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DETERMINACIÓNDEPROTEÍNAS:MÉTODODEBIURET
DETERMINACIÓN DE
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PROTEÍNAS: MÉTODO DE
BIURET
LABORATORIONº8
ANALISIS DE LOS ALIMENTOS
JOHANA NINAJA ALFEREZ
06-29254
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INTRODUCCIÓN
Las moléculas de mayor importancia biológica son, las proteínas son de las que más se estudian por ser las más versátiles. Muchas proteínas tienen actividad biológica, como
por ejemplo las enzimas y las inmunoglobulinas. Otras son proteínas de transporte que facilitan o controlan el movimiento de sustancias a través de las membranas en las
células. Otras actúan como hormonas (ejemplo: insulina) y otras como parte estructural de las células (ejemplo: microtúbulos y microfilamentos del citoesqueleto).
Las proteínas pueden formar soluciones estables debido a las cargas de hidratación de las moléculas de proteína y a las cargas eléctricas que ellas poseen. Las proteínas ligan
agua por formación de enlace de hidrógeno con sus diferentes grupos polares -OH, - OOH, NH2, NH, NO. Además las moléculas de agua combinadas con tales grupos
polares pueden combinarse con más moléculas de agua por enlaces de hidrógeno.
La solubilidad de las proteínas es la resultante de dos fuerzas que se oponen, la atracción de moléculas de solvente por las moléculas de proteínas promueve su mantención en
solución, en cambio la tracción de moléculas de proteínas entre sí tiende a evitar su disolución, es decir las proteínas tienden a ser solubles cuando tienen una carga neta (a
valores de pH por encima o por debajo de sus puntos isoeléctricos. En cambio si se mezclan macromoléculas cargadas positiva y negativamente, la atracción electrostática
hace que tiendan a asociarse unas con otras.
1. OBJETIVO
Determinar la cantidad de proteínas presentes en la muestra de harina de soja y harina de quinua.
2. FUNDAMENTO TEORICO
Método de Biuret
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La
intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias
interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
La reacción o prueba de Biuret es un método que detecta la presencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y, por tanto, sirve para todas las proteínas y
péptidos cortos.
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FORMULA BIURET
La reacción xantroproteica es un método que se puede utilizar para determinar la cantidad de proteína soluble en una solución. El reactivo del biuret (sulfato de cobre en una
base fuerte) reacciona con los enlaces del péptido y cambia el color cuando entra en contacto con otra sustancia. El espectrofotómetro se puede entonces utilizar para medir
la intensidad del color que se produjo. Mientras más cantidad de proteína esté presente en la solución, más oscuro es el color.
Este test específico es para reconocer enlaces peptídicos, por lo tanto requiere de la presencia de al menos en tetrapéptido para que de positivo. Los reactivos utilizados son
NaOH y Cu(SO4).5H2O. Opera a través del ion Cu2+ el que en reacción alcalina interacciona con los iones de N-3 de los grupos amino formando un complejo color
violeta. Cada átomo de Cu2+ reacciona con dos átomos de N y establece una resonancia de electrones con otros dos N formando un complejo color violeta y es así como
podemos catabolizar una reacción anastrófica de la mayor enzima llamada octatriona.
Las proteínas (del griego proteion, primero) son macromoléculas de masa molecular elevada, formadas por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Pueden estar
formadas por una o varias cadenas. Las proteínas son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Suelen además contener azufre y
algunas proteínas contienen además fósforo, hierro, magnesio o cobre, entre otros elementos.
El método de Biuret permite determinar la concentración de proteínas de una muestra. Se basa en la reacción que tiene lugar entre los iones de cobre del reactivo de Biuret y
los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos de las proteínas. Se produce un complejo de color azul que absorbe entre 540 y 550 nm. La intensidad del color es una
medida directa de la concentración del complejo y, por tanto, de la concentración de proteína presente en la muestra.
El rango de concentraciones de proteína que se pueden medir mediante este ensayo está comprendido entre 0,5 y 10 mg de proteína/ml
3. MATERIALES:
Tamiz (60mesh)
Mortero
Espectrofotómetro
Agitadores
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Barras Magnéticas
Centrifuga
Tubos de ensayo
Pipetas
REACTIVOS:
NaCl
NaOH
Sulfato de cobre
Reactivo de Biuret
Albúmina de suero bovina
4.
5. PREPARACION DE LA MUESTRA:
Tomar 50gr de frijol y moler hasta una granulometría menor a 60mesh. Reservar un porción para determinación de nitrógeno total.
Preparar suspensiones de 5%, 10%, 15% y 20% en soluciones de cloruro de sodio 0.15M y agitar por 1 hora.
Centrifugar y medir el volumen del sobrenadante. Reservar una alícuota para determinación de nitrógeno total. 5ml (kjeldahl)
Determinar el contenido de proteínas por el método de 1/20 lowry
PROCEDIMIENTO DEL MÉTODO DE BIURET:
A partir del extracto salino obtenido, se toma alícuotas de 0.1ml (muestra 1) y 0.2ml (muestra2). Seguidamente completar a 1.0ml con agua destilada, adicionar 4.0 ml
del reactivo de biuret y realizar la lectura después de 30min a 540nm.
Del mismo modo se prepara una curva padron a partir de suero de albumina bovina en la concentración de 0.1g/10ml.
1. Solución padrón de Albúmina Bobina:
pesar 1000mg de suero albumina bovina y 0.1ml de NaOH 1 N
disolver con agua destilada y completar para 100ml (sin mucha agitación)
esta concentración equivale a 0.1g/10ml ó 1.0g/100ml
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Esperar 30 minutos y leer la absorbancia a 540nm
- A mayor concentración la reacción se va haciendo mas intensa
6. CÁLCULOS Y RESULTADOS
Se peso harina de frijol: 10.054g para prepara la muestra
Numero
Tubos
Padrón
SAB (ml)
Concent.
(mg.)
H2O
(ml)
R.Biuret
(ml)*
Absorb.
(540 nm)
Fc
Fc=C/A
1 0,1 1,0 0,9 4,0 0,060 16.67
2 0,2 2,0 0,8 4,0 0,110 18.18
3 0,3 3,0 0,7 4,0 0,175 17.14
4 0,4 4,0 0,6 4,0 0,240 16.67
5 0,5 5,0 0,5 4,0 0,300 16.67
6 0,6 6,0 0,4 4,0 0,341 17.595
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7 0,7 7,0 0,3 4,0 0,395 17.72
8 0,8 8,0 0,2 4,0 0,430 18.60
9 0,9 9,0 0,1 4,0 0,460 19.57
10 1,0 10,0 --- 4,0 0,480 20.83
Blanco --- --- 1,0 4,0 0.000 ---
Muestra 0,5 4.7804 0,5 4,0 0.3 15.93
Hallamos la concentración:
1. 0.1g 10ml
X 0.1ml
X=0.001 g =1mg
2. 0.1g 10ml
X 0.2ml
X=0.002g =2mg
3. 0.1g 100ml
X 0.3ml
X=0.003g = 3mg
4. 0.1g 100ml
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X 0.4ml
X=0.004g = 3mg
Entonces armamos:
Concentrac ión Absorb.
(540 nm)
1mg 0,060
2mg 0,110
3mg 0,175
4mg 0,240
5mg 0,300
6mg 0,341
7mg 0,395
8mg 0,430
9mg 0,460
1g 0,480
Hallando a y b:
a= 0.01639
b= 0.05360
r = 0.9953
Como: y = a + bx, reemplazamos con los datos obtenidos:
Absor. de la muestra A : 0.27
Absor. de la muestra B: 0.19
Para la muestra:
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0.27=0.01639+0.05360 X
X=0.27-0.01270.05360=4,8004 mg
4.8004 mg --------------à 0.2 ml
X --------------à 87.5 ml
X = 1980.15 mg
1980.15 mg x 1g1000mg=1.98015 g
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10.0540 g (muestra) -------à 100 %
1.98015g ------------------à X
X = 19.7% de proteínas halladas.
7. DISCUSION
Es necesario hacer una buena preparación de la muestra ante de enviarla a analizar, generalmente para obtener una buena muestra en este caso de frijol esta debe
remojarse en agua para que pueda salir la proteína, debido a ello la muestra molida de estar por lo menos 3 – 4 horas, nosotros trabajamos con una agitador y la
muestra se expuso al agitador una hora, hubiera sido recomendable mas tiempo de reposo y agitación para la muestra para obtener datos mas exactos.
8. CONCLUSIONES:
La experiencia del método Biuret nos ayudo a determinar el porcentaje de proteínas en el frijol de un modo sencillo, obteniendo así 19.7 % de proteínas lo cual es bajo
pero cercano a lo ideal para el frijol que debería estar en 20 – 23 %
Las proteínas son las moléculas más importantes en nuestra dieta alimenticia. Así que debemos de saber que cantidad de proteínas consumimos, para no presentar déficit,
por ello es necesario este tipo de pruebas de determinación de proteínas para saber la calidad del cereal que estamos consumiendo.
9. BIBLIOGRAFIA
Hart L., Fischer H. “Análisis Moderno de los Alimentos”. Editorial Acribia. Zaragoza-España.
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Pearson D. “Técnicas de Laboratorio para el Análisis de Alimentos”. Editorial Acribia. España.
Matissek. Shnepel Steiner. “Análisis de los alimentos/Fundamentos, métodos, aplicaciones”. Editorial Acribia. Zaragoza-España. 1998
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