DETEKSI DNA

Kualitatif

•Elektroforesis•Staining•Sequencing•Hibridisasi•Blotting (Southern dan Northern Blotting)

Kuantitatif

•Microarray•PCR (Polymerase Chain Reaction)•Spektrofotometri UV-Vis

Metode Analisis

Analisis KualitatifElektroforesis

Elektroforesis adalah proses migrasi molekul bermuatan di dalam media yang bermuatan listrik. Kecepatan migrasinya tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk setiap molekul yang terlibat. Elektroforesis biasanya menggunakan gel sebagai tempat untuk migrasi molekul.Perbedaan molekul menyebabkan terjadinya pemisahan. Kecapatan molekul untuk bermigrasi: molekul kecil > molekul besarTerdapat beberapa jenis elektroforesis yang telah dapat digunakan untuk menganalisis makromolekul termasuk asam nukleat. Beberapa diantaranya adalah elektroforesis gel agarosa, elektroforesis gel poliakrilamida, elektroforesis gel 2D, dan elektroforesis isoenzim. Metode elektroforesis gel agarosa merupakan metode yang paling umum (konvensional) yang dapat digunakan untuk menganalisis asam nukleat.

STAINING Metode staining digunakan untuk

visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel elektroforesis.Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan keperluan ini, beberapa diantaranya adalah etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, dan Eva Green.

SEQUENCING Sequencing adalah penentuan urutan

basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetik dari molekul DNA.

Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA. Metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger.

METODE MAXAM GILBERT Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode

kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.

Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

METODE SANGER Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu

subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.

Sekuensi DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama.

METODE HIBRIDISASI Hibridisasi asam nukleat adalah proses

dimana 2 DNA atau RNA rantai tunggal yang berasal dari sumber induk yang berbeda, untuk membentuk konfigurasi urutan ganda.

Urutan nukleotida yang berasal dari 2 induk yang berbeda bersifat komplementer.

Hibridisasi dapat dilakukan dengan pasangan DNA-DNA, RNA-RNA or DNA-RNA.

Hibridisasi (molecular probe) bertujuan untuk mengidentifikasi atau untuk mengetahui lokasi dari beberapa asam nukleat dalam susunan gen pada makhluk hidup.

SOUTHERN BLOTTING Southern Blotting adalah metode untuk menganalisis urutan DNA

tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui aksi kapiler. Membran tersebut kemudian dikenakan probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan DNA sampel.

Gambar 6. Ilustrasi tahapan metode Southern Blotting Metode ini digunakan untuk memindahkan protein DNA ke suatu

pengangkut sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel elektroforesis. Southern blot berkombinasi dengan elektroforesis gel agarosa untuk separasi ukuran DNA.

Southern blotting digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA, evolusi dan studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme. blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan danuntuk mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang mengalami perubahan.

NORTHERN BLOTTING Northern Blotting digunakan untuk menganalisis urutan RNA (RNA

sequence) tertentu diantara kumpulan molekul RNA. Pada dasarnya metode ini adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak RNA hadir dalam sampel yang berbeda.

Langkah pertama dari metode ini adalah denaturasi atau pemisahan RNA di dalam sampel menjadi rantai tunggal. Hal ini memastikan bahwa rantai RNA tidak dalam posisi terlipat dan tidak terdapat ikatan diantara rantai molekul. Selanjutnya molekul RNA dipisahkan berdasarkan ukuran melalui metode gel elektroforesis. Setelah pemisahan, RNA ditransfer dari gel ke blot membran. Setelah itu membran dilalui proses probe, DNA atau RNA yang digunakan pada proses ini dipastikan harus memiliki urutan yang sesuai dengan urutan sampel. Dengan begitu, probe dapat terhibridisasi atau terikat pada pecahan RNA di membran. Setelah hibridisasi, probe mengizinkan molekul RNA yang diinginkan dapat terdeteksi diantara molekul RNA lainnya pada membran.

Analisis Kuantitatif

Microarray adalah salah satu metode untuk meneliti ekspresi seluruh genom. Salah satu contoh Microarrays adalah Microarray DNA atau gene chip. Microarray DNA terdiri dari berbagai macam fragmen DNA beruntai tunggal dalam jumlah sedikit merepresentasikan gen yang berbeda-beda, difikasasi ke kaca objek dalam array, atau kisi-kisi, yang berjarak sempit.

Microarray

Metode ini dapat menguji ribuan gen secara bersamaan untuk menentukan gen mana yang diekspresikan dalam jaringan tertentu, lingkungan yang berbeda, berbagai penyakit, ataupun tahap perkembangan yang berbeda.

Metode ini dapat menguji ribuan gen secara bersamaan untuk menentukan gen mana yang diekspresikan dalam jaringan tertentu, lingkungan yang berbeda, berbagai penyakit, ataupun tahap perkembangan yang berbeda.

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) PCR adalah suatu metode untuk

memperbanyak DNA secara in Vitro saat sumber DNA hanya sedikit atau tidak murni. Dalam teknik ini, segmen sasaran spesifik apapun dalam satu atau lebih molekul DNA dapat diperbanyak berkali-kali. PCR mempunyai kelebihan yaitu lebih cepat dan lebih efektif. Dikatakan PCR lebih cepat karena metode ini mampu membuat miliaran salinan segmen sasaran DNA dalam waktu beberapa jam, tidak seperti metode pustaka DNA. Ibaratnya PCR bagaikan memfotokopi satu halaman saja, bukan memeriksa setiap buku dalam perpustakaan.

Tahap-tahap PCRDenaturasiPada tahap ini molekul DNA dipanaskan

sampai suhu 94 oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

Penempelan (Annealing) Enzim Taq polimerase dapat memulai

pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 0C selama 30-60 detik.

Pemanjangan (Ektension) Setelah primer menempel pada untai DNA target,

enzim DNA polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.

Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial (Marks Dawn, et al., 2000).

REAL TIME PCR Real Time PCR adalah suatu teknik

pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.

Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa.

Analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda).

Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis, DNA murni dapat

menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada λ 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada λ 280 nm. Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi λ 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi λ 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0. Serta untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut:

Metoda standar yang digunakan untuk identifikasi, separasi dan purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel agarosa. Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konformasi molekul DNA, konsentrasi agarosa, arus listrik dan temperatur. Pewarna Ethidium Bromide (EtBr) digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. EtBr ini akan terikat diantara dua untai ganda DNA, sehingga band/pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar, karena pewarna ini mengandung zat fluoresence. EtBr dapat diberikan pada setiap sampel yang akan dimasukkan ke sumuran gel atau dicampurkan ke gel agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel. Intensitas fluoresence dapat diukur dengan menggunakan DNA marker standar, sehingga dapat diperkirakan kuantitas DNAnya, misal antara 0.50 sampai 20 ug/mL.