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REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - SEPTEMBRE/OCTOBRE 2014 - N°465 CAHIER 2 // 15 7 es JOURNÉES SCIENTIFIQUES DE L’AFIPP Détection de « nouveaux » polyomavirus humains dans des prélèvements cervicaux de femmes infectées ou non par le VIH Kolia-Diafouka P 1,2 , Foulongne V 2, 3 , Boulle N 4 , Ngou J 2 , Kelly H 5 , Sawadogo B 6 , Delany-Moretlwe S 7 ,Mayaud P 5 , Segondy M 2,3 et le groupe d’étude HARP 1 Service des maladies infectieuses, CHU Treichville, Abidjan, Côte- d’Ivoire, 2 INSERM U1058, Montpellier, France, 3 Laboratoire de virologie et 4 Service de biopathologie cellulaire et tissulaire des tumeurs, CHU de Montpellier, France, 5 London school of hygiene and tropical medi- cine, London, UK, 6 Centre de recherche international pour la santé, Université de Ouagadougou, Burkina Faso, 7 Reproductive Health & HIV Institute,University of the Witwatersrand, Johannesburg, South Africa La présence de polyomavirus humains dans le tractus géni- tal féminin a été très peu explorée jusqu’ici. Quelques rares études ont toutefois rapporté l’association de certains poly- omavirus avec des lésions cervicales précancéreuses ou cancéreuses. Nous avons recherché la présence de « nouveaux » polyoma- virus (MCPyV, HPyV6, HPyV7 et TSPyV) dans les prélèvements cervicaux de 140 femmes africaines VIH+ enrôlées dans l’étude HARP (âge médian : 34,5 ans) ainsi que dans les prélèvements d’une population de 50 femmes métropolitaines non infectées par le VIH (âge médian : 40 ans). La prévalence des HR-HPV était de 88,6 % dans la population africaine et 48,0 % dans la population métropolitaine. La prévalence des CIN2+ était de 65,0 % dans la population africaine et 2 % dans la population métropolitaine. Les polyomavirus ont été retrouvés avec une prévalence de 55,3 % pour MCPyV, 3,2 % pour HPyV6, 2,1 % pour HPyV7 et 0 % pour TSPyV. Les charges virales étaient faibles, sou- vent à la limite de la détectabilité. Il n’a pas été observé de différences de prévalence entre les femmes africaines VIH+ et femmes métropolitaines. La présence de polyomavirus n’était associée ni à la présence de HR-HPV ni à la présence ou au grade de lésions cervicales. Les virus MCPyV, HPyV6 et HPyV7 sont donc retrouvés au niveau cervical avec une fréquence similaire à ce qui a été rapporté au niveau cutané. Ces résultats ne sont pas évocateurs d’un rôle de ces virus dans la pathologie cervicale. Détection des HPV et HPyV dans différents sites anatomiques Gheit T 1 , McKay-Chopin S 1 , Tommasino M 1 1 Centre international de recherche sur le cancer (CIRC/IARC), Lyon, France Le développement de tests sensibles et robustes pour la détection des agents infectieux est primordial pour la réalisation d’études épidémiologiques. Nous avons établi une plateforme pour la détec- tion de plus de 130 agents infectieux. Nos tests de détection com- binent deux techniques différentes : une PCR multiplexée utilisant des oligonucléotides spécifiques pour l’amplification de l’ADN viral, et la technologie Luminex (Luminex Corporation, Austin, TX). Grâce à son rendement élevé, sa grande flexibilité et sa robus- tesse, la technologie Luminex peut être utilisée pour répondre à différentes questions scientifiques posées dans des études biologiques et épidémiologiques. Nous avons montré que ces tests, hautement sensibles et spéci- fiques, sont primordiaux pour les études épidémiologiques visant à déterminer la distribution des agents infectieux (HPV, HPyV, HHV et autres) dans différents sites anatomiques, et pour l’identification de nouveaux carcinogènes potentiels. Session Polyomavirus of tumour-specific immune responses by (i) inducing in mice a less immunosuppressive environment compared to CF, (ii) promoting the optimal release and presentation of tumour antigens through the induction of immunogenic cell death. Rôle de l’épissage alternatif dans l’expression des protéines virales E6 d’HPV16 Baguet A 1 , Scalabrino M 1 , Morel A 1 , Prétet JL 1 , Mougin C 1 1 Université de Franche-Comté, EA3181, SFR – FED4234, Besançon, France Les papillomavirus de haut risque (HPV-HR), tels que HPV16, sont les agents étiologiques des cancers du col de l’utérus et sont aussi associés à d’autres cancers comme les cancers du canal anal et de l’oropharynx. Lors d’une infection persistante, la protéine virale E6 d’HPV16 dérégule de nombreux processus cellulaires conduisant à l’immortalisation et à la transformation des cellules infectées. La synthèse de la protéine E6 est réalisée par la machinerie traductionnelle de la cellule hôte à partir de transcrits polycistroniques contenant plusieurs sites cryptiques d’épissage incluant le site donneur d’épissage en position 226 (SD226) et le site accepteur d’épissage en position 409 (SA409). La présence des sites cryptiques d’épissage SD226 et SA409 chez les HPV-HR, alors qu’ils sont absents des HPV à bas risque carcinogène, suggère que l’épissage alternatif des transcrits viraux participe à la régulation de l’expression de l’oncopro- téine E6. Les transcrits viraux non épissés en SD226 et SA409 codent la protéine E6 entière (E6Fl). En revanche, l’utilisation concomitante du SD226 et du SA409 conduit à la production d’ARN codant la protéine E6*I. Le caractère oncogénique de la protéine E6 est bien connu et dépend en partie de son interaction avec la protéine cellulaire E6-AP qui conduit à la dégradation du gène suppresseur de tumeur p53. Quelques travaux réalisés sur les isoformes de E6 indiquent un effet dominant négatif de E6*I sur E6Fl. De manière intéressante, contrairement aux transcrits E6Fl, les niveaux de transcrits E6*I augmentent avec la sévérité des lésions du col de l’utérus. Cependant, le rôle fonctionnel de E6*I reste à élucider. Afin de mieux comprendre l’importance des isoformes de E6 dans le processus de carcinogenèse, des vecteurs permettant l’expression i) des protéines E6Fl et E6*I, ii) de la protéine E6Fl seule et iii) de la protéine E6*I seule ont été créés. Nos résultats corroborent ceux de la littérature et indiquent que E6Fl et E6*I ont des effets antagonistes sur les niveaux de p53 et sur certains facteurs clés du métabolisme des ARNm. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent la régulation post-transcriptionnelle des oncogènes d’HPV16 est nécessaire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques ou de nouveaux biomarqueurs diagnostiques des cancers associés aux HPV.

Détection des HPV et HPyV dans différents sites anatomiques

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Page 1: Détection des HPV et HPyV dans différents sites anatomiques

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - SEPTEMBRE/OCTOBRE 2014 - N°465 CAHIER 2 // 15

7es JOURNÉES SCIENTIFIQUES DE L’AFIPP

Détection de « nouveaux » polyomavirus humains dans des prélèvements cervicaux de femmes infectées ou non par le VIH

Kolia-Diafouka P1,2, Foulongne V2, 3, Boulle N4, Ngou J2, Kelly H5, Sawadogo B6, Delany-Moretlwe S7,Mayaud P5, Segondy M2,3 et le groupe d’étude HARP1Service des maladies infectieuses, CHU Treichville, Abidjan, Côte-d’Ivoire, 2INSERM U1058, Montpellier, France,3Laboratoire de virologie et 4Service de biopathologie cellulaire et tissulaire des tumeurs, CHU de Montpellier, France, 5London school of hygiene and tropical medi-cine, London, UK, 6Centre de recherche international pour la santé, Université de Ouagadougou, Burkina Faso, 7Reproductive Health & HIV Institute,University of the Witwatersrand, Johannesburg, South Africa

La présence de polyomavirus humains dans le tractus géni-tal féminin a été très peu explorée jusqu’ici. Quelques rares études ont toutefois rapporté l’association de certains poly-omavirus avec des lésions cervicales précancéreuses ou cancéreuses.Nous avons recherché la présence de « nouveaux » polyoma-virus (MCPyV, HPyV6, HPyV7 et TSPyV) dans les prélèvements cervicaux de 140 femmes africaines VIH+ enrôlées dans l’étude HARP (âge médian : 34,5 ans) ainsi que dans les prélèvements d’une population de 50 femmes métropolitaines non infectées par le VIH (âge médian : 40 ans). La prévalence des HR-HPV était de 88,6 % dans la population africaine et 48,0 % dans la population métropolitaine. La prévalence des CIN2+ était de 65,0 % dans la population africaine et 2 % dans la population métropolitaine.Les polyomavirus ont été retrouvés avec une prévalence de 55,3 % pour MCPyV, 3,2 % pour HPyV6, 2,1 % pour HPyV7 et 0 % pour TSPyV. Les charges virales étaient faibles, sou-vent à la limite de la détectabilité. Il n’a pas été observé de

différences de prévalence entre les femmes africaines VIH+ et femmes métropolitaines. La présence de polyomavirus n’était associée ni à la présence de HR-HPV ni à la présence ou au grade de lésions cervicales.Les virus MCPyV, HPyV6 et HPyV7 sont donc retrouvés au niveau cervical avec une fréquence similaire à ce qui a été rapporté au niveau cutané. Ces résultats ne sont pas évocateurs d’un rôle de ces virus dans la pathologie cervicale.

Détection des HPV et HPyV dans différents sites anatomiques

Gheit T1, McKay-Chopin S1, Tommasino M1

1Centre international de recherche sur le cancer (CIRC/IARC), Lyon, France

Le développement de tests sensibles et robustes pour la détection des agents infectieux est primordial pour la réalisation d’études épidémiologiques. Nous avons établi une plateforme pour la détec-tion de plus de 130 agents infectieux. Nos tests de détection com-binent deux techniques différentes : une PCR multiplexée utilisant des oligonucléotides spécifiques pour l’amplification de l’ADN viral, et la technologie Luminex (Luminex Corporation, Austin, TX).Grâce à son rendement élevé, sa grande flexibilité et sa robus-tesse, la technologie Luminex peut être utilisée pour répondre à différentes questions scientifiques posées dans des études biologiques et épidémiologiques.Nous avons montré que ces tests, hautement sensibles et spéci-fiques, sont primordiaux pour les études épidémiologiques visant à déterminer la distribution des agents infectieux (HPV, HPyV, HHV et autres) dans différents sites anatomiques, et pour l’identification de nouveaux carcinogènes potentiels.

Session Polyomavirus

of tumour-specific immune responses by (i) inducing in mice a less immunosuppressive environment compared to CF, (ii) promoting the optimal release and presentation of tumour antigens through the induction of immunogenic cell death.

Rôle de l’épissage alternatif dans l’expression des protéines virales E6 d’HPV16

Baguet A1, Scalabrino M1, Morel A1, Prétet JL1, Mougin C1

1Université de Franche-Comté, EA3181, SFR – FED4234, Besançon, France

Les papillomavirus de haut risque (HPV-HR), tels que HPV16, sont les agents étiologiques des cancers du col de l’utérus et sont aussi associés à d’autres cancers comme les cancers du canal anal et de l’oropharynx. Lors d’une infection persistante, la protéine virale E6 d’HPV16 dérégule de nombreux processus cellulaires conduisant à l’immortalisation et à la transformation des cellules infectées. La synthèse de la protéine E6 est réalisée par la machinerie traductionnelle de la cellule hôte à partir de transcrits polycistroniques contenant plusieurs sites cryptiques d’épissage incluant le site donneur d’épissage en position 226 (SD226) et le site accepteur d’épissage en position 409 (SA409). La présence des sites cryptiques d’épissage SD226 et SA409 chez les HPV-HR, alors qu’ils sont absents des HPV à bas risque

carcinogène, suggère que l’épissage alternatif des transcrits viraux participe à la régulation de l’expression de l’oncopro-téine E6. Les transcrits viraux non épissés en SD226 et SA409 codent la protéine E6 entière (E6Fl). En revanche, l’utilisation concomitante du SD226 et du SA409 conduit à la production d’ARN codant la protéine E6*I. Le caractère oncogénique de la protéine E6 est bien connu et dépend en partie de son interaction avec la protéine cellulaire E6-AP qui conduit à la dégradation du gène suppresseur de tumeur p53. Quelques travaux réalisés sur les isoformes de E6 indiquent un effet dominant négatif de E6*I sur E6Fl. De manière intéressante, contrairement aux transcrits E6Fl, les niveaux de transcrits E6*I augmentent avec la sévérité des lésions du col de l’utérus. Cependant, le rôle fonctionnel de E6*I reste à élucider. Afin de mieux comprendre l’importance des isoformes de E6 dans le processus de carcinogenèse, des vecteurs permettant l’expression i) des protéines E6Fl et E6*I, ii) de la protéine E6Fl seule et iii) de la protéine E6*I seule ont été créés. Nos résultats corroborent ceux de la littérature et indiquent que E6Fl et E6*I ont des effets antagonistes sur les niveaux de p53 et sur certains facteurs clés du métabolisme des ARNm. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent la régulation post-transcriptionnelle des oncogènes d’HPV16 est nécessaire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques ou de nouveaux biomarqueurs diagnostiques des cancers associés aux HPV.

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La plateforme a été validée et a permis l’établissement de nombreuses collaborations entre le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC/IARC) et des scientifiques du monde entier.

Caractéristiques du polyomavirus de Merkel dans des lignées de carcinome à cellules de Merkel au cours du temps

Molet L1, Cantero-Brassart L1, Chantot-Bastaraud S2, Nicco C1, Vallette B2, Valent A3, Siffroi JP2, Batteux F1, Rozenberg F1

1Institut Cochin – UMRS 1016, Stress oxydant, prolifération cellulaire et inflammation, Paris, France, 2 Service de génétique et d’embryolo-gie médicales, Hôpital Armand-Trousseau, AP–HP, Université Paris VI, Paris, France, 3 Institut de cancérologie Gustave-Roussy, Villejuif, France

Le carcinome à cellules de Merkel est une tumeur neuroendocrine cutanée du sujet âgé ou immunodéprimé. Le génome du Polyomavirus de Merkel (MCPyV) est présent dans la majorité des MCC étudiés à ce jour. De plus, l’intégration clonale du génome viral, la présence de mutations dans la séquence codant l’antigène LT, analogue de pro-téines oncogènes des Polyomavirus, et l’expression d’un Ag LT tron-qué suggèrent l’implication du virus dans l’oncogenèse. Cependant une minorité de MCC est dépourvue de génome MCV. Ce phénomène pourrait s’expliquer par un mécanisme « hit and run », où le virus via l’expression de la protéine LT induirait la tumorigenèse, puis l’acqui-sition d’aberrations chromosomiques dans les cellules transformées permettrait à la fois de s’émanciper de l’expression de l’antigène LT et d’éliminer le génome viral.Trois lignées cellulaires ont été établies à partir de tissus MCC provenant de deux patients. L’intégration du génome MCPyV a été démontrée dans les trois lignées en phase précoce de culture. Dans la lignée gan-glionnaire métastatique du premier patient, l’intégration et l’expression de la protéine LT ont persisté après plusieurs mois en culture, les cellules injectées par voie sous cutanée à la souris scid-nod-gamma ont reproduit des tumeurs conservant ces mêmes caractéristiques au long cours. Malgré la perte en quelques semaines du génome viral de la lignée tumorale du second patient, la tumorigenèse des cellules injectées à la souris était conservée voire accrue par rapport au modèle précédent. Deux modèles d’oncoge-nèse ont donc été établis : le premier illustre l’oncogenèse dépen-dante de l’expression de l’Ag LT du MCPyV, tandis que le second semble illustrer l’oncogenèse de type « hit and run » où le génome viral initie la transformation cellulaire puis est éliminé.

Caractérisation des interactions entre les cellules dendritiques myéloïdes humaines et le BKPyV

Sikorski M1,3,4, Tang TL2,3,4, McIlroy D2,3,4, Bressollette-Bodin C2,3,4, Touze A5, Halary F1,3,4

1 UMR1064 INSERM/Center for research in transplantation and immuno-logy, Institute for transplantation, urology and nephrology (ITUN), Nantes, France, 2EA 4271, Nantes, France, 3Université de Nantes et 4CHU Hôtel-Dieu, Nantes, France, 5UMR INRA 1282, Nouzilly, France

Le polyomavirus BK (ou BKPyV) est un virus ubiquitaire infectant de manière asymptomatique 80 % de la population pendant l’enfance. Suite à la primo-infection, il entre en phase de réplication à bas bruit dans les epithelia réno-urinaires. Suite à une transplantation, la prise d’un traitement immunosuppresseur diminue les réponses immuni-taires et donc le contrôle des infections virales notamment. Dans ce contexte, le BKPyV se comporte en pathogène opportuniste et se réplique activement dans le rein. Cette infection active peut en outre induire le développement d’une néphropathie évolutive, la néphro-pathie associée aux polyomavirus ou PVAN, caractérisée par une virémie et pouvant conduire au rejet du greffon. La gravité de cette atteinte rénale a été corrélée à l’établissement de cette virémie, dont la cause reste mal connue. Ainsi, le BKPyV est reconnu comme une cause infectieuse majeure de rejet de greffe. Basé sur des propriétés des cellules dendritiques (DC) aujourd’hui bien décrites, telles que la capacité à protéger des virus en surface et à les transmettre à d’autres cellules, et l’observation de DC à proximité immédiate des sites de réactivation du virus dans le rein normal, notre hypothèse est que les DC sont capables de capter le BKPyV et de le transporter avec elles dans l’organisme, favorisant l’établissement de la virémie. Notre groupe a ainsi pu démontrer par cytométrie de flux et par imagerie confocale, que des particules virales infectieuses, mais également des pseudo-particules (VLP), peuvent être capturées spécifiquement par des cellules dendritiques myéloïdes (mDC) in vitro. En outre, nous avons également démontré que la protéine VP1, composant majeur de la capside, était incapable d’activer les mDC. Enfin, nous avons montré que le virus capturé par les mDC peut être transmis à des cellules épithéliales tubulaires rénales très susceptibles à l’infection BKPyV. En conclusion, nous pouvons dire que cette interaction entre des particules infectieuses de BKPyV avec notre modèle de mDC est décrite pour la première fois. Elle doit être confirmée dans d’autres modèles et approfondie. Nous envisageons en collaboration avec les néphrologues nantais d’investiguer le rôle de ces cellules dans les greffons de reins humains après transplantation.

Implication des HPV dans la carcinogenèse cutanéeAubin FUniversité de Franche-Comté, EA3181, SFR FED 4234 et Centre hospi-talier universitaire, Service de dermatologie, Besançon, France

Alors que le rôle carcinogène des HPV béta cutanés de type 5 et 8 est bien établi dans l’épidermodysplasie verruciforme, l’impli-cation des HPV béta cutanés dans la carcinogenèse cutanée reste discutée. Sur le plan sérologique, il existe une association statistique significative entre la présence d’anticorps anti-HPV de type bêta et la présence de carcinome épidermoïde. Sur le

Session Dermatologie

plan épidémiologique, de nombreux travaux ont mis en évidence la présence d’ADN d’HPV dans une forte proportion de cancers épithéliaux cutanés, en particulier les carcinomes épidermoïdes. La prévalence de la détection de l’ADN d’HPV bêta dans les carcinomes épidermoïdes des sujets immunocompétents ou immunodéprimés (greffés rénaux, infection par le VIH) varie de 50 à 90 % des cas, selon les techniques de détection et selon les localisations anatomiques et géographiques des patients. De plus, la prévalence génomique virale est similaire à celle de la peau saine ou des sourcils et à celle des lésions précancéreuses épithéliales. Enfin, la prévalence de l’ADN d’HPV bêta est plus importante dans les couches superficielles (stratum corneum)