Diagnosticul de laborator al infec ţiilor produse de ... ?· Diagnosticul de laborator al infec ... examene evitându-se, de exemplu, darea în consum a unor produse animaliere care pot

  • Published on
    04-Feb-2018

  • View
    216

  • Download
    1

Embed Size (px)

Transcript

  • Voichioiu et al. Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

    Vol. 9(1) Mai - Iunie 2015

    24

    Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de stafilococi la cine

    Laboratory diagnosis of infections caused by staphylococci in dogs

    Vili Robert Voichioiu, Viorel Herman, Janos Degi Facultatea de Medicin Veterinar Timioara

    Coresponden: vilirobert@yahoo.com

    Cuvinte cheie: Staphylococcus spp., ghid practic, infecii Key words: Staphylococcus spp., practical guide, infections

    Rezumat n prezentul referat bibliografic este destinat educaiei continue a specialitilor din domeniu. Sunt prezentate metodele utilizate in diagnosticul de laborator al diverselor infecii produse de stafilococi. Autorii prezint n detaliu metodele de recoltare a probelor, modul n care se realizeaz transportul, dar i totalitatea examenelor de laborator, unele executndu-se fr prea mult dificultate, chiar i n condiii de teren, punnd accent pe testele de biologie molecular. Foarte importante sunt i cele dou subcapitole n care se discut diferenierea stafilococilor de alte familii de bacteria, dar i rezistena primilor amintii la antibiotic, o problem de actualitate n medicina modern.

    Abstract In this review destined for education of specialists in the field are presented methods used in the laboratory diagnosis of various staphylococcal infections. The authors present in detail the methods of sampling, how the samples are transportated, and all laboratory tests, from which, some are done without too much difficulty, even in field conditions, focusing on molecular biology tests. Very important are the two chapters in which are discussed the differentiations between staphylococcus and other bacteria families, but also the antibiotic resistance of the staphilococcuci, a problem of modern medicine current year.

    1.Introducere Stafilococii sunt considerai germeni

    ubicvitari, de forma rotund, gram-pozitivi dispui n grmezi neregulate cu aspect de ciorchine (staphylos), cu variaii n dimensiuni, comensali ai pielii i mucoaselor la animale i om, ns, curent, se izoleaz i din sol, aer i ap [6, 7, 28, 29, 31 36].

    Se mai pot gsi, n numr foarte mare n atmosfera ncperilor locuite, n adposturile de animale, pe diferite obiecte i utilaje. Frecvent sunt izolai din produsele alimentare precum i din finurile animale [6, 7, 10, 19 28, 29, 31, 37].

    Stafilococii sunt inclui n familia Staphylococcaceae, genul Staphylococcus, pn n prezent n acest gen sunt recunoscute 71 de specii [14]. n comparaie cu alte specii nesporulate, rezistena fa de factorii de mediu a stafilococilor este mai mare.

    Majoritatea celulelor bacteriene sunt distruse la 60C n 30 minute, la 70C n 15 min, unele celule rezistnd chiar pn la 80C.

    Stafilococii sunt sensibili fa de numeroase antibiotice precum: penicilina, tetraciclin, eritromicin, cloramfenicolul, neomicina, dar genereaz frecvent variante antibiotico rezistente [28, 29, 31, 38].

    Stafilococii prezint sensibilitate la foarte muli bacteriofagi, fapt care a permis segmentarea lor n lizotipuri.

    Lizotipia i-a fcut loc n practica curent a diagnosticului infeciilor cu stafilococi la om, mai ales n scopul stabilirii sursei de infecie i a filierei epidemiologice.

    Setul internaional de fagi, utilizat n bacteriologia uman, a fost adoptat i pentru stafilococii de origine animal, adugndu-se i fagii specifici pentru stafilococii bovini, pe care i-a propus Davidson n 1965 [6, 7, 29, 31, 39, 40].

  • Voichioiu et al. Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

    Vol. 9(1) Mai - Iunie 2015

    25

    Totalitatea infeciilor ce sunt produse de bacteriile incluse n genul Staphylococcus, au primit generic denumirea de stafilococii, putnd apare ca infecii supurative localizate sau boli infecioase bine conturate epidemiologic i morfoclinic [21, 22, 24, 41].

    Pentru a putea diagnostica stafilocociile animalelor se vor utiliza mai multe examene, respectiv: epidemiologic, clinic, anatomo-patologic i de laborator.

    Prin examenele de laborator se confirm aceste infecii i se pun n eviden caracterele fenotipice i genotipice ale stafilococilor izolai de la animale i oameni.

    Prin intermediul testelor de biologie molecular, n ultimii ani, au fost detectate mai multe gene care guverneaz fie sinteza unor factori de patogenitate, fie rezistena la antibiotice, detandu-se ca importan gena mec, care guverneaz rezistena la meticilin, stafilococii meticilin-rezisteni fiind considerai bacterii cu risc zoonotic [9, 10, 42].

    1.1. Examenul bacteriologic

    Examenul bacteriologic presupune

    izolarea, cultivarea i identificarea germenilor bacterieni din diferite produse patologice suspecte.

    Spre deosebire de examenul microscopic, care permite decelarea prezenei agentului etiologic, metodele bacteriologice complexe permit, pe lng izolare i cercetarea diferitelor nsuiri biologice care caracterizeaz agentul patogen, pe baza crora se poate afirma cu certitudine natura procesului patologic, putnd apoi orienta corect msurile terapeutice de combatere n focar i de profilaxie.

    Aceste aspecte au o deosebit importan epidemiologic, prin intermediul acestor examene evitndu-se, de exemplu, darea n consum a unor produse animaliere care pot provoca la om infecii sau toxiinfecii, uneori cu evoluie grav [40].

    Izolarea i identificarea agentului etiologic, din infeciile stafilococice se realizeaz prin examen bacteriologic.

    i n cazul infeciilor stafilococice, examenul bacteriologic se execut ca o metod complementar care ajut la

    precizarea diagnosticului, prin coroborarea cu rezultatele examenului epidemiologic i clinic [37, 40].

    1.1.1. Prelevarea

    probelor de material patologic

    Recoltarea trebuie s se realizeze naintea administrrii de antibiotice i cu respectarea riguroas a regulilor de antisepsie, att n ceea ce privete hemocultura, LCR, lichidul articular, urina, dar i n cazul secreiilor purulente, aspiratul bronic, exsudatele faringiene i nazale i totodat trebuie s fie fcut de medicul veterinar, sau sub controlul acestuia i numai n cazuri speciale direct de ctre proprietari, efi de ferm etc., cu respectarea ntocmai a recomandrilor date de personalul de specialitate [29, 31].

    Cel mai mare risc este reprezentat de contaminarea accidental a prelevatelor cu tulpini de S. aureus i S. epidermidis prezeni la nivelul pielii.

    Pentru diagnosticul stafilocociilor, n general, se recolteaz probe care vor fi expediate la laborator dup cum urmeaz:

    de la cini si pisici cu piodermatite, dermatite stafilococice, otite, conjunctivite, infecii genitale, pododermatite se recolteaz probe de pe piele, pr, mucoase conjunctival, genital (secreii auriculare, genitale, conjunctivale, exsudate din papule, pustule, secreii purulente, cruste) sau probe de snge, pentru determinarea toxinogenezei [9, 42].

    Materialele patologice utilizate pentru diagnosticul de laborator al diferitelor boli la animale sunt foarte diversificate n funcie de natura afeciunii, de faza evolutiv n care se afl, n funcie de starea animalului de la care provin i de posibilitile materiale de examinare [9, 42].

    Pentru examenul bacteriologic, dar i bacterioscopic se pot recolta:

    snge att pentru examinarea sub form de frotiuri colorate prin metodele Gram sau Giemsa, ct i pentru hemocultur, recoltat prin puncie venoas, dup o

  • Voichioiu et al. Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

    Vol. 9(1) Mai - Iunie 2015

    26

    prealabil asepsie. Se recolteaz 5 - 10 ml snge, n funcie de specie i talia animalului, n eprubete sterile cu anticoagulant sau cu perle de sticl. Trebuie asigurat o proporie optim a sngelui fa de mediul de nsmnare, pentru a satisface, pe de o parte, neutralizarea efectului bactericid al sngelui i pe de alt parte, condiiile nutritive proprii unei dezvoltari optime. Aceast proporie este de 1/20, 1/30. Pentru a se realiza blocare aciunii fagocitare a lecucocitelor coninute n sngele nsmnat se poate recurge i la un adaos de saponin n proporie de 2%. n caz c animalul de la care provine sngele de examinat a fost supus unui tratament cu penicilin sau sulfamide, este necesar s se adauge 5 mg acid paraamino-benzoic la 100 ml mediu care s neutralizeze efectul inhibitor al acestora. Se poate realiza hemocultura i din snge coagulat. Transportul sngelui pentru nsmnare trebuie s se realizeze ntr-un timp ct mai scurt. Incubaia se va face la 37 C i eventual n atmosfer mbogit cu CO2, se urmrete circa 1 lun, practicdu-se periodic subculturi [7, 9, 19, 42].

    lichid cefalorahidian se poate recolta cu ace de sering sterile, n eprubete sterile pe un anticoagulant (ex. heparina), se vor realiza frotiuri din sedimentul lichidului cefalorahidian care vor fi colorate Gram sau Giemsa. Cel puin 0,5 ml de lichid cefalorahidian se nsmneaz n bulion glucozat i pe plci cu geloz cu snge [7, 19, 9, 42].

    urina trebuie recoltat n recipiente sterile. De la femele se va realiza recoltarea prin cateterism, n acest fel evitndu-se ca germenii de pe cile urinare s falsifice rezultatele examenului. Urocultura este de dorit s se efectueze i ea ct mai rapid dup recoltare. Frotiurile vor fi colorate Gram sau Giemsa. Deasemenea, se vor nsmna, direct 3-4 picturi de urin luate cu pipeta Pasteur, pe suprafaa

    unei plci cu geloz simpl i una cu geloz cu snge, dup care se disperseaz cu ansa pe toat suprafaa mediului de cultur.Se repet procedura i cu sedimentul obinut prin centrifugarea a 10 ml urin timp de 10 minute la 3000 turaii/min [29].

    secreiile (oculare, nazale, vaginale, otice, etc.) vor fi recoltate cu tampoane sterile pregtite pentru acest scop. Se efectueaz frotiuri colorate Gram i Giemsa. Pentru examenul bacteriologic, nsmnarea se efectueaz direct cu tamponul cu care s-a fcut recoltarea, att pe mediul lichid ct i pe cel solid. Tampoanele mai pot fi splate n ser fiziologic steril din care ulterior se fac nsmnrile pe aceleai medii [29].

    lichidele patologice de puncie se vor recolta asemntor cu sngele, n eprubete sau recipiente sterile. Frotiurile realizate vor fi colorate Gram i Giemsa. nsmnarea va fi direct, fie se ateapt s apar sedimente din care ulterior se fac nsmnri [7, 19].

    materiile fecale vor fi recoltate n vase sterile urmnd ca nsmnarea s se fac n timpul cel mai scurt. Se nsmneaz direct pe medii de cultur.

    organele cu leziuni vor fi trimise la laborator, preferabil ntregi sau fr a fi scoase din cadavrul respectiv, pentru ca nsmnarea s se fac n cele mai bune condiii;

    1.2. Transportul probelor

    1.2.1. Condiiile de ambalare i transport

    Indiferent de natura materialului patologic

    recoltat i de scopul examenului, pentru ambalare, expediere, pstrare (dac este cazul) este necesar s se respecte urmtoarele norme de lucru:

    Cadavrele, produsele patologice sau organele recoltate de la cadavre se vor expedia la laborator, n cel mai scurt timp dup moarte, deoarece procesele de putrefacie creeaz ntotdeauna dificulti n diagnosticul bacteriologic,

  • Voichioiu et al. Medicamentul Veterinar / Veterinary Drug

    Vol. 9(1) Mai - Iunie 2015

    27

    uneori fiind imposibil efectuarea acestui examen, datorit prezenei florei bacteriene de putrefacie;

    Recoltarea probelor trebuie realizat n aa fel nct materialul s fie ct mai puin expus contaminrii cu germeni din mediul ambiant;

    n cazul n care prelevarea nu a putut fi efectuat nainte de nceperea aplicrii terapiei cu antibiotice, se va nota pe buletinul de trimitere antibioticul folosit i doza aplicat;

    Dac prelucrarea nu se poate face din cadavre sau organe proaspete, sau atunci cnd transportul dureaz un timp mai ndelungat, este obligatorie asigurarea unei temperaturi sczute (n jur de 0C) pentru materialele respective, care se poate realiza prin meninerea materialelor n frigidere, lzi izoterme etc. sau se transport n recipiente speciale cu ghea;

    n cazul n care n materialul patologic recoltat exist flor asociat se vor folosi lichide conservante care, prin coninutul lor, n substane bacteriostatice, sau substane tampon, opresc dezvoltarea florei saprofite;

    Ambalarea materialelor patologice n vederea transportului la laborator se va executa n aa fel nct s asigure o ct mai strict etaneitate, pentru a se evita rspndirea germenilor;

    Indiferent de natura materialului, probele destinate examenul bacteriologic trebuie s fie nsoite de note anamnetice ct mai explicite i mai detaliate din partea medicului privind evoluia bolii, situaia epidemiologic, descrierea leziunilor etc.;

    Doar persoalul instruit poate realiza transportul produselor.

    Transportul probelor recoltate se face ct mai repede la laborator folosind mediile de transport gelozate sau recipiente sterile corespunzatoare: urocultoare, coprocultoare, tampoane pentru exudat faringian sau nazal etc. [29, 54].

    Recoltarea, ambalarea i transportul probelor de material patologic, prelevate de la animale, sunt reglementat prin Ordinul ANSVSA 25/03/2008 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind metodologia de prelevare, prelucrarea primar, ambalare i transport al probelor destinate examenelor de laborator n domeniul sntii animalelor, fiind nsoite de un document sanitar veterinar legal [54].

    1.2.2. Mediile de transport

    n unele circumstane, materialele

    patologice prelevate sunt pstrate n medii nutritive pn la prelucrarea lor n laborator.

    Mediul de transport universal Stuart este un mediu non-nutritiv, semisolid, ce protejeaz mult microorganismele de efectele autolitice i letale ale oxidrii (hemofili, salmonele, coli, stafilococi, streptococi, pneumococi). O deficien a acestui mediu este faptul c nu se poate controla eficient nmulirea coliformilor contaminani existeni n mediu. Mediul conservat la 4C, se poate utiliza timp de un an [25].

    Compoziia mediului: Tioglicolat de sodiu 1,000 g; Glicerofosfat de sodiu 10,000 g; Clorur de calciu 0,100 g; Albastru de metilen 0,002 g; Agar 3,000 g; Ap distilat...