di distribuzionedelle probabilità di una cellula di acquisire, ad esempio, un fenotipomieloide, piuttosto che linfoide.

Due modelli distinti fanno riferimento al modello deterministico.Il modello del potenziale predeterminato vede nel differenziamentostaminale un fenomeno programmato a priori a livello genetico. Ildestino, cui una cellula staminale andrà incontro una volta abbando-nata la “nicchia” midollare, sarebbe pertanto prevedibile e l’azione difattori di crescita ed altre citochine sarebbe limitata al controllo delciclo cellulare o della sopravvivenza. In quest’ottica, i fattori umorali,pur perdendo il potere di guidare la direzione della via differenziativa,aggiungerebbero flessibilità alle risposte biologiche di cellule il cuidestino è tuttavia in gran parte già deciso (, ). Il modello del con-trollo extracellulare suggerisce al contrario che il destino delle cellulestaminali sia determinato principalmente dall’effetto induttivo del mi-croambiente midollare, vale a dire dal peculiare ambiente citochinicoin cui le cellule si vengono a trovare durante il loro sviluppo (, ).

Qualunque sia la teoria che meglio descrive il destino delle cellu-le staminali emopoeitiche, è tuttavia bene ricordare che entrambele scuole di pensiero si basano sui concetti fondamentali di auto–rinnovamento e potenziale differenziativo, che sono alla base dell’or-ganizzazione gerarchica (o“piramidale”) dell’emopoiesi (Fig. .). Alvertice di questa piramide si trova una ristretta popolazione di celluleprimitive, con caratteristiche di auto–rinnovamento e multipotenzia-lità, da cui si dipartono compartimenti sequenziali all’interno dellagerarchia emopoietica. Tali compartimenti si caratterizzano per laprogressiva perdita di potenziale autoreplicativo, accompagnata da unaumento consensuale della specificità differenziativa.

... Compartimentalizzazione della staminalità nel sistema emopoietico

Sebbene la diversità funzionale dei progenitori emopoietici sia stataormai appurata, rimangono invece poco chiari i meccanismi attraver-so cui tale variabilità si genera nel sistema emopoietico. Il modelloattualmente più accettato vuole che l’eterogeneità del compartimen-to staminale sia il risultato dell’integrazione di segnali intrinseci edestrinseci.

. Introduzione

Per fattori estrinseci si intendono prevalentemente stimoli ambien-tali (quali fattori umorali, chemochine, molecole di adesione e fattoridi crescita), prodotti dallo stroma midollare per generare il mielieudella “nicchia” staminale. In quest’ottica, la localizzazione di cellulestaminali in “nicchie” di diversa composizione citochinica sarebbe, adesempio, un meccanismo in grado di generare di per sé eterogeneitànella popolazione staminale.

In aggiunta a tali fattori estrinseci, vi sono poi meccanismi intrinsecialla cellula staminale stessa, in grado di generare variabilità attraversodiversi programmi genici, generati in modo casuale, ad ogni divisionecellulare. Ad esempio, ogni cellula può, ad ogni momento, decideretra diversi destini: auto–rinnovamento, differenziamento, apoptosi omigrazione.

Nel corso degli ultimi anni sono emerse tuttavia evidenze della

Figura .. Schema rappresentativo del sistema emopoietico e della suacaratteristica struttura ad “albero”.

Espressione di molecole di adesione in cellule staminali/progenitrici [...]

“non” casualità di tali decisioni: vale a dire, che la genesi di questifattori intrinseci potrebbe non essere totalmente stocastica, come ri-tenuto in passato, ma che essi siano (almeno in parte) frutto di unaprogrammazione a priori. Ad esempio, le dimensioni del comparti-mento staminale e la sua evoluzione nel corso dell’invecchiamentosembrano dipendere da meccanismi intrinseci, determinati già a livel-lo germinale. In questo modo, alcuni dei meccanismi di regolazioneintrinseca costituirebbero un limite alla generazione incontrollata dieterogeneità, determinando a priori un numero ristretto di destinievolutivi possibili (). L’idea che il compartimento staminale sia rego-lato da fattori estrinseci ed intrinseci generati stocasticamente rendeplausibile l’ipotesi formulata da Quesenberry (), secondo la quale lagenerazione di eterogeneità sia un continuum di stati intermedi nonprevedibili a priori. A questa visione si oppone tuttavia l’idea che ildestino delle cellule staminali sia in gran parte pre–determinato, comesembrano indicare gli studi pubblicati dal gruppo di Sieburg (, ,).

Ovunque risieda il “vero” modello dell’emopoiesi, è plausibilepensare che fattori di crescita, chemochine e molecole di adesione gio-chino un ruolo importante nella modulazione delle funzioni staminali,sia in vivo che ex–vivo. Rimane perciò di fondamentale importanzapoter identificare nuovi fattori umorali coinvolti nella generazione diun medium in grado di guidare le cellule staminali verso l’autorinno-vamento, il differenziamento terminale o la migrazione verso diversimicroambienti.

... Le cellule staminali midollari

È noto che il midollo osseo sia una notevole riserva di cellule staminaliadulte, le quali sono state usate per trattare disordini ematologici damolto tempo. Recenti studi hanno dimostrato che tali cellule sono ca-paci di attraversare i confini delle linee cellulari e ditransdifferenziarsiin epatociti, cellule endoteliali, muscolo scheletrico, e neuroni sottoopportuna stimolazione ().

Le cellule staminali ematopoietiche possono essere isolate dallecellule del midollo osseo, ma sono estremamente rare ( su .–. cellule); inoltre, la morfologia tipica di cellule immature edindifferenziate ne rende particolarmente difficile l’isolamento. Soltan-

. Introduzione

to grazie all’analisi combinata di caratteristiche immunofenotipichee funzionali è stato possibile, negli ultimi anni, l’identificazione ecaratterizzazione dei progenitori emopoietici più immaturi ().

Per quanto riguarda l’emopoiesi umana, il fenotipo staminale èprincipalmente associato all’antigene CD (–), o Sca– nel topo,insieme all’assenza di espressione dell’antigene CD e di quei markersche identificano cellule che abbiano già maturato lungo le diversefiliere differenziative. Un’altra caratteristica fondamentale delle cellulestaminali emopoietiche consiste nella loro quiescenza; pertanto, lapopolazione staminale può essere isolata anche in funzione del bassocontenuto di DNA o del basso livello di attività metabolica.

All’interno dello stroma del midollo osseo risiede anche una sot-topopolazione di cellule non ematopoietiche, le cellule stromali me-senchimali; tali cellule rappresentano circa lo .% –.% dellapopolazione totale cellulare nucleata midollare, una concentrazione volte inferiore a quella delle cellule ematopoietiche. Le cellule stami-nali mesenchimali sono autorigeneranti e immunofenotipicamente,tali cellule non esprimono i tipici markers antigenici ematopoietici,ad es. CD, ma esprimono invece specifiche molecole di adesio-ne (ALCAM/CD) ed altri antigeni (SH, SH, SH, STRO–) ().All’inizio, si riteneva che le cellule staminali mesenchimali contri-buissero soltanto alla formazione del microambiente stromale delmidollo osseo e che mantenessero la sopravvivenza e la funzionedelle cellule staminali ematopoietiche. Successivamente, altri studihanno suggerito che le cellule mesenchimali sono capaci esse stesse dimultipotenzialità, differenziandosi in condrociti, osteoblasti, astrociti,neuroni, muscolo scheletrico e cardiomiociti (–). Infine le cellulestaminali progenitrici endoteliali rappresentano una sottopopolazionedi cellule staminali ematopoietiche che sono capaci di acquisire unfenotipo endoteliale in vitro (). Le cellule progenitrici endotelialiesprimono i markers cellulari staminali ematopoietici CD e CD edil marker endoteliale VEGFR– (). Tali cellule possono essere isolatedirettamente dal midollo osseo oppure dal sangue periferico e quindiespanse in vitro.