Das Verhalten der Histaminase, Diaminoxydase und Benzylaminoxydase im Blutplasma von Meerschweinchen und Mensch nach intravenöser Injektion von Heparin

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    19-Aug-2016

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  • 46. Jg., Heft 17, 1968 W. Se~5~v~zs~: Histaminase, Diaminoxydase und Benzylaminoxydase im Blutplasma 953

    I~E!~N, J., u. E. ZIEGLEP~: Neue Gesichtspunkte zur Patho- genese des Kollapses. Dtsch. reed. Wschr. 83, 560 (1958); - - Untersuchungen zur klh~ischen Bedeutung des l~edoxpoten- tints. Arzneimittel-Forsch. 10. Beiheft (1960). - - gOSE~EI~S, J.C., R. C. Lmn~EI, W. H. l~Io~A~, and B. Z~Em~A~-~: Effect of endotoxin on plasma catecholamine and serum sero- tonin. Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.) 102, 335 (1959). - - SE~S~, D. J., F. G. EsAu~, jr., and S. C. HAWS~CK~n: Assessment of tissue anoxemia in chronic anemia by the arterial lactate/ pyruvate ratio and excess lactate formation. J. Lab. clin. 5~ed. 69, 177 (1967). - - Sn~r~, A.: Sehock und extra- korporaler Kreislauf. In: Sehock, Pathogenese und Therapie, S. 339. Berlin-GSttingen-Heidelberg: Springer 1962. - - ULS~E~, W.T.: ProbIcme der Blutgaskontrolte bei chirnrgi- schen Patienten. Verh. dtsch. Ges. Chir. 1967. Langenbecks Arch. klin. Chir. 319, 999 (1967). - - UL~E~, W. T., G. B~TA U. G. RE:[CttEL: Sauerstoff- und Kohlensgurcpartialdruck- messung im arterMlen and Ohrlappchencapillarblut mit stabilisierten Mikroelektroden. ~ed. thorac. 20, 235 (1963). - - ULMER, W. T., u. B. I~ASCICiE: )ilchs~ure- und Brenztrauben-

    sgurekonzentration im Armvenenblut bei gesunden Versuchs- personen, unter Ruhebedingungen bei venSser Stauung und unter Arbeitsbelastung. Z. ges. exp. ~ed. 14g, 185 (1968). - - V~SSE~, B.F., I. Kn~VK~ET, and A .H . J . MAAS: Increase of whole blood lactic acid concentration during exercise as predicted from pH and PCO, determination. Pfliigers Arch. ges. Physiol. 281, 300 (1964). - - ZL~E~IAX~-, W. E. : Tier- experimentelte und klinische Untersuchungsergebnisse bei Starkstromverletzungen und Verbrennnngen. Beitr. Erste Hilfe und Behandlung yon Unf~llen durch elektrisehen Strom, Heft ~, S. 3 (1963); - - Hypoxie und Gewebsstoffwechsel. Anaesthesist 13, 122 (1964); - - Neuere therapeutische MSg- lichkeiten bei thermonuelearen Sehgdigungen und Verbren- nungen. Langenbecks Arch. klin. Chir. 308, 60 (1964) ; - Importance of the acidebase metabolism in severe burns and during the shok. Bruxelles: Presse Academ. Europ~ennes 1964.

    Prof. Dr. W. T. ULS~ Institut ffir Lungenfunktionsforschung 4630 Bochum, Hunscheidtstr. 12

    Das Verhalten der Histaminase, Diaminoxydase und Benzylaminoxydase im Blutplasma yon Meerschweinchen und Menseh nach intraven~iser Injektion yon tIeparin

    W. SCItMUTZLER Pharmakologisehes Institut der Universit~t Freiburg (Direktor: Prof. Dr. F. Ha~)

    Hepar in und andere an- und kationische Poly- e lektrolyte be~drken beim Meersehweinehen die Frei- setzung eines histaminzerst6renden Enzyms aus der Leber ins Blur (BE~xAV~l~ n. Mitarb., 1964; GIERTz u. Mitarb., 1964; SCgMVTZLEn U. Mitarb., 1965 a, 1966 b ; HAH~ n. Mitarb., 1966). Dabei steht einem dosis- abhgngigen Anstieg der enzymat isehen Akt iv i tt im Blutp lasma ei~e entspreehende Verminderung des Enzymgehal tes im Lebergewebe gegeniiber. Diese kann z.B. naeh i .v . In jekt ion yon 500 IE t tepar in oder 5 mg Pentosanpolysul fat /kg KSrpergewicht inner- halb yon 2 rain bis zur vNl igen Entspeieherung des Enzyms ans der Leber gehen, woes normaterweise an Part ike l der Mikrosomenfrakt ion gebunden ist (Sc~rU-TZL~ u. Mitarb., 1966a; SC!t~IVTZL~ u. GOLDSCIIMIDT, in Vorbereitung; Sc~VTZnm~ u. BETH~, in Vorbereitung).

    Bei diesem his~aminzerst6renden Enzym handelt kS sigh um eh~e I t istaminase, d .h . um eine carbonyl- reagensempfindl iehe Aminoxydase (Enzyme Commis- sion Nr. 1.4.3.6). Al lerdings ist z. Z. noeh nieht ldar, ob die naehge~desene Akt iv i t~t auf der YVirkung eines einheit l iehen Enzyms oder eines Gemisehes homologer Enzyme beruht. Neben His tamin werden besonders Cadaverin, Putresein und Spermidin, aber aueh die Monoamine f i -Phenyl- / i thylamin und Benzylamin an- gegriffen (ScI~MV~ZLER U. Mitarb., 1966 a ; Sc~v~zn~ u. K~oP, im Druek).

    Nueh ersten Versuchen schien die histaminasel i - berierende t Iepar inwh'kung speziesspezifisch auf das Meerschweinchen begrenzt zu sein: 500 IE Hepa.rin/kg i.v. bewix'kten innerhalb yon 15 min keinen signiii- kanten Anstieg der h is taminabbauenden Akt iv i t i i t im Blutp lasma yon Mensch, Hund, Kaninchen, Rat te und I tuhn (I-IAI~N u. Mitarb., 1966; SCg~rTZL]~ U. Mitarb., 1966 a).

    Inz,Msehen konnten Tt~DIga (1965) sowie Ic[a~S- so~ u. Mitarb. (1966) mi~ tier modii ' izierten Isotopen- technik yon OKUYAMA n. KOBAYASH]: (1961) einen stark vermehrten Abbau yon 14 C-Putrescin darch menschliehes B lutp lasma naeh intravenSser oder intra-

    muskul/ irer Hepar in in jekt ion beobachten, wobei die Akt iv i tt etwa 60 min naeh der intra.ven6sen In jek- t ion am h6ehsten war. Sehon dar in seheint ein erheb- Heher Unterschied zwischen der I- Ieparinwirkung bei Menseh und 5{eerschweinchen zu liegen, bei dem wir die maximale Akt iv i t~t bereits 2 - -3 rain naeh der In jekt ion fanden. Da wit die Enzymbest immungen in nnseren fr~heren Versuehen am Mensehen mit Blur ausgeftihrt hatten, das innerhalb 15 rain nach der Hepar in in jekt ion gewonnen worden war, kormte uns ein Anstieg der h is taminabbauenden Akt iv i tgt ent- gangen sein.

    YVir haben deshalb die histaminasel iberierende Hepar inwirkung noeh einmal am Mensehen gepr/ift und mit der beim ?[eersehweinehen vergliehen. Dabei semen es yon Interesse, nieh~ nur die histamin- abbauende, sondern auch die putresein- und benzyl- aminabbauende Akt iv i tgt zu verfolgen.

    Methodilc Ffinf m~innliehe Versuchspersonen (Alter: 25--33 Jahre;

    Gewicht: 73--84kg) erhielten nach Entnahme yon 20ml Kontrollblut dutch die gleiche Kaniile 500 IE/kg Hep~rin Novo (Novo-Industrie, ~ainz) in eine Cubitatvene injiziert 30, 60 and 120rain danach wurden ihnen jeweils weitere 20 ml Blur aus den Cubitalvenen entnommen 1.

    l~rmlichen Meerschweinchen (Gewicht: 520 750 g) wurde in Lokalanaesthesie mit 2,0ml/kg einer 2%igen Novocain- I5sung zur Blutentnahme ein diinner PVC-Katheter in eine A. earotis eingebunden. Naeh Entnahme yon 5 ml Kon- trollblut erhielten die Tiere 500 IE/kg tIeparin Novo in eine V. jugularis injiziert. Weitere Blutentnahmen (je 5 ml) er- folgten 5, 30, 60 und 120rain spiiter. Zur }Iinderung des hg~morrhagisehen Schoeks erhielten die Tiere ab der 3. Blut- entnahme ihr eigenes Blur wieder injiziert, wobei das ab- genommene Plasma durch ein gleiehes Volumen physiologisehe Kochsalzl6sung ersetzt wurde. Auf diese Weise gelang es, ffinf Tiere trotz des starken Blutverlustes fiber 2--4 Std nach der tfeparininjektion am Leben zu erhaIten. Die an diesen Tieren gewonnenen Ergebnisse werden ira folgenden wieder- gegeben.

    1 Der Verfasser dankt seinen Kollegen Dr. G.M. Fi~L- Gr~AFF, Dr. P. KRVLL, Dr. tt. LAAFF and J. KNOP, die sich als Versuehspersonen zur Verfiigung stellten, and Fraulein G. SCmUIDT fiir technische Assistenz.

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    Das entnommene Blur wurde in Mlen Fi~llen in paraffi- nierten Zentrifugengl~sern mit 7,5IE tIeparin ,,Novo" in einem Votumen yon 0,05 ml pro ml Blut versetzt und 10 rain mit 1500 g zentrifugiert. Das abgezogene Plasma wurde dann noehmals 20 rain zentrifugiert.

    Die Bestimmungen der Histaminase-Aktivit~tt erlolgten Meer- Vor nach der modifizierten Methode WICKS~LLs (1949). schwein- Iteparin

    1,0 ml Plasma werden mit 17,0 ml 0,067 M PhosphatpuHer, chen Nr. pH 7,0 versetzt und 10 rain bei 37 C temperiert. Zusatz yon 0,18~Mol Histamin (als -dihydroehlorid). Naeh kurzem AnsatzNr. Sehiitteln wird die erste Probe zur Bestimmung der initialen I 0,057 Substratkonzentration entnommen, weitere Proben folgten 2 0,t60 zu verschiedenen Zeiten danach. Abstoppen der Reaktion 3 0,263 (lurch kurzes Aufkochen der Proben. Aus der Abnahme der 4 0,027 Histaminkonzentration im A~matz wird, wie bei SCmUVTZL~ 5 0,000 U. Mitarb. (1966e) angegeben, die enzymatisehe Aktivit~t be- reehnet und in internationMen mE pro ml Plasma angegeben, 0,101 wobei 1 mE einem Umsatz yon 1 m~mol/min entsprieht. -~0,049

    Die Bestimmung des Putrescin-Abbaues (Diaminoxydase- Aktivit~t) erfolgte im optischen Test naeh HOLMSTEDT U. Mitarb. (1959, 1961). Nachgewie~n wird dabei das Produkt 1 0,001 der oxydativen Desaminierung 4-Aminobutyraldehyd bzw. 2 0,004 sein Kondensationsprodukt A1-Pyrrotin. 3 0,004

    1,0 ml Plasma wird mit 2,0 ml 0,067 M Phosphatpuffer, 4 0,000 pH 7,0, und 6,0 ml o-AminobenzaldehydlSsung (Fluka, 5 0,005 Sehweiz) versetzt (0,005 M in 0,067 lV[ Phosphatpuffer, ptI 7,0, 0,003 und nach Abfiltrieren des ungelSsten Restes verdiinnt bis zur :~0,001 Extinktion 1,500, gemessen bei 400 mtz und 1 cm Liehtweg, vgl. W~L~ u. Scm~, 1965).

    Nach Temperierung Zusatz von 1,0 ml 0,1 M Putrescin- 0,003 2-HCI (Fluka, Schweiz) in Phosphatpuffer pH 7,0. Inkubation 0,000 3 Std bei 37 C, Abstoppen der geaktion dureh Zusatz yon 0,010 2,0 ml 50 %iger Trichloressigs~iure. Nach Abzentrifugieren des 0,000 gef~llten Proteins wird sofort ira Eppendorf-Photometer bei 0,000 436 m~ und 1 em Lichtweg gegen entspreehende Leerwerte, denen Substrat erst nach der Inkubation zugesetzt wurde, 0,003 eotorimetriert. Angegeben wird die Extinktionszunahme im :~=0,002 Trich]oressigsgureextrakt innerhalb 3 Std.

    Die Bestimmung des Benzylaminabbaues (Benzylaminoxy- dase-Aktivitgt) erfolgte naeh McEwnsr u. Co~z~ (1963). Nach- gewiesen wird dabei das Reaktionsprodukt Benzaldehyd. An- satz: 1,0 ml Plasma wird mit 1,25 ml 0,067 M Phosphatpuffer pH 7,0, versetzt. Naeh Temperierung Zusatz yon 0,25 ml 0,1 M Benzylamin-HC1 (Sehuehhardt, Miinehen). Inkubation 60 rain bei 37 C. Danaeh Substratzusatz zum Leemver~, Ab- Versuchs- Vor stoppen der Reaktion mit 0,25ml 60%iger Perehlorsgure. personen Heparin Das Reaktionsgemisch wird nun mit 4,0 ml Cyclohexan ver- setzt and darin 2 mat im Abstand yon 15 rain emulgiert. Nach Zentrilugation wird der Cyelohexanextrakt bei 242 m~ und Ansatz Nr. I. 1 cm Liehtweg im Zeiss-Spektrophotometer PMQ I I gegen W. Sch. 0,000 den Leerwert photometriert. Angegeben wird die Extinktions- J. Kn. 0,013 zunahme pro Stunde und pro ml Plasma. P. Kr. 0,047

    Da bei den Meersehweinehenversuehen insgesamt nieht H. La. 0,000 mehr als 3,0--3,5 ml Plasma pro Blutentnahme gewonnen G. Fii. 0,000 werden konnten, wurden fiir die Enzymbestimmungen im 0,012 Meerschweinchenplasma stets s~mtliche Komponenten der ~:0,009 Reaktionsgemisehe nur im halben Volumen eingesetzt.

    Tabelle 1. Histaminase., Diaminoxydase- und Benzylaminoxy. dase-Aktivitiit im Plasma des Meerschweinchens nach intravenOser InjeCtion von 500 IE Heparin/~g Einzelwerte, Mittdwerte und

    mittlerer Fehler des Mittelwertes

    5 rain 30 rain 60 rain 120 min

    nach tIeparin intraven6s

    I. Histaminase (mE/ml Plasma) 28,840 19,532 I6,320 14,320 45,100 35,480 33,200 13,900 65,340 51,860 40,900 5,230 15,820 12,250 1,360 0,680 62,800 56,800 50,800 44,300

    43,580 35,184 28,516 15,686 i9,573 J:8,707 :~c8,826 ~:7,610

    Ansatz Nr. II. Diaminoxydase (E 436 m~./3 Std) 0,308 0.272 0,261 0,266 0,436 0,389 0,356 0,320 0,486 0,417 0,348 0,145 0,201 0,I66 0,044 0,031 0,520 0,490 0,474 0,450

    0,390 0,347 0,297 0,242 :~0,059 ~0,057 ::~0,072 ~0,072

    Ansatz Nr. II I. Benzylaminoxydase (E 242 m~/1 Std) 1 0,930 0,920 0,840 0,874 2 1,640 1,320 1,308 0,852 3 1,562 1,384 1,000 0,560 4 0,884 0,490 0,144 0,086 5 0,882 0,796 0,746 0,670

    1,180 0,982 0,808 0,608 0,173 ~-0,167 ~0,191 ~0,143

    Tabelle 2. Histaminase-, Diaminoxydase- und Beuzylaminoxy- dase-Alctivit~it im Plasma des Menschen nach intraven6ser In~elc- tion von 500 IE Heparin/kg Einzelwerte, Mittelwerte und mittlerer

    Fehler des Mittelwertes

    30 min 60 min 120 min

    naeh Heparin intravenSs

    Histaminase (mE/ml Plasma) 0,436 0,987 0,526 0,411 0,798 0,252 0,195 1,219 1,018 0,191 0,567 0,652 0,000 0,107 0,169

    0,247 0,736 0,523 0,080 :t-0,162 _~0,152

    Ansatz Nr. II. Diaminoxydase (E 436 rn~/3 Std) Ergebnisse W. Sch. 0,002

    J. Kn. 0,00t Die Tabelle 1 zeigt in Ansatz Nr. I den bereits P. Kr. 0,00

    fr/iher beschriebenen, starken Anstieg der H istami- H. La. 0,000 nase-Aktivit i~t im P lasma des Meersehweinchens nach G. Fii. 0,00I i.v. In jekt ion yon 500 IE Hepar in/kg (vgl. HA~ u. 0,001 Mitarb., 1966). Die Akt iv i t~t ist 5 rain nach der He- 0,00 par in in iekt ion am h5chsten und sinkt dann stetig ab. 2 Std sparer ist im Mittel noch ca. 1/3 der anf~nglichen W. Sch. 0,097 Aktivit/~t naehweisbar. J~hnlich verh/i lt es sich mit der J. Kn. 0,026 putrescin- und benzy]aminabbauenden Akt iv i t~t (An- P. Kr. 0,018 s/itze I I und I I I ) , deren Ver/~nderung nach Heparin- H. La. 0,060 0,046 injekt ion dem Verh~lten der I t is taminaseakt iv i t / i t weitgehend paral lel geht. Die Tabelle 2 zeigt ent- 0,049 0,014 sprechende Versuche am Menschen. Auff/~llig ist dabei, dai3 der Anstieg aller drei enzymatischen Akt iv i t~ten sehr viel tangsamer erfolgt als beim Meersehweinchen. Er ist zwar fiir die I t istaminaseaktivit /~t bereits 30 min nach der I- Ieparininjektion signif ikant (p < 0,02, maximal im Mittel abet erst nach 60 rain (p < 0,005).

    0,001 0,054 0,055 0,013 0,037 0,041 0,000 0,012 0,006 0,012 0,018 0,027 0,009 0,014 0,020 0,007 0,027 0,030

    ~0,003 ~0,008 i0,008

    Ansatz Nr. II I. Benzylaminoxydase (E 242 my./1 Std) 0,057 0,165 0,242 0,047 0,076 0,098 0,060 0,088 0,092 0,099 0,105 0,147 0,068 0,092 0,081

    0,066 0,105 0,132 0,009 0,016 =~t0,030

    Bei der Diamin- und Benzylaminoxydase-Akt iv i t / i t (Ans/~tze I I und I I I ) ist ein signif ikanter Anstieg erst 60 rain nach der Hepar in in jekt ion festzustellen (p < 0,02 bzw. p

  • 46. Jg., He]t 17, 1968 W. SCI-IN[UTZLEll: Histaminase, Diaminoxydase und Benzylaminoxydase im Blutplasma 955

    beide Aktivitten sogar erst naeh 120 min bestimmt (p < 0,01 bzw. p < 0,05).

    Wie die Einzelwerte der versehiedenen Versuehs- personen zeigen, verhalten sich allerdings die Aktivi- taten sparer als 60 min naeh der Heparininjektion nieht mehr einheitlieh: bei manchen Versuehsper- sonen steigen sie noch weiter an, bei anderen fallen sie bereits wieder ab, wobei sich ein eindeutiger Parat- lelismus yon Histaminase, Diamin- und Benzyl- aminoxydase-Aktivit/it nicht feststellen l/~gt.

    Hervorzuheben ist, dab aueh die hSehsten, im menschlichen Plasma nach Heparininjektion gefun- denen Aktivitaten nur sehr gering sind, wenn man sie mit denen im Meersehweinehenplasma vergleieht: im Mittel erreiehen im mensehlichen Plasma die Hist- aminase-Aktivitgt nur rund 2%, die Diaminoxydase- Aktivitat nut 7 % and die Benzylaminoxydase-Aktivi- tat nur 9% der hfehsten, nach Heparininjektion im Meerschweinchenplasma gefundenen Werte. Es ist dabei zu berficksiehtigen, dab die im mensehliehen Plasma bereits normalerweise vorkommende Benzyl- aminoxydase-Aktivitat (McEwEN u. COHEN, 1963) auch unter unseren Versuehs- und Testbedingungen vor der Heparininjektion signifikant (p

  • 956 W. Scm~uTZ~ER: Histaminase, Diaminoxydase und Benzylaminoxydase im Blutplasma Klin. Wschr.

    sind and noch keine megbare Vermehr...