Archly ffir ldinische u. experimen~elle Derma~ologie 220, 374--382 (1964)

Aus dem Institu~ fiir Medizinische Chemie der Universi~t Wien (Vorstand: Prof. Dr. F. SEv, LIC~)

Die Wirkung des Hautsekretes der Gelbbauchunke (Bombina variegata L.) auf das Hautbindegewebe

yon Meerschweinchen, Ratten und M~iusen Von

W. RAAB und ]~. KAISER

Mi% 3 Textabbildungea

(Eingegangen am 25. Mai 1964)

WAhrend die I tautsekrete der Kr5 tea Gegenstar, d ausgedehnter che- mischer u_ad pharmakologiseher Untersuchungen warerl, liegerl fiber die Sekrete der t tautdrfisen der U~kea ~ur vereinzelt Angaben vor (vgl. MICKL u. KAISER 1964). Naeh GESSN~ (1926, 1938) zeigea die aktiven Substaazen des Hautsekretes der Unken sapoainartigen Charakter. Eiaer Gruppe yon Untersuchera (Kiss u. MIcn~ 1962; MIC~L u. BACE•AYER 1963) gelaag in letzter Zeit die Isolierung einer Reihe yon Peptiden aus dem Hautsekre t yon Bombina variegata L. ; ferner konnte der Naehweis des Vorliegens yon 5-Hydroxy~ryptamin erbracht werden (Kiss u. MIC~L 1962). Das Hautsekre t der Uaken besitzt eine starke l~eizwirkung auf versehiedene Gewebe uad ffihrt zur Kont rak tu r am isolierten Kalt- blfiterherz, am Skeletmuskel und an der glatten Muskulatur. Zum Unter- sehied zu den Bufonidengfften beruht die Wirkung am Kaltbliiterherz sicher nicht auf einem Digitaliseffekt (G~ss~ER 1938). Bei Untersuehung der Wirkung auf Einzelzellen zeig~ das Sekret der GelbbauehuIlke aieht nur gegen Erythrocytea , sondern auch gegen andere Zelltypen einen s tarkea cytotoxischen Effekt (W~]3ER 1923; Gozo~Y u. H O F r ~ E I C ~ 1930; Kis s u. MIC~L 1962; KAISER, MICHL u. SPR~G]~R 1964). Kfirzlich konnte die eytotoxisehe Wirkung aueh in der Gewebekultur nachgewiesen wet- den (SPRINGER U. KAISER 1964). Das Hautsekre t der Unken entfaltet s tark reizende Wirkung auf Itau~ und Schleimhi~ute des Menschen und ruft Niesen, Tr~nenflul~ und bei direktem Kon tak t lokales Stechea und Juckea hervor.

Die Wirksamkeit zahlreieher tieriseher Gifte beruht zumiadest teil- weise auf ei~em Histamineffekt, wobei verschiedene Gifte nicht nur selbst t t i s tamin enthalten, sondern auch als Histamial iberatoren wirksam sind (Literatur bei KAISER u. MIC]tL 1958). In erster Lir~ie ist die I t istamin- freisetzung durch Schlangengifte zu erw~hnen, auf die erstmalig yon

Wirkung des Hautsekretes der Gelbbauchunke 375

FELDBERG U. Mi ta rb . hingewiesen wurde (L i t e ra tu r be i RAAB U. K A I S ~ 1964). Neuerd ings wurde fiber die E x t r a k t i o n einer h i s taminf re i se tzenden F r a k t i o n aus Ascaris lumbricoides L. u n d den Ten take ln yon Cyanea capillata L. be r ich te t (HSGB]~O, S~I)ow, T ~ o ~ u. U v ~ s 1957; HSG- ~E~G, TUFVnSSON u. U v ~ s 1957; DIDACT, HSG~,~O, T ~ o ~ u. Uv~/ . s 1957; HSaB~RG u. UV~s 1958; UVNs 1960, 1961; U v ~ i s , D I ~ A ~ , H60]~En~ U. T ~ o ~ 1960; GAZZINELLI, GuIA, NEVES, PUDLES, BERALDO U. D~AS ])A S]~v~ 1961). A u f Grund dieser Befunde schien es yon In t e r - esse zu untersuehen , ob das Hautsekre~ der Ge lbbauehunke gleichfalls zu e iner His t aminf re i se tzung f/ ihrt . H_istamin wi rd im 0 rgan i smus in ers ter Linie aus Mastzel len freigesetzt , was morphologisch an der Degranu la t ion dieser Zellen zu erkennen ist (vgl. R~L]~ 1959; RA~B 1963); ein cyto- tox iseher Effekt au f Mastzel len , der zu einer His t aminf re i se tzung ffihrt , l~l~t sich daher in e infaeher Weise feststel len. Zur Prf i fung einer t t i s t~min- f re ise tzung wurde das Verha l t en der eu t~nea M~stzellen be i verschie- denen Versuehs t ie ren (Rat te , Maus, Meerschweinchen) nach in t ruder - ma]er A p p l i k a t i o n des Hau t sek re t e s yon Bombina variegata L. geprfif t . Zu Vergle icbszwecken erfolgten Para l le lversuche m i t dem Gift yon Agkistrodon ~iscivorus LAC~E~)E (Wassermokass inschlange; co t ton- mouth) .

Material und Methoden Die Untersuchungen erfolgten an sechs Ratten, sechs M~usen und zwSlf Meer-

schweinchen. Die Versuehe wurden an der Nackenhaut der Tiere durchgef/ihrt, da aus den Untersuchungea yon FELDBV.nG U. M~,S (i953) bekannt ist, dub in dieser Region eine relativ diehte Verteilung der Mastzellen bestekt, l~ach mechaniseher Epilation erhielten die Versuchstiere an einer Nackenseite vier intracutane In- jektionen yon je 100 ~g des getrockneten ttautsekretes der Gelbbauchunke (Bom- bina variegata L.) 1 in 0,1 ml 0,15 m KochsalzlSsung. Symmetrisch an der anderen Seitc erfolgte die intracutane Injektion yon 100 #g des Giftes der Wassermokassin- schlange (Agkistrodon 2~iscivorus Lacepede) I ebenfalls in 0,1 ml 0,15 m Kochsalz- 15sung. Zu Vergleichszwecken erhielten Tiere aller drei Species 0,1 ml 0,15 m Koch- salz]Ssung intracutan injiziert. Nach 5 und 30 min sowie nach 3 und 6 Std erfolgten jeweils links mid rech~s Excisionen einer Injektionsstelle, wobei vorher allf~llige makroskopiseh sichtbare Ver~nderungen beurteilt wurden. Mit den Kochsalz- kontrollen wurde in gleicher Wcise verfahren. Das bioptisch gewonnene material wurde in Chromatgemisch fixiert. Es warden 8 # dicke Schnitte angefertigt und mit It~malaun-Eosin, sowie mit 0,5~ w~riger To]uidinblaul5sung (pH 5,0) gef~rbt.

Bci 4 Versuchstieren jeder Species wurde an der epilierten Nackenhaut mehr- ma]s hintereinander 200/zg des Hautsekretes der Unken sowie des Schlangengiftes in 0,2 ml 0,15 m Kochsalzl5sung aufgebracht und eine allfiillige percutane Wirkung der Gifte in der bei vorliegenden Versuchen verwendeten Konzentration auszu- schlieI3en. Obzwar klinisch keinerlei Hautreaktionen zu beobachten waren, er- folgten bei je zwei Tieren Biopsien.

1 Fiir die l)berlassung der verwendeten Gffte sind wir Hcrrn Doz. Dr. I-I. MIcm~ (Wien) and Herrn Dr. Z. H~DIDIAN (Pittsburgh) zu grol3em Dank verpflichtet.

376 W. RA~t~ und E. K_~sE~:

Ergebnisse I. Intracutane A pplikation

a) Meerschweinchen. Schon 5 min nach Injektion des Hautsekretes yon Bombina variegata L. zeigte sich an der Injektionsstelle eine gerin ge R6tung und Schwellung, die im Verlaufe yon 3 Std langsam abklang. Im histologi- sehen Pr~parat (Abb. 1) land sieh bereits nach 5 rain eine Auflockerung des oberen Ceriums, die Gef/~Be waren weitgeste]lt und bluterfiillt, die Endo- thelien zeigten Schwellungen. Blutungen waren nieht nachzuweisen. Eine

Abb. 1. ~Ieerschweinchen~haut, 5 rain nach Einbringung yon 100/*g ]tau~sekret der Gelbbauchunke. Im mittleren Cerium finder sich ein metachromatischer (im Schwarz-Wei~-Bild dunkelgrauer)

Streifen. (Chromatfixielxmg, 0,5~ w~l]riges Toluidinblau p i t 5, 224fach)

ge~nderte Anfs des Hautbindegewebes mit w~B~ger Toluidin- blaul6sung (pg 5,0) wies auf eine Verschiebung des pH-Wertes des Binde- gewebes. Uber grSl~ere Abschnitte land sich ein subepidermal gelegener metachromatischer Streifen. Einzelne perivascul~re und frei hn Gewebe liegende Mastzellen zeigten beginnende Degranulation. Nach 30 inin war insofern eine J~nderung des B~]des festzusbellen, als der metachromatische Streifell subepidermal verschwunden war. Im ganzen Cerium hatte eine h6hergradige Aufloekerung der S~ruktur eingesetzt; das Bindegewebe lieB weiterhin, in den meisten Biopsien sogar in versts M~Be, eine ver~nderte Anfs erkermen. Die Gef~l~ver~tnderungen hatten zugenommen, jedoch sah m~n nur ganz vereinzelt Erythrocyten aul3er- halb der Gef~Ll]e. Die Degranulation der M~stzellen war welter fort- gesehritten. Nach 3 Std befanden sich die Ver~tnderungen des Binde- gewebes mid der Gef~Be bereits in Riickbildung, Blutaustritte waren

Wirkung des Hautsekretes der Gelbbauchunke 37"i

nicht mehr naehweisbar, hingegen hatte die Mastzelldegraaulation zu- genommen. Nach 6 Std waren die Get , B- and BLudegewebsvers weiter abgeklungen, die Mastzellen hatten sieh zum GroBteil entleert und ~mpo~erten ~ls soge~a.nnte ,,ghost-cells".

Bereits 5 rain nach intracutaner Injektion des Giftes yon Aglcistrodon ~oiscivorus LACEPEDE zeigten sich samtliche Gef~Se des Coriums maximal weitgestellt und blutgefiillt, welters war eine deutliche Schwelhmg der Endothelien nachzuweisen. Um zahlreiche Gef~l~e famden sieh kleine,

Abb,2. M~usehau~, 5 rain nach :Ei~brhlgung yon I00 ~g Hautsekret de~ Gelbbauchunke. Zahh'eiche M~stzeile~, insbesondere in den tieferen Cm'iumschichten, lassen bereits deutlich eine Degranulierung

erk~mem (Chronm~fbxicrung, 0,5~]~ Jgcs w~r~ges Toluidinbla,u pt[ 5, 2S0fa~b)

klinisch noch nicht erkermbare Blutaustritte. Bindegewebsvers waren nur mal~ig ausgebildet, l~ast samtliche perivasculare Mastzellcn zeigten Degranulation, die freien Mastzellen el~viesen sich als weitgehend unverAndert. Naeh 30 min waren GefaBverAnderungen und Blut~ustritte in verstarktem MaBe zu beobachten; Blutungen waren klinisch deutlich erkennbar. Die MastzeUdcgranulation hatte zugenommen. Die Riiek- bildur~g dcr GefASver~nderungen setzte nach 3--6 Std ein, ws zu diesem Zeitpunkt die Mas~zellen ihre metachroma~isehen Granuta welter entleert hattem Naeh 6 Std sah man zahlreiehe v6~ig degr~nulierte Mast- zellen (,,ghost-cells"). Ia dea 30 min-Biopsien fanden sich auch frei im Gewebe liegende Mastzellen vom Degraaulierungsprozel~ mitergriffen, ebenso nach 3 und 6 Std.

5--30 min nach iatracutancr Injektion yon 0,15 m Kochsalzl6sung fanden sich geringgradige strukturelIe Auflockerungen im oberen Corium.

378 W. R ~ und E. KAISER:

b

Abb,3a u. b, Rattenhau~, Corium-Subcutis-Grenze. a 6 Std nach Eiabringung yon 0,1 ml einer physioIogischen KochsalzlSsung. Die ]~[ast2eilen lust durchwegs ~r begrenz~, b 6 Std nach Eia- br ingungvon ~(}0 ~g Hatt~ekre~ tier Getbbauchauke. Die ]~Ias~zelten weiCgehen4 4egranulier~

(ghost-ceils). (Chromatfixierung, 0,5~ w~Briges Toluidinblau pH 5, 700fach)

Nach 3 Std beobachtete man ganz vereinzelt degranulierte Mastzellen, etwa jede 10.--15. Mastzelle zeigte eiazelne auSerhalb der Zellko~tur liegende metachromatische Gr~nula.

Wirkung des I-Iautsekretes der Gelbbauchunke 379

b) Ratten und Miiuse. Da bei I~atten und Miiusen die gMchen l~eak- tionen auf das Hautsekret der Unkcn und auf das Schlangengift zu beob- achten waren, sollen diese beiden Tierarten im folgenden gemeinsam besprochen werden.

Bereits 5 mila nach intracutaner Injektion des Itautsekretes yon Bombina variegata L. waren geringgradige Gef/~gver/~nderungen sowie eine ptt-iimdertmg im Bi~degewebe und eine strukturelle Auflockerung des Coriums naehweisbar (Abb. 2). Daneben sah man eine betrgchtliche Degranulation dcr Mastze]lcn, die vorwiegend die perivascul~ren Mast- zellen ergriffelt hatte. Blutaustritte waren Ilicht nachweisbar. Nach 30 mill hatten die GefiiB- und Bindegewebsver/inderlmgen e~was zuge- nommen; die Mastzelldegranulation war ebenfalls deuthcher geworden. Naeh 3 und 6 Std zeigte sich eine beginnetlde giickbildung der GeNB- and Bindegewebsver/~nderultgen; die Degralmlierur~g der Mastzellen hatte welter zugenommen (Abb.3).

Schoa 5 min naeh Injektion des Giftes yon Agkistrodon piseivorus LAC~rEDE liegen sich geringfiigige Bmdegewebs- mad Gef/igver/inderungen erkennen, die nach 30rain ihr Maximum erreiehten mad darm langsam ab- klangcn. Degranulatioltserscheinungen an Mastzellelt setztelt bereits itach 5 min ein; Itach 6 Std war die fiberwiegende Zahl der Mastzellen entleert. Blutaustrit te aus den Gef~geI1 waren zu keinem Zeitpultkt nachweisbar.

Bei den Kontrollen mit 0,15 m KochsalzlSsmag fanden sich, ~hnlich wig bei den Meerschweinchell, Imr geringfiigige, Ultchurakteristische Ver- gndertmgen.

II. Epieutane A pplikation Naeh mehrmaliger epieutaner Verabreichtmg yon 200 fig des Unken-

hautsekretes oder des Sehlangengiftes waren bei keiner der drei Species klinisehe oder histologisehe Ver~nderungen festzustellen.

Besprechung der Ergebnisse

Die Ergebnisse lassen deutlich erkennen, dab nich~ nur das gepriifte Schlangengfft, dessen Wirkung auf die Mastzellen der Maus bereits yon ZAJZL u. NOWaK (1951) untersucht worden war, sondern auch das Itaut- sekret der Gelbbauehunke nachintracutaner Applikation zu einer Degranu- lation der Mastzellen ffihrt. Naeh mehrmaliger epieutaner Verabreichung yon 200 #g der beidert Gffte waren bei den drei untersuehten Species weder klinische noeh histologisehe Ver/~nderungen festzustellen. Die t~eaktionen nach intracu~aner Applikation yon Unkenhautsekret und Sehlangengift unterschieden sich bei Meerschweinchen hiItsichtlich der zu beobachtenden Blutungen, die nut nach Injektion dos Gfftes yon Aglcistrodon piscivorus LAcErE])]~ auftretea. Nach Injektion des Haut- sekretes von Bombina variegata L. sind trotz der betr/ichtliehen Gef/~l~- ver/inderungen Blutungen nicht nachweisbar. Sehlangengift verursacht

380 W. i%Ais und E. K .~s~ :

bei allen drei Species eine rascher einsetzende und intensivere Degranu- lation der MastzelIen als das Hautsekre t der Gelbbauehunke.

Die Schwierigkeiten bei der Fraktionierung des Hautsekretes yon Bombina variegata L. haben es bisher nieht gestattet , einzelne Gifffrak- tionen in grSfieren Mengen herzus~elien. Urttersuchungea mit gereinigten Komponemten des Hautsekretes mugten aus diesem Grunde unterbleiben. Es lassen sich deshMb fiber die Ursaehe der dutch das Unkenhautsekret hervorgerufenen Mastzelldegranulatioti zur Zeit noch keine genaueren Aussagen ~reffen. Prinzipiell kann es auf zwei Wegen zm" Mastzell- degranulatiorL kommen: durch osmotische t%eize (z. B. Injekt ion von Wasser) oder dutch spezifischere Meehanismert, z. B. dutch Einbringung mastzellerschSpfender Substanzen. Eingehendere Untersuehungen haben ergeben, dag aueh versehiedene Eiweigk6rper einen mastzelldegranulie- renden Effekt besitzen. Eine besondere I%olle spielen aueh proteoly~ische Fermente (Literatur bei RAAB u. K A I s ~ 1964).

Am wahrscheinlichsten erseheint es, einen eytotoxischen EtI%kt ffir die Ver/~nderungen der Mastzellen verantwortlieh zn maehen. Auf Grund der betri~ehtlichen Empfindiiehkeit der Mastzellmembran ist es verstandlieh, dab ghnliche eytotoxisehe Effekte wie z. g . an Erythroeyten ausl6sbar sind. Zweifellos ist aber noeh ein anderer Faktor zu berficksiehtigen. Kiss u. MXCHL (1962) haben im t tautsekre t der Gelbbauchunke 5-Hydroxy- t ryp tamin identifizieren k6nnen. Es ist sehr wahrscheinlieh, dab das im I tautsekre t der Gelbbauehunke enthaltene 5-Hydroxyt ryptamin bei der Ausl6sung der Mastzelldegramdation mitwirkt, da diese Substanz auch in der menschliehen I-Iaut eine mastzelIerseh6pfende Wirkung entfaltet (Literatnr bei I%AA~ 1963).

Wie bereits erw/ihnt, kommt es nach Berfihren der Unken zu lokalem Brennen und Juckreiz. Man wfirde als ansl6sendeUrsaehe einenI-Iistamin- effek~ vermuten. M6glicherweise kommt der Juckreiz abet fiber einen anderen Meehanismus zustande, wobei der Aktivierung proteolygischer Fermente in der H a u t ehle bedentende l%olle zukommen dfirfte (Literatur bei RAAS u. K A I S ~ 1964). Von besonderem Intercsse ist in diesem Zusammenhang die Beobaehtung, dal3 die Verabreiehung mastzell- ersch6pfender Substanzen zu eincr starken Degranulierung und zu einem relativ schwaehen Juckreiz ffihrt; die intraeutane Gabe yon Trypsin bewirkt hingegen s~arken Juckreiz und geringftigige Xnderung der Mor- phologie der Mastzellen (BI~AzzI, LANDI u. Frxzi 1961). Es wird dutch wei~ere Versuchsserien zu kl&ren sein, ob dieser lV[eehaaismus in diesem Zusammenhang tatsachlieh yon Bedeugung ist.

Zusammenfassung Zur Feststellung eines mastzelldegra~ulierenden Effek~es des I-Iaut-

sekre~es der Gelbbauchunke (Bombina variegata L.) wurder~ 100 #g des

Wirkung des ttautsekretes der Gelbbauchunke 381

Sekretes in die I-Iaut v o a Meerschweinchen, R a t t e n und M/s in t ra - cu tan in j iz ier t . Zu verschiedenen Z e i t p u n k t e n nach der I n j e k t i o n erfolg- t en Biopsien, u m den Ver lauf der morphologischen J~nderungen an den Mastzel len sowle a m Gef/~l]bindegewebsapparat verfolgen zu kSnnen. Die Ergebnisse zeigten, dab das t t a u t s e k r e t der Ge lbbauchunke einen s t a rk mas tze l ldegranu l ie renden Effekt besitz~, der al lerdings n ich t die In tens i t / i t der W i r k u n g des Gfftes der Wassermokass insch lange (Agkistro- don piscivorus LAcEPv~])w) erreicht . I n der Diskuss ion erfolgt eine Be- sprechung der verschiedenen Mechanismen, die zur Mas tze l ldegranu la t ion Anla$ geben k5nnen. Als Ursache ffir die Mas tze l ldegranu la t ion nach i n t r a c u t a n e r A p p l i k a t i o n des Hau t s ek re t e s der Ge lbbauchunke dfirf te vorwiegend ein cy to tox ischer Effekt sowie eine 5 - H y d r o x y t r y p t a m i n - wi rkung ve ran twor t l i ch sein. Die ep icu tane Aufb r ingung yon 200 fig des H a u t s e k r e t e s ff ihrt bei Meerschweiachen, Ra~ten und M/~usen zu ke inen kl inischen oder his tologischen Ver/~nderungen.

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Dr. WOL~G~NG RAAB, Med.-Chem. Univ.-Institut, Wien 9, W~hringerstraBe 10 (0stcrreich)