DANNO CELLULARE

Reversibile Irreversibile

Morte

Necrosi Apoptosi

L’apoptosi viene definita “ morte cellulare programmata“

o

“ suicido cellulare”

Perché la cellula si “suicida”?

Ci sono due ragioni principali:

� Durante lo sviluppo embrionale la morte cellulare ènecessaria quanto la mitosi

• Riassorbimento della coda durante la metamorfosi del girino in rana

• La formazione delle dita delle mani e dei piedi

• La formazione delle appropriate connessioni tra i neuroni durante lo sviluppo embrionale.

Per esempio l’eliminazione di:

o Cellule infettate con virus

o Cellule del sistema immunitario

o Cellule con danni al DNA (mutate)

o Cellule tumorali

� La morte cellulare programmata è necessaria per distruggere quelle cellule che rappresentano un pericolo per l’integrità dell’organismo

Cosa spinge le cellule a morire ?

Il bilancio tra:

• Il rilascio di segnali positivi, necessari per la sopravvivenza (fattori di crescita)

• ricevere segnali negativi quali:

� i livelli di ossidanti intracellulari

� il danno al DNA da ossidanti o altri agenti

� i raggi UV, X, ionizzanti

� i chemioterapici

� specifiche molecole che si legano a recettori che trasmettono messaggi di morte (Fas e TNF)

APOPTOSI

embriogenesi

sviluppo fetale

omeostasi tissutale

malattie degenerative

tumori

APOPTOSI

1800s

Caratterizzazione morfologica delle alterazioni che accompagnano la sofferenza cellulare

1964-66

Saunders e Lockshinsuggeriscono l’esistenza di una “morte cellulare programmata” durante la metamorfosi degli insetti

1971

Kerr, Wyllie e Curriedefiniscono la modalità di morte alternativa alla necrosi, definita “apoptosi”, deputata al controllo dell’omeostasi tissutale degli organismi

1980-82

Si osserva la DNA fragmentation e viene identificata la caspasi-3

1989-91

Identificati alcuni geni coinvolti nel processo apoptotico, bcl-2, fas e p-53

L’APOPTOSI E’ UNA FORMA DI MORTE CELLULARE CHE HA LO SCOPO DI ELIMINARE CELLULE NON DESIDERATE ATTRAVERSO L’ATTIVAZIONE DI UNA SERIE DI EVENTI COORDINATI E INTERNAMENTE PROGRAMMATI PORTATI AVANTI DA UN INSIEME SPECIFICO DI PRODOTTI GENICI.

Modificazioni morfologiche associate al processo apoptotico

� Diminuzione delle dimensioni cellulari con addensamento degli organelli e mantenimento della loro integrità

� Condensazione della cromatina e successiva degradazione internucleosomale del DNA in frammenti multipli di 180 paia di basi

� Formazione di estroflessionidella membrana citoplasmatica(blebs) che si distaccano da questa formando i caratteristici corpi apoptotici

� Processo di fagocitosi dei corpi apoptotici da parte di macrofagi

A) Apoptosi nel fegato nel corso di epatite; B) nella cute nel corso di un eritema

A B

Cellula leucemica vitale (A) e cellula apoptotica (B)

Si tratta di un processo , che richiede espressione di geni specifici, finemente controllato dalla cellula (oncogeni e onco-soppressori)

� Taglio delle proteine;

� Formazione di legami crociati fra le proteine;

� Rottura del DNA (a livello internucleosomiale ad opera di endonucleasi);

� Ricognizione fagocitaria (fosfatidilserina).

Caratteristiche biochimiche dell’apoptosi

BASI AZOTATE

Basi azotate + pentoso = nucleosidi

adenina guanina

Basi azotate + pentoso + fosfato = nucleotidi

I nucleosomi sono le unità ripetitive della cromatina, ciascuna contenente 200 bp di DNA e due molecole di ciascun istone H2A, H2B, H3 e H4

Taglio ad opera di endonucleasispecifiche

A) Controllo B) DNA laddering apoptosis C) necrosi

Perché la definiamo morte cellulare programmata?

Caenorabditis elegans

• 1090 cellule somatiche

• 131 vanno in apoptosi

Studi condotti su C. eleganspermisero di suddividere il processo apoptotico in 3 fasi:

� induzione;

� esecuzione;

� riconoscimento;

fagocitosi.

Studi condotti sul C. elegans hanno permesso di identificare un gran numero di geni dell’apoptosi, tali geni sono in grado di dare risposte stereotipate a stimoli diversi, e attualmente sonocosì raggruppati:

� Recettori di membrana (Fas /APO1/CD95, TNF, TRIAL)

� Adattatori (FAAD, APAF1, ced-4)

� effettori (caspasi, ced-3, endonucleasi)

� Modulatori (Anti-apoptotici come Bcl-2 e ced-9, proapototicicome il Bax)

� inibitori (Crma, survivina)

� Induttori (p53, c-myc)

� Fagocitosi

Come avviene l’apoptosi?

Caspase-8

CD95L

CD95

FADD

Procaspase-8

c-FLIP Danno al DNA

BidP-53

Bax

Bcl-2

AIF

Smac/DIABLO

IAPs

Apaf-1Procaspase-9

Apoptotic substrates

Caspase-3

Apoptosome

Procaspase-3Cytochrome-c

Truncated bid

Bcl-xL

Vie principali del processo apoptotico

� via estrinseca mediata dai recettori di morte

� via intrinseca mediata dai mitocondri

Caspase-8

CD95L

CD95

FADD

Procaspase-8

c-FLIP Danno al DNA

BidP-53

Bax

Bcl-2

AIF

Smac/DIABLO

IAPs

Apaf-1Procaspase-9

Apoptotic substrates

Caspase-3

Apoptosome

Procaspase-3Cytochrome-c

Truncated bid

Bcl-xL

Vie principali del processo apoptotico

� via estrinseca mediata dai recettori di morte

� via intrinseca mediata dai mitocondri

Caspasi

Cysteinyl aspartate proteinases

� cistein-proteasi che possiedono un sito attivo cisteinico e operano il taglio proteolitico dei loro substrati specifici a livello di residui di acido aspartico

� sono presenti in tutte le cellule animali in forma inattiva, come zimogeni inerti, composti da tre domini: un prodominioN-terminale e due domini p10 e p20

� in relazione alla loro funzione e ai tempi di attivazione le caspasi vengono distinte in due gruppi principali:

Caspasi iniziatrici Caspasi esecutrici

CASPASI INIZIATRICI CASPASI ESECUTRICI

caspasi esecutrici • proteine coinvolte nella degradazione del citoscheletro

• endoribonuleasi responsabili della frammentazione del DNA

• proteine deputate alla trascrizione, duplicazione e riparazione del DNA

caspasi 8, 9 caspasi 3, 6, 7

Le caspasi esecutrici, come la caspasi-3, sono in grado di indurre l’attivazione di tutti quegli enzimi che sono responsabili delle modificazioni morfologiche a carico delle cellule

Durante il processo apoptotico l’azione delle caspasi è strettamente regolata da due

famiglie di proteine

Inhibitor Apoptosis Proteins (IAPs)

Proteine della famiglia del Bcl-2

Caspase-8

CD95L

CD95

FADD

Procaspase-8

c-FLIPDanno al DNA

BidP-53

Bax

Bcl-2

AIF

Smac/DIABLO

IAPs

Apaf-1Procaspase-9

Apoptotic substrates

Caspase-3

Apoptosome

Procaspase-3Cytochrome-c

Truncated bid

Bcl-xL

IAPs

Le IAPs svolgono un’azione di tipo inibitorio sulle caspasi

Queste vengono indicate come HIAP1, HIAP2, XIAP, NIAP, Survivin e Livin.

Tra queste, la XIAP, legandosi alla caspasi-3, inibisce entrambe le vie apoptotiche, intrinseca ed estrinseca.

L’azione della proteina XIAP può essere inibita mediante legame con la proteina mitocondriale Smac/DIABLO

La famiglia delle proteine del Bcl-2

Le proteine del Bcl-2 si dividono in tre gruppi in base a criteri di omologia di sequenza e di funzione:

� 1°gruppo: proteine antiapoptotiche (Bcl-2, Bcl-xL), presentano 4 brevi domini (BH1, BH2, BH3, BH4) e un dominio c-terminale idrofobico che costituisce il sito di ancoraggio al mitocondrio

� 2°gruppo: proteine proapoptotiche (Bax, Bad, Bcl-xs), mancano del dominio BH4

� 3°gruppo: proteine con attività proapoptotica (Bid, Bik), conservano inalterata una sequenza di 12-16 aa del dominio BH3

Caspase-8

CD95L

CD95

FADD

Procaspase-8

c-FLIP Danno al DNA

BidP-53

Bax

Bcl-2

AIF

Smac/DIABLO

IAPs

Apaf-1Procaspase-9

Apoptotic substrates

Caspase-3

Apoptosome

Procaspase-3Cytochrome-c

Truncated bid

Bcl-xL

PROTEINE BCL-2

� le proteine Bcl-2 formano eterodimeri o omodimeri

� questi dimeri svolgeranno un’azione anti o pro-apoptotica, a seconda che prevalgano le proteine anti o pro-apoptotiche

L’azione delle proteine Bcl-2 è strettamente correlata all’attività di proteine regolatrici

del ciclo cellulare quali la p53

Caspase-8

CD95L

CD95

FADD

Procaspase-8

c-FLIP Danno al DNA

Bid

-

P-53

Bax

Bcl-2

AIF

Smac/DIABLO

IAPs

Apaf-1Procaspase-9

Apoptotic substrates

Caspase-3

Apoptosome

Procaspase-3Cytochrome-c

c

Truncated bid

Bcl-xL

p53

� l’attivazione della p53 avviene in seguito alla sua fosforilazione in corrispondenza di un residuo di serina

� la p53 attivata blocca la progressione del ciclo cellulare nella fase G1

� la p53 attivata determina l’up-regulation di proteine pro-apoptotiche quali il Bax.

INDUZIONE DI APOPTOSI DA PARTE DI MOLECOLE

CHE SI LEGANO A RECETTORI DI MEMBRANA

FasL

TNF

FasTNFR1

DD

FADD TRADD

Attivazione sequenziale delle caspasi

APOPTOSI

INDUZIONE DI APOPTOSI DA PARTE DI SEGNALI PROVENIENTI

DAI MITOCONDRI

Bcl-2, proteina codificata dall’omonimo gene che appartiene alla famiglia di geni ANTI-APOPTOTICI

Bax

Citocromo C + Apaf-1 + ATP

Pro-caspasi 9

caspasi 9

APOPTOSI

IAP = Proteine Inibenti l’Apoptosi

___

Variazione del potenziale di transizione di permeabilità

Proteina codificata dall’omonimo gene che

appartiene alla famiglia di geni PRO-APOPTOTICI

Stimolo stressogeno

p53

Apaf = fattore attivante le proteasi dell’apoptosi (=caspasi)

DANNO

Attivazione p-53

Trascrizione geni pro-apoptotici

Rilascio citocromo-c

Attivazione procaspasi 9

Attivazione procaspasi 3

APOPTOSI

VIA ESTRINSECA VIA INTRINSECALIGANDO

Attivazione recettore di morte

Legame con proteine adattatrici

Attivazione procaspasi 8

Attivazione procaspasi 3

APOPTOSI