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De l’analyse de lipides à l’analyse lipidomique
Pierre Chaminade Professeur de Chimie Analytique
EA 4041 Groupe de Chimie Analytique de Paris-Sud Faculté de Pharmacie Université Paris-Sud
19ème siècle, classification chimique des lipides
• 1823, traité « Recherches chimiques sur les corps gras d'origine animale »
Michel Eugène CHEVREUL
On voit, d'après ce qui précède, combien l'expression de corps gras est vague, et l'impossibilité où l'on est d'en donner une définition scientifique
Diversité structurale des lipides
Nombres de structures par classes Acides gras 5791 Glycérolipides 7538 Glycérophospholipides 8005 Sphingolipides 3939 Stérols 2617 Prénols 1200 Sacccharolipides 1293 Polykétides 6744 TOTAL 30,081 (2011) TOTAL 37,127 (2012)
Classes lipidiques et espèces moléculaires
O
O
HO
O ON
+P
O
O
O
R2
R1
Category Glycerophospholipids [GP]
Main Class
Glycerophosphocholines [GP01]
Sub Class Diacylglycerophosphocholines [GP0101]
Category Glycerophospholipids [GP]
Main Class
Glycerophosphoethanolamines[GP02]
Sub Class Diacylglycerophosphoethanolamines [GP0201]
O
O
HO
R1
O ONH
2
P
O
O
O
R2
O
O
HO
O ONH
2
P
O
O
O
PE(18:0/18:1(9Z))
O
O
HO
O ONH
2
P
O
O
O
PE(18:1(9Z)/18:0)
O
O
HO
O ONH
2
P
O
O
O
PE(18:0/18:2(9Z,12Z))
O
O
HO
O ONH
2
P
O
O
O
PE(20:0/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))
…. 1274 structure de PE dans Lipid Maps
Lipides et polarité
Paramètre de solubilité d
d’Hildebrand
5 10 15 20 25 0
O
O
O
O
HO
O
O O
O
O
H
H
H
O
H
H
O
H
H
H
OH
H
H
HN
OH
O
OHH
HN
O
O
OHH
O
OO
O
O
O
O
HO
O
R1
R2
OOH
O
OHOH
OOH
OH
OHOH
O
O
O
HO
R1
O ONH
2
P
O
O
O
R2
O
O
HO
O ON
+P
O
O
O
R2
R1
O
O
HOH
R O ON
+P
O
O
Chromatographie sur couche mince.
• lipides de cerveau de rat
• Silice G • 1ère dimension
CHCl3/MeOH/NH4OH- 65/35/4
• 2nde dimension CHCl3/ Acétone / Méthanol / Acide acétique / eau 10/4/2/2/1
• Révélation : 5% m/v dichromate de K dans acide sulfurique concentré, chauffage à 150°C
(1) cérébrosides (2) sulfatides (3) PE (4) PC, PS, SM, LPE (5) PA
(6) ganglisosides (dépôt)
Quantitative analysis of lipid classes, O.S. Privett et al. Am J Clin Nutr. 1971 vol. 24 no. 10 1265-1275
Détection en CLHP des lipides
Comparison of detection systems for the high-performance liquid chromatographic analysis of complex triglyceride mixtures, J.L. Robinson, R. Macrae, J. Chromatogr, Volume 303, 1984, 386-390
Réfractomètre différentiel
Détecteur UV avec soustraction de ligne de base
Détecteur Evaporatif à Diffusion de la Lumière
Analyse des lipides par classe de polarité
A Isooctane: THF 99:1 v/v
B Isopropanol:CHCl3 4:1 v/v
C Isopropanol: eau 1:1 v/v
Lipides de foie de rat
Rapid separation and quantification of lipid classes by high performance liquid chromatography and mass (light-scattering) detection. W W Christie, 1985 The Journal of Lipid Research, 26, 507-512.
Colonne: Spherisorb 3µm 150x5mm
Analyse d’espèces moléculaires
Digalactosyldiglycéride Colonne Hypercarb®
Méthanol Toluène Tétrahydrofurane Chloroforme
64.3 21.5 13.7 0.5
v/v
Deschamps F, Gaudin K, Baillet A & Chaminade P. Wheat digalactosyldiacylglycerol molecular species profiling using porous graphitic carbon stationary phase. JOURNAL OF SEPARATION SCIENCE (2004) 27: p. 1322.
Détection DEDL
Stratégies de simplification de l’échantillon
Après saponification
Échantillon d’origine
Saponification Analyse des acides gras méthylés
Documentation Macherey-Nagel OPTIMA® FFAPplus, 50 m, 0.25 mm ID, 0.25 µm film Temperature: 140 °C (2 min) --> 200 °C, 5 °C/min (15 min) --> 240 °C, 20 °C/min (25 min)
Colonne INTERCHROM Strategy 3 Si 150*2.1mm Gradient Chlorofome -> Méthanol 20 min 0,3 ml/min
Analyse lipidomique Voies métaboliques
Techniques couplées
Traitement de données
Ch
imie
/ B
iolo
gie
Analyse par classe et couplage CLHP/spectrométrie de masse
Laurent Imbert, Thèse de l’Université Paris-Sud, Comparison of Electrospray Ionization, Atmospheric Pressure Chemical Ionization and Atmospheric Pressure PhotoIonization for a lipidomic analysis of Leishmania donovani. L. Imbert; M. Gaudin; D. Libong; D. Touboul; S. Abreu; P. M Loiseau; O. Laprévote; P. Chaminade, .
Couplage de techniques séparatives à la spectrométrie de masse à haute résolution.
Couplage chromatographique
Chromatographie bidimensionnelle.
Couplage phase normale x polarités de phases inversées
Repris de « Some Practical Aspects of Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography » Pavel Jandera
Mobilité ionique différentielle
Field Asymetric IMS • http://www.faims.com
Champ de compensation vs m/z
Separation and Classification of Lipids Using Differential Ion Mobility Spectrometry. Shvartsburg AA, Isaac G, Leveque N, Smith RD, Metz TO. J Am Soc Mass Spectrom 2011 juill;22(7):1146-1155.
De l’analyse de lipides à l’analyse lipidomique
Analyse de lipides
Échantillon
Fractionnement Saponification …
Analyses
Analyse de lipidomique
Échantillon Analyse Multi- dimensionnelle
Traitement de données
Résultats
