t~aunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. u. Pharmak. 253, 388--394 (1966)

Die Beteiligung des Insulins an der Diazoxid-Hyperglyk~imie ~

W. LOS~RT, G. S~NFT, R. SITT**, G. SCHULTZ u n d tI . KA~ss**

Pharmakologisches Institut der Freien Universit~t Berlin

Eingegangen am 29. Oktober 1965

Bei Unte r suchungen fiber den Mechanismus der Diazoxid-Hyper- glyki~mie haben wir auBer einer ve rmehr ten Adrena l in inkre t ion eine H e m m u n g der 3 ' ,5 ' -AMP-Phosphodiesterase gefunden (ScHuLTZ, S~NFT, LOSERT U. S~TT, 1966), deren Folgen ffir eine Akt iv ierung der Glykogen- Phosphorylase und eine Inak t iv i e rung der Glykogen-Synthetase ver- antwort l ich gemacht werden kSnnen (LAR~ER, ROSV, LL-PER~.Z, FRI~D- MAN U. CRAIG, 1964). Eine Abnahme der akt iven Form der Glykogen- Synthetase wird auch bei Insu l inmange l beobaehtet (STEIN]~R, 1964). Wi r haben deshalb untersucht , ob eine verminder te Insu l in inkre t ion an den beschriebenen StSrungen im Kohlenhydratstoffwechsel (Los]~RT, SCHULTZ, SEI~FT U. SITT, 1966) beteiligt ist.

Methodik Als Versuchstiere wurden m~nnliehe Wistarratten mit einem K6rpergewicht

zwischen 100 und 150 g verwendet, die Leitungswasser ad libitum erhielten. ])as Putter (Altromin R) entzogen wir bei Versuchsbeginn.

Wurden adrenalektomierte Ratten benutzt, fiihrten wir die Versuche 24 Std nach der Operation dutch. Die Tiere erhielten isotonische NaC1-L6sung als Trink- fltissigkeit. Aul~erdem wurden Gluco- und Mineralocortieoide substituiert.

Versuche an diabetisehen Ratten wurden 2 oder 3 Tage naeh i.v. Injektion von 80 mg/kg Alloxan durchgef'ffhrt. Wir verwendeten nur die Tiere, deren Glucose- konzentration im Blur mindestens 200 mg°/0 betrug.

Diazoxid wurde den Ratten i.v. in alkahscher LSsung injiziert oder oral in einer Gummi-arabicum-Suspension durch eine Schlundsonde appliziert.

Die Messung der Glucose, die Gewinnung des Blutes sowie die Bestimmung der Glykogen-Synthetase-Aktivit~t in der Skeletmuskulatur sind in einer voran- gegangenen Arbeit (Sc~4ULTZ, SE~FT, LOSE~T U. SITT, 1966) beschrieben. Bei der Untersuchung der Glykogen-Synthetase-Aktivit~t der Leber liel3en wir das Fer- ment in dem von DA~FORT~ (1965) angegebenen Versuchsansatz auf UDP-14C - Glucose einwirken. Die in das Glykogen eingebaute markierte Glucose wurde nach der Methode yon STEINER, l~AUDA U. ~VILLIAIVIS (1961) bestimmt.

* Ein Teil tier Ergebnisse wurde auf der 29. Tagung der Deutschen Phar- makologischen Gesellschaft vorgetragen (KA~SS, LOSERT, SCHULTZ, SENFT U. SrrT, 1966).

** Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft fiir die Unterstiitzung unserer Arbeiten.

Betefligung des Insulins an der Diazoxid-Hyperglyki~mie 389

Die Insulinkonzentration im Plasma wurde als IDI (immunologically de- tectable insulin) nach den Angaben yon MOROA~ u. LAZARICOW (1962, 1963) ge- messen.

Ergebnisse Die akt ive Form der Glykogen-Synthetase (Glykogen-Synthetase I)

in der Leber wird be± Tieren mit einem Alloxandiabetes (3 Tage naeh i.v. In jekt ion yon 80 mg/kg Alloxan) vermindert , ohne dab die Gesamt- aktivitKt des Ferments (Glykogensynthetase I ~- D) ver/indert ±st. In- jektion yon Insul in fiihrt zu einem Anstieg der akt iven Form auf den Normalwer t (Tab. 1).

Tabelle 1. Abnahme der Glykogensynthetase-Aktivitdit bei alloxandiabetischen _Ratten nnd nach Gabe yon Diazoxid

Glykogen- synthetase (fxmol UDPG/ gFG- rain) IS] = 10 -a M

D ÷ I

Leber Ske le tmusku la tu r

KontroUen

n = 22

1,88 ± 0,15

p > 0,6

Diabet ische Tiere (3 Tage nach 80 m g / k g

Alioxan i .v.)

Insu l in (6 Std nach 50 E / k g i.p.)

n = 4 n = 5

1,71 1,46 ± 0,33 ± 0,21

p > 0,5

Kontro l len

n = 3

2,67 ± 0,35

p > O , 7

Diazoxid (2 S td nach

2 0 0 m g / k g i . v . )

n = 5

2,84 ± 0,34

I 0,187 0,096 0,176 0,209 0,082 =j= 0,014 -4- 0,017 ± 0,048 -4- 0,035 ± 0,0096

p < 0 ,0004 p < 0,02

I - - 11,9o/o = 6 ,0% = 11 ,1% - - 7,75o10 = 2,77o/0 D + I " 100 ± 1,6 ± 1,0 ± 1,7 ± 0,67 ± 0,15

p < 0,005 p < 0,04 p < 0,001

Abnahme der Insulinkonzentration im Plasma (Immunologically Detectable Insulin I D I ) 2 Std nach 200 rag]kg Diazoxid i.v.

Kontrol len Diazoxid n = 6 n = 7

Insulin (~E/ml Plasma) 57,7 ± 7,4 16,4 ± 1,3

p < 0,0003

Applikat ion yon Diazoxid ha t ebenfalls eine Inakt iv ierung der Glykogen-Synthetase be± unver/~nderter Gesamtakt ivi t~t zur Folge, wie wir bei Untersuchungen an der Skeletmuskulatur festgestellt haben (siehe Tab. 1).

390 W . LOSERT, G. SI~FT, R. SITT, G. SCHULTZ und H. KAESS:

Die radioimmunologische Messung der Insuhnkonzentration im Plasma ergab, dab diese nach Gabe yon Diazoxid auf weniger als ein Drittel der bei normalen Tieren gemessenen Werte abf/illt (siehe Tab. 1).

Die Folgen der verminderten Insulininkretion lassen sich auch bei der Priifung des cellul/tren Glucosetransports feststellen. Injiziert man Rat ten nach Entfernung der Nebennieren und Ausschaltung der Nieren- funktion Glucose, so steigt die Konzentration des Zuckers in der extra- cellul~rcn Flfissigkeit bei den zuvor mit Diazoxid behandelten Tieren

T

I p<O, ooS 1 ~ Z00 I 7~ V..~x~[~.# < \ . ~ 1 lung m i t

I / / "\ . . . . . . ]. Oiozox'l'd ,~, i / I / \\\\ p<u, ,uec fn=s)

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~ I ~/l ~ 100 f///II ~'x~'x,~\ .~unvol,Dehcrndeltel Tilbl,o l.n= 7)

r ........ "~--~ck Vorbehandlg. I I I i milD/ozoxid(n= 7<) o 75 30 qSrnin

Abb. 1. Verminderung der Olucoseutilisation durch Diazoxid (200 mg/kg i.v., 105 rain vor Glucose- gabe). Unterdriickung des glycogenolyt. Diazoxideffektes dutch Glykogenverarmung (Adrenal- ektomie und Futterentzug 24 Std vor Versuchsbeginn, keine Glucocorticoidsubstitution), Verhinde-

rung der renalen Glucoseausscheidung durch 5Tephrektomie

h6her an als bei den Kontrollen. Der Abfall der Glucosekonzentration ist auBerdem verz6gert (Abb. 1). Die Versuche zeigen zugleich, dab sich die beiden Wirkungen des Diazoxids, die Steigerung der Glykogenolyse infolge Hemmung der 3',5'-AMP-Phosphodiesterase und die Abnahme der Insulininkretion, formal getrennt voneinander nachweisen lassen. Der glykogenolytische und blutzuckersteigernde Effekt des Diazoxids wurde in diesen Versuchen durch eine Glykogenverarmung und eine Abnahme der Glucose-6-phosphatase-Aktivitiit als Folge des Gluco- corticoidmangels (WEBER, 1963; RAY, FOSTm~ u. LARDY, 1964) aus- geschaltet (siehe Abb. 1).

Der Effekt des Insulins auf den cellul/~ren Glucosetransport sowie der insulinunabh~ngige Basaltransport werden durch Diazoxid nicht be- eintrachtigt (Abb. 2).

DaB die Diazoxidwirkung jedoch nicht nur auf einer Hemmung der Insulininkretion beruht, geht aus Versuchen an Tieren mit einem Alloxandiabetes hervor. Die i.v. Injektion yon Diazoxid ffihrt auch

Beteiligung des Insulins an der Diazoxid-Hyperglyk~imie 391

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75 LlSmin 0 15 ¢S min Abb. 2. ]~influB yon Insulin (0,5 I .E./kg i.v.) auf den Abfall der Glucosekonzentration im Blur nach Gabe yon 1,67 g Glucose/kg, 2 Std nach 400 mg/kg Diazoxid p.o. (Alloxandiabetische, adrenal-

ektomierte Ratten, Substitution: 5 Izg d-Aldosteron + 5 mg Hydrocortison/kg)

Tabelle 2. Steigerung der Glucosekonzentration im Blut durch Diazoxid nach isolierter Ausschaltung der lnsulin l-Inkretion sowie kombinierter Ausschaltung der Insulin 1-,

Adrenalin 2_ und Noradrenalin~. Freisetzung

Glucosekonzentration im Blur (mg°/0)

Diabetische Tiere

])iabetische, adrenalektomierte Tiere nach Vor- behandlung mit einem Ganglien- blocker

Kontrollen Diazoxid

2 Std nach i.v. 2 Std nach i.v. Ausgangswert Injektion des Ausgangswert Injektion yon

L6sungsmittels 200 mg/kg Diazoxid

400,6 ± 14,6 342,2 :J= 11,4 333,1 =t= 21,7 613,1 ± 28,2 A = --58,4

± 9,8 ~ \ p < 0,0002 /z ,d = +280,0± 33,5

(n = 46) (n = 10) I I

260,5 ~ 8,1 1 255,4 ± 15,0 282,9 ± 6,9 [ 341,~ ± 15,6 A = -- 5,1 /1 A = +58,7

±15,2 \ p = 0,005 ±i5,2 (n = 13) [ (n = 13)

1 80 mg/kg Alloxan i.v., 48 Std vor Versuchsbeginn. 2 Adrenalektomie, 24 Std vor Versuchsbegirm, + je 25 mg/kg Azamethonium-

bromid bei Versuchsbeginn (i.v.) und 1 Std danach (i.p.). Substitution der adrenal- ektomierten Tiere: 20 mg/kg Hydrocortison + 5 ~zg/kg d-Aldosteron.

un te r diesen Bedingungen zu einem weiteren Anst ieg der Glucose- konzen t ra t ion im Blu t (Tab.2). Der Effekt des Diazoxids ble ibt auch d a n n erhalten, wenn auBerdem eine Betei l igung yon Catecholaminen durch E n t f e r n u n g der Nebennie ren u n d Gabe eines Ganglienblockers

Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Path. Pharmak., Bd. 253 26

392 W. LOSERT, G. SE~rT, R. SITT, G. SC~ULTZ und H. KAESS:

zur Verhinderung einer adrenergischen Gegenregulation auf einen durch Diazoxid bedingten Blutdruckabfall (HUTC~ESON u. BARTHALAMUS, 1962; 0KUN, RUSSELL u. WrLSON, 1963) ausgeschaltet wird (siehe Tab. 2).

Diskussion Die verminderte Insulinkonzentration im Plasma, die nach i.v. In-

jektion yon 200 mg/kg Diazoxid auftritt , s t immt im Prinzip mit den yon FI~EI~IC~S, REIC~ u. CREUTZFELD (1965) mitgeteflten Befunden fiberein, nach denen Diazoxid die Insulinabgabe in vitro hemmt. KvAM u. STANTO• (1964) haben dagegen keine signifikante Abnahme der ,,insulin like activ- i ty" (ILA) im Plasma nach oraler Gabe yon 400 mg/kg Diazoxid festge- stellt. Der Arabinoseverteilungsraum war dabei unver~ndert. Wir haben bei Verwendung der gleichen oral verabfolgten Dosis ebenfalls keine Ab- weichung gefunden, die fiir eine Beeintr/~chtigung des insulinabh/~ngigen cellul/~ren Glucosetransports sprechen w/irde (LoSERT, SCHULTZ, SENFT U. SITT, 1965). Da die Aufnahme der Glucose in die Zelle bei Ver- minderung der Insulinkonzentration im Plasma naeh i.v. Injektion yon 200 mg/kg Diazoxid deutlich eingeschr/£nkt ist, scheinen die genannten Unterschiede auf den geringeren Diazoxid-Konzentrationen zu beruhen, die bei oraler Gabe infolge verzSgerter Resorption im 0rganismus auf- treten.

Die i.v. Gabe von 200 mg/kg Diazoxid fiihrt andererseits auch dann zu einer Hyperglyk/~mie, wenn die inkretorische Leistung des Insel- organs durch Alloxan gesch/~digt ist. Diese mit den Beobachtungen yon TABAC~IlqlCK, GULBENKIAN, ZEMAN U. BLACK (1963) und von TABACItNICK, GULBE~XIAN U. SEIDMAN (1964) bei pankreatektomierten Hunden sowie Yon GULBENKIAN, PETILLO, SC]:IOBERT, SEIDMAN, "~X~ANNELL U. TAEACtt- ~ICK (1963) bei alloxandiabetischen M/£usen iibereinstimmenden Be- funde zeigen, da$ die Hemmung der Insulininkretion nicht die einzige Ursache der Diazoxid-Hyperglyk/~mie ist. Eine Steigerung der Glyko- genolyse durch t I emmung der 3',5'-AMP-Phosphodiesterase, eine ver- mehrte Adrenahninkretion sowie eine Wirkungsverst/£rkung dieses I{ormons infolge verminderter 3',5'-AMP-Phosphodiesterase-Aktivit&t (Sc~ULTZ, SE~FT, LOSERT U. SITT, 1966) sind an den StSrungen im Kohlen- hydratstoffwechsel ebenfalls wesentlich beteiligt. Alle diese Faktoren, die sich bei der Entstehung der Diazoxid-Hyperglyk/~mie synergistiseh aus- wirken, k6nnen getrennt voneinander nachgewiesen werden.

Summary Insulin deficiency in alloxan diabetic animals has been shown to

reduce the active form of glycogen synthetase. This enzymic impairment has also been found in diazoxide treated rats. The conclusion that

Beteiligung des Insulins an der Diazoxid-Hyperglykamie 393

diazoxide lowers insul in incret ion has been proved by measur ing the radioimmunological ly detectable insul in p lasma concentra t ion.

I n accordance to this f inding insul in dependen t cellular glucose t rans- port has been found impai red in diazoxide t rea ted animals.

Admin i s t r a t ion of diazoxide to al loxan diabet ic ra ts results in a rise in extracellular glucose concent ra t ion indica t ing the diazoxide hyper- glycemia no t being caused by a reduct ion in insul in release only. The increased ra te of glycogenolysis caused by an inh ib i t ion of 3 ' ,5 ' -AMP phosphodiesterase and a consecutive enhancemen t of the metabol ic effect of epinephrine released from the adrenals are fur ther decisive factors.

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Priv. Doz. Dr. med. G. SENFT Pharmakologischcs Ins t i tu t der Freien Universi t£t 1000 Berlin 33, Thielallee 69/73