DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC ŢIILOR VIRALE

  • Published on
    03-Jan-2016

  • View
    32

  • Download
    0

Embed Size (px)

DESCRIPTION

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC IILOR VIRALE. DIAGNOSTICUL INFECIILOR VIRALE. Argumente: clinice (sdr. clinic, debut, evoluie, patologia asociat) epidemiologice (vrsta, sex etc.) laborator. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE. Indicaii: Alegerea terapiei etiotrope - PowerPoint PPT Presentation

Transcript

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE

  • DIAGNOSTICUL INFECIILOR VIRALEArgumente:clinice (sdr. clinic, debut, evoluie, patologia asociat)epidemiologice (vrsta, sex etc.)laborator

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALEIndicaii:Alegerea terapiei etiotropeMonitorizarea eficienei terapieiAdoptarea msurilor de profilaxie i combatere n focar a unor boli contagioaseSupravegherea epidemiologic a unor boli infecioase

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALENejustificat (tardiv, fr consecine terapeutice)?Inaccesibil (infrastructur complex, personal nalt calificat)?Costisitor ?

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALEn prezent:Justificat i necesar (metode de diagnostic rapid, antivirale eficiente)Accesibil (cel puin pentru anumite metode)Cost / eficien

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALEIndicaii:Iniierea i monitorizarea terapiei antivirale (v. gripale, HSV1, HSV2, CMV, HIV, HBV, HCV) Stabilirea conduitei terapeutice sau profilactice (herpes genital prepartum, infecie cu v. rubeolic, HIV la gravid)

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALEAdoptarea msurilor de profilaxie i combatere n focar a unor boli contagioase (HAV)Supravegherea epidemiologic i adoptarea msurilor de sntate public (triajul donatorilor de snge i organe, supravegherea epidemiilor gripale, SARS)Evidenierea unor infecii noi, virusuri noi sau a unor noi asocieri virus-boal

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALETipuri de laboratoare:Laboratoare cliniceInstitute de Sntate PublicCentre de referin

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE METODE NESPECIFICE METODE SPECIFICE Metode directeex microscopic (ME, IF)evidenierea antigenelor viraleevidenierea secvenelor ac. nucleicizolarea - identificareaex. citologic (MO)Metode indirecteevidenierea anticorpilor specifici

  • DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR VIRALE - ETAPECooperarea clinician medic de laborator!Alegerea celui mai potrivit test (contextul clinico-epidemiologic)Alegerea produsului patologic Tipul (sdr. clinic, stadiul bolii)Momentul prelevrii Metoda de recoltare i transport

  • PRODUSE PATOLOGICE UTILIZATE N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC Sdr respiratorii: exsudat nazal, exsudat faringian, lichid de spltur nazal, sputSdr digestive: materii fecale, tampon rectalRash vezicular: lichid vezicular, produs de raclajInfecii urinare: urinInfecii oculare: raclat conjunctival sau corneean, exsudat faringianSdr meningian/ encefalitic: LCR, biopsie cerebral, materii fecale, saliv, esuturiSnge

  • MOMENTUL PRELEVRII N DIAGNOSTICUL VIROLOGICOPTIM primele 2 3 zile de la debutul bolii (diagnostic direct)!

  • PRELEVAREA N DIAGNOSTICUL VIROLOGICTipul produsului patologicExpediere imediatMediu de transportRefrigerare (+4 +8 C), nu congelare (-15 -20 C)

  • Lichid amniotic: se aspira lichidul cu seringa si se injecteaza apoi intr-un tub steril. Scop: cultivare virusuriSange periferic: se decontamineaza tegumentul. Se folosesc tuburi cu heparina sodicScop: cultivare virusuriBiopsie cerebrala: probele se transporta in mediu de transport M4Scop: cultivare, PCR pentru VHSBronhoscopie: se recomanda aspirarea secretiilor prin camera interioara a bronhoscopului intr-un recipient steril cu 1 ml solutie salina. Se transporta imediat la laborator.Scop: cultivare virusuri

  • Cervix: se foloseste speculum fara lubrifiant. Se indeparteaza excesul de mucus si puroi cu ajutorul tampoanelor de descarcare. Se introduce un tampon mic in endocervix si se roteste pentru 15 30 secunde. Se evita atingerea peretilor vaginali cu tamponul. Se comprima usor cervixul intre lamele speculului si se exprima puroiul eventual existent. Se introduce tamponul intr-un tub de colectie. Daca sunt prezente leziuni, acestea se comprima cu un alt tampon, care se introduce intr-un mediu de transport M4.Scop: cultivare virusuri si PCR

  • Cornee: raclajul corneean este realizat de catre medic. Este indicat a se introduce raclatul in mediu de transport M4Cultivare VHSLCR: se decontamineaza pielea. Se realizeaza punctie lombara, ventriculara sau suboccipitala. Se strimite LCR intr-un tub steril cu capac insurubat. Nu se foloseste mediu M4. Se transporta in laborator imediat dupa prelevare.Cultivare virus si PCR pentru Herpes Simplex VirusUreche interna: se curata canalul extern cu antiseptic cu actiune medie. Se preleva puroiul aseptic.Cultivare virusOchi (extern): se indeparteaza machiajul. Se antiseptizeaza tegumentul din jurul ochilor cu antiseptic slab. Se trece de 2 ori un tampon umed la nivelul conjunctivei. Evitati atingerea pleoapelor. Se foloseste mediu de transport M4. Cultivare virus

  • Leziuni herpetice: se sterge viguros baza unei vezicule deschise cu un tampon, se trimite produsul in mediu de transport M4. Cultivare VHS, PCRBiopsie pulmonara: se decontamineaza tegumentul. Se efectueaza doar de catre specialist. Se trimite produsul la laborator in mediu de transport M4.Cultivare virusSpalatura nasala / aspirat nasal: capul pacientului este indicat a fi inclinat sub un unghi de 70. Se aspira in seringa 1 ml solutie salina. Se introduce lichidul in narine. Se colecteaza lichidul si se reintroduce de cateva ori. La final se colecteaza lichidul de spalatura intr-un tub steril insurubat. Se trimite imediat la laborator. Detectarea rapida de virus gripal este posibila in sezon epidemic.Cultivare virus gripal, virus respirator sincitial.

  • Nasofaringe: se introduce un tampon subtire, in nasofaringe, in cavitatea nasala. Se tine tamponul aproape de septul nasal. Se roteste tamponul si se retrage. Se transporta imediat la laborator. Se foloseste mediu de transport M4. Cultivare virus; detectare VRSLichid pericardic, pleural, peritoneal: se decontami-neaza tegumentul. Se recomanda aspirarea sterila a cativa ml intr-o seringa. Se introduce lichidul intr-un recipient steril, cu capac.Cultivare virusRash: se curata suprafata cu alcool 70%. Se instileaza o cantitate mica de solutie salina si apoi se aspira intr-un tub steril. Se foloseste mediu de transport M4. Pentru rash vezicular se cur viguros cu un tampon baza veziculelor proaspete.Cultivare virus si IF directa pentru V Varicella Zoster

  • Tampon rectal: in timpul proctoscopiei sau sigmoidoscopiei se ating cu tamponul leziunile de la acest nivel. Se introduce tamponul in mediu de transport M4. Cultivare virusLichid unt: se decontamineaza tegumentul si cateterul. Se aspira steril de la nivelul untului si se conditioneaza intr-un recipient steril.Cultivare virusMaterii fecale: se colecteaza in recipiente curate, uscate, cu capac. Daca se recolteaza in plosca, se evita contamina-rea cu urina sau dezinfectante. Transportul nu trebuie sa depaseasca 1 ora. Cultivare virus. Detectie Rotavirus (e.g. LA).

  • Faringe: tampon de la nivelul exudaului faringian sau al membranelor formate. Se sterg viguros criptele amigdaliene. Nu se atinge mucoasa bucala sau limba!Cultivare virusesut: se recolteaza de catre medic Cultivare virusAspirat traheal: secretiile se transporta in container steril. Cultivare virus

  • Secretie uretrala: se recolteaza la o ora dupa ultima mictiune. Se introduc tampoane subtiri de 2 4 cm in uretra si se rotesc timp de 3 5 secunde. Se depune tamponul intr-un tub colector. Pentru VHS se foloseste mediu de transport M4. PCR pentru VHS2; Cultivare VHSUrina de la nivelul cateterului: se dezinfecteaza tubul cu alcool. Se aspira urina cu o seringa sterila. Se transporta in container steril. Se refrige-reaza imediat.Cultivare virusUrina suprapubiana / citoscopie: se realizeaza recoltarea de catre medic intr-un recipient steril; se refrigereaza imediat.Cultivare virus

  • Vagin: se foloseste speculum cu lubrifiant. Se introduce un tampon steril in vagin. Mediu M4 pentru VHS.Cultivare VHS, PCRVulva: nu se foloseste alcool pentru membranele mucoase. Tegumentul se antiseptizeaza. Se colecteaza cu tamponul sau se aspira cu seringa. Mediu M4 pentru VHS. Cultivare VHS, PCR

  • Diagnosticul directExaminarea direct a produselor patologiceDetectarea de antigene: Evidentiere de virus / ME si IEMimunofluorescen (IF), teste imunenozimatice (ELISA enzime linked immunosorbent assay); latex aglutinarea (LA);Detectarea genomuluiPCR si RT-PCR

  • Diagnosticul directIn examinarea direct, produsele patologice sunt examinate pentru evidenierea:virusului; antigenelor virale;a genomului;modificrilor histopatologice induse de ctre infecia viral.

  • Diagnosticul directAvantaje: examinarea direct este rapid, rezultatele fiind obinute n aceeai zi, mai ales n scopul instituirii chimioterapiei.Dezavantaje: costul ridicat al tehnicilor, personalul de laborator nalt calificat, fac din aceste metode apanajul laboratoarelor de cercetare sau special echipate. Tehnicile de biologie molecular au devenit, n ultimul timp, din ce n ce mai accesibile, iar sensibilitatea i specificitatea lor, dublat de automatizarea metodei, depesc aceste inconveniente.

  • Diagnosticul directScderea preului de cost per determinare reprezint soluia de viitor pentru extinderea lor pe scar mai larg.Prin dezvoltarea tehnologiilor tip DNA chip se vor putea detecta virusuri direct n produsul patologic (PP), cu posibilitatea cuantificrii lor, n vederea monitorizrii terapiei antivirale.

  • MetodeMicroscopia electronic (ME) pentru evidenierea morfologiei i dimensiunilor virusurilor i identificarea acestora utiliznd imunoelectron-microscopia (IME).Microscopia optic: modificri histopatolgice i evidenierea de incluzii.Detectarea genomului viral: hibridizarea i reacia de amplificare genic (PCR polymerase chain reaction).

  • Izolarea virusurilor

    Culturi de celule: evidenierea efectului citopatic (ECP) produs de ctre virusuri citopatogene; identificarea virusului izolat prin IF, reacia de neutralizare (RN), testul de hemadsorbie, RIA, etc.Izolarea pe ou embrionate n dezvoltare: evidenierea de pocksuri la nivelul membranei chorioalantoidiene (MCA), urmat de identificarea prin RIH.Izolarea pe animale de laborator determin decesul sau reproducerea bolii la animal, urmat de obinerea de seciuni histologice i examinarea lor prin MO pentru evidenierea unor leziuni caracteristice i identificarea de antigene prin RN, RIH, etc.

  • METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGICMicroscopia electronic (ME) sensibilitate redus (106-7 virioni/ml) personal specializat i infrastructur complex cost ridicat utilizare limitat

  • Microscopia electronic (ME)presupune un laborator dotat cu ME cu putere de mrire ntre 20000-40000X sau 50000-60000X. Pe lng dezavantajele legate de echipamentul scump, al necesitii de personal nalt calificat i al costurilor ridicate pentru reactivi i ntreinerea ME, tehnica are i dezavantajul unei sensibiliti reduse, deoarece limita de detecie presupune prezena virusului n PP n cantitate de aproximativ 106 particule virale/ml.

  • Microscopia electronic (ME)Avantaje: rapiditatea detectrii virusurilor i utilitatea descrierii morfologiei virusurilor; uneori reprezint singura metod de diagnostic, aa cum s-a ntmplat n cazul descrierii coronavirusului recunoscut, ulterior, ca agent etiologic al SARS (sindromul acut respirator sever).Dezavantaje: sensibilitatea redus, cost ridicat, similitudini morfologice ntre diferite virusuri, imposibilitatea identificrii serotipului.

  • Microscopia electronic (ME)Produse patologice utile pentru detecia de virus: materii fecale (MF) pentru rotavirusuri, adenovirusuri, virusul Norwalk i virusurile Norwalk-like, astrovirusuri, calicivirusuri; lichid vezicular pentru VHS i VVZ;produs din leziunile cutanate pentru papillomavirusuri, virusul orf, moluscum contagiosum.

  • Picornavirusuri

  • IMECreste sensibilitatea si specificitatea MEVariante ale IME:IEM clasic: proba este tratat, anterior examinrii la ME cu un ser specific cu Ac monoclonali, anti-virus presupus prezent n PP. Particulele virale, prezente n probe vor aglutina i n final, se vor agrega, datorit specificitii reaciei Ag-Ac;IEM n faz solid: grila ME, (sau alt suport), va fi coafat cu Ac monoclonali; particulele virale, prezente n PP vor fi adsorbite la suprafaa grilei prin intermediul Ac-lor.

  • Microscopia optic:Evidentiaza modificri histopatolgice i evidenierea de incluzii Incluziile cu diferite localizri:intranucleare i/sau intracitoplasmatice,eozinofile sau bazofile, cu variate forme rotunde, alungite, piriforme, etc. reprezint doar un reper orientativ i nu unul patognomonic.

  • Infectii cu VHS (incluzii IN)

  • Leziuni determinate de VHS. Sageata verde indica incluzii IN, cea albastra , celule keratinizate, iar cea rosie, celule binucleate, cu incluzii iN.

  • Sageata rosie - incluzii IN, albastra, degenerarea celulelor cu balonizare (aspect generat de VHS, keratinocite, multinucleate).

  • VVZ incluzii IN

  • V. rabic incluzii IC (bazofile)Coloratie HE

  • Incluzii Babes-Negrigranule albastru-inchis la nivelul incluziilor (coloratie Sellers)

  • VRS sincitii si incluzii eozinofile i.c.

  • Infectie HIV celule nervoaseIncluzii Cowdry A, IN si IC eozinofile (coloratie HE)

  • joi

  • METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGICDetecia i identificarea antigenelor virale imunofluorescen imunohistochimie metode imunoenzimatice latexaglutinare reacii de neutralizare, fixare a complementului, inhibare a hemaglutinrii

  • METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENAAnticorpi marcai cu fluorocromDetecia i identificarea antigenelor de la nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi de celule)

  • METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENA

  • METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIEDetecia i identificarea antigenelor virale de la nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi de celule)Anticorpi marcai cu peroxidazExaminare la microscopul opticDezavantaj peroxidaza endogen, prezent n numeroase esuturi, poate genera reactii fals pozitive

  • METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

  • METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

  • METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

  • Rabie - imunohistochimie

  • Incluzii IN Cowdry A se vad uneori; Imunohistochimie, utilizand Ac monoclonali anti- VHS: semnal (+) IN si IC (stanga coloratie Papanicolau si dreapta: IHC, dupa recolorare)

  • METODE INDIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC Evidenierea anticorpilor specifici metode imunoenzimatice (ELISA) latexaglutinare (LA) reacia de fixare a complementului (RFC) / evidentiaza Ac specifici de grup (exceptii / VSR, paragripal tip 3) reacia de inhibare a hemaglutinrii (RIH)Sensibilitate, specificitate, complexitate i costuri funcie de metoda utilizatCriterii de semnificaie a prezenei Ac

  • Criterii de semnificaie a prezenei Ac2 probe de ser (ideal)dinamica semnificativseroconversia1 prob unictitrul semnificativclasa de Ac (IgM versus IgG)

  • METODE IMUNOENZIMATICE N DIAGNOSTICUL VIROLOGIC Aplicaii extrem de variateDiverse variante (directe, indirecte, competitive, sandwich)Detecia i identificarea antigenelor (virioni, antigene virale solubile, celule infectate) si a anticorpilorSensibilitate foarte bunSpecificitate funcie de afinitatea anticorpilorAccesibilitateCost redus

  • Teste pe membrana

  • Teste pe membrana (HIV si VHC)

  • Teste pe membranaPentru laboratoare putin dotateNU NECESITA PERSONAL SPECI...

Recommended

View more >