DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC ŢIILOR VIRALE

DIAGNOSTICUL DE DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL LABORATOR AL

INFECINFECŢIILOR VIRALEŢIILOR VIRALE

DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR VIRALE

Argumente:• clinice (sdr. clinic, debut, evoluţie, patologia asociată)

• epidemiologice (vârsta, sex etc.)

• laborator

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE

Indicaţii:• Alegerea terapiei etiotrope• Monitorizarea eficienţei terapiei• Adoptarea măsurilor de profilaxie şi

combatere în focar a unor boli contagioase• Supravegherea epidemiologică a unor boli

infecţioase


• Nejustificat (tardiv, fără consecinţe terapeutice)?

• Inaccesibil (infrastructură complexă, personal înalt calificat)?

• Costisitor ?


În prezent:• Justificat şi necesar (metode de diagnostic

rapid, antivirale eficiente)

• Accesibil (cel puţin pentru anumite metode)

• Cost / eficienţă


Indicaţii:• Iniţierea şi monitorizarea terapiei antivirale

(v. gripale, HSV1, HSV2, CMV, HIV, HBV, HCV)

• Stabilirea conduitei terapeutice sau profilactice (herpes genital prepartum, infecţie cu v. rubeolic, HIV la gravidă)


• Adoptarea măsurilor de profilaxie şi combatere în focar a unor boli contagioase (HAV)

• Supravegherea epidemiologică şi adoptarea măsurilor de sănătate publică (triajul donatorilor de sânge şi organe, supravegherea epidemiilor gripale, SARS)

• Evidenţierea unor infecţii noi, virusuri noi sau a unor noi asocieri virus-boală


Tipuri de laboratoare:

• Laboratoare clinice

• Institute de Sănătate Publică

• Centre de referinţă


METODE NESPECIFICE

METODE SPECIFICE

Metode directe• ex microscopic (ME, IF)• evidenţierea antigenelor virale• evidenţierea secvenţelor ac.

nucleic• izolarea - identificarea• ex. citologic (MO)

Metode indirecte• evidenţierea

anticorpilor specifici

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR VIRALE - ETAPE

• Cooperarea clinician – medic de laborator!• Alegerea celui mai potrivit test (contextul clinico-

epidemiologic)• Alegerea produsului patologic

Tipul (sdr. clinic, stadiul bolii)

Momentul prelevării

Metoda de recoltare şi transport

PRODUSE PATOLOGICE UTILIZATE ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

• Sdr respiratoriiSdr respiratorii: exsudat nazal, exsudat faringian, lichid de spălătură nazală, spută

• Sdr digestiveSdr digestive: materii fecale, tampon rectal• Rash vezicularRash vezicular: lichid vezicular, produs de raclaj• Infecţii urinareInfecţii urinare: urină• Infecţii oculareInfecţii oculare: raclat conjunctival sau corneean,

exsudat faringian• Sdr meningian/ encefaliticSdr meningian/ encefalitic: LCR, biopsie

cerebrală, materii fecale, salivă, ţesuturi• Sânge

MOMENTUL PRELEVĂRII ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

OPTIM – primele 2 – 3 zile de la debutul bolii (diagnostic direct)!

PRELEVAREA ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

• Tipul produsului patologic

• Expediere imediată

• Mediu de transport

• Refrigerare (+4 +8 ºC), nu congelare (-15 -20 ºC)

• Lichid amniotic: se aspira lichidul cu seringa si se injecteaza apoi intr-un tub steril.

• Scop: cultivare virusuri• Sange periferic: se decontamineaza tegumentul.

Se folosesc tuburi cu heparina sodică• Scop: cultivare virusuri• Biopsie cerebrala: probele se transporta in mediu

de transport M4• Scop: cultivare, PCR pentru VHS• Bronhoscopie: se recomanda aspirarea secretiilor

prin camera interioara a bronhoscopului intr-un recipient steril cu 1 ml solutie salina. Se transporta imediat la laborator.

• Scop: cultivare virusuri

• Cervix: se foloseste speculum fara lubrifiant. • Se indeparteaza excesul de mucus si puroi cu ajutorul

tampoanelor de descarcare. • Se introduce un tampon mic in endocervix si se roteste

pentru 15 – 30 secunde. • Se evita atingerea peretilor vaginali cu tamponul. Se

comprima usor cervixul intre lamele speculului si se exprima puroiul eventual existent.

• Se introduce tamponul intr-un tub de colectie. • Daca sunt prezente leziuni, acestea se comprima cu un alt

tampon, care se introduce intr-un mediu de transport M4.• Scop: cultivare virusuri si PCR

• Cornee: raclajul corneean este realizat de catre medic. Este indicat a se introduce raclatul in mediu de transport M4

• Cultivare VHS• LCR: se decontamineaza pielea. Se realizeaza punctie

lombara, ventriculara sau suboccipitala. Se strimite LCR intr-un tub steril cu capac insurubat. Nu se foloseste mediu M4. Se transporta in laborator imediat dupa prelevare.

• Cultivare virus si PCR pentru Herpes Simplex Virus• Ureche interna: se curata canalul extern cu antiseptic cu

actiune medie. Se preleva puroiul aseptic.• Cultivare virus• Ochi (extern): se indeparteaza machiajul. Se

antiseptizeaza tegumentul din jurul ochilor cu antiseptic slab. Se trece de 2 ori un tampon umed la nivelul conjunctivei. Evitati atingerea pleoapelor. Se foloseste mediu de transport M4.

• Cultivare virus

• Leziuni herpetice: se sterge viguros baza unei vezicule deschise cu un tampon, se trimite produsul in mediu de transport M4.

• Cultivare VHS, PCR• Biopsie pulmonara: se decontamineaza tegumentul. Se

efectueaza doar de catre specialist. Se trimite produsul la laborator in mediu de transport M4.

• Cultivare virus• Spalatura nasala / aspirat nasal: capul pacientului este

indicat a fi inclinat sub un unghi de 70°. Se aspira in seringa 1 ml solutie salina. Se introduce lichidul in narine. Se colecteaza lichidul si se reintroduce de cateva ori. La final se colecteaza lichidul de spalatura intr-un tub steril insurubat. Se trimite imediat la laborator. Detectarea rapida de virus gripal este posibila in sezon epidemic.

• Cultivare virus gripal, virus respirator sincitial.

• Nasofaringe: se introduce un tampon subtire, in nasofaringe, in cavitatea nasala. Se tine tamponul aproape de septul nasal. Se roteste tamponul si se retrage. Se transporta imediat la laborator. Se foloseste mediu de transport M4.

• Cultivare virus; detectare VRS• Lichid pericardic, pleural, peritoneal: se decontami-

neaza tegumentul. • Se recomanda aspirarea sterila a cativa ml intr-o seringa.

Se introduce lichidul intr-un recipient steril, cu capac.• Cultivare virus• Rash: se curata suprafata cu alcool 70%. Se instileaza o

cantitate mica de solutie salina si apoi se aspira intr-un tub steril. Se foloseste mediu de transport M4.

• Pentru rash vezicular se curăţă viguros cu un tampon baza veziculelor proaspete.

• Cultivare virus si IF directa pentru V Varicella Zoster

• Tampon rectal: in timpul proctoscopiei sau sigmoidoscopiei se ating cu tamponul leziunile de la acest nivel. Se introduce tamponul in mediu de transport M4.

• Cultivare virus• Lichid şunt: se decontamineaza tegumentul si cateterul.

Se aspira steril de la nivelul şuntului si se conditioneaza intr-un recipient steril.

• Cultivare virus• Materii fecale: se colecteaza in recipiente curate, uscate,

cu capac. Daca se recolteaza in plosca, se evita contamina-rea cu urina sau dezinfectante. Transportul nu trebuie sa depaseasca 1 ora.

• Cultivare virus. Detectie Rotavirus (e.g. LA).

• Faringe: tampon de la nivelul exudaului faringian sau al membranelor formate. Se sterg viguros criptele amigdaliene. Nu se atinge mucoasa bucala sau limba!

• Cultivare virus• Ţesut: se recolteaza de catre medic • Cultivare virus• Aspirat traheal: secretiile se transporta in

container steril. • Cultivare virus

• Secretie uretrala: se recolteaza la o ora dupa ultima mictiune. Se introduc tampoane subtiri de 2 – 4 cm in uretra si se rotesc timp de 3 – 5 secunde. Se depune tamponul intr-un tub colector. Pentru VHS se foloseste mediu de transport M4.

• PCR pentru VHS2; Cultivare VHS• Urina de la nivelul cateterului: se dezinfecteaza

tubul cu alcool. Se aspira urina cu o seringa sterila. Se transporta in container steril. Se refrige-reaza imediat.

• Cultivare virus• Urina suprapubiana / citoscopie: se realizeaza

recoltarea de catre medic intr-un recipient steril; se refrigereaza imediat.

• Cultivare virus

• Vagin: se foloseste speculum cu lubrifiant. Se introduce un tampon steril in vagin. Mediu M4 pentru VHS.

• Cultivare VHS, PCR• Vulva: nu se foloseste alcool pentru membranele

mucoase. Tegumentul se antiseptizeaza. Se colecteaza cu tamponul sau se aspira cu seringa. Mediu M4 pentru VHS.

• Cultivare VHS, PCR

Diagnosticul direct

• Examinarea directă a produselor patologice– Detectarea de antigene:

– Evidentiere de virus / ME si IEM

– imunofluorescenţă (IF),

– teste imunenozimatice (ELISA – enzime linked immunosorbent assay);

– latex aglutinarea (LA);

– Detectarea genomului

– PCR si RT-PCR

Diagnosticul direct

• In examinarea directă, produsele patologice sunt examinate pentru evidenţierea:

• virusului;

• antigenelor virale;

• a genomului;

• modificărilor histopatologice induse de către infecţia virală.

Diagnosticul direct• Avantaje: • examinarea directă este rapidă, • rezultatele fiind obţinute în aceeaşi zi, mai ales în

scopul instituirii chimioterapiei.• Dezavantaje: • costul ridicat al tehnicilor, • personalul de laborator înalt calificat, fac din aceste

metode apanajul laboratoarelor de cercetare sau special echipate.

• Tehnicile de biologie moleculară au devenit, în ultimul timp, din ce în ce mai accesibile, iar sensibilitatea şi specificitatea lor, dublată de automatizarea metodei, depăşesc aceste inconveniente.

Diagnosticul direct

• Scăderea preţului de cost per determinare reprezintă soluţia de viitor pentru extinderea lor pe scară mai largă.

• Prin dezvoltarea tehnologiilor tip DNA chip se vor putea detecta virusuri direct în produsul patologic (PP), cu posibilitatea cuantificării lor, în vederea monitorizării terapiei antivirale.

Metode– Microscopia electronică (ME) pentru evidenţierea

morfologiei şi dimensiunilor virusurilor şi identificarea acestora utilizând imunoelectron-microscopia (IME).

– Microscopia optică: modificări histopatolgice şi evidenţierea de incluzii.

– Detectarea genomului viral: hibridizarea şi reacţia de amplificare genică (PCR – polymerase chain reaction).

Izolarea virusurilor

• Culturi de celule: evidenţierea efectului citopatic (ECP) produs de către virusuri citopatogene; identificarea virusului izolat prin IF, reacţia de neutralizare (RN), testul de hemadsorbţie, RIA, etc.

• Izolarea pe ouă embrionate în dezvoltare: evidenţierea de pocksuri la nivelul membranei chorioalantoidiene (MCA), urmată de identificarea prin RIH.

• Izolarea pe animale de laborator determină decesul sau reproducerea bolii la animal, urmată de obţinerea de secţiuni histologice şi examinarea lor prin MO pentru evidenţierea unor leziuni caracteristice şi identificarea de antigene prin RN, RIH, etc.

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC

Microscopia electronicăMicroscopia electronică (ME) sensibilitate redusă (106-7 virioni/ml)

personal specializat şi infrastructură complexă

cost ridicat utilizare limitată

Microscopia electronică (ME)

• presupune un laborator dotat cu ME cu putere de mărire între 20000-40000X sau 50000-60000X.

• Pe lângă dezavantajele legate de echipamentul scump, al necesităţii de personal înalt calificat şi al costurilor ridicate pentru reactivi şi întreţinerea ME, tehnica are şi dezavantajul unei sensibilităţi reduse, deoarece limita de detecţie presupune prezenţa virusului în PP în cantitate de aproximativ 106 particule virale/ml.

Microscopia electronică (ME)• Avantaje: • rapiditatea detectării virusurilor şi utilitatea descrierii morfologiei

virusurilor; • uneori reprezintă singura metodă de diagnostic, aşa cum s-a

întâmplat în cazul descrierii coronavirusului recunoscut, ulterior, ca agent etiologic al SARS (sindromul acut respirator sever).

• Dezavantaje: • sensibilitatea redusă, • cost ridicat, • similitudini morfologice între diferite virusuri, • imposibilitatea identificării serotipului.

Microscopia electronică (ME)

• Produse patologice utile pentru detecţia de virus:

• materii fecale (MF) pentru rotavirusuri, adenovirusuri, virusul Norwalk şi virusurile Norwalk-like, astrovirusuri, calicivirusuri;

• lichid vezicular pentru VHS şi VVZ;• produs din leziunile cutanate pentru

papillomavirusuri, virusul orf, moluscum contagiosum.

Picornavirusuri

IME• Creste sensibilitatea si specificitatea ME• Variante ale IME:• IEM clasică: proba este tratată, anterior examinării la

ME cu un ser specific cu Ac monoclonali, anti-virus presupus prezent în PP.

• Particulele virale, prezente în probe vor aglutina şi în final, se vor agrega, datorită specificităţii reacţiei Ag-Ac;

• IEM în fază solidă: grila ME, (sau alt suport), va fi “coafată” cu Ac monoclonali; particulele virale, prezente în PP vor fi adsorbite la suprafaţa grilei prin intermediul Ac-lor.

Microscopia optică:

Evidentiaza modificări histopatolgice şi evidenţierea de incluzii

• Incluziile cu diferite localizări:• intranucleare şi/sau intracitoplasmatice,• eozinofile sau bazofile, • cu variate forme – rotunde, alungite, piriforme, etc. • reprezintă doar un reper orientativ şi nu unul

patognomonic.

Infectii cu VHS (incluzii IN)

http://www.medvet.umontreal.ca/pathologie_microbiologie/beluga/images/Herpes_micro.jpeg

Leziuni determinate de VHS. Sageata verde indica incluzii IN, cea albastra , celule keratinizate, iar cea rosie, celule binucleate, cu incluzii iN.

Sageata rosie - incluzii IN, albastra, degenerarea celulelor cu balonizare (aspect generat de VHS, keratinocite, multinucleate).

VVZ – incluzii IN

V. rabic – incluzii IC (bazofile)Coloratie HE

Incluzii Babes-Negrigranule albastru-inchis la nivelul

incluziilor (coloratie Sellers)

VRS – sincitii si incluzii eozinofile i.c.

Infectie HIV – celule nervoaseIncluzii Cowdry A, IN si IC – eozinofile

(coloratie HE)

joi

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC

Detecţia şi identificarea antigenelor viraleDetecţia şi identificarea antigenelor virale imunofluorescenţă imunohistochimie metode imunoenzimatice latexaglutinare reacţii de neutralizare, fixare a complementului,

inhibare a hemaglutinării

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA

• Anticorpi marcaţi cu fluorocrom

• Detecţia şi identificarea antigenelor de la nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi de celule)

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

• Detecţia şi identificarea antigenelor virale de la nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi de celule)

• Anticorpi marcaţi cu peroxidază

• Examinare la microscopul optic

• Dezavantaj – peroxidaza endogenă, prezentă în numeroase ţesuturi, poate genera reactii fals pozitive




Rabie - imunohistochimie

Incluzii IN Cowdry A – se vad uneori; Imunohistochimie, utilizand Ac monoclonali anti- VHS: semnal (+) IN si IC (stanga coloratie

Papanicolau si dreapta: IHC, dupa recolorare)

http://www.fujita-hu.ac.jp/~tsutsumi/photo/photo141-3.htm

METODE INDIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC

• Evidenţierea anticorpilor specifici metode imunoenzimatice (ELISA) latexaglutinare (LA) reacţia de fixare a complementului (RFC) /

evidentiaza Ac specifici de grup (exceptii / VSR, paragripal tip 3)

reacţia de inhibare a hemaglutinării (RIH)

• Sensibilitate, specificitate, complexitate şi costuri – funcţie de metoda utilizată

• Criterii de semnificaţie a prezenţei Ac

Criterii de semnificaţie a prezenţei Ac

• 2 probe de ser (ideal)

- dinamica semnificativă

- seroconversia

• 1 probă unică

- titrul semnificativ

- clasa de Ac (IgM versus IgG)

METODE IMUNOENZIMATICE ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

• Aplicaţii extrem de variate• Diverse variante (directe, indirecte, competitive, sandwich)

• Detecţia şi identificarea antigenelor (virioni, antigene virale solubile, celule infectate) si a anticorpilor

• Sensibilitate foarte bună• Specificitate – funcţie de afinitatea anticorpilor• Accesibilitate• Cost redus

Teste pe membrana

Teste pe membrana (HIV si VHC)

Teste pe membrana

• Pentru laboratoare putin dotate

• NU NECESITA PERSONAL SPECIALIZAT

• In zone unde prevalenta infectiei respective este redusa

• SE CONFIRMA OBLIGATOR PRIN ELISA

ELISA- principiu

• Evidenţierea complexului Ag-Ac cu ajutorul unui element cunoscut (Ac sau Ag) marcat cu o enzimă

• Reacţia de culoare, prin adăugarea unui substrat specific (pentru enzima utilizată)

Placa ELISA (12/8)

ELISA - metoda

• Ag partial purificat, inactivat este adsorbit pe suport

• Se adauga ser (poate contine Ac – se cupleaza de Ag)

ELISA - metoda

• Ac anti Ig umana, cuplati cu enzima (conjugat)

• Cromogenul (substratul) va schimba culoarea reactiei daca se formeaza complexul Ag-Ac-Conjugat

ELISA – ser reactiv

ELISA – ser nereactiv

ELISA

Positive Control Negative Control Patient A Patient B Patient C Assay Control

1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123

ELISAindirect

ELISAindirect

ELISA

http://www.apotech.ch/?id=12

ELISA – direct (detectare de Ag)

ELISA

ELISA – competitiv

• competiţia se realizează direct în prezenţa de Ac dirijaţi împotriva Ag insolubilizat, prin adsorbţia pe faza solidă.

• este posibil să adăugăm reactivii în etape: în prima etapă, Ag-ul de dozat se adaugă peste Ac insolubilizaţi pe faza

ELISA – competitiv

ELISA

• Nu se lucreaza probe hemolizate, contaminate!• Pastrarea serului cel mult 5 zile la frigider (ideal,

maxim 3 zile).• Nu se ingheata proba repetat!

• Rezultate fals pozitive: impun repetarea probei pe 2 godeuri (mai ales in cazul probelor indeterminate; AS = CO).

Surse de eroare în dozarea antigenelor:

rezultatele fals pozitive pot fi determinate de:* fixarea nespecfică a imunoglobulinelor de către

receptori Fc membranari sau de către factorul reumatoid (FR) prezenţi în ser sau alte lichide biologice;

* reacţii heterospecifice determinate de utilizarea anticorpilor anti-antigene heterologe, anti-gazdă sau anti-membrane ale gazdei sau de prezenţa de antigene în probă (bacterii, levuri, ciuperci, proteine);


* proasta conservare a serurilor ce duce la alterarea imunoglobulinelor în probă;

* folosirea unui conjugat la titru sau cu o aviditate insuficientă.


• Rezultate fals negative

• Aviditate scazuta a Ac adsorbiti pe suport

• Conjugat nelegat (incubare insuficienta, spalare in exces, etc)

ELISA

• Conduita: repetarea pe aceeasi proba sau/si pe o noua proba de ser (recoltat imediat sau/si la 2-3 luni interval).

• Se prefera repetarea pe truse de la producatori diferiti.

• Atentie: pacienti cu boli autoimune, sub tratament cu cortosterioizi, hemodializati, etc.

ELISA

• Rezultate fals negative:• ser recoltat anterior perioadei de

seroconversie• Ac complexati/legaţi cu Ag• sensibilitate redusa a trusei• Ac antiHIV2 nu sunt recunoscuti de truse

pentru HIV1• imunsupresie

Evoluţia răspunsului imun în infecţia cu HIV

ELISA – schematic (indirect)

ELISA – Ag p 24 (HIV)

Sandwich ELISA (Ac-Ag-Ac)

IgG-Capture EIA

Serum (1/100)

Biotin -Labeled Ag

Strepavidin-Peroxidase

TMBSubstrate

Goat-anti-Human-IgGCapture Antibody

ELISA

• Rezultate fals pozitive

• Confirmarea printr-un test principial diferit (WB, IF).

HIV WB

WB - principiu

• Ag virale fixate pe un suport (membrană), reacţionează specific cu Ac din ser

• Marcaj imunoenzimatic

• Legarea reactivilor ca in ELISA de tip indirect

WB

• Avantaje:

• evidentiaza categorii de Ac

• este mai specifica

• permite aprecieri prognostice (ex. aparitia/versus disparitia Anti- p24).

WB

• Dezavantaje:

• timp mai mare de executie

• presupune dotari suplimentare

• personal super-calificat

• uneori presupune interpretari “subiective”

• cost ridicat

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC – LATEX AGLUTINARE

• Anticorpi fixaţi pe particule de latex – identifică antigene (reciproca este valabilă, pentru evidenţierea de Ac)

• Metodă simplă, rapida şi accesibilă

• Sensibilitate şi specificitate relativ reduse

• Ex: antigenul rotaviral in materii fecale

LA

METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

• Detecţia şi identificarea unor secvenţe specifice de acizi nucleici

• Diverse varianteHibridizarea acizilor nucleici neamplificaţiAmplificarea semnalului (bDNA)Amplificarea secvenţei (PCR, RT-PCR, NASBA)

• Sensibilitate şi specificitate foarte bune• Accesibilitate restrânsă• Cost ridicat, dar cu raport cost/beneficii favorabil

PCR

PCR – evidenţierea fragmentului amplificat

Detectarea calitativă a acizilor nucleici virali

• Cand metodele convenţionale sunt greu de utilizat:• virusurile care se cultivă dificil (VHB, VHC,

papillomavirusul uman, HIV şi parvovirusul B19);• datorită riscului crescut de infecţiozitate (HIV);• când serologia nu este evidentă (ex. în cazul pacienţilor

imunocompromişi- virusul citomegalic);• diagnosticul infecţiilor virale congenitale şi perinatale

(HIV, VHC);• virusul este prezent în concentraţii foarte joase:

screening–ul sângelui şi al produselor sanguine (VHB, VHC, HIV);

Produse patologice

• testarea fluidelor organismelor care în mod normal sunt sterile

- LCR (VHS, VVZ, VCM);

- lichidul amniotic (VVZ, VCM, parvovirusul B19, virusul rubeolei);

- fluidele oculare (VVZ, VCM).

PCR

- Au fost folosite variate metode pentru aceste scopuri, inclusiv PCR şi hibridizarea, cu scopul de a putea evidenţia concentraţii scăzute de genom viral în probe.

Secvenţierea acidului nucleic viral

• Odată ce genomul viral a fost detectat, secvenţierea genomului poate evalua relaţiile dintre două sau mai multe izolate virale, în cazurile în care este posibilă coinfecţia (VHB – VHC) sau poate ghida terapia antivirală.

• În testarea rezistenţei la antitretrovirale a HIV se determină secvenţierea RT şi a proteazelor şi se compară expresia schimbărilor aminoacizilor cu tulpina iniţială de virus.

• Testarea sensibilităţii HIV la antiretrovirale are un potenţial limitat datorită beneficiului clinic redus, costurilor ridicate, dificultăţilor de interpretare.

Secvenţierea acidului nucleic viral

• Aplicaţii: • alegerea terapiei de primă intenţie, adaptarea terapiei, • profilaxia post – expunere şi prevenţia transmiterii

verticale. • Ex. terapia HIV şi VHC. • răspunsul la IFN în infecţiile cu VHC depinde de

genotipul viral: genotipurile 2 şi 3 răspund mai bine decât genotipul 1;

• câteva variante de VHB cu sensibilitate redusă la Lamivudină sunt asociate cu prezenţa unui singur nucleotid la nivelul genei care codifica sinteza polimerazei.

Cuantificarea acidului nucleic viral

• Cuantificarea încărcăturii virale este importantă în virusologia clinică datorită utilităţii sale ca:

- indicator al prognosticului;

- al răspunsului la terapia antivirală;

- al riscului transmiterii infecţiei.

Evaluarea prognosticului:

• A fost bine stabilit pentru HIV.

• S–a demonstrat că nivelul plasmatic al ARN–ului viral corelat cu stagiul bolii şi cu un nivel scăzut al HIV1 în plasmă se asociază cu o lungă perioadă asimptomatică.

• Incărcătura virală crescută după seroconversie poate preceda progresia spre SIDA.

Evaluarea prognosticului:

• Măsurarea încărcăturii virale pentru VCM este utilă în cazurile post – transplant, această metodă dovedindu–se mult mai eficientă decât determi-narea calitativă.

• Incărcătura virală pentru VCM este un factor predictiv independent în supravieţuire, în cazul SIDA avansat.

• Creşterea VEB în plasmă şi în limfocitele din sângele periferic poate precede apariţia unor tulburări limfoproliferative post – transplant.

Evaluarea răspunsului terapeutic:

• este cel mai bine cunoscută în cazul infecţiei cu HIV, caz în care scopul terapiei este de a reduce nivelul plasmatic al HIV1 cât mai mult posibil

• există controverse în acest sens;- s-a sugerat că pacienţii cu nivelul plasmatic al HIV1 între

30.000 şi 50.000 cópii / ml ar trebui să primească terapie antiretrovirală indiferent de stadiul clinic,

- în timp ce pentru pacienţii care au concentraţii între 5000 – 30000 cópii / ml trebuie să se aibă în vedere şi stadiul clinic şi numărul CD4 pentru iniţierea terapiei antiretrovirale.


• Terapia antiretrovirală este eficientă dacă s - a redus nivelul plasmatic al HIV1 cu cel puţin 0,5 log10.

• Revenirea nivelului ARN – ului plasmatic până la valori egale cu cele dinaintea terapiei, ar trebui să trezească suspiciuni cu privire la dezvoltarea rezistenţei.


• În cazul HVB, în care un nivel crescut de ADN înainte de iniţierea tratamentului este asociat cu un răspuns slab la IFN, cuantificarea ADN/ VHB a fost utilizată pentru a preconiza răspunsul terapeutic şi pentru a monitoriza răspunsul la terapia antivirală.

• La fel şi în cazul infecţiilor cu VHC, nivelul ridicat al viremiei, înaintea iniţierii terapiei antivirale este asociat cu un răspuns terapeutic redus (s-a demonstrat că acesta apare indiferent de genotip).

• Este încă neclar care este raportul dintre genotipul VHC şi nivelul viremiei.

Evaluarea riscului transmiterii virale:

• cuantificarea genomului viral pentru a evalua riscul transmiterii virale nu este frecvent utilizată în prezent, dar poate deveni mult mai importantă în viitor;

• este general acceptat că riscul transmiterii virale este corelat cu nivelurile crescute de virus în diverse fluide ale organismului;

• transmiterea VHC de la mamă la copil este mai frecventă atunci când nivelul ARN / VHC al mamei în sânge este mai mare decât 108 cópii / ml (practic risc = 0 la 103 cópii / ml ).

• Transmiterea se face frecvent în timpul naşteriii; frecvenţa ratei transmiterilor este mai mică în cazul naşterilor prin cezariană decât în cazul naşterilor pe cale naturală.

Evaluarea riscului transmiterii virale:

• În ceea ce priveşte transmiterea mama-fat în cazul HIV1, s-a demonstrat, deşi inconstant, că nivelurile ridicate ale ARN / HIV în plasma mamei cresc riscul infecţiilor fetale.

• Scăderea riscului transmiterilor se poate face eficient prin Zidovudină.

• O meta – analiză recentă ce a inclus 15 studii de cohortă sugerează că naşterea prin cezariană reduce riscul transmiterii HIV pe cale verticală, indiferent de utilizarea Zidovudinei.

• Nivelurile crescute de HIV1 apar mai frecvent în timpul relaţiilor heterosexuale.

Metode cantitative

• Real Time pCR (LP cu demonstratii practice)

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC - CULTIVARE

• Metodă standard – permite stabilirea semnificaţiei izolatului testarea sensibilităţii la antivirale izolarea unor virusuri noi

• laborioasă, necesită infrastructură complexă şi personal calificat

• accesibilitate redusă şi costuri mari


• Prelucrarea produsului patologic

• Medii de cultură celularecelulare culturi de celule (primare, diploide, linii celulare) ouă embrionate animale de laborator


• Evidenţierea replicării virale efect citopatic incluzii hemadsorbţie hemaglutinare imunofluorescenţă, metode imunoenzimatice transformare malignă interferenţă

CULTIVAREA VIRUSURILOR – EFECT CITOPATIC - sincitii

Virus urlian : CC- sincitii (se confunda cu cele ale VRS – diferentiere prin testul de

hemadsobtie)

CULTIVAREA VIRUSURILOR – INCLUZII VIRALE

Documents

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC ŢIILOR VIRALE