Detección de Mutaciones

y diagnóstico prenatal

Curso de Genética Molecular

Ciencias Biológicas

Universidad de Jaén

Detección de mutaciones: Objetivos

•Detección de enfermedades hereditarias

•Detección de polimorfismos asociados a predisposición frente

a enfermedades

•Detección de polimorfismos genéticos asociados a resistencias a

•enfermedades

•Genética forense: Identificación de haplotipos específicos

•Genética de poblaciones: Caracterización molecular de

poblaciones humanas

•Farmacogenómica: Polimorfismos genéticos asociados a

respuesta diferencial a fármacos

Detección de mutaciones: Técnicas clásicas

•RFLP: Anemia falciforme

•PCR específica de alelo: Microorganismos resistentes a drogas

(usa la variante Stoeffel de la Taq polimerasa)

•ASO (Allele Specific Oligonucleotide Hybridization)

•Fluorímetro acoplado al termociclador

•Medición fluorescencia directa del tubo de

PCR

•Varios tipos de marcaje fluorescente del

producto de PCR

Específico: TAQMAN, Scorpions, etc...

Inespecífico: SYBR green

PCR en tiempo real

Detección de mutaciones: PCR en tiempo realTAQMAN

Detección de mutaciones: PCR en tiempo real, Scorpions, Molecular Beacoms

Detección de mutaciones: Fluorescent ResonanceEnergy Transfer (FRET)

Transferencia de energía dependiente de la distancia entre dos fluorocromos adyacentessin emisión de un fotón. El donador y aceptor deben estar muy próximosEl espectro de excitación del aceptor debe

solapar el espectro de emisión del donadorEl dipolo de transición del donador y aceptor

deben estar en paralelo

Detección de mutaciones: Rotura química o enzimática del heterodúplex

TCAGCAGCCG

TCGGCAGCCG

TCGGCAGTCG

TCAGCAGTCG

TCGGCAGCCG

ADN silvestremarcado

TCAGCAGTCG

ADN mutante

mezclar, desnaturalizar y renaturalizarCuatro productos posibles

Añadir un agente modificante específico de cadena simple, pe hidroxilamina (específico de C)Añadir una endonucleasa de cadena simple

sin modificación sin modificación sin modificaciónTCAGCAGCCG

Desnaturalizar, romper con piperidina y separar por gel

Silvestre Heterocigoto Mutante

Detección de mutaciones: Tm melting peak shifting (cambio temperatura desnaturalización)

Detección de mutaciones: Reacción en cadena de la ligasa

Hibridación individuos mutantes

Hibridación ADN individuos silvestres

Oligo hibridación perfectaOligo mutación interna

Secuencia de referencia

Detección de mutaciones: Microarrays de oligonucleótidos

Imagen real después de escáner

Detección de mutaciones: Single Strand ConformationPolimorphism (SSCP)

Prevención de las enfermedades genéticas

SituaciónAlgunas enfermedades genéticas pueden ser tratadas con

mayor o menor éxito, sin embargo la mayoría son incurables. El patrón de transmisión de estas enfermedades es predecible

en muchos casos

ConclusiónLa prevención es el mejor sistema para manejar las

enfermedades genéticas

La prevención incluye

Chequeo genético (screening)Consejo genético

Diagnóstico prenatal

Chequeo genético (screening)

Detección precoz de homocigotos enfermos:dependiente de test baratos, algún beneficio en el diagnóstico y

consejo genético dada la probabilidad de que otros miembros de la familia puedan estar afectados. Ejemplos: fenilcetonuria,

homocistinuria, galactosemia, fibrosis quística, hipotiroidismo y anemia falciforme.

Detección de heterocigotos portadores:Se aplica a poblaciones con una alta frecuencia de portadores y

permite el diagnóstico prenatal y la selección de hijos no enfermos. Ejemplo: Tay-Sach enfermedad incurable común en poblaciones

judías (1/20 portadores)

Chequeo genético

Extracción de sangre total y aislamiento de células mononuclearesExtracción de fibroblastos de piel a partir de biopsia

Extracción directa de ADN genómico o ARN

Análisis de mutaciones o anomalías cromosómicas

Inmortalización convirus de Epstein-Barrgeneración de líneas

celulares

Consejo genético I

¿Para quién?

Parejas con familiares afectados por una enfermedad hereditaria que desean conocer la probabilidad de tener descendencia enferma

Parejas pertenecientes a grupos o poblaciones de riesgo

Pasos previosRevisar los informes clínicos previos

Preparar un pedigrí para determinar el patrón de herencia (autosómicos dominantes, recesivos, ligados al X, anomalías cromosómicas). No puede realizarse consejo genético para

enfermedades con origen multifactorial (malformaciones congénitas, arteriosclerosis, enfermedades mentales, etc...)

Resultados:Cálculo de probabilidadesOpciones reproductivas

Casos simples:

autosómica dominante o recesiva y ligado al X, fáciles de calcular

normalmente pueden ser enfermedades muy raras

Consejo genético I I

Casos complicados:

no se heredan de manera simple y el riesgo de recurrencia se deriva

de la frecuencia de la enfermedad entre parientes (riesgo empírico),

problemas con la penetrancia, anticipación, mosaicismo de la línea

germinal, expresividad variable, fenocopias, infidelidad...

Teorema de Bayes

Probabilidad previa (PP): antecedentes de la persona

Probabilidad condicional (PC): dependientes de la edad, análisis bioquímicos o fenotipo de la descendencia

Probabilidad conjunta (PX): PC*PP

Probabilidad relativa (PR): PX de estar afectado/ PX de estar afectado+ PX de no estar afectado

Consejo genético I I I

Aplicación del Teorema de Bayes

Un hombre de 50 años de edad cuyo padre murió de Huntington deseaconocer la probabilidad de que su hijo desarrolle la enfermedad

enfermedad autosómica dominante que aparece entre los 25 y los 55 años de edad

(1/10)/(1/10+1/2)=1/6Relativa

½1/10Conjunta

11/5Condicional

½½Previa

No portadorPortadorProbabilidad

Diagnóstico genético prenatal

Diagnóstico genético prenatal

Indicaciones principales:

Edad avanzada de la madre

Padres con translocaciones cromosómicas equilibradas

Algún hijo previo con anomalías cromosómicas

Enfermedad monogénica (pareja portadora de enfermedad

hereditaria tipo error innato del metabolismo) con

marcadores genéticos disponibles

Malformaciones fetales debidas a enfermedades

monogénicas que no tienen ningún tipo de marcador

genético o bioquímico

Diagnóstico genético prenatal

Técnicas de diagnóstico prenatal

Análisis suero sanguíneo de la madre (alfa fetoproteína)

detección de defectos en el tubo neural y aneuploidías

Ultrasonografía fetal, detección de anomalías morfológicas

Toma de muestras fetales:

Células coriónicas (citogenética, marcadores

bioquímicos)

Amniocentésis (citogenética, marcadores

bioquímicos)

Biópsia fetal (piel, hígado, etc.) detección de

enfermedades hereditarias de la sangre.