Structura moleculei de imunoglobulin

Despre antigene

Antigene moleculare De cele mai multe ori, pentru antigenele proteice, nu se face distincia dintre epitopii inductori ai rspunsului imun i gruparea carrier, deoarece proteinele posed un spectru continuum de determinani antigenici, ce corespund unor secvene discrete ale suprafeei moleculare localizate n zonele cele mai expuse contactului cu receptorii sistemului imunitar. Antigenitatea moleculelor globulare este determinat adeseori, de configuraia lor spaial, rezultat din plierea tridimensional. Pentru cele mai multe proteine globulare (mioglobina, hemoglobina, lizozimul, ribonucleaza etc.), aproape toi determinanii antigenici sunt conformaionali, adic sunt rezultatul plierii spaiale a moleculei, iar alii sunt secveniali, adic sunt reprezentai de o secven particular de aminoacizi. Moleculele proteice fibrilare (cheratina, colagenul, fibroina) au configuraii mai simple dect cele globulare, catenele lor fiind aranjate sau rsucite pe o singur dimensiune. Determinanii antigenici ai acestor proteine sunt secveniali, formai din 3-6 aminoacizi.

Sistemul imunitar al unui organism recunoate un numr limitat de determinani antigenici ai unei molecule proteice. Epitopii, conformaionali sau secveniali, care stimuleaz rspunsul imun in vivo, iar in vitro induc proliferarea limfocitelor, se numesc epitopi dominani. O parte a determinanilor antigenici ai unei molecule native, cel mai adesea, sunt neimunogeni (imunosilenioi), nefiind accesibili sistemului imunitar al organismului, dar se pot exprima ntr-un anumit set de condiii de imunizare (gazd, adjuvant etc.). Acetia sunt epitopi interni ai proteinelor globulare. Un determinant intern poate fi silenios n molecula nativ, dar devine imunostimulator dup clivarea enzimatic a moleculei, in vivo sau in vitro.De aceea, M. Sela a recomandat utilizarea termenului de grupare imunodominant, pentru epitopul sau epitopii care se exprim n anumite condiii(gazd, adjuvant, cale de administrare) i determin specificitatea rspunsului imun.

Fig.2.Epitopii dominani sunt localizai la suprafaa moleculei globulare. Epitopii subdominani devin accesibili dup clivarea moleculei n etapa prelucrrii n macrofag, iar epitopii criptici sunt inaccesibili fenomenului de recunoatere imunitar.

Imunogenitatea antigenelor proteice se modific n diferite condiii.

Denaturarea moleculelor native sub aciunea agenilor chimici i a cldurii, modificarea configuraiei moleculei sub aciunea agenilor reductori sau hidroliza enzimatic, modific imunogenitatea. Anticorpii specifici fa de proteina nativ precipit slab sau de loc proteinadenaturat termic sau chimic.

Formaldehida i glutaraldehida sunt ageni de legare ncruciat a moleculelor proteice, constituind reele multimoleculare stabile. Aceti ageni produc denaturarea proteinelor i modific funciile celor cu activitate biologic (toxine, enzime). Astfel, exotoxinele tratate cu formaldehid, i pierd proprietile toxice, dar rmn imunogene. Formaldehida i glutaraldehida se folosesc pentru conservarea antigenelor cu greutate molecular mic (peptide), dar sunt mai puin utilizate pentru conservarea proprietilor antigenice ale moleculelor mari. Agenii chimici de legare ncruciat modific imunogenitatea moleculelor proteice prin schimbarea conformaiei moleculei i mascarea epitopilor sau prin modificarea chimic a aminoacizilor epitopului.

Denaturarea semnific deplierea structurii rsucite a moleculelor proteice i are loc prin modificarea pH, prin nclzire, prin reducerea legturilor S-S sub aciunea ureii i a beta-mercaptoetanolului sau a acidului performic. Prin denaturare, proteina i pierde nu numai funcia biologic, dar i modific specificitatea antigenic. De exemplu, cele 4 puni S-S ale RN-azei, ntre resturile de cistin, sunt reduse de -mercaptoetanol i transformate n 8 resturi de cistein, cu pierderea total a activitii enzimatice. Anticorpii fa de RN-aza pancreatic bovin nativ nu precipit moleculele de RN-az denaturat prin reducerea legturilor S-S. Invers, anticorpii fa de RN-aza denaturat, nu precipit RN-aza nativ. Modificarea specificitii anticorpilor sugereaz c reducerea legturilor S-S determin pierderea epitopilor conformaionali.

Proteinele denaturate reverseaz greu la forma nativ, chiar prin restabilirea condiiilor de mediu.

Hidroliza enzimatic modific configuraia spaial a moleculelor proteice native i diminu imunogenitatea lor, cu att mai mult cu ct fragmentele rezultate au dimensiuni mai mici. Prin clivare enzimatic se anuleaz imunogenitatea epitopilor conformaionali i se relev epitopi care n molecula nativ au statutul de epitopi criptici.

O atenie special s-a acordat studiului imunogenitii unor proteine ale cror proprieti biologic-active sunt uor de evaluat: enzime, inhibitori enzimatici, hormoni proteici, toxine, imunoglobuline (n calitatea lor de antigene), proteine ale capsidei sau ale nveliului viral. Enzimele sunt antigenice, indiferent de originea lor. Reacia moleculelor de enzim cu anticorpii specifici a constituit o modalitate de determinare a poziiei epitopilor. Anticorpii fa de diferii epitopi ai moleculei de enzim modific n grade foarte diferite activitatea ei catalitic. Dac anticorpii sunt specifici fa de epitopi localizai la nivelul situsului activ al enzimei, molecula i pierde activitatea fa de substrat, deoarece legarea anticorpilor la situsul activ inhib competitiv legarea moleculelor de substrat. Gradul de inhibiie a activitii enzimatice este cu att mai accentuat, cu ct molecula este mai mare. Efectul inhibitor al anticorpilor nu se produce dac enzima a legat deja substratul specific. Dac gruprile determinante de specificitate ale moleculei de enzim sunt situate n afara situsului catalitic, activitatea enzimei este parial inhibat, datorit modificrilor conformaionale care survin dup reacia antigen-anticorp, sau rmne intact. Foarte rar, complexul enzim-anticorp are un efect catalitic superior, comparativ cu enzima nativ.

Hormonii sunt molecule slabimunogene, datorit uniformitii relative a structurii lor chimice n regnul animal. Anticorpii specifici fa de majoritatea hormonilor proteici se obin prin asocierea lor prealabil cu adjuvantul Freund. Imunogenitatea hormonilor este ntr-o relaie direct cu gradul deosebirilor chimice existente ntre hormonul exogen i hormonul produs de organismul receptor. Consecina este sinteza anticorpilor antihormon.

Proprietile antigenice ale insulinei sunt bine cunoscute, datorit utilizrii clinice a hormonului. Molecula de insulin este alctuit din dou catene polipeptidice, cu un numr total de 51 de aminoacizi: 21 ai catenei A i 30 ai catenei B. Cele dou catene sunt reunite prin puni S-S. Structura moleculelor de insulin de la diferite specii este foarte asemntoare, 47 din cei 51 de aminoacizi fiind identici. Deosebirile se gsesc n catena A pentru aminoacizii 8, 9 i 10 (la bovine Ala, Ser, Val,la om sunt Thr, Ser, Ile, iar la ovine Ala, Gly, Val). In catena B, diferena este limitat la aminoacidul C-terminal. Aceste mici diferene ale secvenei de aminoacizi nu modific funcia hormonului. De aceea, insulina, indiferent de provenien, este la fel de eficient pentru tratamentul diabetului uman. Micile diferene de secven, n general, nu sunt sesizate de organismul receptor. Totui, dup administrare prelungit, organismele receptoare cu reactivitate imunitar mai nalt, sintetizeaz anticorpi anti-insulin.

Polizaharidele, dei au complexitate structural relativ mare, condiionat de multitudinea posibilitilor de legare a atomilor de carbon, sunt molecule slabimunogene n stare nativ, comparativ cu proteinele. Antigenitatea lor este conferit de succesiunea unitilor componente, de configuraia spaial a moleculei i de greutatea molecular. Cele cu greuti mai mici de 50 kD nu sunt imunogene. Polizaharidele sunt antigene cu epitopi secveniali repetitivi i cel puin uneori, n funcie de originea polizaharidului i de specia imunizat, sunt imunogeni.

Din punctul de vedere al structurii moleculare, se disting dou tipuri de polizaharide: a) cele care au o caten central pe care se inser ramificaiile laterale; b) polizaharide lipsite de o caten central, iar ramificaiile sunt dispuse aleatoriu, fr nici o simetrie. Rolul catenelor centrale n conferirea imunogenitii este controversat, dar ramificaiile laterale au o importan deosebit pentru determinarea specificitii antigenice a polizaharidelor. Din punctul de vedere al compoziiei chimice pot fi homo- sau heteroplizaharide, iar n ceea ce privete sarcina, pot fi neutre sau ncrcate. Oligo- i polizaharidele pot dobndi o structur teriar (globular). Uneori, configuraia spaial a polimerului glucidic este determinant pentru specificitatea sa antigenic. Schimbrile conformaionale ale polizaharidelor se produc mai uor dect ale proteinelor, pentru c au bariere energetice sczute. Pentru polizaharide, denaturarea este practic necunoscut, ceea ce le confer stabilitate. Dac imunogenitatea polizaharidelor native este slab, adeseori ele se comport ca haptene, adic devin antigenice dup cuplarea cu un purttor proteic, rezultnd lectine, cu o foarte larg distribuie n lumea vie. In calitate de haptene, polizaharidele au proprietatea de specificitate, adic se combin cu anticorpii complementari fa de complexul glicoproteic.

Din motive de ordin practic, cele mai studiate polizaharide din punct de vedere antigenic sunt cele de origine bacterian: dextranul i polizaharidele capsulare.

Dextranii sunt polimeri ramificai de glucoz, resturile glucozil fiind unite mai ales prin legturi de tip 1-6, dar n funcie de specia productoare, punctele de ramificaie ale catenelor polimere pot fi 1-2, 1-3 sau 1-4.

Dextranii sunt sintetizai n special de unele bacterii lactice, din zaharoz, dup reacia:

Dextranaz

N(zaharoz)---------------(Glucoz)n+ (Fructoz)n

Dextranii au greuti moleculare foarte diferite (pn la 106D), n funcie de gradul de polimerizare. Nu sunt imunogeni i de aceea se folosesc ca nlocuitori ai plasmei. Prin transfuzii repetate cu soluii de dextran la om i prin injectare repetat la oarece, s-au sintetizat anticorpi antidextran. Specificitatea anticorpilor antidextran este foarte nalt. In serul animalelor imunizate cu dextrani s-au detectat dou tipuri de anticorpi: unii specifici fa de resturile de glucozil legate 1-2 i alii specifici fa de resturile de glucozil legate 1-3, ce nu dau reacii ncruciate, dei deosebirea dintre cele dou categorii de molecule de dextran const numai n modul diferit de legare a resturilor de glucozil ntre ele.

Polizaharidele capsulare se pot gsi fie subforma moleculelor libere (solubile), fie subform corpuscular (ataate celulelor bacteriene capsulate).

Variaiile biochimice ale polizaharidelor capsulare, determinate de compoziia glucidic a catenei, de secvena monomerilor sau de modul de legare a lor n caten, confer tulpinilor bacteriene, specificitate antigenic de tip. La Str. pneumoniae s-au identificat peste 80 de tipuri antigenice ale polizaharidelor capsulare. In compoziia lor intr hexoze, pentoze, derivaii lor aminai, metilai etc. Specificitatea antigenic a polizaharidelor capsulare depinde att de compoziia chimic, ct i de succesiunea monomerilor n catena polizaharidic. Ca vaccinuri, polizaharidele induc starea de toleran.

n stare purificat sunt molecule neimunogene, datorit uniformitii lor structurale n lumea vie. Injectarea lor la animale nu induce sinteza anticorpilor. Acizii nucleici nativi sunt conjugate nucleoproteice, n care acizii nucleici au rolul de hapten. Majoritatea epitopilor conjugatului sunt conformaionali. O fracie din anticorpii anti-conjugat se combin cu acizii nucleici. Anticorpii anti-acizi nucleici se combin cu acizii nucleici n stare pur, indiferent de provenien. Proteinele asociate acizilor nucleici confer o nou specificitate antigenic i determin sinteza anticorpilor care se combin cu proteina puttor.

Experimental, anticorpii anti-acizi nucleici se obin pe una din urmtoarele ci:

1. Imunizarea cu bacteriofagi din seria T par (T2, T4, T6), supui ocului osmotic. ADN al acestor fagi se deosebete de ADN din celulele eucariote, prin prezena 5-hidroxi-metilcitozinei glicozilate, n locul citozinei. Anticorpii au specificitate fa de bazele glicozilate, ceea ce explic lipsa reaciilor ncruciate cu ali acizi nucleici.

2. Imunizarea cu ribosomi din celulele vegetale sau animale. Anticorpii sintetizai reacioneaz cu ARN de origine bacterian, vegetal sau animal, precum i cu polinucleotidele sintetice(poli-A, poli-C, poli-U), dar nu reacioneaz cu ADN nativ i nici cu ADN denaturat.

3. Imunizarea cu conjugate hapten-protein, n care haptena este reprezentat de baze azotate, ribonucleozide, dezoxiribonucleozide, nucleotide, dinucleotide i trinucleotide. Anticorpii sintetizai reacioneaz att cu haptena ct i cu ADN nativ sau denaturat.

4. Imunizarea cu complexe formate din acizi nucleici i albumin metilat. Cele dou molecule formeaz un complex necovalent, datorit interaciei dintre gruprile negative ale acizilor nucleici i cele pozitive ale proteinei. Anticorpii sintetizai reacioneaz cu complexul molecular, cu proteina, cu acidul nucleic nativ i denaturat de diferite origini.

5. Anticorpii anti-acizi nucleici se gsesc n sngele pacienilor cu lupus eritematos diseminat (LED).

Anticorpii sintetizai fa de acizii nucleici cu rol de haptene n conjugatele cu proteine nu au specificitate, deoarece precipit ADN monocatenar, ARN de diferite origini, poliribonucleotide i acizii nucleici dublu catenari.

Lipidele sunt molecule neimunogene n stare nativ, dar se pot cupla cu proteinele i n conjugatul format au rolul de haptene. Din punct de vedere imunologic, cele mai importante lipide sunt fosfatidele (sfingomielina i cefalina) i glicosfingolipidele(galactocerebrozida).

O hapten lipidic cu o importan practic deosebit este cardiolipina, din cordul mamiferelor. In sngele indivizilor infectai cu T. pallidum se gsesc anticorpi care reacioneaz cu cardiolipina nalt purificat (reacie ncruciat), extras din cordul bovin.

Un alt antigen lipidic este antigenul Forssman, inductor al sintezei anticorpilor hemaglutinani i n prezena complementului, hemolitici.

Studiul imunogenitii lipidelor a fost ngreunat de insolubilitatea lor n ap. Problema reactivitii anticorpilor cu antigenele lipidice a fost depit parial, prin utilizarea lipidelor auxiliare (lecitina i colesterolul) n suspensia antigenic. Disponibilitatea liposomilor a permis studiul imunogenitii lipidelor asociate cu membranele.

Haptene Haptenele(haptein, grec = a apuca) sunt substane chimice naturale sau de sintez, cu molecul mic, a cror imunogenitate este condiionat de cuplarea cu o molecul purttor, dar i pstreaz proprietatea de specificitate, adic reacioneaz cu anticorpii specifici a cror sintez a fost indus de haptena conjugat cu o molecul cu rol de purttor.

Denumirea de hapten a fost introdus de Landsteiner pentru a caracteriza din punct de vedere funcional un extract alcoolic de rinichi de cal, neimunogen ca atare pentru iepure, dar capabil s se combine cu anticorpii sintetizai dup imunizarea iepurelui cu extractul alcoolic de rinichi de cal, cuplat cu o molecul purttor. El a propus ca n categoria haptenelor s fie cuprins orice substan natural sau sintetic, cu greutate molecular mic sau mare, care n form nativ nu poate s induc un rspuns imun detectabil, dar dobndete capacitatea imunogen, dup cuplarea sa in vivo sau in vitro, cu o molecul purttor cu greutate molecular mare. Conjugatul este imunogen nu numai n raport cu epitopii moleculei purttor, ci i cu epitopul haptenei.

Din punct de vedere funcional, haptenele s-au numit jumti de antigene, deoarece au numai una din cele dou proprieti eseniale ale antigenelor: nu sunt imunogene, dar i pstreaz proprietatea de specificitate. De aceea, termenul antigenic nu este sinonim cu cel de imunogenic. Haptena este un antigen, dar n forma sa nativ, nu este imunogen.

n general, haptenele sunt molecule mici, dei uneori, macromoleculele pot funciona ca haptene. Extractul alcoolic de rinichi de cal este o hapten complex. Haptenele simple sunt reprezentate de polinucleotide, alcooli, formaldehida, unele medicamente etc.

Utiliznd haptenele simple, prin reacii de cuplare cu o molecul purttor s-au obinut antigene artificiale. Haptena din complexul molecular are rolul gruprii determinante de specificitate. Studiul imunogenitii conjugatelor hapten-molecul purttor a permis determinarea mrimii gruprilor determinante de specificitate ale antigenelor i indirect, determinarea situsului de combinare a anticorpilor. Pe aceiai cale s-a evaluat specificitatea, afinitatea i heterogenitatea anticorpilor. Haptenele au fost folosite pentru studiile de cristalografie cu raze X a unui complex antigen-anticorp.

Haptene autocuplante sunt molecule cu greutate molecular mic, a cror particularitate const n aceea c, dup injectare, n organism se combin spontan cu proteinele tisulare i formeaz conjugate hapten-protein, in vivo. Conjugatele hapten-protein induc sinteza anticorpilor i determin procese de hipersensibilitate sau iniiaz maladii autoimune. Astfel se comport derivaii dinitrofenolului substituii cu clor sau fluor, unii produi de degradare a penicilinei.

Antigene corpusculare

Antigenele bacteriene sunt fie solubile (eliminate n mediul extracelular), fie corpusculare (legate de celul). Din prima categorie fac parte exotoxinele i polizaharidele capsulare libere, iar din cea de a II-a, antigenul somatic O (endotoxina bacteriilor Gram negative), antigenele polizaharidice din glicocalix, flagelina, pilina, acizii teichoici, mureina etc.

Antigenele eritrocitare sunt glicoproteine ale suprafeei eritrocitare, cu determinism biochimic cunoscut, n sistemul A, B, 0. Glicoproteinele eritrocitare de grup sanguin se gsesc i pe suprafaa celulelor tisulare, dar i n secreiile exocrine (saliv, suc gastric etc.), la circa 75% dintre indivizi, denumii secretori. Glicoproteinele din secreii sunt hidrosolubile i studiul lor a fost mai uor dect al moleculelor eritrocitare.

Gruprile glucidice ale glicoproteinelor membranei eritrocitare au rol dominant n determinarea specificitii de grup sanguin, aa cum au evideniat studiile de digestie enzimatic controlat. Eritrocitele tuturor grupelor sanguine au un precursor antigenic comun antigenul H (codificat de gena H), bine exprimat pe suprafaa antigenelor de grup 0 i n cantiti progresiv descrescnde pe hematiile de grup A, Bi Ab.

Specificitateaantigenic de grup 0 este conferit de L-fucoz. Grupul A are o gen ce codific sinteza glicozil-transferazei, enzim ce adaug N-acetil-D-galactozamina, la galactoza preterminal a moleculei H. De aceea, specificitatea antigenic a eritrocitelor de grup A este conferit de trizaharidul N-acetil-galactozamin, galactoz i L-fucoz:

N-acetil galactozamin ( 1-3) Gal R(R = restul catenei polizaharidice)

1-2

Fuc

Indivizii de grup B au o gen ce adaug D-galactoza (n loc de N-acetil galactozamin) la galactoza preterminal a moleculei H, avnd un determinant antigenic format din dou resturi terminale de D-galactoza i L-fucoza.

Fig. 3.Oligozaharidele cu rol de epitopi determinani ai grupelor sanguine ABO. Oligozaharidul este ancorat n membrana eritrocitului prin intermediul sfingomielinei, denumit ceramid. 85% din indivizii umani secret substanele de grup sanguin n saliv. La indivizii secretori, oligozaharidelesunt prezente sub forma conjugatelor cupolipeptidele codificate de genele secretoare (dup Roitt, 1997).

Prezena restului de fucoz (adic antigenul H) este esenial pentru expresia epitopilor A i B. Gena H i antigenul su lipsesc la fenotipul Bombay. De aceea, transferazele A i B nu pot aduga glucidele specifice la restul Gal al polizaharidului i antigenele de grup A i B nu sunt exprimate.

Exprimarea antigenelor ABO pe hematii poate fi modificat prin tratamentul in vitro cu glicozidaze: o -glicozidaz (extras din bobul de cafea verde) poate cliva restul de Gal de pe hematiile de grup B i le convertete n hematii de grup 0, ce pot rmne funcionale dup transfuzia la subieciide grup 0.

Antigenele de histocompatibilitate (descrise de J. Dausset, 1958) sunt molecule de suprafa ale majoritii esuturilor. Din punct de vedere biochimic, ele sunt strict specifice fiecrui organism uman i animal i confer individualitate biochimic proprie fiecrui organism. Se numesc i antigene de transplantare, deoarece, dup grefarea unui esut sau a unui organ, moleculele de histocompatibilitate se comport ca antigene i declaneaz rspunsul imun al organismului receptor, care determin respingerea grefei.

Antigenele individuale de histocompatibilitate se evideniaz prin reacia de respingere a grefei. n funcie de raportul genetic dintre donor i receptor, antigenele de histocompatibilitate aparin urmtoarelor categorii:

1) autoantigenele includ antigenele proprii de histocompatibilitate, care, n condiii normale sunt tolerate de sistemul imunitar. Sub aciunea unor factori fizici, chimici sau biologici, antigenele de histocompatibilitate se modific devenind autoantigene, generatoare ale conflictelor autoimune;

2) izoantigenele cuprind antigenele de transplantare comune orga-nismelor identice din punct de vedere genetic, care aparin unei linii genetic pure (inbred). Verificarea puritii genetice a unei populaii de organisme se face prin transplantul de piele. Dac grefa este acceptat, organismele respective aparin aceleiai linii inbred. Termenii izoantigen i inbred nu au coresponden pentru populaia uman;

3) aloantigenele (alos = altul) includ molecule care, dup injectare declaneaz rspunsul imun la organisme ale aceleiai specii, dar diferite genetic, de organismul donor. Aloantigenele sunt inegal rspndite la indivizii unei specii i induc rspunsul imun la organismele care nu posed antigenul respectiv. Aloantigenele se evideniaz dup imunizarea unui organism, cu o suspensie celular provenit de la organisme ale aceleiai specii, dar aparinnd unui alotip diferit;

4) heteroantigenele (xenoantigene, xenos = strin) includ molecule care se gsesc n/pe celulele tuturor indivizilor unei specii i care se comport ca antigene fa de organismele altei specii. Heteroantigenele se evideniaz prin sinteza anticorpilor fa de antigenele celulelor provenite de la un organism al unei specii diferite.

Celulele unei specii diferite aduc n organismul receptor nu numai heteroantigene, ci i aloantigene i chiar autoantigene. De aceea injectarea unui heteroantigen este una dintre cele mai utilizate metode pentru a induce sinteza autoanticorpilor.

Antigenele de organ sunt molecule specifice care confer particularitile biochimice i funcionale ale celulelor unui organ. De exemplu, proteinele hepatice sau ale glandei mamare difer de proteinele esutului renal al aceluiai organism.

Antigene artificiale a) Conjugatele hapten-protein au fost utilizate de Landsteiner, n studiile cu privire la mecanismele rspunsului imun. In conjugate, haptenele ndeplinesc rolul de epitopi (grupri determinate de specificitate), iar mole-culele proteice au rolul de carrier. Rspunsul imun nu este orientat strict fa de epitopii haptenici, ci i fa de determinani antigenici ai gruprii carrier.

Cuplarea hapten-purttor necesit existena unei grupri reactive a haptenei, care s se lege covalent cu gruprile funcionale ale purttorului, cu condiia pstrrii integritii funcionale a celor doi reactani. Haptenele se pot cupla cu purttori foarte diveri, dar proteinele naturale (albumina, globulinele) furnizeaz conjugate foarte imunogene.

Landsteiner a cuplat amino-benzen-sulfonatul cu molecule proteice, prin reacia de diazotare i a obinut azoproteine:

Dup cuplarea haptenei cu Tir, His sau Lys din structura unei proteine, rezult un antigen artificial care induce formarea a dou categorii de anticorpi cu specificiti diferite, dup cum reacioneaz cu haptena, sau cu molecula purttor.

Conjugatele azoproteice au permis studiul influenei configuraiei spaiale a haptenei, asupra specificitii antigenice. Gruparea sulfonat a fost legat n poziia orto, meta sau para a haptenei aminobenzen. Antiserurile obinute au specificitate fa de fiecare izomer. Izomerul meta al aminobenzen-sulfonatului, cuplat cu proteina, pstreaz capacitatea de a precipita cu anticorpii specifici fa de proteina nativ, n timp ce conjugatele cu izomerii orto- i para- dau reacie foarte slab de precipitare. Concluzia este c izomerii de poziie induc modificri sterice (conformaionale) ale haptenei.

Conjugatele hapten-protein se pot obine prin reacia de iodurare. Proteinele puternic iodurate i modific specificitatea antigenic. Ele induc sinteza anticorpilor care dau reacii ncruciate de precipitare cu proteinele iodurate heterologe. Semnificaia este c prin iodurare, proteinele i pierd specificitatea antigenic. Toate proteinele iodurate induc sinteza anticorpilor fa de o grupare iodurat, n special fa de tirozina iodurat, indiferent de specificitatea gruprii purttor.

O alt reacie de obinere a conjugatului hapten-protein este cea de substituie nucleofil. Cele mai folosite haptene sunt 2,4-dinitrofenolul(DNP) i 2,4,6-trinitrofenolul(TNP).

Mecanismul molecular al cuplrii este urmtorul: un atom de H din gruparea OH-, NH2+sau S-SH a proteinei, este nlocuit de gruparea haptenic prin eliminarea apei. Proteina pierde electroni, iar nucleul benzenic i accept. Gruprile donoare de electroni sunt OH-, NH2+, S-SH. Gruprile DNP i TNP sunt cuplate cu proteina purttor sub forma 2,4-dinitrobenzen-sulfonatului de Na, a 2,4,6-trinitrobenzen-sulfonatului de Na sau subforma derivailor halogenai.

Reacia dintre o protein i 2,4-dinitrobenzen-sulfonatul de sodiu ilustreaz mecanismul atacului nucleofilic, reacie n care proteina cedeaz electroni, iar nucleul benzenic i accept.

b) Conjugatele protein-protein se obin prin intermediul agenilor bifuncionali de legare: diizocianaii i carbodiimidele. Deoarece gruprile ciano au reactivitate diferit, reacia de cuplare se realizeaz n trepte. De exemplu, gruparea din poziia 4 a toluilen-diizocianatului este mai reactiv dect gruparea ciano din poziia 2. Aceasta permite ca una dintre proteine s se cupleze n poziia 4, iar ulterior, ntr-o nou etap a reaciei, cea de a II-a protein se va cupla la gruparea ciano din poziia 2:

Carbodiimidele, utilizate ca ageni bifuncionali pentru cuplarea proteinelor, sunt considerate anhidride simetrice ale ureii:

H2N C NH2 HOHOHN = C =NH((H2N C 4 N

UreeCarbodiimida simetricCianamida asimetric

Carbodiimidele pot fi substituite simetric sau asimetric cu molecule proteice:

R1N= C = NR1 sau R1N = C = NR2.

Agenii bifuncionali de cuplare permit obinerea conjugatelor proteice (conjugate anticorpi-feritin, insulin-albumin), dar se folosesc i ca mediatori ai legrii diferitelor molecule proteice pe suprafaa eritrocitelor.

Marcajul cu feritin este deosebit de important din punct de vedere practic, deoarece se folosete pentru evidenierea electrono-optic, la nivelul membranei, a diferitelor molecule proteice.

c) Conjugatele protein-suport insolubil se obin prin cuplarea proteinelor cu un suport insolubil, prin reacia de diazotare, prin intermediul carbodiimidelor sau al BrCN. Ca suporturi insolubile se folosesc derivai celulozici: sephadex, sepharoza, agaroza etc. Legarea proteinei de suport, prin reacia de diazotare, se face prin intermediul tirozinei, lizinei, histidinei, triptofanului sau argininei.

Conjugatele anticorpi-suport insolubil se numesc imunosorbeni i sunt folosii cu o eficien deosebit pentru purificarea proteinelor dintr-un amestec, datorit specificitii lor de combinare cu anticorpii corespunztori, fixai ntr-o coloan de material inert. Antigenul complementar specificitii de legare a anticorpului fixat n coloan, se leag necovalent de imunosorbent, dup care poate fi eluat cu un agent chimic.

Anticorpii pot fi imobilizai pe un suport insolubil, prin tratamentul cu un agent de legare ncruciat (glutaraldehid), dar multe din situsurile reactive pt fi denaturate sau rmn ascunse.

Fig. 4.Principiul funcional al imunosorbenilor utilizai n cromatografia de afinitate. Coloana conine sefaroz, pe care sunt fixate moleculelede anticorp. Amestecul de antigene este trecut prin coloan, unde va fi reinut numai antigenul care recunoate specific anticorpul fixat. Cel mai bun suport de imobilizare este agaroza, un polizaharid obinut prin fracionarea agarului. Agaroza este rezistent la aciunea degradativ a enzimelor bacteriene i a agenilor chimici i poate fi regenerat. Este disponibil subforma sferelor poroase hidratate, cu diametrul de 40-300 m i conine 2-8% agaroz n soluie apoas.

In coloana de imunosorbent se pot fixa nu numai anticorpii, ci i antigenele sau chiar celule intacte.

Imunosorbenii se folosesc n activitatea de cercetare i n clinic, pentru prepararea unor produse biologice i a medicamentelor.

Antigene sintetice Homopolimerii nu sunt imunogeni, cu excepia poli-L-Pro, poli-L-Glu, poli-L-Arg, poli-L-Lys. Copolimerii formai din doi aminoacizi nu sunt totdeauna imunogeni, dar cei rezultai prin polimerizarea a trei aminoacizi diferii sunt totdeauna imunogeni. Cu ct compoziia lor este mai heterogen, imunogenitatea este mai accentuat. Prezena aminoacizilor aromatici confer o anumit rigiditate a epitopilor i implicit, o imunogenitate superioar.

Pentru a fi imunogeni, copolimerii trebuie s fie catabolizai de aparatul enzimatic al celulelor care prelucreaz i prezint antigenul. Polipeptideleformate din D-aminoacizi sunt slab imunogene, datorit incapacitii organismului de a cataboliza polimerul. Polipeptidele sintetice s-au dovedit a fi foarte utile n studiile de imunochimie, cu privire la:

- determinarea mrimii gruprii determinante de specificitate i indirect, a situsului de combinare a anticorpilor specifici;

- rolul dimensiunilor moleculei asupra proprietilor de imunogenitate;

- rolul configuraiei spaiale a moleculei n conferirea proprietii de imunogenitate;

- identificarea epitopilor secveniali i conformaionali.

Determinanii antigenici De cele mai multe ori, antigenele sunt macromolecule complexe sau chiar celule ntregi, dar rspunsul imun, dup injectarea lor n organism, este orientat predominant fa de situsuri discrete, strict limitate ale antigenului, denumite grupri determinante de specificitate (gds), situsuri antigenice, determinani antigenici sau epitopi.

Epitopul este regiunea limitat a antigenului care induce un rspuns imun specific, se combin cu situsul activ al moleculei de anticorp i determin specificitatea reaciei antigen-anticorp.

Antigenele proteice prezint cea mai mare diversitate de epitopi, att n privina compoziiei chimice, ct i a configuraiei spaiale. Studiile de cristalografie cu raze X permit identificarea atomilor individuali ai unei molecule i determinarea mobilitii lor, exprimat n factori de temperatur atomic. Factorii de temperatur ridicat corespund regiunilor moleculare cu mobilitate nalt (regiuni calde). In molecula proteic, epitopii corespund zonelor moleculare cu o mobilitate nalt a atomilor. La temperatura biologic, aceste secvene necesit cantiti mici de energie, pentru a trece dintr-o conformaie n alta. Invers, regiunile moleculare cu mobilitate atomic redus au factori termici de valoare sczut (regiuni reci) i necesit o cantitate mai mare de energie pentru schimbarea conformaiei. Adeseori, epitopii antigenici sunt localizai n regiunile calde ale moleculei.

Capacitatea unei regiuni a moleculei de antigen de a funciona ca epitop (adic de a stimula rspunsul imun) se numete imunopoten.

Mrimea gruprii determinante de specificitate s-a apreciat indirect prin determinarea mrimii haptenei capabil s umpl complet situsul de combinare al anticorpului. n acest scop s-a utilizat sistemul dextran-antidextran, ntr-o reacie de precipitare. Dextranul cu greutate molecular de 50 kD este imunogen i prin injectare repetat la iepure, se obine serul imun anti-dextran. Artificial se prepar oligozaharide cu dimensiuni controlabile. Reacia de precipitare dextran-anticorpi specifici este inhibat progresiv de oligozaharidul de glucoz i este complet n prezena hexazaharidului. Oligomerul cu 6 resturi de glucoz corespunde celui mai bun ligand care se cupleaz cu anticorpii anti-dextran (ligandul este orice molecul capabil s formeze un complex cu o alt molecul). Heptazaharidul, ca i oligozaharidele cu mai puin de 6 resturi de glucoz inhib mai puin eficient reacia de precipitare a sistemului dextran-antidextran.

Fig. 5.Oligozaharidul format din 6-7 resturi de glucoz, blochez cu cea mai mare eficien, reacia de precipitare dintre dextran i anticorpii specifici antidextran. Oligozaharidele mai mari sau mici nu se combin eficient cu anticorpii i inhib ntr-o msur progresiv mai mic reacia de precipitare cu dextranul. Cercetri similare s-au fcut cu homopolimeri de aminoacizi (poli-Lys, poli-Ala), legai de proteine purttor. Serul imun obinut pe iepure, fa de aceste conjugate, conine predominant anticorpi specifici fa de haptena homopolimeric. Reacia de precipitare dintre serul specific i conjugatul hapten-protein, este inhibat de pentamerul de alanin, ceea ce denot c acesta se leag cu cea mai mare afinitate de situsul de combinare al anticorpului. Pentamerul corespunde mrimii epitopului antigenic al conjugatului i reflect, indirect, mrimea situsului de combinare al anticorpilor specifici.

n concluzie, mrimea unui epitop polizaharidic corespunde la 6-8 uniti monomerice, iar pentru antigenele proteice, epitopul are 4-6 aminoacizi.

Valena antigenului s-a definit convenional prin numrul de epitopi ai unui antigen. Numrul de epitopi ai unei molecule antigenice variaz n raport cu mrimea i complexitatea sa structural.

Valena se evalueaz prin numrul moleculelor de anticorp care reacioneaz cu o molecul de antigen. Pentru evaluarea numrului de epitopi ai unui antigen, trebuie avut n vedere c molecula de anticorp este bivalent (leag doi epitopi), dar i faptul c un antiser nu conine anticorpi fa de toi epitopii unui antigen.

Studiile privind reacia antigen-anticorp in vitro, au condus la concluzia existenei a trei tipuri de valene antigenice (epitopi):

-valenele funcionale conformaionale sunt conferite de epitopii conformaionali, situai la suprafaa moleculei native de antigen i sunt accesibili sistemelor imunitare de recunoatere specific a moleculei. Numrul lor este proporional cu greutatea molecular a antigenului i este dependent de complexitatea conformaional a moleculei. Un situs antigenic, teoretic, s-ar gsi la fiecare cteva mii de daltoni;

-valenele funcionale interne sunt reprezentate de epitopi interni, care, n molecula nativ sunt inaccesibile sistemului imunitar. Ele devin funcionale, in vivo, dup degradarea parial a moleculei, n celulele care prelucreaz antigenul;

-valene nefuncionale, reprezentate de epitopi criptici care nu devin funcionale dup prelucrarea antigenului in vivo, dar se pot releva dup clivarea enzimatic in vitro a moleculei.

Numrul total al epitopilor unui antigen nu se cunoate, dar se poate evalua cu aproximaie, dup degradarea parial a moleculei de antigen. De exemplu, albumina seric bovin nativ are 6 situsuri funcionale conformaionale. Dup scindarea enzimatic menajat in vitro, rezult 9 fragmente peptidice, fiecare dintre ele dnd reacie de precipitare cu serul anti-albumin nativ. Pentru ca reacia de precipitare s aib loc, sunt necesari cel puin doi epitopi, ceea ce nseamn c molecula de albumin seric bovin are cel puin 18 epitopi, care devin funcionali dup scindarea enzimaticamoleculei i induc sinteza anticorpilor specifici.

Efectul de carrier Antigenele prezint o dualitate funcional evident, conferit de faptul c specificitatea rspunsului imun este orientat predominant, dar nu exclusiv, fa de gruprile determinante de specificitate. La rndul su, suportul macromolecular (carrier) are proprietatea de imunogenitate, dar confer i un grad de specificitate a rspunsului imun. Rezultatele experimentale cu conju-gate hapten-protein (dinitrofenol-albumin seric) au evideniat c n cazul n care suportul carrier este nonself, rspunsul imun este mai intens. Antigenul artificial s-a obinut prin cuplarea DNP cu albumina de oarece. Injectarea conjugatului la oarece induce un rspuns imun slab, cu un titru sczut al anticorpilor anti-DNP(anti-hapten). Conjugatul DNP-albumin seric bovin, injectat la oarece, stimuleaz intens rspunsul imun primar anti-hapten, ceea ce demonstreaz c gruparea carrier are rol modulator asupra rspunsului imun.

Rolul gruprii carrier n reactivitatea imunitar a fost evideniat prin evaluarea titrului anticorpilor dup stimularea secundar. Animalele stimulate repetat cu haptena A, cuplat cu purttorul B, produc un rspuns imun secundar intens, cu anticorpi anti-hapten i anti-carrier. ns, n rspunsul imun secundar, dac stimularea s-a fcut cu haptena A, cuplat cu un carrier diferit (C) titrul anticorpilor anti-hapten nu crete. Acest fenomen curios s-a denumit efect de carrier.

Un purttor eficient pentru stimularea rspunsului imun trebuie s fie imunogenic, adic s stimuleze rspunsul celulelor T. Moleculele neimunogene sunt purttori ineficieni ai haptenelor, pentru stimularea rspunsului imun. Aceasta arat c mecanismele de recunoatere pentru hapten i pentru gruparea purttor sunt diferite.

Imunizarea cu conjugate hapten-carrier, a indus numai sinteza anticorpilor specifici anti-hapten, dac purttorul a fost un antigen T-dependent. Moleculele neimunogene nu au caliti de carrier pentru haptene.

Efectul de carrier denot c haptena i epitopii purttorului sunt recunoscui separat, de limfocitele B i respectiv T. Cele dou subpopulaii de celule coopereaz pentru a induce sinteza anticorpilor cu specificitate de hapten.Factorii care condiioneaz imunogenitatea

Antigenul este o substan nonself, care, la contactul cu celulele sistemului imunitar, declaneaz sinteza anticorpilor specifici i a receptorilor celulari cu care se combin in vitro i in vivo. Definiia este nesatisfctoare, pentru c se refer la ce face antigenul, fr s-l defineasc n termeni proprii. Definirea complet a antigenului este rezultatul nsumrii unei serii de proprieti, fiecare dintre ele fiind o condiie necesar a imunogenitii, dar nu i suficient.

Condiiile imunogenitii au fost deduse prin studii experimentale, utiliznd antigene artificiale i sintetice.

1. Caracterul strin al moleculei este condiia major a imunogenitii. O molecul nonself este cu att mai imunogen, cu ct este mai diferit de moleculele organismului receptor. In esen, caracterul nonself al unei molecule nu este strict dependent de raporturile taxonomice ale organismului donor cu cel receptor de antigen, ci este consecina deosebirilor de structur molecular.

Cele mai multe proteine ale unei specii sunt nonself pentru alte specii, dar uneori, proteinele omologe ale unor specii sunt lipsite reciproc de imunogenitate. De exemplu, hemoglobina de cal nu este imunogen pentru iepure, dei celelalte proteine de cal sunt imunogene. Caracterul nonself nu implic n mod obligatoriu existena unor molecule cu totul noi, nentlnite la organismul receptor, ci numai modificri minime ale moleculei, conferite de existena ctorva aminoacizi diferii n anumite poziii ale catenei proteice. Pentru restul secvenei, molecula nonself poate fi asemntoare proteinelor proprii organismului receptor de antigen. Micile diferene de secven a aminoacizilor, au rolul de epitopi. De regul, proteinele aprute timpuriu n evoluie au un grad superior de asemnare chimic interspecific i sunt slab imunogene pentru speciile nrudite (de exemplu, albumina seric), iar cele aprute mai trziu (de exemplu, globulinele serice) sunt mai heterogene i mai imunogene.

2. Mrimea moleculei influeneaz imunogenitatea moleculelor nonself. Pentru a fi imunogen, o molecul trebuie s aib dimensiuni care s depeasc un prag limit. Moleculele cu o bun imunogenitate sunt mai mari de 10 kD. Cu ct o molecul este mai mare, cu att numrul epitopilor si este mai mare. Secvenele de aminoacizi cu rol de epitopi au ansa repetrii de mai multe ori ntr-o molecul mai mare. Proteinele mari (de exemplu, ovalbumina 40 kD, albumina seric - 70 kD, hemocianina 6000 kD) sunt foarte imunogene, iar cele cu molecul mic (insulina 5,7 kD, histonele 6 kd, glucagonul 3,5 kD) sunt puin imunogene. Glucagonul este cea mai mic molecul natural fa de care s-au obinut anticorpi, iar cea mai mic molecul sintetic imunogen este un polipeptid de 1,4 kD.

Pentru polizaharide, limitele minime pentru imunogenitate sunt mai mari. Dextranii sunt antigenici dac au peste 50 kD, cu variaii mari de rspuns imun de la o specie la alta (omul i oarecele rspund bine, cobaiul foarte puin).

Moleculele mici neimunogene sau slab imunogene pot dobndi o imunogenitate optim, dup adsorbia pe particule inerte de colodiu, caolin sau de crbune. Acestea au rol de purttori i asigur creterea taliei moleculare.

3. Complexitatea molecular. Dimensiunile mari ale unei molecule nonself nu sunt totdeauna suficiente pentru a-i conferi imunogenitate. De exemplu, moleculele de polimeri sintetici (poli-acrilamida, nylonul) sunt foarte mari, fiind formate dintr-un numr mare de monomeri repetitivi, dar nu sunt imunogene pentru c nu au complexitatea molecular minim necesar.

Moleculele naturale, n special proteinele au un grad nalt de complexitate, datorit diversitii monomerilor componeni. Fiecare tip de molecul proteic are o configuraie tridimensional unic, determinat de secvena specific de aminoacizi.

Proteinele globulare au cea mai mare complexitate antigenic, derivat din configuraia lor teriar. Ele posed epitopi exprimai pe suprafaa moleculei native, accesibili fenomenului de recunoatere de ctre celulele sistemului imunitar i epitopi interni, care pot stimula rspunsul imun, dup clivarea enzimatic a moleculei n celulele specializate pentru prelucrarea antigenelor. De exemplu, serul imun anti- albumin seric bovin precipit cu fiecare din cele 9 fragmente peptidice rezultate prin clivajul enzimatic al moleculei native, ceea ce sugereaz c in vivo, molecula este scindat i astfel se relev epitopi interni, fa de care se sintetizeaz anticorpi specifici.

Complexitatea unei molecule nu depinde numai de diversitatea monomerilor, ci i de secvena lor i de efectul secvenei asupra structurii secundare, teriare i eventual quaternare a moleculei.

4. Starea fizic a antigenului. Imunogenitatea unei molecule este condiionat de o anumit rigiditate a epitopilor si. Lipsa rigiditii ar explica imunogenitatea redus a gelatinei, o protein denaturat, derivat din hidroliza colagenului, foarte bogat n glicocol (21-35%).

n mod obinuit, rotaia liber a unei molecule are loc numai ntre C i legtura peptidic. Glicocolul nurealizeaz ramificaii ale catenei polipeptidice n poziia C , ceea ce face ca molecula de gelatin s prezinte rotaii libere n jurul axului longitudinal. Gelatina are o proporie foarte mic de aminoacizi aromatici (Tir, His), iar cisteina i triptofanul lipsesc. LegareaL-Tir, n proporie de 2% mrete gradul de imunogenitate a gelatinei. Complexul induce sinteza anticorpilor care precipit gelatina nativ.

5. Solubilitatea. Condiia solubilitii unui antigen pentru a fi imunogen este sugerat de urmtarele observaii:

-polimerii macromoleculari sintetici care nu sunt solubilizai, adic nu sunt hidrolizai, sunt lipsii de imunogenitate;

-organismele cu echipamente enzimatice hidrolitice mai active (oarece) elaboreaz un rspuns imun mai amplu fa de un antigen greu solubil(de exemplu, polizaharidul de pneumococ), n raport cu organismele care hidrolizeaz mai greu (de exemplu, iepurele);

-antigenele corpusculare (celule, virioni) devin imunogene dup solubilizarea i eliberarea componentelor imunogene n macrofag, unde are loc degradarea menajat a antigenelor.

Hidroliza enzimatic a antigenului nu este totdeauna o condiie prealabil obligatorie a imunogenitii. Studiile cu antigene sintetice au artat c, n momentul recunoaterii de ctre celulele sistemului imunitar, o parte a epitopilor sunt intaci, identici cu aceia ai moleculei native.

6. Accesibilitatea determinanilor antigenici. Pentru ca un epitop s fie imunogen, trebuie s fie expus la suprafaa moleculei, pentru a fi accesibil mecanismelor de recunoatere imunitar. De exemplu, un polimer de L-Lys, cu rol de purttor pentru tripeptidul Tir-Ala-Glu este imunogen. Dup mascarea epitopilor tripeptidici cu catene de poli-Ala, molecula i pierde imunogenitatea. Fig. 6.Rolul accesibilitii determinanilor antigenici n imunogenitate. Copolimerul multicatenar format din acidul L-glutamic (G) i tirozina (T), legat prin intermediul poliL-alaninei (A-A), de purttorul polilizin este imunogen. Acelai copolimer, legat direct depurttorul polilizin, dar mascat de polialanin, este neimunogen.

7. Configuraia spaial a moleculei este un factor decisiv pentru imunogenez. Studiile privind imunogenitatea antigenelor sintetice, au evideniat c cel mai adesea, anticorpii se formeaz fa de o anumit secven de aminoacizi, care are rol de epitop. Dar, uneori, anticorpii sunt specifici fa de configuraia spaial a unui determinant antigenic. Concluzia a reieit din specificitatea distinct a anticorpilor fa de dou polipeptide sintetice cu aceiai compoziie chimic, dar cu configuraii spaiale diferite. In primul caz, determinantul antigenic este tripeptidul Tir-Ala-Glu, legat de un polimer sintetic, cu rol de purttor. La iepure, se sintetizeaz anticorpi specifici fa de tripeptidul Tir-Ala-Glu.

n al II-lea caz, prin polimerizarea tripeptidului se obine o molecul cu structura periodic a secvenei Tir-Ala-Glu, care dobndete configuraie -helical. Dup imunizarea iepurelui, se sintetizeaz anticorpi care precipit moleculele cu structur spaial -helical, dar nu precipit tripeptidul simplu. Pe baza acestor observaii, M. Sela recunoate existena a dou tipuri de determinani antigenici:

-determinani secveniali, a cror specificitate este dat de secvena subunitilor componente (aminoacizi, monozaharide), indiferent de structura spaial a moleculei. Epitopii secveniali sunt comuni pentru toate polipeptidele care au secvene de aminoacizi identice sau asemntoare i existena lor este o surs a reaciilor imune ncruciate;

Fig. 7.Tipuri de epitopi. Epitopi secveniali i conformaionali, continui i discontinui. -determinani antigenici conformaionali, a cror specificitate deriv din configuraia spaial a moleculei. Epitopii conformaionali sunt de dou feluri: continui i discontinui. Cei discontinui sunt formai din regiuni distincte ale moleculei, care ajung n juxtapoziie cnd molecula se pliaz n configuraia sa nativ.

Meninerea integritii determinanilor conforma-ionali este condiionat de integritatea legturilor S-S. Dup fragmentarea enzima-tic a moleculei, epitopii conformaionali discontinui i pierd integritatea i semnificaia funcional, iar cei continui au o soart variabil: i pierd sau i pstreaz configuraia avut n molecula nativ.

Importana epitopilor conformaionali a fost evi-deniat pentru molecula de lizozim din albuul de ou de gin. Bucla format de aminacizii 64-80 este nchis de o legtur S-S ntre dou resturi de cistein. Secvena buclei a fost sintetizat artificial i legat de polimerul Ala-Lys, cu rol de carrier. Complexul format induce sinteza anticorpilor laiepure, specifici fa de aceast secven, dar dau reacie de precipitare i cu molecula nativ de lizozim.Fig. 8.Bucla format din aminoacizii 64-80 ai secvenei moleculei de lizozim din albuul de ou, formeaz un determinant conformaional. n general, anticorpii care se sintetizeaz fa de antigenele proteice naturale au specificitate, n primul rnd, fa de epitopii conformaionali i mai rar fa de cei secveniali, ceea ce denot c sistemul imunitar recunoate molecula nativ sau regiuni ale ei, cu configuraia spaial iniial.

n concluzie, studiul antigenelor sintetice a avut un rol decisiv pentru definirea condiiilor de imunogenitate. Polizaharidele sunt molecule cu o slab imunogenitate, corespunztoare unei complexiti moleculare limitate. Acizii nucleici i lipidele sunt molecule neimunogene n stare nativ, dar dup cuplarea cu un suport proteic, ndeplinesc rolul de haptene i devin foarte imunogene. Din aceast cauz, nucleoproteinele i lipoproteinele sunt antigene foarte eficiente. Proteinele native sunt imunogene, dar pentru exprimarea la un nivel superior a acestei proprieti, trebuie s ndeplineasc condiiile enumerate. Acestea, luate n parte, sunt necesare, dar nu suficiente. O bun imunogenitate este rezultatul cumulrii unui numr ct mai mare de condiii.

Un antigen ideal trebuie s fie greu degradabil (pentru o persisten ct mai lung n organism), s fie timodependent i s aib un numr ct mai mare de semnale imunogene (epitopi), conectate ntr-un ansamblu funcional, denumit imunon.Antigenele heterofile

Reaciile imune ncruciate pe care antigenele de tip Forssman le dau cu serul imun obinut fa de unul din antigenele grupului se explic prin asemnarea structurii chimice a acestor molecule. Cele mai multe antigene heterofile sunt glicoproteine sau glicolipide, n care gruprile glucidice au rolul de haptene. Componentele glucidice ale antigenelor heterofile sunt foarte asemntoare din punct de vedere chimic, chiar dac aparin unor organisme cu poziie sistematic foarte diferit. Antigenul Forssman este un glico-sfingolipid, la care determinantul antigenic este format din dou resturi de N-acetil-galactozamin.

Polizaharidele antigenelor de tip Forssman, n stare purificat, nu sunt imunogene, sunt rezistente la fierbere i chiar la autoclavare.

Adjuvanii Substanele sau amestecurile de substane, care n asociaie cu un antigen sau injectate simultan cu acesta, intensific rspunsul imun specific fa de antigenul respectiv sunt denumite adjuvani (adjuvere, latin = a ajuta). Punctul de plecare al introducerii adjuvanilor n practica imunologic a fost un fapt de observaie: dup asocierea unui vaccin bacterian celular, cu un vaccin macromolecular (anatoxin), rspunsul imun antitoxin este mult mai intens dect n cazul n care cele dou vaccinuri se administreaz separat. Dup injectarea vaccinului celular anti-tifoparatific A i B, mpreun cu anatoxina tetanic (TAB), titrul anticorpilor fa de anatoxina tetanic este de 20-30 de ori mai mare dect n cazul injectrii separate a anatoxinei tetanice. Explicaia acestui fenomen a fost dat ulterior: la locul injectrii vaccinului, corpii celulari bacterieni determin un proces inflamator, adic un aflux local de celule efectoare ale rspunsului imun (limfocite, macrofage). Macrofagele capteaz i fixeaz anatoxina ntr-un stoc, de unde este eliberat treptat i astfel se prelungete durata de stimulare a sistemului imunitar.

Cel mai cunoscut i folosit pentru studiul experimental al imunogenitii antigenelor este adjuvantul Freund, o emulsiede ap n ulei mineral de parafin. Antigenul se suspend n ap. Emulsia de ap n ulei se realizeaz cu un emulgator care conine grupri lipofile i hidrofile (lanolina, arlacel A). Acesta este adjuvantul Freund incomplet. Dup adugarea celulelor omorte de M. tuberculosis, rezult adjuvantul Freund complet. Principiul imunostimulator al celulelor de M. tuberculosis este reprezentat de glicolipidele i glicolipopeptidele(denumite ceruri) din structura peretelui celular. Glicolipopeptidele sunt formate din acizi micolici esterificai cu un polizaharid (arabinogalactan) ce conine arabinoz, galactoz, manoz, la care se leag un fragment peptidic ce conine D i L-alanin, acid D-glutamic, acid diaminopimelic.

Fig. 9.Reprezentarea schematic a interaciunii moleculelor componente ale adjuvantului Freund.

Adjuvantul Freund determin urmtoarele efecte:

a) persistena antigenului n organism prin ntrzierea degradrii sale i eliberarea treptat n circulaie;

b) picturile de emulsie vehiculeaz antigenul pe cale limfatic, n tot organismul, inclusiv spre ganglionii limfatici, unde se va declana rspunsul imun; c) adjuvantul Freund complet i incomplet fac imunogene doze mici de antigene, care altfel nu ar fi imunogene i mresc semnificativ titrul anticorpilor fa de oricare antigen.

Amestecul de adjuvant i antigen se administreaz subcutan sau intradermic. Administrarea intravenoas anuleaz efectul adjuvantului. Este posibil administrarea decalat la interval de cteva zile (mai nti a adjuvantului), dac cele dou injectri se fac n acelai loc.

Efectul stimulator al adjuvantului Freund este foarte intens pentru dozele mici de antigen. Este foarte eficient n asociaie cu antigenele proteice, stimulnd sinteza IgG. Utilizarea sa la om este limitat de efectele secundare pe care le produce (artrita de adjuvant).

Endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Brucella, Bordetella etc.) au efect adjuvant. Ele sunt n acelai timp adjuvani, antigene, toxine i factori pirogeni. Efectul maxim se obine numai dac endotoxina se administreaz simultan sau la mai puin de 6 ore dup injectarea antigenului. Nu se adaug vaccinurilor umane pentru c produce febr.

Srurile de aluminiu (Al(OH)3, Al(SO4)2.12 H2O), fosfatul de aluminiu) i cele de calciu au efect adjuvant, deoarece se combin cu imunogenul i formeaz un complex insolubil la situsul subcutan sau intramuscular al injectrii, mrind intervalul de timp n care celulele imunitare pot fi activate. Se stimuleaz afluxul de fagocite i funcia de fagocitoz.

Compuii aluminiului sunt singurii adjuvani acceptai n clinica uman i veterinar, dei prezint unele dezavantaje: stimuleaz rspunsul imun mediat humoral, dar nu i imunitatea mediat celular; vaccinurile care conin compui ai Al nu pot fi conservate prin nghe i nici liofilizate i de aceea necesit transport refrigerat.

Ali adjuvani acioneaz prin stimularea activitii enzimelor lizosomale. Vitamina A i srurile de beriliu, de siliciu, srurile quaternare de amoniu mobilizeaz macrofagele la locul injectrii i stimuleaz activitatea lor fagocitar i degradativ.

Despre anticorpi

Structura moleculei de imunoglobulin Structura moleculei de imunoglobulin (Ig) s-a stabilit prin analiza proteinelor omogene secretate de plasmocitoame, cu metodologii complexe: biochimice, analitice, cristalografia prin difracie cu raze X.

Unitatea structural de baz a moleculei de Ig estemonomerul. Acesta este o unitate tetrapeptidic, format prin asocierea a dou lanuri grele (H,Heavy = greu), fiecare avnd circa 450 de aminoacizi i o greutate molecular cuprins ntre 50-76 kD i dou lanuri uoare (L,Light = uor), fiecare avnd circa 216 aminoacizi i o greutate molecular de 25 kD. Cele 4 catene polipeptidice sunt legate ntre ele prin puni S-S i se rsucesc n spiral - att unul fa de altul, dar i fiecare separat fa de propria-i ax, rezultnd o configuraie tridimensional, stabilizat prin 16-24 legturi S-S i prin alte interaciuni necovalente. Monomerul tetrapeptidic tridimensional are form de T sau de Y.

n funcie de secvena aminoacizilor, fiecare lan polipeptidic este alctuit din dou regiuni distincte:

a)regiunea constant(C ) corespunde jumtii C-terminale a celor 4 catene polipeptidice. Are o secven relativ uniform a aminoacizilor i asigur unitatea structural i funcional a moleculei de Ig;

b)regiunea variabil(V) cuprinde o secven de circa 110 aminoacizi n jumtatea N-terminal a celor 4 catene polipeptidice. Mrimea sa nu este fix, deoarece intervin inserii sau deleii de 3-6 aminoacizi. Regiunile variabile ale fiecrei perechi de catene formeazsitusul de combinareal moleculei de Ig, care confer specificitate de legare cu antigenul.

Variabilitatea maxima secvenei de aminoacizi a catenei L se concentreaz n poziiile 24-34, 50-55, 89-97, iar a catenei H, la secvenele30-36, 50-56, 86-91 i 95-100. Aceste secvene formeazregiunile hipervariabilesauregiunile determinante de complementaritate(RDC), fa de configuraia spaial a epitopului. Aminoacizii acestor secvene intr n alctuirea situsului de combinare al moleculei de Ig.

Secvenele relativ invariante se numesc regiuni cadru (RC) i formeaz 80-85% din regiunea variabil a moleculei de Ig. Variaia secvenei aminoacizilor la nivelul regiunilor cadru este limitat la 5%. Secvena regiunilor cadru i a celor determinante de complementaritate alterneaz astfel: RC1, RDC1, RC2, RDC2, RC3, RDC3, RC4, RDC4.

Aproape de jumtatea catenelor H se gsete o secven de circa 15 aminoacizi, n care sunt grupate toate resturile de cistein ce formeaz puni S-S intercatenare. Aceast secven se numeteregiunea balama. Este sensibil la aciunea proteazelor fiind clivat de papain, pepsin etc. La IgM i IgE, regiunea balama lipsete, dar cea omolog balamalei este clivat de proteaze. Regiunea balama asigurflexibilitateamoleculei de Ig, permind mobilitatea fragmentelor Fab, care, teoretic, pot forma unghiuri variabile, ntre 0-180o, conferind moleculei o geometrie variabil. Cele 16-24 legturi S-S ale monomerului tetrapeptidic sunt constante ca numr i localizare pentru diferitele clase de Ig. Se disting 3 categorii de puni S-S:

- legturi intercatenare H-H sau L-H, ale unui monomer. Legturile L-L s-au descris la IgA2i la proteinele Bence-Jones, care sunt dimeri de lanuri L;

- legturi intracatenare, care determin structura teriar a fiecrui lan polipeptidic.

- legturi intercatenare, ntre lanurile H ce aparin unor monomeri diferii, la IgA2i IgM, care formeaz complexe moleculare polimerice:

moleculei de Ig se formeaz prin plierea fiecreia din cele 4 catene polipeptidice i prin rsucirea lor n spiral. Domeniile sunt regiuni globulare ale moleculei, legate ntre ele prin secvene lineare scurte. Domeniile se pliaz ntr-o conformaie stabil, conferit de secvena proprie de aminoacizi. Comparativ cu secvenele lineare, domeniile pliate sunt mai rezistente la proteoliz.

Catena L are dou domenii: unul corespunztor regiunii variabile (VL) i altul corespunztor regiunii constante (CL).

Catena H are 4 domenii: unul corespunztor regiunii variabile (VH) i trei domenii ale regiunii constante: CH1, CH2, CH3.Fig. 11.a.Reprezentarea schematic astructurii primarea moleculei de imunoglobulin.

Fig. 11.b.Localizarea diferitelor funcii ale moleculei de anticorp.Fiecare caten H a moleculelor de IgM i IgE are 5 domenii: unul n regiunea variabil (VH) i 4 n regiunea constant (CH1 CH4).

Secvena de legtur ntre regiunea constant (CH1) i cea variabil a fiecrei catene se numetezon de comutare(s = switch).

Fiecare domeniu are o form cilindric sau globular, cuprinde o secven de circa 60 de aminoacizi i este stabilizat prin interaciuni necovalente de tiptrans, cu domeniul omolog din lanul opus i de tipcis, cu domeniul vecin al aceleiai catene.

Domeniile fiecrui lan, mpreun cu cele omologe ale lanului opus, formeaz uniti funcionale denumitemodule. Cooperarea lor funcional este ilustrat de faptul c domeniile VL i VH separate, au o capacitate foarte limitat de legare a antigenului, n timp ce forma lor asociat (care constituie situsul de legare al moleculei) este foarte eficient n legarea antigenului.

Fig. 12.Reprezentarea schematic adomeniilorpliate i stabilizate ale moleculei de IgG.

Fig. 13.Clivajul enzimatical moleculei de IgG1umane. Pepsina cliveaz catena H i elibereaz fragmentele F(ab)2i regiunea Fc (segmentul cristalizabil). Hidroliza prelungit taie fragmentul Fc n peptide scurte. Papaina cliveaz molecula n regiunea balama (la restul 224) i elibereaz dou fragmente Fab i un fragment Fc (dup Roitt, 1984). Moleculele de imunoglobuline exist sub dou forme:secretate, ca anticorpi n umorile organismului ilegatede membrana limfocitelor B, ndeplinind funcia de receptori de antigen. Forma legat prezint o secven hidrofob la captul C-terminal, de circa 30 de aminoacizi, care strbate membrana i se ancoreaz n structura ei.

Metodele declivarei dedenaturare chimica moleculei de imunoglobulin au contribuit la nelegerea structurii i funciei sale. Clivarea s-a realizat cu enzime proteolitice (papain, pepsin, tripsin) sau prin cianoliz cu BrCN.

Papaina scindeaz mo-lecula de imunoglobulin la nivelul regiunii balama (aminoacidul 224) i elibe-reaz dou fragmenteFab(Fragment antigen binding) i fragmentulFc(cristalizabil). Fiecare fragment Fab (50 kD) conine un lan L ntreg i jumtatea N-terminal a lanului H, notat cu Fd (difficult), care cuprinde domeniile VH i CH1. Frag-mentul Fab poate fi scindat transversal i rezult frag-mentul Fv (variabil) format din domeniile VL i VH, se-parat de domeniile CL i CH1.

Fragmentul Fc (50 kD) este format din jumtile C-terminale ale celor dou catene H, unite printr-o legtur S-S i prin legturi necovalente.

Pepsina cliveaz lan-urile H sub regiunea balama i elibereaz fragmentul Fc, mai mic dect fragmentul Fc papainic i dou fragmente Fab legate ntre ele (Fab)2, prin puni S-S intercatenare.

BrCN scindeaz lanurile polipeptidice la nivelul secvenelor cu Met, pe care o transform n homoserin. Fragmentele rezultate sunt heterogene ca mrime, n funcie de frecvena metioninei. Polipeptidele rezultate prin clivare enzimatic, ct i prin cianoliz, se separ prin tehnici cromatografice.

Denaturarea moleculei de imunoglobulin prin reducerea legturilor S-S. Agenii reductori (mercaptoetanolul, mercaptoetanolamina, ditiotreitolul) au o grupare SH liber i reduc legturile S-S intercatenare i intracatenare.

HO CH2 CH2 SH (Mercaptoetanolul)

Legturile intercatenare (H-H sau H-L) sunt reduse mai uor, iar cele intracatenare, care stabilizeaz buclele domeniilor moleculei de imunoglobulin, sunt disociate mai greu.

Reducerea legturilor S-S este reversibil. Dup ndeprtarea agentului denaturant, renaturarea este rapid i complet. Din acest motiv, agenii denaturani se ncorporeaz n sistemul supus denaturrii. Denaturarea se poate stabiliza prin diferite metode chimice.

Funciile moleculei de imunoglobulin n ansamblul efectorilor sistemului imunitar, moleculele de imunoglo-bulin ndeplinesc dou categorii de funcii:

- funcii despecificitate- funcii grupate sub denumirea deactiviti biologice efectoare Specificitatea imunoglobulinei fa de un antigen este exprimat prin capacitatea de recunoatere fin a epitopului complementar al antigenului i de combinare cu acesta. Specificitatea moleculei de imunogobulin este conferit de situsul su de combinare. Marea diversitate a moleculelor de anticorpi, asigur o diversitate uria a situsurilor de combinare, de ordinul a 108 109specificiti de legare.

Specificitatea de legare este dat de structura spaial a situsului de combinare cu antigenul, conferit de resturile de aminoacizi ale regiunilor hipervariabile ale catenelor H i L.

Aminoacizii care formeaz situsul de combinare al moleculei de imunoglobulin, prin plierea regiunilor hipervariabile, delimiteaz ocavitate molecularce difer ca form i mrime.

Cavitatea prezint substructuri (proeminene i depresiuni), pe care le formeaz secvenele hipervariabile, n timp ce restul regiunilor variabile ale celor dou catene confer structura tridimensional a cavitii moleculare.

Potrivirea spaial dintre situsul de combinare al moleculei de anticorp i epitopul specific, din punctul de vedere al configuraiei spaiale, este perfect. Eventualele imperfeciuni geometrice pot fi ocupate de moleculele de ap. Potrivirea perfect a celor dou uniti combinante este sugerat de metafora cheie-broasc.

Dup combinarea cu antigenul, modificrile spaiale ale situsului de combinare a anticorpului sunt minime, nedectabile. Epitopul antigenic are un rol important n potrivirea conformaional perfect cu situsul de combinare a anticorpului, deoarece corespunde unei regiuni moleculare cu factor de temperatur mai ridicat, ceea ce sugereaz o flexibilitate mai accentuat a secvenei moleculare respective.

Flexibilitatea unui determinant antigenic i permite s se adapteze mai uor ntr-un situs de legare preexistent al moleculei de anticorp, chiar dac epitopul nu se potrivete exact geometriei situsului de combinare a anticorpului. Datorit flexibilitii epitopului, legarea antigenului cu anticorpul se aseamn cu ntlnirea a doi nori i nu cu aceea a dou pietre.

Anticorpii specifici fa de secvenele peptidice mobile (calde) ale antigenului proteic, se leag cu afinitate mai mare de proteina nativ. Aceste rezultate sunt foarte importante din punct de vedere practic, pentru selectarea segmentelor peptidice n vederea obinerii vaccinurilor sintetice subunitare.

Dimensiunile situsului de combinare s-au dedus indirect, prin determinarea mrimii haptenei care blocheaz reacia de combinare a anticorpilor cu antigenul nativ: oligozaharidul format din6-8 uniti monomericeocup complet situsul de combinare al moleculei de anticorp. Oligozaharidele mai mici inhib parial reacia specific de precipitare. Pentru anticorpii specifici fa de antigene proteice,tetrapeptideleau blocat cu maxim eficien reacia de precipitare dintre anticorpi i antigenul nativ.

Funciile biologice efectoare sunt amorsate de reacia antigen-anticorp. Numrul funciilor biologice efectoare este mai mic i sunt dependente de regiunile constante ale moleculei de imunoglobulin.

Fiecare domeniu al regiunii constante a moleculei de imunoglobulin ndeplinete anumite funcii:

- legarea antigenului pe imunoglobulinele de suprafa care funcioneaz ca receptori pe limfocitele B, declaneazproliferarea i diferenierealor, iar legarea antigenului cu imunoglobulinele citotrope pentru mastocite, declaneazdegranulareaacestor celule;

- dup cuplarea cu antigenul, moleculele de imunoglobulin expun fragmentul Fc, recunoscut ulterior de receptorii specifici pentru Fc de pe suprafaa monocitelor, macrofagelor, PMNN. Astfel se stimuleaz procesul de fagocitoz a celulelor nonself tapetate cu imunoglobuline, denumitimunofagocitoz; - celulele K, prin intermediul receptorilor pentru Fc, interacioneaz cu celulele nonself tapetate cu IgG i realizeaz liza de contact prin fenomenul decitotoxicitate;

- interaciunea antigen-anticorp genereaz un semnal care se transmite regiunii Fc. Aceasta i modific configuraia spaial i expune unsitus de recunoatere(pentru IgG situat ntre Glu 318 i Lys 322), de care se leag C1q;

- regiunea balama este transductoare de semnale i are un rol important n flexibilitatea moleculei de imunoglobulin, permind variaia unghiului dintre fragmentele Fab: ele trec reversibil de la forma T la Y. Geometria variabil a moleculei de imunoglobulin mrete eficiena de legare a antigenului, deoarece ajusteaz poziia celor dou situsuri de combinare ale anticorpului, n funcie de distana la care se gsesc determinanii antigenici pe suprafaa unui antigen particulat (virus sau celul);

- regiunea balama a moleculelor de IgG i IgD este sensibil la aciunea enzimelor proteolitice, iar a moleculei de IgA este rezistent.

Componenta glucidic a imunoglobulinei ndeplinete urmtoarele funcii;

- realizeaz i menine o conformaie a moleculei de imunoglobulin, esenial pentru secreie;

- mrete solubilitatea moleculelor de imunoglobulin;

- are rol de spaiator ntre domeniile unui lan i ntre catenele moleculei;

- particip la funciile citotrope ale moleculei de imunoglobulin;

- are rol n legarea C1q, component a sistemului complement.

Heterogenitatea anticorpilor Moleculele de imunoglobuline din plasma oricrui organism sunt foarte heterogene, att datorit diversitii epitopilor fa de care s-au sintetizat ceea ce induce variaii ale secvenelor hipervariabile ale moleculei, ct i datorit variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunile constante ale moleculei.

Heterogenitatea anticorpilor este ordonat n clase, subclase, tipuri, alotipuriiidiotipuri, pe baza variaiei secvenei de aminoacizi. Moleculele de imunoglobuline au caliti duble: ele se comport nu numai camolecule de recunoatere, care recunosc specific antigenul, dar la rndul lor sunt recunoscute caantigene. Pentru sporirea gradului de imunogenitate, moleculele de imunoglobuline se asociaz cu adjuvantul Freund i se injecteaz la animale de experien. Variaiile de structur chimic a imunoglobulinelor se comport ca determinani antigenici i induc sinteza anticorpilor anti-imunoglobulin. Variaiile de ordin chimic ale imunoglobulinelor se evideniaz prin metode imunochimice de precipitare ntre moleculele de imunoglobulin cu rol de antigen i anticorpii anti-imunoglobulin din serul imun. Din punctul de vedere al manifestrii imunopotenei determinanilor antigenici ai imunoglobulinelor, s-au definit trei nivele de heterogenitate:izotipic, alotipiciidiotipic.

Heterogenitatea izotipic Heterogenitatea izotipic (izos= acelai) definete variantele biochimice ale imunoglobulinelor, comune pentru toi indivizii unei specii. Variantele biochimice se datoreaz variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunea constant a catenei H. Ele se comport ca determinani antigenici dup injectarea n organismul altei specii. Pentru identificarea epitopilor izotipici ai moleculelor de imunoglobulin uman, acestea, n asociaie cu adjuvantul Freund, se injecteaz la iepure.

Fiecare individ al unei specii exprim toate variantele antigenice izotipice caracteristice speciei.

Variantele antigeniceizotipiceale imunoglobulinelor umane s-au identificat iniial,n regiunea constant a catenei H.

Exist 5 variante antigenice distincte ale catenelor H n regiunea constant, notate cu g, m, a, d, e, corespunztoare celor 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Serul imun fa de un determinant antigenic de clas nu d reacii ncruciate cu celelalte tipuri de determinani, deoarece catenele H ale diferitelor clase de imunoglobuline prezint diferene mari de ordin chimic ntre domeniile echivalente, care merg pn la circa 60% din totalul aminoacizilor.

Determinanii antigenici ai unei clase de imunoglobuline sunt comuni tuturor indivizilor unei specii i se evideniaz nserul imun heterolog, obinut prin imunizarea organismelor altei specii. De exemplu, un antiser fa de lanul uman , obinut pe iepure, va precipita numai anticorpii clasei IgG din orice ser uman.

Ulterior, determinanii antigenici s-au identificat in regiunile constante ale catenelor L. Determinanii antigenici ai catenelor L determintipurilede imunoglobuline.

Catena L are dou variante antigenice, notate cuki l, care se gsesc la toate cele 5 clase de imunoglobuline. Cele dou tipuri structurale de lanuri L (k i l) prezint deosebiri de secven a aminoacizilor n regiunea constant i nu au determinani antigenici comuni. De aceea, nu dau reacii imune ncruciate. Serul imun heterolog anti-molecule de imunoglobuline umane cu caten Lk,obinut pe iepure, precipit toate moleculele de imunoglobuline umane care conin catena Lk, indiferent de clas. Serul imun anti-Lk nu precipit moleculele de imunoglobuline care conin catena L l.

O molecul de imunoglobulin are dou catene de tip k sau l. Formula general a diferitelor clase de imunoglobuline esteg2k2(sau g2l2), m2k2(m2l2), a2k2(a2l2).

Catenele L de tip k i l determintipurile molecularede imunoglobuline. La om, raportul Ig k/ l este 7/3, iar la oarece este 19/1, valori care probabil reflect raportul numeric al genelor codificatoare pentru cele dou tipuri de catene.

Izotipurile catenelor H nu influeneaz funcia de specificitate a moleculelor de imunoglobuline: acelai antigen poate fi legat de oricare din cele 5 clase de imunoglobuline.

Pe lng variantele antigenice menionate clase i tipuri s-au identificat diferene mai subtile ale moleculelor de IgG i IgA, n ceea ce privete proprietile fizice, chimice i biologice, diferene care corespund subclaselor antigenice. Aceasta nseamn c, pe lng determinanii antigenici de clas, exist i alte variante antigenice aleregiunii constante ale catenei H, corespunz toare subclaselor. Ele se noteaz cu litera clasei, urmat de o cifr: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, respectiv IgA1, IgA2.

Moleculele de imunoglobuline ale subclaselor au n comun determinanii antigenici proprii fiecrei subclase, aducnd un nivel superior de heterogenitate a catenelor H.

Diferenele secvenei de aminoacizi ai catenei H, ntre diferite subclase sunt mici: 24 de aminoacizi ntre IgG1i IgG4. Cea mai important deosebire const n numrul legturilor S-S intercatenare.

Moleculele diferitelor subclase sunt sintetizate de celule diferite.

Variantele alotipice Descoperirea alotipiei (alos= altul) a pornit de la urmtorul fapt de observaie: n serul pacienilor cu artrit cronic reumatoid se gsesc molecule de tip special, ncadrate n categoria factorilor reumatoizi (FR). Factorii reumatoizi sunt molecule de auto-anticorpi, adic IgM anti- IgG.

Factorii reumatoizi se evideniazin vitro, prin capacitatea lor de a determina aglutinarea eritrocitelor tapetate cu o doz subaglutinant de anticorpi specifici antieritrocitari (IgG).

Grubb (1956) a observat c FR seric, uneori, aglutineaz hematiile tapetate cu auto-anticorpi specifici (care se sintetizeaz n anemia hemolitic autoimun) ale unor pacieni, iar alteori, reacia de hemaglutinare nu se produce, testul evidenieriiFRin vitrofiind fals negativ. Concluzia reaciei de hemaglutinare pe care, uneori, FR din serul pacienilor de artrit reumatoid o produce asupra hematiilor tapetate cu o doz subaglutinant de anticorpi specifici, a fost urmtoarea: autoanticorpii de pe suprafaa eritrocitelor unor indivizi cu anemie hemolitic autoimun, posed determinani antigenici diferii, pe care FR poate s-i recunoasc. Astfel s-a dedus c moleculele de imunoglobulin de la indivizi diferii, sunt diferite din punct de vedere antigenic. n consecin, imunizarea unui individ cu imunoglobulinele provenite de la alt individ al aceleiai specii, determin sinteza anticorpilor fa de determinanii antigenici ai moleculelor imunoglobulinice ale donorului.

Imunoglobulinele sunt aloantigene ineficiente dac sunt injectate ca proteine solubile n organismul uman. De aceea, transfuziile de snge total, de plasm sau injectarea imunoglobulinelor solubile, de cele mai multe ori, nu induc sinteza anticorpilor anti-imunoglobuline ale donorului. Moleculele de imunoglobuline devin antigenice dup asocierea lor cu adjuvantul Freund.

Semnificaia variantelor antigenice alotipice ale moleculelor de imunoglobuline este analog celei a antigenelor de grup sanguin. Fenomenul este general, adic i alte molecule provenite de la un organism pot fi imunogene pentru alte organisme ale aceleiai specii, la care se comport ca aloantigene.

Variantele alotipice ale imunoglobulinelor se detecteaz n reacia de precipitare cu aloantiseruri obinute pe organisme ale aceleiai specii, dar cu alotip diferit de acela al organismului donor al antigenului imunoglobulinic.

Variantele moleculare alotipice sunt consecina existenei genelor alele perechi (aa), o caracteristic general a organismelor diploide. Prin mutaii succesive, n acelai locus, apar mai multe alele care formeaz o serie polialelic - a1, a2, a3 an. Genele alele ocup acelai locus pe cromosomii omologi, ca i gena de tip slbatica. Fiecare individ va avea o combinaie de gene alele: aa1, aa2.. aansau a1a2, a1a3 a1an, cu variante antigenice distincte.

Alotipurile imunoglobulinelor sunt rezultatul variaiilor secvenei aminoacizilor n regiunile constante ale catenelor H i L, ceea ce le confer un grad superior de heterogenitate, consecin a alelelor codominante la acelai locus.

Pentru moleculele imunoglobulinice umane s-au descris trei categorii de markeri alotipici:

- factorii Gm (gamamarker), numerotai de la 1 la 25, pe catena H a subclaselor de IgG. De exemplu, markerul G1m(a) pe moleculele de IgG1are secvena Asp-Glu-Leu-Thr-Lys, iar moleculele altor indivizi au secvena Glu-Glu-Met-Thr-Lys, adic doi aminoacizi diferii. Pentru IgG3sau descris 14 alele;

- factorii A2m(1) i A2m(2), identificai pe catenele H ale subclasei IgA2;

- factorii Km(Inv), pe catenele Lk, n numr de trei;

- dou variante alelice pentru IgE.

Foarte rar, determinanii antigenici alotipici sunt localizai n domeniile variabile ale moleculei.

Ca i n alte sisteme alelice, indivizii pot fi homozigoi sau heterozigoi pentru genele care codific markerii. Genele se exprim codominant i se transmit n descenden dup mecanismul mendelian. De exemplu, alotipurile b4b5pe catenele L ale imunoglobulinelor de iepure se exprim astfel: un organism homozigot b4b4sau b5b5exprim alotipul b4, respectivb5. Dar genotipul b4b5rezultat n descendena lor exprim markerul b4pe o fracie a moleculelor i markerul b5, pe restul moleculelor de imunoglobuline.

Variantele idiotipice Idiotipul (idios= individual) este reprezentat de o populaie omogen de molecule de anticorpi, sintetizate de descendenii unei clone celulare, care recunosc i se combin cu un singur determinant antigenic (epitop).

Specificitatea idiotipic a unei populaii de anticorpi s-a dedus pe cale experimental:

- antigenul (celule deS. typhi) s-a injectat la organismele A i B (iepuri), identice din punct de vedere genetic. Se sintetizeaz anticorpi aglutinaniantiS. typhi;

- anticorpii aglutinani 1(produi de organismul A) s-au injectat la organismul C (iepure din aceiai linie genetic). Se sintetizeaz anticorpi anti-anticorpi 1, evideniai n reacia de precipitare.

Surprinztor, anticorpii anti-anticorpi 1 nu precipit anticorpii 2, dei anticorpii 1 i anticorpii 2 au aceiai specificitate fa de antigeneleS. typhi, iar organismele A, B, C aparin aceluiai alotip.

Concluzia este c anticorpii 1 i anticorpii 2, dei au aceiai specificitate fa de antigenul deS.typhi, la rndul lor, au determinani antigenici proprii. De aceea, anticorpii anti-anticorpi 1 nu precipit anticorpii 2, sintetizai de un alt organism. Moleculele de anticorpi cu aceiai specificitate de combinare fa de un antigen, sintetizate de organisme identice genetic, au o individualitate antigenic distinct, denumitspecificitate idiotipic.

Heterogenitatea idiotipic este consecina determinanilor idiotipici, localizai n regiunile hipervariabile ale catenelor H i L. Specificitatea idiotipic a moleculelor de anticorpi sintetizai de o clon de celule este conferit de unicitatea secvenei de aminoacizi de la nivelul secvenelor hipervariabile ce particip la formarea situsurilor de combinare, care determin epitopi cu caracter strict individual denumiiidiotopi. Unii idiotopi sunt localizai chiar n interiorul situsului de combinare sau n imediata sa vecintate. Dovada o constituie faptul c legarea epitopului specific de situsul de combinare a anticorpului, blocheaz ntr-o msur mai mare sau mai mic, legarea anticorpilor anti-idiotipici.

Fig. 14.Ilustrarea diagramatic aheterogenitiianticorpilor. Colecia de idiotopi ai situsului de combinare a unei molecule de imunoglobuline formeazidiotipulei. Idiotipul este rezultatul configuraiei spaiale unice a regiunilor hipervariabile ale catenelor H i L, conferit de o secven unic a aminoacizilor.

Repertoriul idiotipurilor este de acelai ordin de mrime cu acela al specificitii situsurilor de com-binare. Pentru situsul de combinare al moleculei de imunoglobulin s-a pro-pus denumirea deparatop.

La alctuirea idiotipului particip ambele catene. Cele dou catene disociate nu pot s lege anti-idiotipul sau l leag cu o eficien foarte sczut.

IgG Imunoglobulinele reprezint circa 20% din totalul proteinelor serice. IgG este dominant cantitativ n serul uman normal, reprezentnd 70-75% din cantitatea total de imunoglobuline. Concentraia sa medie n ser este de 1250 mg/100 ml, cu variaii individuale normale ntre 800 2000 mg/100 ml.

IgG este cea mai heterogen dintre imunoglobuline n ceea ce privete sarcina electric. Din aceast cauz, n cmpul electroforetic se distribuie n fraciile g 1 i g 2 ale serului.

Din punct de vedere structural, IgG este un monomer cu greutatea molecular de 150 kD i cu constanta de sedimentare 7S. Componenta glucidic reprezint circa 3% din greutatea molecular a IgG.

Fig. 15.Modelulstructuralal IgG1. Domeniile variabile ale celor dou catene (VH i VL) formeaz situsul de legare a antigenului.Cercurilenegre indic poziia gruprilor glucidice. HR = regiunea balama. IgG se sintetizeaz tardiv n rspunsul imun pri-mar, dar este imunoglobulina predominant arspunsului imun secundari se distribuie uniform n compartimentele intra- i extravasculare.

IgG se prezint sub forma a 4 variante antigenice, conferite de compoziia n aminoacizi a catenei g: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Proporia normal a celor 4 subclase este de 66% pentru IgG1, 23% pentru IgG2, 7% pentru IgG3i 4% pentru IgG4.

IgG3 este mai grea, datorit catenei g 3 i are o regiune balama extins, codificat de civa exoni, iar IgG4are o regiune balama scurt i rigid, ceea ce produce o nepotrivire steric pentru fixarea complementului.

IgG este singura imunoglobulin care traverseaz placenta, asigurnd astfel protecia ftului i nou-nscutului n primele luni de via. Pe membrana sinciio-trofoblastului se gsesc receptori pentru regiunea Fc a IgG, care mediaz transferul placentar al moleculei.

In vivo, funcia esenial a IgG este neutralizarea toxinelor bacteriene. IgG activeaz sistemul complement i produce liza celulelor bacteriene i a particulelor virale, dar are i rol opsonizant.In vitro, IgG particip la reaciile de aglutinare i precipitare.

Termenul de njumtire al IgG este de 21 de zile.

n toate serurile imune, o proporie de 5-15% din moleculele de IgG, pare s conste din molecule asimetrice, cu un singur situs funcional de legare (molecule monovalente). Aceste molecule nu particip la reaciile secundarein vitro(aglutinare, precipitare). Cellalt situs este blocat stereochimic de un polizaharid bogat n manoz, legat de primul domeniu constant (CH1).

IgA

Unitatea de baz a structurii IgA estemonomerul, alctuit din dou catene grele (H) cu specificitate de clas (izotipic) a i dou catene uoare (L) de tip l sau k.

Unitatea monomeric (l)2sau (a-k)2are o tendin constant de a produce structuri moleculare polimerice, formate din 2, 3, 4 sau 5 monomeri (10S, 13S, 15S, respectiv 17-18S), care n ser se gsesc n concentraii descrescnde.

La microscopul electronic, molecula de IgA monomer are aspectul literei Y. Complexele dimerice au forma a dou litere Y, aezate una n prelungirea celeilalte. Cele dou fragmente Fc formeaz un lan lung i rigid.

IgA se gsete att n plasma sanguin, ct i n secreiile externe: salivar, lacrimal, gastric vaginal, intestinal, biliar, pancreatic, lactat.

Pe baza unor diferene de structur molecular (numrul punilor S-S, secvena aminoacizilor n regiunea balama) au fost descrise dou subclase de IgA: IgA1i IgA2. Ele difer prin 22 de aminoacizi, n primul rnd datorit deleiei a 13 aminoacizi din regiunea balama a IgA2, dar care se gsesc la IgA1. Aceast diferen structural confer rezisten moleculei de IgA2la aciunea unor proteaze bacteriene, care cliveaz specific IgA1n regiunea balama.

n funcie de localizare se distingIgA sericiIgA din secreii.

Fig. 16.StructuraIgA1uman. Sunt indicate poziiile punilor disulfurice inter- i intracatenare, precum i poziia ipotetic a catenelor polizaharidice. O punte disulfuric suplimentar stabilizeaz domeniul C a 2 i o alta leag lanul J n polimerul de IgA. IgA sericeste reprezentat n primul rnd de IgA1(90%) i este monomer n proporie de 80%. Catenele L i H sunt reunite prin dou puni S-S. Subclasa IgA2reprezint numai 10% din IgA seric. Pe baza markerilor alotipici ai catenei H, IgA2se subdivide n dou variante alotipice: A2m1(la populaiile caucaziene) i A2m2(la populaiile mongoloide-negroide)

Funciile IgA seric nu sunt bine precizate, datorit dificultilor de purificare. Rolul su cel mai important ar fi acela de a ndeprta cantitile mici de antigene, provenite din alimente sau antigenele solubile ale microorganismelor, absorbite n circulaia general. Eliminarea timpurie mpiedic accesul acestor antigene la celulele sistemului imunitar i stopeaz declanarea unui rspuns imun de amploare, care ar devia forele de aprare a organismului, de la funcia sa esenial, aceea a proteciei antiinfecioase.

In vivo, IgA nu activeaz complementul pe calea clasic i nu produce liza antigenelor celulare, dar moleculele agregatein vitrode IgA1i IgA2activeaz calea altern. Funcia opsonizant a IgA este controversat. IgA nu produce reacii de precipitare cu antigenele moleculare.

IgA din secreii(sau IgA secretor) se gsete n secreia mucoaselor (digestiv, respiratorie, urinar), n secreia biliar i pancreatic. De aici deriv i denumirea sa improprie,IgA secretoare (sIgA), dei mai corect ar fi denumirea de IgA din secreii.

Fig.17.StucturasIgA1uman. Piesa secretoare, probabil este rsucit n jurul dimerului de IgA i se leag prin puni disulfurice de domeniul C a 2 al fiecrui monomer. Piesa J este amplasat la jonciunea celor doi monomeri. Puntea disulfuric ce leag domeniul C a 2 de regiunea balama nu este figurat (dup Roitt, 1984).

sIgA se gsete n special n form dimeric (80%), iar restul ca monomer sau alt tip de polimer. Compartimentul seric al IgA nu influeneaz semnificativ concentraia IgA din secreii i invers, IgA din secreii nu este absorbit n circulaie.

sIgA se sintetizeaz local, n structurile limfoide asociate mucoaselor: n mucoasa tractului respirator, dar mai ales cea nazal, a tractului digestiv (n special n mucoasa antrului piloric i a intestinului subire), n lamina propria a acinilor secretori ai glandelor salivare i mamare, n glandele lacrimale. In toate aceste structuri se gsesc numeroase plasmocite i precursorii lor. Imunizarea oral stimuleaz n primul rnd, sinteza IgA.Structura moleculei de sIgA Molecula de sIgA este alctuit din doi monomeri de IgA, legai princatena J(joining) i o caten suplimentar, denumitcomponent secretoare(CS). Formula general a sIgA dimer este (IgA)2J CS i are greutatea molecular de 385 kD i constanta de sedimentare 10S.

Complexul molecular (IgA)2J CS este foarte rezistent la proteoliz datorit conformaiei speciale dobndit dup legarea catenei J i a catenei CS, precum i datorit capacitii sale de a se lega de mucinele din secreii.

Catena Jeste un glicopeptid de 15-16 kD (136 aminoacizi) i se sintetizeaz nplasmociteleproductoare de IgA. Este bogat n acizi glutamic i aspartic i conine un oligozaharid legat de Asp din poziia 43. Conine 7-8 resturi de cistein. Lanul J se leag prin puni S-S de regiunea Fc a IgM polimeric i de sIgA. Prezena catenei J s-a stabilit la imunoglobulinele polimerice de la toate clasele de vertebrate, iar ARNm pentru catena J s-a detectat la numeroase nevertebrate. In complexele moleculare cu un grad superior de polimerizare, numai dou molecule de IgA sau IgM se leag prin intermediul catenei J, celelalte fiind legate una de alta prin puni S-S. Polimerizarea moleculelor de IgA n citoplasma celulei productoare este esenial pentru transportul lor la suprafaa mucoasei. Lanul J se gsete n citoplasma limfocitelor B, n cursul diferenierii spre plasmocit. Aproape toate limfocitele din structurile limfoide asociate mucoaselor (digestiv, respiratorie), din esutul interstiial mamar, salivar i lacrimal, exprim lanul J intracelular. Catena J este sintetizat i de unele celule care produc IgG sau IgD din aceste structuri, dar este degradat n citoplasm. Plasmocitele din mduva osoas care produc IgA sau IgG sunt negative pentru lanul J.

Componenta secretoarea sIgA este o glicoprotein din categoria betaglobulinelor, nenrudit cu imunoglobulinele, bogat n glucide (8,7%). Secvena catenei cuprinde 750 de aminoacizi, distribuii n trei domenii: domeniul citoplasmatic (103 aminoacizi), transmembranar (23 aminoacizi) i extracelular (circa 625 aminoacizi), la care se adaug o secven semnal de 18 aminoacizi, care este clivat dup sintez.

Componenta secretoare se sintetizeaz ncelulele epiteliale ale mucoaselor. Dup prelucrarea n complexul Golgi (unde are loc glicozilarea), CS migreaz pentru a fi integrat n plasmalema bazal i lateral a celulelor. Sinteza CS este independent de IgA. La noul nscut, CSse sintetizeaz n sptmna a 8-a (nainte de apariia plasmocitelor). Este prezent chiar la persoanele n ale cror secreii IgA lipsete.

Funciile componentei secretoare. Componenta secretoare are rol dereceptorpentru moleculele dim