DISSERTAÇÃO PALU FINAL

UNIVERSIDADE DE CUIBÁ

Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal Área de Concentração Saúde Animal

LUCIANA PALÚ

AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITINA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL

DO PEDÍCULO HEPÁTICO E REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS

Cuiabá, 2013

UNIVERSIDADE DE CUIBÁ Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal

Área de Concentração Saúde Animal

LUCIANA PALÚ



Cuiabá, 2013

LUCIANA PALÚ


DO PEDÍCULO HEPÁTICO E REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito para obtenção do Título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo

Cuiabá, 2013

FICHA CATALOGRÁFICA

Bibliotecária: Daniely Cristina Bejo da Silva / CRB1 - 0611

P184a Palú, Luciana. Avaliação da concentração de ferro sérico e ferretina em ratos, após

clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão, em diferentes tempos / Luciana Palú. – 2013.

77f.: il.; 30cm. Orientador: Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo. Dissertação (mestrado) – Universidade de Cuiabá - UNIC,

Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal, Cuiabá, 2013. Inclui bibliografia.

1. Análise bioquímica. 2. Ferro sérico. 3. Clampeamento-pedículo hepático. 4. Reperfusão. 5. Ratos. I. Título: Avaliação da concentração de ferro sérico e ferretina em ratos, após clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão, em diferentes tempos. II. Universidade de Cuiabá.

CDU – 619:577.1

LUCIANA PALÚ



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito para obtenção do Título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo

BANCA EXAMINADORA

______________________________________ Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo - UNIC

______________________________________________ Profa. Dra. Ana Helena Benetti Gomes - UNIC

______________________________________________ Profa. Dra. Lisiane Pereira de Jesus - UFMT

Cuiabá, ___ de ____________ de 2013.

Conceito Final: _____________

Aos meus pais , pelo exemplo de persistência e honestidade, a mim pelo comprometimento e dedicação e ao Lázaro pela paciência, tolerância e pelas agradáveis horas compartilhadas. Em especial ao meu filho Guilherme Palú pelo carinho, incentivo e pela luz que trouxe à minha vida.

AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo, meu orientador, por sua dedicação, contribuição científica e profissionalismo. Ao Prof. Dr. Sílvio Henrique de Freitas, meu coorientador, pelo comprometimento, ensinamentos e profissionalismo. À Profa. Dra. Ana Helena Benetti Gomes por participar das minhas bancas de qualificação e defesa de dissertação, pela paciência e pelos apontamentos que ajudaram em muito o meu crescimento como pesquisadora. À Prafa. Dra. Lisiane Pereira de Jesus por participar de minha banca de defesa de dissertação e pelas correções e incentivos realizados à minha pessoa que muito engrandeceram como profissional. À Universidade de Cuiabá que colaborou e propiciou esse mestrado com competência, pela oportunidade e pela contribuição para meu crescimento pessoal e profissional. Ao Prof. Dr. Marcelo Diniz dos Santos pela brilhante coordenação do nosso Mestrado e pelo companheirismo e comprometimento durante essa minha jornada. Ao Prof. Dr. Carlo Ralph De Musis pelo infinito conhecimento, pelo carinho, comprometimento e ajuda com a parte de estatística de minha dissertação. À Fundação de Amparo a Pesquisa de Mato Grosso – FAPEMAT por acreditar no meu trabalho e financiar o mesmo propiciando sua conclusão. À minha eterna chefe Ilza Marta de Souza pelo companheirismo, comprometimento, pela amizade sincera e profícua e por todos os ensinamentos de vida que permitiram meu crescimento pessoal. Ao amigo Márcio Ferrari pelo incentivo e pela eterna amizade e por esse ser fantástico que és. À professora Ângela Maria Nolasco Monteiro por acreditar em mim e no meu trabalho no início de minha carreira e pela eterna amizade e dedicação para comigo. À Profa. Lívia Saab Muraro pela consideração e ajuda na realização da parte experimental da minha dissertação. Aos funcionários e professores do Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá pela ajuda e dedicação durante a realização da parte experimental de minha dissertação. Ao acadêmico William Barella da Rocha pelo companheirismo e dedicação no acompanhamento e na coleta e processamento dos materiais gerados na parte experimental de minha dissertação.

Ao funcionário Willian Carneiro de Franca Leão pelo carinho e ajuda com os animais do biotério. Aos colegas Nestor Albino de Aguiar Junior e Cristiane Calçada pelo comprometimento e pela ajuda na realização dos exames laboratoriais da parte experimental de minha dissertação. Aos colegas do mestrado pelo companheirismo, pela paciência e agradável convívio. Ao professor Walmir Cibin Watanabe, meu professor de Inglês, que contribuiu com minha formação e possibilitou minha proficiência. Aos amigos Inês Gameiro Colvara Beloli, Michelle Igarashi e Kledir Anderson H. Spohr pelo carinho, paciência, pelo incentivo, pela maravilhosa amizade e pelos momentos de alegria que passamos juntos durante esses dois anos.

“O tempo é muito lento para os que esperam, Muito rápido para os que têm medo, Muito longo para os que lamentam,

Muito curto para os que festejam, Mas, para os que amam, o tempo é eterno.”

Shakespeare

AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITI NA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO E

REPERFUSÃO EM DIFERENTES TEMPOS

RESUMO

No trauma hepático, torna-se necessário o bloqueio do fluxo sanguíneo para facilitar as manobras cirúrgicas reparadoras. Uma das formas de conter essa hemorragia é por meio do clampeamento total do pedículo hepático (artéria hepática, veia porta e colédoco). No entanto, esse procedimento resulta na congestão esplâncnica e, consequentemente, perfusão sanguínea deficiente de órgãos como fígado, estômago, intestino delgado, parte anterior do intestino grosso, pâncreas e baço. Além disso, ao restabelecer o fluxo sanguíneo desses órgãos, novas complicações, além das lesões já causadas pelo clampeamento, surgirão. Avaliou-se neste estudo, as concentrações de ferro sérico e ferritina após desclampemaneto do pedículo hepático em vários tempos. Foram utilizados 42 ratos Wistar, machos, com três meses de idade e peso médio 300 gramas, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos experimentais: grupo controle (GC) – representados por seis animais que não foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático; grupo E10, representado doze animais que foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 10 minutos; grupo E20, representado doze animais que foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 20 minutos e grupo E30, representado doze animais foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 30 minutos. Cada grupo clampeado foi subdividido em quatro subgrupos representados por três animais, nos quais desclampeados para reperfusão: subgrupo R15, - submetidos a 15 minutos de reperfusão, subgrupo R30 - submetidos a 30 minutos de reperfusão, grupo R60 - submetidos a 60 minutos de reperfusão e grupo R120 - submetidos a 120 minutos de reperfusão.

Palavras chaves: Ferritina. Ferro sérico. Isquemia. Ratos wistar. Reperfusão.

Determination of serum iron and ferritin in rats af ter total hepatic pedicle clamping and reperfusion at different times.

ABSTRACT

In hepatic trauma, it is necessary the blocking of the blood flow to facilitate reparative surgical maneuvers. One way to stop this hemorrhage is through total clamping of the hepatic pedicle (hepatic artery, portal vein and common bile duct). However, this procedure results in splanchnic congestion and hence poor blood perfusion of organs such as liver, stomach, small intestine, anterior part of the large intestine, pancreas, and spleen. Furthermore, by restoring blood flow to those organs, new complications, as well as injuries caused by clamping, arise. This study evaluated, the concentrations of serum iron and ferritin after the declamping of pedicular liver at various times. It was used a total of 42 male Wistar rats with three months old and weighting 300 grams, randomly divided into four groups: control group (CG) - represented by six animals that haven´t been submitted to the hepatic pedicle clamping; E10 Group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 10 minutes; E20 group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 20 minutes and E30 group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 30 minutes. Each group has been subdivided into four clamped subgroups represented by three declamping animals from reperfusion: subgroup R15, - submitted to 15 minutes of reperfusion, subgroup R30 - subjected to 30 minutes of reperfusion, group R60 - subjected to 60 minutes of reperfusion and group R120 - subjected to 120 minutes of reperfusion.

Keywords: Ferritin. Iron. Ischemia. Male Wistar. Reperfusion.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Tabela 1 – Valores médios de ferro sérico (mcg/dL) em ratos submetidos a 10 (T10), 20 (T20) e 30 (T30) minutos de clampeamento seguidos de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.

72

Tabela 2 - Tabela 2 – Valores médios de ferritina (ng/mL) em ratos submetidos a 10 (T10), 20 (T20) e 30 (T30) minutos de clampeamento seguidos de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.

72

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - A: Vilo intestinal normal, não isquêmico, de intestino delgado eqüino. B: Mucosa de intestino delgado eqüino após 60 minutos de obstrução estrangulatória

21

Figura 2 - Eventos celulares relacionados à conversão da xantina

desidrogenase a xantina oxidase durante a hipóxia. 26

Figura 3 - Transporte do ferro através do epitélio intestinal 36 Figura 4 - Transporte do ferro através da membrana do macrófago 36 Figura 5 - Endocitose do complexo transferrina-receptor da

transferrina 38

Figura 6 - Homeostase do ferro 39 Figura 7 - Molécula de ferritina com átomos de ferro em sua poção

central 40

Figura 8 - Regulação molecular da produção da hepcidina 44 Figura 9 - Animal sendo submetido a tosquia da região abdominal

com máquina tosquiadeira 64

Figura 1 0 - Anti-sepsia da região abdominal do animal com PVPI

tópico 64

Figura 1 1 - Panos de campos colocados sobre o animal 65 Figura 1 2 - Celiotomia pré-reto umbilical com bisturi 65 Figura 1 3 - Ampliação da incisão da cavidade abdominal com

tesoura Merzenbaum 66

Figura 1 4 - Ilustração do pedículo hepático 66 Figura 1 5 - Apresentação do hilohepático 67 Figura 1 6 - Clampeamento do pedículo hepático com pina vascular 67 Figura 1 7 - Animais durante a isquemia e a reperfusão 68 Figura 1 8 - Animais durante a reperfusão 68 Figura 1 9 - Intestino delgado e estômago congestos após 70

clampeamento do pedículo hepático. Figura 20 -

Notar em C (grupo controle) pigmento de hemossiderina dentro do macrófagos, aumenta progressivamente (setas), nos grupos E1 (10 minutos), E2 (20 minutos) e E3 (30 minutos). Reação de Perls (Ferrocianeto-férrico) 10X.

71

Figura 2 1 - Concentração de ferro sérico (mcg/dl) de ratos

submetidos ao clampeamento (isquemia) seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.

73

Figura 2 2 - Concentração de ferritina (ng/ml) de ratos submetidos ao

clampeamento (isquemia) seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.

74

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 17 2 REVISÃO DE LITERATURA 20 2.1 ISQUEMIA 20 2.2 REPERFUSÃO 23 2.2.1 Patofisiologia da injúria de reperfusão 25 2.3 METABOLISMO DO FERRO 31 2.3.1 Absorção intestinal do ferro 33 2.3.2 Transporte do ferro para os tecidos 37 2.3.3 Ferritina 40 2.3.4 Sobrecarga de ferro 44 REFERÊNCIAS

48

3 3.1 3.2

OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS

56

56

56

4 ARTIGO 57 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E

FERRITINA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO E REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS

4.1 INTRODUÇÃO 60 4.2 MATERIAL E MÉTODO S 62 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 69 4.4 CONCLUSÃO 74 REFERÊNCIAS 75 5. CONCLUSÕES GERAIS

79

1.INTRODUÇÃO

O sistema digestório está envolvido com secreções e absorções de

nutrientes, tais como: minerais, proteínas, vitaminas, açúcares e gorduras. As

enzimas e alguns tipos de ácidos estão envolvidos na digestão dos alimentos. A bile,

o suco pancreático e a água também contribuem no processo. O sistema digestório

possui uma barreira mucosa capaz de protegê-lo contra as ações do suco gástrico

durante o processo de digestão, além de impedir a penetração de microorganismos

patogênicos no organismo. A absorção de nutrientes, vitaminas e minerais está

localizada no intestino delgado (CAMARGO, 2004).

Restrepo e Felix (1994) observaram que a isquemia intestinal constitui uma

injúria associada a alta letalidade. Com o aumento crescente de problemas que

afetam a sociedade moderna, a enfermidade vascular abdominal adquire

preponderante importância epidemiológica. A gravidade e a extensão da necrose

intestinal isquêmica dependem do vaso principal afetado, da qualidade e da

circulação colateral e de sua capacidade de resposta, além do estado da circulação

geral e do grau de reperfusão. A isquemia resulta na liberação de grande quantidade

de agentes tóxicos endógenos, que são produtos normais e do metabolismo celular,

gerados inicialmente pela hipoperfusão e anóxia, agravando-se com a reperfusão

dos tecidos afetados. Esses produtos tóxicos exercem ação deletéria, tanto local,

como sistêmica.

Devido à lesão de mucosa, a isquemia se torna particularmente grave no

intestino, desencadeando efeitos intensos e complexos, em decorrência da absorção

de endotoxinas e da ocorrência de distúrbios hidroeletrolíticos e no equilíbrio ácido-

base, que se manifestam em órgãos à distância e cujo tratamento é mais difícil que

a correção dos distúrbios isquêmicos ou ressecção cirúrgica intestinal (MOORE,

1990).

Nas lesões sangrantes dos órgãos drenados pelo sistema porta, torna-se

necessário o bloqueio de seus vasos sanguíneos para que procedimentos cirúrgicos

reparadores possam ser realizados (SILVA JR. et al., 2002; ARAÚJO JR. et al.,

2005). Desde 1908, para conter hemorragias hepáticas, Pringle propôs a realização

do clampeamento total do pedículo hepático (artéria hepática, veia porta e

colédoco), procedimento que resulta na congestão esplâncnica e,

consequentemente, perfusão sanguínea deficiente de órgãos como fígado,

estômago, intestino delgado, parte anterior do intestino grosso, pâncreas e baço

(SEBE, 1999; CAMARGO et al., 2003; FREITAS, 2004; CAMARGO, 2004;

BRASILEIRO et al., 2007; PIRES, 2008). Na sequência, ao restabelecer o fluxo

sanguíneo hepático, reperfusão, novas agressões surgirão além das lesões já

causadas pelo período de isquemia (MIRANDA et al., 2004, SILVA, et al., 2006).

Da mesma forma, supõe-se que nos casos de dilatações vólvulo-gástrica,

encarceramentos nefro-esplênico ou gastro-esplênico, torção esplênica,

intussuscepção e torção intestinal, em que ocorre compressão seguida de

descompressão do pedículo hepático, ou seja, uma isquemia seguida de reperfusão

possa culminar com o comprometimento dos órgãos envolvidos com o sistema porta,

como fígado, baço, pâncreas, estômago, intestino delgado, além das lesões em

órgãos remotos, como pulmões, rins, coração e musculatura esquelética (CAMPOS

e YOSHIDA, 2004; MIRANDA et al., 2004; FRANCISCO NETO et al., 2005;

CAMARGO et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2009; FREITAS et al., 2009).

O evento isquêmico inicia uma resposta inflamatória que se perpetua após a

reperfusão sanguínea, em grande parte, devido à produção de espécies reativas do

metabolismo do oxigênio (BERNADI, 2007). Esse fenômeno é conhecido como

lesão de isquemia e reperfusão. Esse evento envolve mecanismos fisiopatológicos e

vias metabólicas complexas, ainda pouco esclarecidas, porém o resultado final é a

falência de órgãos e morte do paciente (MIRANDA et al., 2004; SILVA, et al., 2006).

Sendo assim, células submetidas à isquemia, que não sofreram lesão

irreversível, com a reperfusão, em vez de se recuperarem, evoluem para morte por

necrose. Os mecanismos propostos incluem a formação de espécies reativas de

oxigênio nas células parenquimatosas, endoteliais e nos linfócitos que infiltram a

lesão, que produzidas durante a reperfusão causam lesão celular diretamente por

agredir uma variedade de moléculas celulares e indiretamente pela promoção da

síntese de mediadores pró-inflamatórios (DAEMEN et al., 2002).

O radical hidroxil (HO) é o mais reativo das espécies reativas de oxigênio

(EROs), o qual é responsável pela peroxidação lipídica e lise da membrana celular.

A presença do ferro (Fe++), íon metálico de transição, associado com o peróxido de

hidrogênio, por meio da reação de Fenton ou Haber-Weiss, potencializa a formação

do radical hidroxil (CAMPOS e YOSHIDA, 2004). Estudos desenvolvidos por Freitas

et al. (2009, 2009a), realizando o clampeamento total do pedículo hepático (manobra

de PRINGLE, 1908), mostraram, pela técnica do ferrocianeto-férrico, acúmulo

progressivo de pigmentos férricos (hemossiderina) nos macrófagos presentes no

parênquima esplênico, durante a congestão esplâncnica. Supõe-se que, com a

reperfusão, esse íon ferro acumulado alcance a corrente sanguínea, potencializando

a formação de radicais hidroxil e, consequentemente, as injúrias promovidas pelas

espécies reativas do oxigênio.

Com a evolução dos estudos na área dos transplantes hepáticos, modelos

experimentais de isquemia e reperfusão hepática têm sido muito difundidos. Além

dos transplantes hepáticos, esses modelos podem ser utilizados em inúmeras outras

situações, como em ressecções hepáticas, devido a tumores, traumas com lesão

hepática e choque hemodinâmico. Pela relevância dos resultados obtidos com a

isquemia promovida pelo clampeamento total do pedículo hepático (manobra de

Pringle modificada), em diferentes tempos (SEBE, 1999; CAMARGO, 2004; PIRES;

2008; FREITAS, 2009), propõe-se neste estudo, pesquisar a concentração de ferro

sérico e ferritina, após clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão em

diferentes tempos.

O objetivo deste trabalho é avaliar e correlacionar a concentração de ferro

sérico e ferritina após o clampeamento total do pedículo hepático (isquemia),

seguido do desclampeamento (reperfusão), em tempos definidos. Tempos definidos

para isquemia, pelo clampeamento do pedículo hepático (10, 20 e 30 minutos),

seguido de reperfusão pelo desclampeamento em tempos definidos (15, 30, 60 e

120 minutos).

2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ISQUEMIA

A obstrução mecânica dos vasos sanguíneos do intestino pode levar à

isquemia, que é uma redução crítica do suprimento sanguíneo, causando perfusão e

oxigenação inadequadas do tecido. Durante a isquemia intestinal, as células

realizam glicólise anaeróbia, gerando acúmulo de ácido láctico intracelular e uma

produção deficiente de ATP. O aumento da concentração sanguínea de lactato e

próton tem sido associado a um prognóstico desfavorável em cavalos com

isquemia/reperfusão de cólon maior. As células da mucosa epitelial são as mais

suscetíveis à injúria e rapidamente lesadas em virtude de comprometimento do fluxo

sanguíneo (ROWE e WHITE, 2002).

As mudanças na mucosa metabolicamente ativa isquêmica (Figura 1) podem

ser graduadas em severidade de Grau I (desenvolvimento de um espaço

subepitelial, chamado espaço de Gruenhagen, e um leve desprendimento epitelial

no topo da vilosidade) ao Grau V (completa perda da arquitetura da vilosidade, com

severa hemorragia da mucosa e perda da lâmina própria). No cólon equino, ao

contrário do intestino delgado, a isquemia completa causa necrose celular e

desprendimento de pequenos aglomerados de células epiteliais da superfície (MAIR

et al., 2002).

Figura 1 - A: Vilo intestinal normal, não isquêmico, de intestino delgado equino. As células da mucosa formam uma barreira impermeável. B: Mucosa de intestino delgado equino após 60 minutos de obstrução estrangulatória. Há perda de integridade da barreira epitelial.

Fonte: Rowe e White ( 2002).



reparadores possam ser realizados (SILVA JR et al., 2002; ARAÚJO JR et al., 2005).

Desde 1908, para conter hemorragias hepáticas, Pringle propôs a realização





(SEBE, 1999; CAMARGO et al., 2003; CAMARGO, 2004; FREITAS et al., 2006;

PIRES, 2008).

Na sequência, ao restabelecer o fluxo sanguíneo hepático, novas agressões

surgirão além das lesões já causadas pelo período de isquemia (MIRANDA et al.,

2004, SILVA et al., 2006).

Da mesma forma, supõe-se que nos casos de dilatação vólvulo-gástrica,


intussuscepção e torção intestinal, ocorre compressão seguida de descompressão

do pedículo hepático, ou seja, isquemia seguida de reperfusão, o que pode culminar

com o comprometimento dos órgãos envolvidos com o sistema porta, como fígado,

baço, pâncreas, estômago, intestino delgado, além das lesões em órgãos remotos,

como pulmões, rins, coração e musculatura esquelética (CAMPOS e YOSHIDA,

2004; MIRANDA et al., 2004; FRANCISCO NETO et al., 2005; CAMARGO et al.,

2006; TEIXEIRA et al., 2009; FREITAS et al., 2009).



metabolismo do oxigênio (ERMO) (BERNADI, 2007). Esse fenômeno é conhecido

como lesão de isquemia e reperfusão. Esse evento envolve mecanismos

fisiopatológicos e vias metabólicas complexas, ainda pouco esclarecidas, porém o

resultado final é a falência de órgãos e morte do paciente (MIRANDA et al., 2004;

SILVA, et al., 2006).

Darien et al. (1995) realizaram um estudo envolvendo obstrução

estrangulatória intestinal induzida em equinos, com o objetivo de avaliar e

estabelecer parâmetros de graduação para a avaliação das lesões histopatológicas

do intestino isquêmico ao longo do tempo. Os autores observaram que após uma

hora de isquemia, o escore histopatológico do grupo experimental diferiu

significativamente do grupo controle. Ocorreu separação progressiva de células

epiteliais com células adjacentes e membrana basal, formação de edema,

hemorragia e acúmulo de debris necróticos na lâmina própria. O escore

histopatológico aumentou progressivamente com duas horas de reperfusão.

Com a isquemia, ocorre falta de produção de energia na célula e inicia-se um

processo degenerativo. Com cinco minutos de isquemia já existem alterações nas

mitocôndrias, sendo que estas precedem as mudanças citoplasmáticas e de

membrana, que ocorrem nos primeiros 30 minutos, pela ativação de fosfolipases,

produção de citocinas e acumulação de ácido aracdônico (SMITH, 2002).

A persistência da isquemia promove falha no transporte de íons pelas bombas

de membrana, tornando possível a entrada do cálcio no citoplasma, e isto ativa

proteases que causam dano à membrana celular e aglutinação nuclear. O cálcio

aumentado na mitocôndria inibe a fosforilação oxidativa (SMITH, 2002).

No intestino, podem ocorrer mudanças histológicas após 30 minutos de

isquemia, quando células epiteliais da mucosa e células mesoteliais da serosa

separam-se de sua membrana basal. Este parece ser um mecanismo de separação

causado pelo movimento de água do leito vascular para o espaço subepitelial. A

separação inicialmente ocorre no ápice das vilosidades, e pode se agravar com a

persistência da isquemia. A mudança é similar no cólon, porém ocorre mais

lentamente. A serosa reage de maneira similar, com as células mesoteliais

desprendendo-se da membrana basal antes de existirem alterações de membrana

ou citoplasmáticas visíveis. Após 180 minutos de isquemia, a lâmina própria e a rede

vascular da mucosa têm perda de sua arquitetura. O tecido está necrótico e se torna

homogêneo, com falta de definição nuclear e estrutura celular (SMITH, 2002).

Algumas células, como as células musculares, parecem ser mais resistente à

isquemia, o que provavelmente se deve a uma maior reserva de energia intracelular

das células. Existem também diferenças na resposta a isquemia de baixo fluxo e a

obstrução arteriovenosa total (SMITH, 2002). A isquemia do intestino pode ocorrer

por encarceramento (causando constrição arteriovenosa direta), por volvulo

intestinal (quando aumenta o retorno venoso), assim como por torções, hérnias

estranguladas e obstrução vascular por trombo-embolismo devido à infecção por

Strongylus vulgaris (pouco expressivo atualmente). A distensão de segmento

intestinal próximo à lesão e a distensão cecal por disfunção também causam

isquemia, já que a pressão intraluminal aumentada acaba comprimindo capilares e

vênulas (MATOS et al., 2000).

O evento isquêmico inicia uma resposta inflamatória que se potencializa com

a reperfusão sanguínea, devido à produção de espécies reativas do metabolismo do

oxigênio (ERMO), também conhecido como lesão de isquemia e reperfusão

(BERNADI, 2007). Esse evento envolve mecanismos fisiopatológicos e vias

metabólicas complexas, ainda pouco esclarecidas, que pode levar a falência de

órgãos e, em alguns casos, até a morte do paciente (MIRANDA et al., 2004; SILVA,

et al., 2006).

2.2 REPERFUSÃO

O conceito de injúria de reperfusão foi introduzido através da observação de

que a reperfusão do intestino isquêmico produziu um dano maior do que aquele

causado por um período de isquemia unicamente (PRICHARD et al., 1991).

As lesões causadas por isquemia progridem com a reperfusão. Se a

reperfusão ocorre enquanto as células são ainda viáveis, ocorre uma cascata de

eventos em conjunto, desencadeados pela entrega de oxigênio ao tecido

previamente isquêmico. A injúria resultante é chamada injúria de reperfusão e

baseia-se na renovação de oxigênio ao tecido, com participação de células

endoteliais e receptores aferentes para criar a resposta inflamatória subsequente

(SMITH, 2002).

Embora faça sentido que o oxigênio é necessário para ressuscitar as célula

previamente isquêmicas, o sistema inato de defesa de muitos tipos de células é

responder à mudança isquêmica com uma resposta inflamatória, e esta parece ser

uma defesa inicial contra invasão bacteriana e é destinada a remover células

danificadas do sistema. Se muitas células estiverem lesadas, o efeito da reperfusão

pode causar um quadro inflamatório suficiente para impedir a sobrevivência das

células, retardando a cura (SMITH, 2002).

Na década de 80, através de estudos em tecidos transplantados e em animais

submetidos a modelos de isquemia e reperfusão experimental, constatou-se que, em

determinadas situações, as lesões produzidas durante o período isquêmico

evoluíam com o retorno da perfusão (PARKS e GRANGER, 1986). Presumiu-se que

parte dos insucessos no tratamento poderiam ser atribuídos ao agravamento das

lesões preexistentes, chamadas lesões de reperfusão. Isso ressaltou a necessidade

de se associar à correção cirúrgica, procedimentos para prevenir ou atenuar as

lesões de reperfusão.

O esclarecimento mais aceito com relação ao mecanismo da injúria de

reperfusão é de que o início do dano tecidual ocorre por metabólitos oxigenados

reativos e a exacerbação do quadro se deve aos neutrófilos (MAIR et al., 2002).

A injúria de reperfusão inicia com uma mudança no metabolismo intracelular

em tecido previamente isquêmico. O processo depende da produção celular de

citocinas e leucotrienos como sinais para numerosas células sanguíneas e teciduais

necessárias para o evento (SMITH, 2002).

Assim, a injúria de reperfusão ocorre quando há déficit de suprimento

sanguíneo ao tecido, antes da ocorrência de morte celular irreversível, e consiste em

eventos bioquímicos posteriores ao retorno da perfusão, que causam dano ao órgão.

O processo pode ser iniciado por vários mecanismos que criam uma resposta

inflamatória (ROWE e WHITE, 2002).

Existem controvérsias sobre a ocorrência de injúria de reperfusão no cólon

maior de cavalos submetidos à isquemia experimental. Vários modelos de obstrução

estrangulatória in vivo têm falhado para documentar a evidência de injúria de

reperfusão, enquanto outros têm demonstrado alterações histológicas compatíveis

com injúria de reperfusão na mucosa do cólon maior após isquemia de baixo fluxo.

Todavia, existem evidências para sugerir que a reperfusão pode exacerbar a injúria

no cólon maio após isquemia (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).

2.2.1 PATOFISIOLOGIA DA INJÚRIA DE REPERFUSÃO

A hiperemia é a primeira resposta do tecido isquêmico quando o fluxo

sanguíneo é restabelecido. Com este aumento no fluxo sanguíneo, ocorrem danos

físicos e bioquímicos no sistema vascular já comprometido pela isquemia,

exacerbando o edema da mucosa, hemorragia e necrose (ROWE e WHITE, 2002).

A exemplo do que ocorre na isquemia de baixo fluxo, quando o fluxo normal

retorna ocorre uma resposta hiperêmica, duplicando o fluxo sanguíneo normal para

o tecido afetado. Os danos celulares se aceleram durante a reperfusão, com

mudanças na permeabilidade vascular, dano na mucosa e na serosa, assim como

acúmulo de fluido na submucosa, muscular e serosa. O edema nas camadas

submucosa e mucosa causa colapso vascular, levando à redução do fluxo abaixo do

normal. A redução do fluxo também está parcialmente associado à turgidez das

células endoteliais e marginação de neutrófilos à vasculatura. Os neutrófilos migram

para todos os tecidos, mas predominantemente para as camadas mucosa e serosa,

acumulando-se inicialmente ao redor de vasos sanguíneos e capilares. Com a

progressão da reperfusão, a maior injúria é observada na serosa, com considerável

acúmulo de neutrófilos. No entanto, os neutrófilos são encontrados em todas as

camadas do intestino (SMITH, 2002).

O tônus da musculatura lisa vascular é regulado pelo balanço de substâncias

vasodilatadoras (óxido nítrico, prostaciclina) e vasoconstritoras (endotelina,

eicosanóides), derivadas do endotélio. Muitas dessa substâncias requerem um

endotélio intacto para exercerem seus efeitos. Quando ocorre dano ao endotélio de

artérias e veias, há perda de vasodilatadores derivados do endotélio, causando um

aumento da sensibilidade aos agentes vasoconstritores, assim como um acréscimo

de resposta a outros agentes contráteis (ROWE e WHITE, 2002).

Um iniciador primário da injúria de reperfusão no intestino equino é a

produção de radicais livres derivados do oxigênio. A maioria das células, incluindo

células endoteliais e células da mucosa intestinal, possui a xantina desidrogenase,

que quando é convertida a xantina oxidase (Figura 2), catalisa a conversão da

hipoxantina a xantina. Durante a isquemia, a (SMITH, 2002). Com o retorno do

oxigênio aos tecidos, a xantina oxidase catalisa hipoxantina está aumentada no

citoplasma das células. O cálcio, aumentado na célula isquêmica, e as proteases,

promovem a conversão da xantina desidrogenase a xantina oxidase a

metabolização da hipoxantina em ácido úrico, formando radicais livres derivados do

oxigênio, que causam peroxidação lipídica, degradação de enzimas e de ácidos

nucléicos e aumento de permeabilidade vascular (MATOS et al., 2000).

Figura 2 - Eventos celulares relacionados à conversão da xantina desidrogenase a xantina oxidase durante a hipóxia.

Fonte: Rowe e White (2002).

A nível celular, uma importante reação que ocorre durante a reperfusão é a

produção de radicais livres, os quais são ativos contra a membrana das células,

causando perturbação no metabolismo celular. Como estes radicais são produzidos

em excesso durante a reperfusão, superam a capacidade dos mecanismos

antioxidantes do indivíduo, como os antioxidantes enzimáticos (superóxido

dismutase, catalase e glutation peroxidase) ou pelas moléculas não enzimáticas

(alfa tocoferol, ascorbato, beta caroteno) (ROWE e WHITE, 2002).

A reação mais frequentemente citada com relação à produção de radicais

livres envolve a enzima xantina oxidase. Durante a isquemia, a xantina

desidrogenase é convertida a xantina oxidase, a qual produz radicais livres ao

transformar a hipoxantina, acumulada no tecido isquêmico, em xantina. Existem

evidências da existência de outras enzimas produtoras de radicais livres em

diferentes segmentos intestinais (ROWE e WHITE, 2002).

Na reintrodução de oxigênio ao tecido isquêmico durante a reperfusão,

radicais livres derivados do oxigênio são produzidos quando o oxigênio reage com a

xantina oxidase e a hipoxantina acumulada, produzindo o ânion superóxido. Em

equínos, o sistema enzimático xantina desidrogenase e xantina oxidase está

presente no intestino delgado, mas tem baixa atividade no intestino grosso. Em meio

aquoso o ânion superóxido é relativamente instável, desdobrando-se a peróxido de

hidrogênio e oxigênio. Como oxidante, o ânion superóxido pode enzimas específicas

que são essenciais para a função celular. Apesar de não ser altamente tóxico, ele

pode gerar outros radicais extremamente tóxicos, como o radical hidroxil, que é um

poderoso oxidante (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).

Prichard et al. (1991) relataram em seu trabalho que no intestino delgado

eqüino não-isquêmico, a localização do segmento intestinal influencia o nível de

atividade enzimática total do sistema xantina desidrogenase e xantina oxidase. Além

disso, foi observado que duas horas de isquemia elevaram o nível médio de

atividade da xantina oxidase de 27% para 41%.

O peróxido de hidrogênio é formado pela redução divalente do oxigênio ou a

partir do ânion superóxido através da enzima superóxido dismutase, e é um agente

oxidante poderoso, sendo precursor de radicais hidroxil. O peróxido de hidrogênio

pode se difundir através das membranas e reagir com metais de transição para

formar radical hidroxil. Este pode causar peroxidação lipídica das membranas

celulares, degradação do colágeno, inativação de enzimas e transporte de proteínas

e causar mutagênese por dano ao DNA (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).

Os metabólitos reativos do oxigênio têm numerosas atividades biológicas,

variando de citotoxicidade direta para as células endoteliais e epiteliais a alterações

não tóxicas na função intestinal. Eles podem, por exemplo, aumentar a adesão de

neutrófilos às células endoteliais e também aumentar a agregação plaquetária

(ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).

A lipoperoxidação da membrana celular pelos metabólitos reativos do

oxigênio pode levar a alterações estruturais e funcionais assim como à geração de

mediadores inflamatórios derivados dos fosfolipídeos, como leucotrieno B4 e fator

ativador de plaquetas (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).

Os neutrófilos desempenham um papel importante na isquemia de

reperfusão. Eles podem ser responsáveis pelo aumento de permeabilidade

microvascular observados após isquemia e reperfusão, em virtude da adesão e

diapedese das células inflamatórias através do endotélio vascular. Quando os

neutrófilos são ativados, há geração de mais radicais oxigênios que compõem a

injúria celular. Neutrófilos ativados também liberam grânulos lisossomais que

danificam a matriz intersticial e a membrana basal capilar (ROBINSON e

SPRAYBERRY, 2003).

O acúmulo de radicais livres derivados do oxigênio nos neutrófilos, durante a

ativação, é responsável pela maior parte da inflamação e dano tecidual visto durante

a reperfusão. Isto também explica o fato de que a injúria inicial pode se expandir ao

tecido adjacente viável, causando dano tecidual irreversível. Além disso, a injúria de

reperfusão pode causar dano em locais distantes da lesão inicial, tendo sido

observada lesão pulmonar, como resultado de citocinas e neutrófilos ativados na

circulação (SMITH, 2002).

Numerosos mediadores inflamatórios estão envolvidos na injúria de

reperfusão, como o fator ativador de plaquetas, metabólitos do ácido aracdônico,

leucotrieno B4 e tromboxane A2. O fator ativador de plaquetas é produzido por

células endoteliais, neutrófilos, macrófagos e plaquetas, podendo causar agregação

e degranulação plaquetária, contração da camada muscular, ativação e quimiotaxia

de neutrófilos e aumento de permeabilidade vascular. Os metabólitos do ácido

aracdônico, leucotrieno B4 e tromboxane A2 são associados ao recrutamento de

neutrófilos e à disfunção microvascular (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).

O nível de cálcio, que já estava aumentado no meio intracelular, se ele eleva

ainda mais, bloqueando a produção de energia da célula, já comprometida, e

ativando proteases que exacerbam a degradação do núcleo celular e do citoplasma.

Além disso, as lipoxigenases formadas podem causar dano à membrana das células

(ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).

As células da mucosa e as células mesoteliais da serosa ao serem

danificadas no início da isquemia são capazes de liberar citocinas para alertar outras

células, mas as células endoteliais atuam como os iniciadores primários da injúria de

reperfusão. Estas células participam da produção de citocinas, da migração e

adesão de neutrófilos à vasculatura e também atuam na mudança de fluxo

sanguíneo após a reperfusão (SMITH, 2002).

As células endoteliais são responsáveis pela manutenção da pressão

sanguínea, permeabilidade vascular, tônus vascular, adesão de células

inflamatórias, coagulação e agregação de plaquetas. Quando estas células são

lesadas, ocorre passagem de eritrócitos e neutrófilos pela junção intercelular além

de deslocamento de fluido e proteínas para o interstício, levando ao colapso de

pequenos vasos sanguíneos. Sob estímulo de radicais livres ou plaquetas, as

células endoteliais produzem citocinas, que atraem e ativam neutrófilos durante a

injúria de reperfusão. Ao aderirem e migrarem do endotélio, os neutrófilos

exacerbam a lesão e aumentam a permeabilidade vascular (ROWE e WHITE, 2002).

Neutrófilos e plaquetas, ao acumularem-se nos vasos, promovem a obstrução

de capilares, alterando o fluxo sanguíneo. Além disso, as células endoteliais, ao

tornarem-se túrgidas, causam redução do lúmen dos vasos sanguíneos. As

alterações no formato das células endoteliais aumentam a permeabilidade capilar,

permitindo o movimento de fluido e proteínas para o interstício. A resposta inicial à

reperfusão resulta em aumento do fluxo sanguíneo ao tecido lesado,

consequentemente o aumento da permeabilidade vascular aumenta a pressão

intersticial, levando ao colapso de capilares (SMITH, 2002).

A adesão do neutrófilo ao endotélio pode ser prevenida com o uso de

anticorpos monoclonais contra as proteínas do complexo receptor de adesão

(ROWE e WHITE, 2002).

Os neutrófilos ativados liberam radicais livres, proteases e ácido hipocloroso,

que causam injúria vascular e na mucosa durante a reperfusão. Radicais livres

causam dano por peroxidação lipídica nas membranas celulares e suas organelas, e

subseqüente ativação de fosfolipase A2. Além de lesar a célula diretamente, esta

enzima produz a liberação de ácido aracdônico (substrato para síntese de

eicosanóides), fator de agregação plaquetária e lisofosfatidilcolina, que causam

efeitos nocivos ao tecido. A produção de compostos oxidativos pelos neutrófilos é

chamada explosão respiratória, e fazem parte do mecanismo pelo qual os neutrófilos

fagocitam e destroem microrganismos (ROWE e WHITE, 2002).

A ação dos eicosanóides, do fator de agregação plaquetária e a formação de

radicais livres estimulam o acúmulo de neutrófilos no tecido pós-isquêmico (MATOS

et al., 2000).

As alterações nas células endoteliais, associado ao colapso de capilares,

provocam o chamado “fenômeno de não-refluxo”, que causa danos adicionais ao

tecido isquêmico (SMITH, 2002).

As alterações de membrana das células endoteliais permitem a expressão de

moléculas de adesão e receptores, necessários para a adesão e migração de

neutrófilos. Esta migração dos neutrófilos gera um quadro inflamatório mais

expressivo no tecido, porque os neutrófilos ativados liberam elastase, radicais livres

derivados do oxigênio e outras proteases que atacam o colágeno e a membrana das

células (SMITH, 2002).

Foram identificadas alterações na morfologia mitocontrial da camada

muscular do jejuno equino após isquemia de baixo fluxo (DABAREINER et al.,

1995). Além disso, durante o vólvulo do cólon maior, os neurônios do plexo

mioentérico sofrem degeneração e são reduzidos numericamente, comparado ao

normal (SCHUSSERe WHITE, 1997). Estas lesões podem estar associadas aos

episódios de cólicas recorrentes em equinos que sofreram longo processo

inflamatório após isquemia e reperfusão.

O óxido nítrico pode estar envolvido na injúria de reperfusão. O óxido nítrico

produz inibição da motilidade, regula o fluxo sanguíneo através do relaxamento da

musculatura vascular, reduz a adesão de neutrófilos ao endotélio vascular, inibe a

formação de microtrombos e ainda antagoniza o vasoespasmo produzido por

substâncias vasoconstritoras. Na inflamação, a síntese de óxido nítrico é

aumentada, e ele passa a exercer efeitos indesejáveis, interferindo na regulação da

circulação local e sistêmica e produzindo moléculas altamente reativas (radicais

hidroxil e dióxido de nitrogênio e ânion peroxinitrito) (MATOS et al., 2000).

A apoptose é outro fator que tem sido atribuído à injúria de reperfusão

intestinal, e é importante sob o ponto de vista clínico, visto que pode afetar a

integridade da barreira da mucosa, predispor à inflamação durante a reperfusão e

ainda contribuir para as complicações durante o pós-operatório (ROWE e WHITE,

2002).

2.3 METABOLISMO DO FERRO

O ferro (Fe) é um metal de transição facilmente encontrado na natureza,

como por exemplo, na maioria dos solos e águas da superfície terrestre.

Provavelmente por isso foi incorporado a numerosas proteínas de importância crítica

nos animais, vegetais e de micro-organismos, além de estar presente na estrutura

de muitas enzimas e proteínas intracelulares essenciais, em quantidades que variam

de acordo com o tipo de tecido e a fase do desenvolvimento (THEIL, 2003; LIU et al.,

2006).

O ferro exerce papel importante no metabolismo dos mamíferos devido à

facilidade com que ganha e perde elétrons. Essa propriedade faz desse elemento

um componente essencial na composição da hemoglobina, mioglobina, citocromos e

várias outras enzimas e cofatores (WRIGHTING e ANDREWS, 2008).

A facilidade com queo ferro perde e ganha elétrons pode resultar na doação

de elétrons para o oxigênio, causando a geração de ânions superóxido e

radicalhidroxil, que são tóxicos às estruturas celulares, proteínas, lipídeos e DNA;

daí a necessidade de regular a concentração de ferro nos fluidos biológicos

(DOMENICO et al., 2008).

No homem adulto normal, o ferro existente é cerca de 40 mg/kg de peso

corporal, do qual 80% está incorporado à hemoglobina presente nos eritrócitos, que

contém 0,34% de ferro em seu peso (cerca de 1,0 mg de ferro por 2 mL de sangue

total); 15% está nos músculos e 5% fazem parte dos citocromos e demais enzimas

(EMERIT et al., 2001).

Diariamente, 200 bilhões de novos eritrócitos são produzidos e requerem 20

mg de ferro para síntese de hemoglobina, representando 80% da demanda em

humanos e não surpreende o fato de ser a anemia por deficiência de ferro o maior

problema de saúde pública em todo o mundo, uma vez que as condições sociais

econômicas da população são um fator determinante (HENTZE et al., 2004).

Em países desenvolvidos, a prevalência de anemia por deficiência de ferro

tem diminuído rapidamente durante as últimas cinco décadas. Entretanto, a

prevalência desta deficiência de forma subclínica tem aumentado

consideravelmente, sendo mais comum em crianças entre 1-3 anos, em

adolescentes de ambos os sexos, em mulheres grávidas e na população idosa

(SUOMINEN et al., 1998).

Alterações no pool de ferro celular são relatadas em doenças neuro e

cardiodegenerativas, intolerância à glicose, diabetes melitus, neoplasias, anemia por

deficiência de ferro, hemocromatose, entre outras (TUOMAINEN et al., 1998;

TUOMAINEN et al., 2003).

Assim, muitos esforços têm sido feitos para descobrir novos mecanismos de

transporte no interior da célula e através das membranas biológicas a fim de melhor

compreender a fisiopatologia de várias doenças (WILSON, 2006).

O ferro é um metal altamente tóxico quando em seu estado livre e por este

motivo sua grande maioria, quando no organismo humano, encontra-se ligada à

hemoglobina, mioglobina e hemossiderina, formas nas quais se apresenta menos

tóxico (ZUNQUIN et al., 2006).

Outra forma de proteger as células dos danos causados pelo ferro é a

produção de ferritina, presente tanto nas células do organismo humano quanto nas

plantas e bactérias, porém, em proporções distintas em cada uma delas (THEIL,

2003; LIU et al., 2006).

O controle da concentração sistêmica do ferro ocorre através da regulação de

sua aquisição e estocagem de acordo com a necessidade do organismo, uma vez

que seu sistema de excreção não está totalmente elucidado (HUNT e ROUGHEAD,

2000).

A perda normal de ferro em humanos ocorre através da esfoliação dos

enterócitos, células da pele, menstruação, suor e parto. Entretanto, esse processo é

independente do status do ferro no corpo (DOMENICO et al., 2008).

A absorção do ferro proveniente da dieta é altamente regulada e envolve

transporte através da membrana apical das células absortivas e, em seguida,

através da membrana basolateral destas células para o interior do sangue, ligado à

transferrina, uma glicoproteína de transporte (ANDREWS, 2000; ANDREWS, 2007;

SCHMIDT, 2007; ANDREWS, 2008).

A incapacidade de manter normal a concentração de ferro leva à deficiência

na homeostase e a desordens clínicas cujas patologias mais frequentes são a

anemia por deficiência de ferro e a deposição parenquimal dos tecidos, conhecida

como Hemocromatose Hereditária (ANDREWS, 2000).

2.3.1 ABSORÇÃO INTESTINAL DO FERRO

Apesar de seu mecanismo de absorção ainda não estar completamente

elucidado, o ferro que chega ao estômago é dissociado a sais de ferro solúveis que

podem ser reduzidos a íons ferrosos ou quelados no estado de valência ferroso ou

férrico a fim de manterem sua estabilidade e promoverem sua absorção (DONOVAN

e ANDREWS, 2004).

Fisiologicamente, os maiores determinantes da absorção do ferro são: a

quantidade de reservas corporais de ferro e o grau de eritropoiese (a absorção

aumenta com as reservas diminuídas e com a atividade eritropoiética) (DONOVAN e

ANDREWS, 2004).

No entanto, só é possível retirar da dieta um máximo de 3,5 mg de Fe/dia

(WALTERS et al., 1973), mesmo com abundância de ferro biodisponível ou com a

absorção aumentada do indivíduo ferropênico (HENTZE et al., 2004).

A biodisponibilidade do ferro depende da forma, composição na dieta e

fatores gastrointestinais, como secreção gástrica, motilidade intestinal e patologias

gastrointestinais, uma vez que sua absorção se dá no intestino proximal (HUNT e

ROUGHEAD, 2000).

A captação do ferro em indivíduos saudáveis, a partir da composição da dieta,

depende principalmente da necessidade do organismo e da interação com os

demais componentes alimentares, uma vez que existe uma singular diferença entre

a absorção de ferro heme e não-heme e a quantidade de ferro disponível em dietas

que não envolvem o consumo de carnes vermelhas (HUNT e ROUGHEAD, 2000;

BAECH et al., 2003; WELLS et al., 2003; MILMAN et al., 2004).

O ferro heme (ferro encontrado na carne vermelha) é mais bem absorvido

(12-20%) e pouco afetado por outros componentes da dieta; já a absorção do ferro

não-heme (ou ferro inorgânico – 1-7%) será aumentada por aminoácidos e ácido

ascórbico (YANG et al., 1999) e diminuída por hemicelulose, celulose, pectina,

fitatos, proteína da soja, polifenóis e tanatos presentes nas frutas e verduras

(MILMAN et al., 1990; HUANG et al., 1999; BEARD e TOBIN, 2000; HUNT e

ROUGHEAD, 2000; BAECH et al., 2003).

Indivíduos que consomem carne com maior frequência em relação àqueles

que possuem uma dieta isenta de carne (os considerados vegetarianos), possuem

uma maior facilidade de elevar seus índices hematológicos, ao contrário destes que

mantêm seus estoques de ferro estável, pelo menos em curto prazo (WELLS et al.,

2003; MILMAN et al., 2004).

A absorção do ferro presente na dieta dos vegetarianos depende da

necessidade de seu organismo em manter o balanço do ferro, porém, mulheres

premenopausadas demonstraram um status de ferro prejudicado, talvez devido à

influência hormonal ou à menstruação (HUANG et al., 1999).

A absorção máxima ocorre no duodeno e na parte superior do jejuno onde a

superfície vilosa é maior e na qual o conteúdo da luz intestinal é ácido ou neutro. Há

uma progressiva diminuição de absorção distal ao ambiente mais alcalino, embora

exista potencialidade para absorção de algum ferro ao longo de todo o tubo

digestivo, do estômago ao reto (LIU et al., 2006).

As condições associadas à absorção aumentada de ferro incluem deficiência

de ferro, anemias hemolíticas e sideroblásticas, hipóxia, administração de cobalto e

eritropoetina, hemocromatose, cirrose e derivação porta-cava, alguns tipos de

insuficiência pancreática e os estágios finais da gravidez (HUNT e ROUGHEAD,

2000; DONOVAN e ANDREWS, 2004; GARCIA et al., 2007).

Existe diminuição da absorção de ferro em pacientes com sobrecarga de

ferro, hipoplasia eritróide, estados de má absorção generalizada, neoplasia maligna,

infecções, estados inflamatórios e acloridria (HUNT e ROUGHEAD, 2000;

DONOVAN e ANDREWS, 2004; GARCIA et al., 2007).

A regulação da absorção intestinal do ferro se dá através das cristas das

células duodenais, as quais percebem a necessidade do corpo por ferro para

realizar a eritropoiese e demais funções essenciais do organismo (WRIGHTING e

ANDREWS, 2008) e assim estas células são programadas, quando maduras, para

realizarem toda absorção do ferro proveniente da dieta (EMERIT et al., 2001).

O íon férrico (Fe+++), proveniente da dieta, é convertido em íon ferroso (Fe++)

pela ação de uma redutase férrica que está localizada na superfície apical do

enterócito, presente na mucosa duodenal. O Fe++ é então transportado para o

interior do enterócito através de um transportador de metal divalente (DMT1),

podendo ser incorporado ao citosol sob forma de armazenamento, a ferritina, ou

transportado através da superfície basolateral desta célula para o plasma, sob ação

da ferroportina. O Fe++ é, subsequentemente, convertido em Fe+++ por ação de uma

ferro-oxidase associada à membrana, a hefaestina (Figura 3) (HENTZE et al., 2004;

DOMENICO et al., 2008)

A presença do DMT1, de acordo com estudos com ratos, não é essencial à

transferência materna através da placenta, mas é requerida para o transporte

intestinal e nos eritrócitos precursores (DOMENICO et al., 2008).

A ferroportina é um transportador encontrado em todos os tipos de células

envolvidas na exportação do ferro, principalmente mucosa duodenal, macrófagos e

células da placenta, além de estar diretamente associada às oxidases, como a

ceruloplasmina e hefaestina (DOMENICO et al., 2008).

A deleção do gene que determina a expressão de transportadores de

membrana ou de ferro-oxidases provoca acúmulo de ferro nos macrófagos,

hepatócitos e células do cérebro causando danos ao tecido parenquimatoso destes

órgãos, o que comprova sua importância nestas células (DOMENICO et al., 2008).

FIGURA 3 - Transporte do ferro através do epitélio intestinal

Fonte: Pietrangelo (2007),

Nos macrófagos, o Fe++, que foi reciclado dos eritrócitos senescentes pela

fagocitose, é exportado através da ferroportina onde é imediatamente convertido em

Fe+++ por glicosilfosfatidilinositol (GPI) ligado à ceruloplasmina, uma ferro-oxidase

(Figura 4) (DOMENICO et al., 2008).

FIGURA 4 - Transporte do ferro através da membrana de macrófago.

Fonte: Domenico et al. (2008).

2.3.2. TRANSPORTE DO FERRO PARA OS TECIDOS

O ferro é exportado das células para o plasma pela ferroportina, ligando-se

então à transferrina, uma glicoproteína transportadora de alta afinidade por este

elemento, e que é produzida pelo fígado, retina, testículos e cérebro. Esta proteína

possui 80 kDa e 2 sítios de ligação (DOMENICO et al., 2008).

Um homem adulto tem aproximadamente 20-30% de ferro circulando no

plasma ligado à transferrina, a qual é capaz de transportar, através do plasma, cerca

de 30 mg/dia de ferro para as células, inicialmente na forma de apotransferrina

(transferrina com apenas 1 de seus sítios ocupados pelo ferro). A afinidade do ferro

por esta proteína de transporte limita a capacidade desse elemento de produzir

radicais tóxicos (EMERIT et al., 2001; DOMENICO et al., 2008).

Para que o ferro seja internalizado nas células, é necessária a presença de

receptores na superfície das membranas – o receptor da transferrina (TfR1) - que

permite a endocitose do Fe+3 (AISEN, 2004).

No plasma (pH 7,2), a Tf-Fe+3 liga-se ao receptor da transferrina (TfR)

localizado na superfície da célula de onde é internalizado por endocitose, cujo

endossomo é formado por uma capa de claritina (ANDREWS, 2008; DOMENICO et

al., 2008).

O pH desse endossomo torna-se ácido (aproximadamente pH=5,5) que, por

ação de uma bomba de prótons (H+ATPase) facilita a liberação do Fe+3 antes

ligado à Tf, o qual é convertido em Fe+2, pela ação de uma redutase endossomal

(STEAP3), cuja mutação resulta em anemia microcítica, e então é transportado para

o citosol por um transportador de metal bivalente-1 (DMT1) (ANDREWS, 2008;

DOMENICO et al., 2008).

Em contrapartida, nos eritrócitos precursores, em células de rápida divisão,

como as neoplásicas, concentra-se, em sua superfície, uma grande quantidade de

receptores TfR, responsáveis pelo provimento de ferro para estes tecidos, estando

presente em todas as células, exceto nos eritrócitos maduros (ANDREWS, 2008).

Outro receptor da transferrina, o TfR2, apesar de pouco conhecido,

apresenta-se primariamente no fígado e se liga ao Fe+3 com baixa afinidade quando

comparado ao TfR1 e que o complexo TfR-(Tf-Fe+3) é o principal processo de

obtenção do ferro do plasma para os tecidos periféricos (AISEN, 2004).

O ferro (Fe+2) resultante desse catabolismo será recuperado e terá dois

caminhos: será armazenado sob a forma de ferritina em células não-eritróides ou

incorporado à hemoglobina em células eritróides ou exportado pela ferroportina para

o plasma e o endossomo contendo o complexo Tf-TfR será reciclado (ANDREWS,

2008; DE DOMENICO et al., 2008) (Figura 5).

FIGURA 6 - Endocitose do complexo transferrina-receptor da transferrina.


Levando-se em consideração a biodisponibilidade do ferro, estudos mostram

uma correlação significativa entre o ferro presente na dieta, a concentração sérica

do ferro, a capacidade total de ligação do ferro bem como o índice de saturação da

transferrina. Porém, não há correlação com a ferritina, pois esta reflete o balanço de

ferro a longo prazo, e as primeiras refletem o “status” de ferro a curto prazo, sendo

então os mais apropriado para avaliar o ferro da dieta (MILMAN et al., 2004).

Vários fatores podem obscurecer a associação entre a ferritina sérica e a

captação de ferro da dieta: a existência de variações na biodisponibilidade do ferro

da dieta, devido as variações na composição das refeições; a ingestão de

componentes alimentares capazes de exacerbar ou inibir a absorção do ferro;

discrepância no cálculo entre o ferro absorvido e o ferro disponível na dieta

(BOUGLE et al., 2000; MILMAN et al., 2004; KRISTENSEN et al., 2005).

O fígado é o primeiro órgão de passagem dos nutrientes provenientes da

dieta e, por isso, capta o ferro excedente da capacidade de ligação da transferrina

plasmática, através de seus hepatócitos e reutiliza a hemoglobina resultante da

degradação de eritrócitos senescentes através de seus macrófagos do sistema

reticuloendotelial (MILMAN et al., 2004) (Figura 6).

FIGURA 6 - Homeostase do ferro.


2.3.3 FERRITINA:

A ferritina é uma grande proteína nanocadeia de α-hélice apresentando

massa molecular de aproximadamente 450 kDa que circunda um núcleo sólido

contendo milhares de átomos de Ferro (≈ 4.500 átomos) e oxigênio por proteína

(Figura 7) (KALANTAR-ZADEH et al., 2006).

FIGURA 7: Molécula de ferritina com átomos de ferro em sua poção central.

Fonte: Galvis (2007).

Possui formato esférico, sendo formada por 12-24 subunidades em α-hélice

(apoferritinas) e composta estruturalmente por cadeias leves de 19 kDa (L) e

pesadas de 21 kDa (H) ligadas não covalentemente. O diâmetro da cavidade que

acomoda o mineral dentro da ferritina é 5-8 nm, e seu diâmetro externo é de 12 –

13nm (KALANTAR-ZADEH et al., 2006).

O substrato da ferritina é o Fe+2, que é oxidado a Fe+3dentro da ferritina e

representa o estoque de ferro nesta proteína. O fígado e o baço são ricos em

subunidade L, enquanto o coração é rico em subunidades H (DOMENICO et al.,

2008).

Esta proteína de armazenamento também está presente nos fluidos corporais

e hemácias circulantes. Porém, encontra-se em altas concentrações nas células do

fígado e nos centros de reciclagem dos eritrócitos (células do retículo endotelial) no

fígado, bílis e medula óssea (WALTERS et al., 1973; ROY e ANDREWS, 2001).

A ferritina pode ser modificada a hemossiderina; ambas, proteínas de reserva

intracelulares, que podem ser mobilizadas de acordo com a necessidade, sendo a

primeira de fácil mobilização, em detrimento da segunda, que é mais estável

(WALTERS et al., 1973).

A síntese de ferritina ocorre em todas as células do organismo, mas

principalmente nos hepatócitos, medula óssea e macrófagos que, quando presentes

no reticuloendotelial, exercem papel importante no “turnover” do ferro tendo sido

descritos como sistema mononuclear fagocitário (WALTERS et al., 1973).

Os macrófagos, principalmente no baço, depois da fagocitose dos eritrócitos

senescente, degradam a hemoglobina, e a fração heme é catabolizada pela

hemoxigenase. Sempre que a capacidade dos macrófagos para degradar eritrócitos

ou heme é excedida, hemoglobina ou heme são lançadas na circulação, onde se

ligam a haptoglobina, hemopexine e albumina (EMERIT et al., 2001).

O “ferro livre” na circulação liga-se à transferrina plasmática. Já no fígado, a

ferritina das células de Kupfer é incorporada pelos hepatócitos que possuem tanto

receptores para transferrina e ferritina como para hemoglobina, haptoglobina e

heme, e podem receber ferro de todas estas moléculas, especialmente da ferritina

oriunda das células de Kupfer (ROY e ANDREWS, 2001).

Estudos demonstram que a relação direta entre a concentração de ferritina no

soro e os estoques de ferro nos tecidos vêm sendo utilizados como parâmetros

auxiliares no diagnóstico de várias doenças relacionadas ao balanço de ferro

(WALTERS et al., 1973), podendo também estar elevados em etilistas ativos e em

indivíduos com doenças hepáticas de caráter autoimune ou causadas por algum

agente etiológico (DE VALK e MARX, 1999).

Atualmente, a ferritina, juntamente com parâmetros como o volume

corpuscular médio (VCM), hemoglobina (HB) e saturação dos receptores da

transferrina sérica (TfRs), detectam estágios iniciais da depleção dos estoques de

ferro, possuindo sensibilidade de 83% e especificidade de 80% (VENDT et al.,

2007).

A ferritina é considerada uma proteína de fase aguda e marcador tumoral

inespecífico (SUOMINEN et al., 1998) que, quando elevada, pode indicar patologias

graves em curso como carcinoma hepatocelular, leucemias, doença de Hodgkin’s,

câncer de cabeça e pescoço, bem como doenças renais, infecciosas, inflamatórias e

sistêmicas (DE VALK e MARX, 1999; LUNEDO et al., 2004).

Durante a resposta de fase aguda, citocinas proinflamatórias como a

interleucina - 1β e fator de necrose tumoral – α aumentam a síntese de ambas as

subunidades de ferritina (L e H) e mesmo na deficiência de ferro, o nível desta esta

proteína continua elevado conduzindo a interpretações duvidosas quanto aos

estoques de ferro (KALANTAR-ZADEH et al., 2006).

Por ser considerada uma proteína de fase aguda, a ferritina é um indicador

que sofre variações, tornando a mensuração dos estoques de ferro discutível, uma

vez que se encontra elevada, principalmente em processos inflamatórios e doenças

hepáticas (WOLFF et al., 2004; KALANTAR-ZADEH et al., 2006).

A hiperferritinemia está associada às disfunções hepáticas, provavelmente

porque o fígado é o principal órgão produtor e reciclador de ferritina circulante. Suas

altas concentrações têm sido relatadas em pacientes portadores de insuficiência

renal crônica com doença glomerular e proteinúria, dos quais 40 – 70% deles

apresentam inflamação e, consequentemente, proteína C-reativa aumentada

(KALANTAR-ZADEH et al., 2006). Por esta razão, recomenda-se uma avaliação

criteriosa através de parâmetros como enzimas do fígado (γ-glutamil transferase e

alanima transferase) e indicadores de inflamação e infecção (contagem de

leucócitos e proteína C-reativa), a fim de se evitar um falso diagnóstico e,

consequentemente, uma conduta terapêutica inadequada (TUOMAINEN et al., 1998;

HAIDARI et al.,2001).

A inflamação é um dos fatores geradores de interferência quando se avaliam

os estoques de ferro no organismo e seu papel frente à doença arterial coronariana

(CAD) (KALANTAR-ZADEH et al., 2006). Além disso, pacientes diabéticos

apresentam concentrações de ferritina superiores aos não-diabéticos, talvez esse

seja um dos principais motivos que justifiquem a maior predisposição a desenvolver,

de maneira precoce, as placas de ateroma (HAIDARI et al., 2001).

Um componente chave do metabolismo do ferro é a hepcidina, um hormônio

peptídico circulante que regula a entrada do ferro no plasma e que é primariamente

secretado pelos hepatócitos, existindo evidências da presença de RNAm no cérebro,

pâncreas e células hematopoiéticas. (LUUKKONEN e PUNNONEN, 2006; ROE et

al., 2007).

A deleção do gene HAMP, que determina a expressão da hepcidina, resulta

na mais severa forma de doença por acúmulo de ferro. Em contrapartida, o aumento

da expressão deste gene diminui a absorção de ferro provocando anemia

(LUUKKONEN e PUNNONEN, 2006; ROE et al., 2007).

A hepcidina regula negativamente o transporte do ferro no plasma ligando-se

à ferroportina, levando-a a ser fosforilada, internalizada e degradada em lisossomas

(WRIGHTING e ANDREWS, 2008).

A remoção da ferroportina da superfície das células previne a exportação do

ferro, levando a uma diminuição da concentração citosólica de ferro, que é estocado

na ferritina. Essa remoção da ferroportina da superfície das células não inibe o

transporte, mas reduz a exportação desse ferro (DOMENICO et al., 2008).

A expressão da hepcidina pode ser regulada de várias maneiras: a

transcrição do gene HAMP que codifica a hepcidina depende da sinalização de

receptores da BMPs (Proteínas morfogenéticas ósseas) e desencadeiam o fator de

transcrição SMAD. A ativação dos receptores BPMs (BPMRs) da superfície da célula

desencadeia a fosforilação do receptor SMADs (R-SMADs), que dimeriza com

SMAD4 (ANDREWS, 2008).

A hemojuvalina (HJV) quando se liga a superfície da membrana funciona

como co-receptor de BPMs, aumentando a eficiência da interação da BPM com seu

receptor. O heterodímero SMAD4-(SMAD-R) desloca-se dentro do núcleo onde

induz a transcrição do gene HAMP. A hemojuvelina solúvel pode ligar-se a BPM e

bloquear a ativação da BPMRs e, consequentemente, a expressão da hepcidina

(ANDREWS, 2008).

Citocinas inflamatórias, como interleucina-6 (IL6), ligam-se aos receptores,

ativando o sinal transdutor e ativador da transcrição-3 (STEAT3), o qual liga-se ao

gene promotor do HAMP e induz a expressão da hepcidina. A ativação do STAT3

requer a presença de SMAD4. O TfR2 e HFE funcionam independente do SMAD4

na ativação do gene HAMP, talvez por um sinal independente ou por interferência na

transdução pelo BMPR (DOMENICO et al., 2008).

Sob condições de hipóxia, o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF)-1/2

liga-se ao gene promotor HAMP e bloqueia a expressão da hepcidina. Defeitos na

eritropóiese resultam em níveis elevados de fator de diferenciação do crescimento-

15 (GDF15), que se liga ao GDF-15R e induz um sinal que bloqueia a transcrição do

gene HAMP (Figura 8) (DOMENICO et al., 2008).

FIGURA 8 - Regulação molecular da produção da hepcidina


2.3.4. SOBRECARGA DE FERRO

O ferro em excesso facilita a replicação viral e as infecções bacterianas,

diminui a resposta imunológica do hospodeiro, induz fibrinogênese, podendo causar

lesão celular por liberação de radicais livres (EMERIT et al., 2001).

A liberação de radicais livres provoca dano às células por catalisar a

conversão do superóxido e peróxido de hidrogênio em espécies de radical livre que

atacam as membranas celulares, proteínas e a molécula de DNA. Para reduzir esta

ameaça, o ferro circulante liga-se à transferrina e acumula-se nas células sob a

forma de ferritina (EMERIT et al., 2001).

Em indivíduos saudáveis, não ocorre um apreciável acúmulo de “ferro livre”,

uma vez que o mesmo é mantido sob a forma de ferritina ou é quelado a compostos

como citrato ou adenosina difosfato, e o “ferro livre” pode participar da catálise de

formação do radical hidroxil (DE VALK e MARX, 1999; EMERIT et al., 2001).

O dano celular provocado pelos radicais livres atinge proteínas, açúcares,

DNA, lipídeos e demais moléculas orgânicas; além de relacionar-se à formação de

placa de ateromas devido à peroxidação lipídica, envolvendo principalmente a

lipoproteína de baixa densidade (LDL) (YANG et al., 1999; HAIDARI et al., 2001).

O radical hidroxil é capaz de retirar um átomo de hidrogênio de ácidos graxos

poliinsaturados para iniciar a peroxidação lipídica (EMERIT et al., 2001). Uma vez

acumulado, o hidroperóxido lipídico pode adicionar-se diretamente ao “ferro livre”

(DE VALK e MARX, 1999; EMERIT et al., 2001).

A oxidação de LDL ocorre nas células endoteliais da parede dos vasos

sanguíneos, nas células musculares lisas, linfócitos ou macrófagos, e este processo

resulta na formação do LDL oxidado, que é reconhecido pelos “scavenger”

(receptores presentes nos macrófagos) e, dessa forma, ocorre acúmulo de lipídeos

no interior destas células, formando as “foam cells” (células espumosas) (DE VALK e

MARX, 1999; WOLFF et al., 2004).

O LDL oxidado tem a capacidade de destruir a integridade do endotélio

facilitando, assim, o acúmulo desses monócitos e outros componentes do sangue

circulante, promovendo a lesão aterosclerótica (DE VALK e MARX, 1999; WOLFF et

al., 2004).

Vários estudos apontam o ferro em excesso como fator determinante para a

formação da placa aterosclerótica e lesões pré-neoplásicas em presença de

elevadas concentrações de ferritina, ferro sérico, LDL colesterol e prática de

exercícios físicos intensos, associados a um desequilíbrio entre fatores antioxidantes

e pró - oxidantes (YANG et al., 1999; ZUNQUIN et al., 2006).

A superprodução de radicais superóxido e peróxido de hidrogênio (estresse

oxidativo) ocorre em vários quadros patológicos, inclusive em doenças infecciosas,

doenças inflamatórias e doenças que envolvem isquemia e reperfusão (DE VALK e

MARX, 1999; EMERIT et al., 2001; RAMAKRISHNAN et al., 2002).

Zunquin et al. (2006) relatam a ação da caseína, uma proteína do leite, que

age como antioxidante em atletas que, em busca de um melhor desempenho físico,

usam suplementação com ferro no intuito de obter uma elevação da concentração

de hemoglobina e, consequentemente, uma maior eritropoiese.

Esta sobrecarga de ferro é considerada fator de risco para doenças

coronarianas, principalmente infarto agudo do miocárdio, sendo que homens e

mulheres posmenopausadas são mais predispostos à mortalidade cardiovascular,

levando-se em consideração as práticas etilista e tabagista, o sedentarismo e o

consumo de uma dieta rica em gordura (DE VALK e MARX, 1999; HAIDARI et al.,

2001; WOLFF et al., 2004).

Tuimainen et al. (1998) encontraram uma relação bastante significativa entre

a concentração dos receptores da transferrina e a ferritina sérica (TfR/ferritina),

quando associados ao aumento do risco de ocorrência do primeiro episódio de

infarto agudo do miocárdio em homens, ao contrário de outros autores que em seus

estudos não encontraram correlação direta entre ferritina sérica e doenças

cardiovasculares, sugerindo a interrelação com outros fatores (KNUIMAN et al.,

2003).

A elevação do “ferro livre” exerce papel crucial na carcinogênese e

crescimento rápido de tumores em modelos animais e cultura de células, como

demonstram alguns relatos em que o ácido ascórbico é utilizado como antioxidante.

Além disso, o ácido ascorbico também participa ativamente na absorção de ferro

pelos enterócitos transformando Fe+3 em Fe+2 (YANG et al., 1999).

Apesar de participar do metabolismo, o ferro não tem meios específicos para

ser eliminado do organismo humano, o que o torna mais hábil no papel de

catalisador de reações de oxi-redução (YANG et al., 1999).

As perdas fisiológicas de ferro resumem-se a pequenas quantidades

excretadas na urina, bílis, suor, descamação dos enterócitos, trato urinário e pele,

além das perdas ocultas no tubo digestivo e, nas mulheres pré-menopausadas,

durante a gravidez e menstruação (WRIGHTING e ANDREWS, 2008), tendo em

vista que, durante a menstruação, a mulher adulta normal perde aproximadamente

20-30mL de sangue e eleva a necessidade de 0,8 – 1,36 mg para 2,34 - 2,84 mg de

ferro (HUANG et al., 1999). Entretanto, homens com idade superior a 50 anos que

realizaram flebotomia reduziram significativamente seus estoques de ferro e

demonstraram uma diminuição na oxidação do LDL-colesterol. Em contrapartida,

mulheres que fazem uso de contraceptivos orais por tempo prolongado têm sua

perda de sangue, através da menstruação, reduzida e, consequentemente, seus

estoques de ferro aumentados (HAUDARI et al, 2001).

Ainda na tentativa de reduzir os estoques de ferro, a terapêutica atual dispõe

do deferroxamine (DFX), droga administrada por via intravenosa e considerada

quelante do ferro. Porém, a excreção corresponde a menos de 0,03 μL de ferro total,

tendo sido utilizada esse medicamento somente em pacientes com sobrecarga

severa de ferro e saturação total de transferrina (EMERIT et al., 2001).

O deferroxamine é capaz de quelar o “ferro livre” no interior das células, o

qual se combina com o ferro formando o ferrioxamine, produto excretado na urina,

fezes e bílis. A regulação da sobrecarga de ferro através do DFX é por excreção,

enquanto a flebotomia é a retirada de todos os elementos do sangue. Ainda são

necessários estudos relacionados à seu risco/benefício na terapia da sobrecarga de

ferro (EMERIT et al., 2001).

Pela relevância dos resultados obtidos com a isquemia promovida pelo

clampeamento total do pedículo hepático (manobra de Pringle modificada), em

diferentes tempos (SEBE, 1999; SEBE et al., 2000; CAMARGO et al., 2003;

CAMARGO, 2004; FREITAS, 2003; PIRES; 2008; FREITAS et al., 1999, 2000, 2006,

2009, 2009a), propõe-se neste estudo, pesquisar a concentração de ferro sérico e

ferritina, após clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão em diferentes

tempos.

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3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar e correlacionar a concentração de ferro sérico e ferritina após o

clampeamento total do pedículo hepático (isquemia), seguido do desclampeamento,

em tempos definidos.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar a concentração de ferro sérico e ferritina após o clampeamento total

do pedículo hepático em tempos definidos para isquemia em 10, 20 e 30 minutos,

seguida de reperfusão pelo desclampeamento do pedículo hepático em tempos

definidos de 15, 30, 60 e 120 minutos.

4. ARTIGO

AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITI NA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO E

REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS

RESUMO

Avaliação da concentração de ferro sérico e ferriti na em ratos, após

clampeamento total do pedículo hepático e reperfusã o em diferentes tempos

No trauma hepático, torna-se necessário o bloqueio do fluxo sanguíneo para facilitar as manobras cirúrgicas reparadoras. Uma das formas de conter essa hemorragia é por meio do clampeamento total do pedículo hepático (artéria hepática, veia porta e colédoco). No entanto, esse procedimento resulta na congestão esplâncnica e, consequentemente, perfusão sanguínea deficiente de órgãos como fígado, estômago, intestino delgado, parte anterior do intestino grosso, pâncreas e baço. Além disso, ao restabelecer o fluxo sanguíneo desses órgãos, novas complicações, além das lesões já causadas pelo clampeamento, surgirão. Avaliou-se neste estudo, as concentrações de ferro sérico e ferritina após desclampemaneto do pedículo hepático em vários tempos. Foram utilizados 42 ratos Wistar, machos, com três meses de idade e peso médio 300 gramas, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos experimentais: grupo controle (GC) – representados por seis animais que não foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático; grupo E10, representado doze animais que foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 10 minutos; grupo E20, representado doze animais que foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 20 minutos e grupo E30, representado doze animais foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 30 minutos. Cada grupo clampeado foi subdividido em quatro subgrupos representados por três animais, nos quais desclampeados para reperfusão: subgrupo R15, - submetidos a 15 minutos de reperfusão, subgrupo R30 - submetidos a 30 minutos de reperfusão, grupo R60 - submetidos a 60 minutos de reperfusão e grupo R120 - submetidos a 120 minutos de reperfusão.

Palavras chaves: Ferritina. Ferro sérico. Isquemia. Ratos wistar. Reperfusão.

ABSTRACT

Determination of serum iron and ferritin in rats af ter total hepatic pedicle clamping and reperfusion at different times .

In hepatic trauma, it is necessary the blocking of the blood flow to facilitate reparative surgical maneuvers. One way to stop this hemorrhage is through total clamping of the hepatic pedicle (hepatic artery, portal vein and common bile duct). However, this procedure results in splanchnic congestion and hence poor blood perfusion of organs such as liver, stomach, small intestine, anterior part of the large intestine, pancreas, and spleen. Furthermore, by restoring blood flow to those organs, new complications, as well as injuries caused by clamping, arise. This study evaluated, the concentrations of serum iron and ferritin after the declamping of pedicular liver at various times. It was used a total of 42 male Wistar rats with three months old and weighting 300 grams, randomly divided into four groups: control group (CG) - represented by six animals that haven´t been submitted to the hepatic pedicle clamping; E10 Group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 10 minutes; E20 group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 20 minutes and E30 group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 30 minutes. Each group has been subdivided into four clamped subgroups represented by three declamping animals from reperfusion: subgroup R15, - submitted to 15 minutes of reperfusion, subgroup R30 - subjected to 30 minutes of reperfusion, group R60 - subjected to 60 minutes of reperfusion and group R120 - subjected to 120 minutes of reperfusion.

Keywords: Ferritin. Iron. Ischemia. Male Wistar. Reperfusion.

4.1. INTRODUÇÃO

O sistema digestório está envolvido com secreções e absorções de

nutrientes, tais como: minerais, proteínas, vitaminas, açúcares e gorduras. As

enzimas e alguns tipos de ácidos estão envolvidos na digestão dos alimentos. A bile,

o suco pancreático e a água também contribuem no processo. O sistema digestório

possui uma barreira mucosa capaz de protegê-lo contra as ações do suco gástrico

durante o processo de digestão, além de impedir a penetração de microorganismos

patogênicos no organismo. A absorção de nutrientes, vitaminas e minerais está

localizada no intestino delgado (CAMARGO, 2004).

Restrepo e Felix (1994) observaram que a isquemia intestinal constitui uma

injúria associada com alta letalidade. Com o aumento crescente de problemas que

afetam a sociedade moderna, a enfermidade vascular abdominal adquire

preponderante importância epidemiológica. A gravidade e a extensão da necrose

intestinal isquêmica dependem do vaso principal afetado, da qualidade e da

circulação colateral e de sua capacidade de resposta, além do estado da circulação

geral e do grau de reperfusão. A isquemia resulta na liberação de grande quantidade

de agentes tóxicos endógenos, que são produtos normais e do metabolismo celular,

gerados inicialmente pela hipoperfusão e anóxia, agravando-se com a reperfusão

dos tecidos afetados. Esses produtos tóxicos exercem ação deletéria, tanto local,

como sistêmica.

Devido à lesão de mucosa, a isquemia se torna particularmente grave no

intestino, desencadeando efeitos intensos e complexos, em decorrência da absorção

de endotoxinas e da ocorrência de distúrbios hidroeletrolíticos e no equilíbrio ácido-

base, que se manifestam em órgãos à distância e cujo tratamento é mais difícil que

a correção dos distúrbios isquêmicos ou ressecção cirúrgica intestinal (MOORE,

1990).



reparadores possam ser realizados (SILVA JR. et al., 2002; ARAÚJO JR. et al,

2005). Desde 1908, para conter hemorragias hepáticas, Pringle propôs a realização





(SEBE, 1999; CAMARGO et al., 2003; FREITAS, 2004; CAMARGO, 2004;

BRASILEIRO et al., 2007; PIRES, 2008). Na sequência, ao restabelecer o fluxo

sanguíneo hepático, reperfusão, novas agressões surgirão além das lesões já

causadas pelo período de isquemia (MIRANDA et al., 2004; SILVA, et al., 2006).

Da mesma forma, supõe-se que nos casos de dilatações vólvulo-gástrica,


intussuscepção e torção intestinal, em que ocorre compressão seguida de

descompressão do pedículo hepático, ou seja, uma isquemia seguida de reperfusão

possa culminar com o comprometimento dos órgãos envolvidos com o sistema porta,

como fígado, baço, pâncreas, estômago, intestino delgado, além das lesões em

órgãos remotos, como pulmões, rins, coração e musculatura esquelética (CAMPOS

e YOSHIDA, 2004; MIRANDA et al., 2004; FRANCISCO NETO et al., 2005;

CAMARGO et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2009; FREITAS et al., 2009).



metabolismo do oxigênio (BERNADI, 2007). Esse fenômeno é conhecido como

lesão de isquemia e reperfusão. Esse evento envolve mecanismos fisiopatológicos e

vias metabólicas complexas, ainda pouco esclarecidas, porém o resultado final é a

falência de órgãos e morte do paciente (MIRANDA et al., 2004; SILVA, et al., 2006).

Sendo assim, células submetidas à isquemia, que não sofreram lesão

irreversível, com a reperfusão, em vez de se recuperarem, evoluem para morte por

necrose. Os mecanismos propostos incluem a formação de espécies reativas de

oxigênio nas células parenquimatosas, endoteliais e nos linfócitos que infiltram a

lesão, que produzidas durante a reperfusão causam lesão celular diretamente por

agredir uma variedade de moléculas celulares e indiretamente pela promoção da

síntese de mediadores pró-inflamatórios (DAEMEN et al., 2002).

O radical hidroxil (HO.) é o mais reativo das espécies reativas de oxigênio

(EROs), o qual é responsável pela peroxidação lipídica e lise da membrana celular.

A presença do ferro (Fe++), íon metálico de transição, associado com o peróxido de

hidrogênio, por meio da reação de Fenton ou Haber-Weiss, potencializa a formação

do radical hidroxil (CAMPOS e YOSHIDA, 2004). Estudos desenvolvidos por Freitas

et al. (2009, 2009a), realizando o clampeamento total do pedículo hepático (manobra

de Pringle, 1908), mostraram, pela técnica do ferrocianeto-férrico, acúmulo

progressivo de pigmentos férricos (hemossiderina) nos macrófagos presentes no

parênquima esplênico, durante a congestão esplâncnica. Supõe-se que, com a

reperfusão, esse íon ferro acumulado alcance a corrente sanguínea, potencializando

a formação de radicais hidroxil e, consequentemente, as injúrias promovidas pelas

espécies reativas do oxigênio.

Com a evolução dos estudos na área dos transplantes hepáticos, modelos

experimentais de isquemia e reperfusão hepática têm sido muito difundidos. Além

dos transplantes hepáticos, esses modelos podem ser utilizados em inúmeras outras

situações, como em ressecções hepáticas, devido a tumores, traumas com lesão

hepática e choque hemodinâmico. Pela relevância dos resultados obtidos com a

isquemia promovida pelo clampeamento total do pedículo hepático (manobra de

Pringle modificada), em diferentes tempos (SEBE, 1999; CAMARGO, 2004; PIRES;

2008; FREITAS 2009), propõe-se neste estudo, pesquisar a concentração de ferro

sérico e ferritina, após clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão em

diferentes tempos.

O objetivo deste trabalho foi avaliar e correlacionar a concentração de ferro

sérico e ferritina após o clampeamento total do pedículo hepático (isquemia),

seguido do desclampeamento (reperfusão), em tempos definidos. Tempos definidos

para isquemia, pelo clampeamento do pedículo hepático (10, 20 e 30 minutos),

seguida de reperfusão pelo desclampeamento em tempos definidos (15, 30, 60 e

120 minutos).

4.2. MATERIAL E MÉTODOS

Para realização deste estudo, o projeto foi submetido à aprovação do Comitê

de Ética da Universidade de Cuiabá – UNIC, Registro: nᵒ56 CEP/UNIC/2009 –

protocolo nᵒ 2009-097.

O experimento foi desenvolvido na sala de técnica operatória do Hospital

Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Cuiabá –

UNIC. Os animais foram fornecidos pelo Biotério da Universidade de Cuiabá – UNIC,

mantido pelo Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária.

Foram utilizados 42 ratos da raça Wistar, machos, três meses de idade e

peso médio de 300 gramas. Os animais ficaram alojados em gaiolas, com

temperatura ambiente mantida por ar condicionado em 22oC, umidade em 65% e

luminosidade controlada artificialmente com lâmpadas fluorescentes (luz do dia -

Phillips – 40 Watts), com 12 horas de luz e 12 horas de escuro, água e alimentação

ad libitum. Após jejum alimentar de duas horas, os animais foram anestesiados com 25

mg/Kg de xilazina e 50 mg/Kg de cetamina, associadas na mesma seringa, pela via

intraperitoneal, seguido de tricotomia (Figura 9) e antissepsia (Figura 10), colocação de

panos de campos (Figura 11). Em continuidade realizou-se celiotomia mediana pré-umbilical

(Figuras 12 e 13), identificação e clampeamento do pedículo hepático (Figuras 14, 15 e 16),

e desclampeamento de acordo com cada tempo em estudo (Figuras 17 e 18).

Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos

experimentais: grupo controle (C) – representados por seis animais em que não foi

realizado o clampeamento do pedículo hepático, grupo E1, representado 12 animais

submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 10 minutos, grupo E2,

representado 12 animais submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 20

minutos e grupo E3, representado 12 animais submetidos ao clampeamento do

pedículo hepático por 30 minutos. Em seguida, cada grupo foi subdividido em quatro

subgrupos: grupo R15, - representado por três animais de cada grupo (E1, E2 e E3)

submetidos a 15 minutos de reperfusão, após o desclampeamento do pedículo

hepático, grupo R30 - representado por três animais de cada grupo (E1, E2 e E3)


hepático, grupo R60 - representado por três animais de cada grupo (E1, E2 e E3)


hepático e grupo R120 - representado por três animais de cada grupo (E1, E2 e

E3) submetidos a 120 minutos de reperfusão, após o desclampeamento do pedículo

hepático.

Após a coleta de sangue dos animais de todos os grupos, eutanasiaram-se os

animais por aprofundamento do plano anestésico e cloreto de potássio a 10%.

Figura 9 - Animal sendo submetido a tosquia da região abdominal com máquina tosquiadeira.

Fonte: Sebe et al. (1999).

Figura 10 - Anti-sepsia da região abdominal do animal com PVPI tópico.( Polivinil Pirrolidona Iodo)


Figura 11 - Panos de campo colocados sobre o animal e fixados com pinças

Backhaus®.


Figura 12 - Celiotomia pré-retro umbilical com bisturi.


Figura 13 - Ampliação da incisão da cavidade abdominal com tesoura Metzenbaum®.


Figura 14 - Ilustração do pedículo hepático.

Fonte: www.facmed.unam.mx. 2012.

Figura 15 - Apresentação do hilo hepático (sistema porta hepático).

Fonte: Arquivo pessoal (2012).

Figura 16 - Clampeamento do pedículo hepático com pinça vascular.


Figura 17 - Animais durante a reperfusão (desclampeados).


Figura 18 - Animais durante a reperfusão.


Ao final de cada período de reperfusão, obteve-se de cada animal uma amostra

de sangue venoso colhido da veia cava caudal, acondicionado em tubo de coleta de

sangue à vácuo, sem anticoagulante, que foi posteriormente centrifugado, em

centrífuga (Modelo- Excelsa II 206 BL, Marca- FANEM) em velocidade de 3.000 rpm

durante cinco minutos, para obtenção do soro, a ser analisado a concentração de

ferro sérico e ferritina.

A avaliação da concentração de ferro sérico e ferritina foram realizadas no

Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Geral Universitário.

Para análise das amostras, foram utilizados analisadores automatizados. Para

dosagem de ferro sérico, o analisador utilizado foi o modelo A15 da marca

BioSystems, utilizando kit de ferro marca BioSitems. Já para o dosagem de ferritina,

o analisador é o modelo AxSYM da marca Abbott, utilizando kit de ferritina marca

AxSYM-Abbot.

Os dados obtidos na fase experimental serão submetidos à análise estatística

empregando-se o software Jandel Sigma Stat para Windows (Jandel Corporation,

1993).

As informações colhidas referentes ao ferro sérico e da ferritina foram

analisadas estatisticamente utilizando o software IBM SPSS 21.0, consistindo em

análises de variâncias com comparações post hoc pelo teste de Dunnet. Os

pressupostos de aderência dos resíduos a distribuição normal e homogeneidade de

variâncias, respectivamente, obtendo resultados não significativos para ambos.

4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foi realizada análise de variância para repetições múltiplas (one way RM

ANOVA) na avaliação das diferenças das médias ao longo do tempo dentro de cada

grupo, seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls. A comparação entre os

grupos, nos diferentes intervalos,foi realizada pelo teste-t de Student. As diferenças

serão consideradas estatisticamente significativas quando p>0,05.

4.3.1. Resultado macroscópico quanto à coloração

Na ocasião do clampeamento, todos os órgãos drenados pelo sistema porto

apresentaram-se congestos (Figura 19).

Figura 19 - Intestino delgado e estômago congestos após clampeamento do pedículo hepático. Fonte: Arquivo pessoal (2012).

4.3.2. Resultado microscópico

A congestão esplâncnica causada pelo clampeamento total do pedículo

hepático (manobra de Pringle, 1908), favorece o acúmulo progressivo de pigmentos

férricos (hemossiderina) nos macrófagos presentes no parênquima esplênico

(FREITAS et al. 2009, 2009a). (Figura 20)

Figura 20 - Notar em C (grupo controle) pigmento de hemossiderina dentro do macrófagos, aumenta progressivamente (setas), nos grupos E1 (10 minutos), E2 (20 minutos) e E3 (30 minutos). Reação de Perls (Ferrocianeto-férrico) 10X.

Fonte: FREITAS et al. (2009, 2009ª).

Logo, com a reperfusão, esse íon de ferro poderia alcançar a corrente

sanguínea, favorecer a formação de espécies reativas de oxigênio como os radicais

hidroxil e, consequentemente, injúrias celulares.

No entanto, como não houve aumento significativo de ferro sérico,

provavelmente essa injúria celular não ocorrerá. Logo, o mesmo não pode afirmado

com a ferritina, pois a mesma apresentou-se diferença significativa, apenas no grupo

reperfusão de 120 minutos.

4.3.3. Resultados Bioquímicos

A Tabela 1 apresenta os valores médios de ferro sérico em ratos após

clampeamento por 10, 20 e 30 minutos, seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120

minutos.

C

E2

E1

E3

Tabela 1 – Valores médios de ferro sérico (mcg/dL) em ratos submetidos a 10 (T10), 20 (T20) e 30 (T30) minutos de clampeamento seguidos de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos

Ferro sérico

Tempo Clampeamento C R15 R30 R60 R120

T10 214,4 125,8 203,8 190,4 242,5

T20 214,4 173,3 201,5 217,2 341,4

T30 214,4 302,7 217,5 303,4 210,7

A Tabela 2 apresenta os valores médios de ferritina em ratos após

clampeamento por 10, 20 e 30 minutos, seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120

minutos.

Tabela 2 – Valores médios de ferritina (ng/mL) em ratos submetidos a 10 (T10), 20 (T20) e 30 (T30) minutos de clampeamento seguidos de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos

Ferritina

Tempo Clampeamento C R15 R30 R60 R120

T10 9,69 29,0 13,4 27,5 53,7

T20 9,69 14,5 24,4 26,5 79,2

T30 9,69 31,3 28,6 22,7 137,9

No estudo estatístico desenvolvido para comparar os resultados obtidos no

experimento entre o grupo controle e os diferentes tempos de reperfusão 15, 30, 60

e 120 minutos para as quantificações realizadas para a variação da quantidade do

ferro sérico não detectaram diferenças significativas, estando as variações do ferro

sérico entre o grupo controle e os grupos experimentais em diferentes tempos. Ao se

comparar o mesmo fator entre os diferentes tempos de reperfusão observou-se que

o grau de significância estava dentro do prescrito pela literatura, não se detectando

diferenças significativas na quantificação do ferro sérico não demonstrou nenhum

grau de significância (Figura 21).

Figura 21 - Concentração de ferro sérico (mcg/dl) de ratos submetidos ao clampeamento (isquemia) seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.

No estudo estatístico desenvolvido para se comparar os resultados obtidos no

experimento entre o grupo controle e os grupos tempos de reperfusão observou-se

que as quantificações realizadas para a variação da ferritina sérica apresentou

diferenças significativas somente para o grupo de tempo de reperfusão de 120

minutos. Ao se comparar o grupo controle e os grupos de reperfusão com tempos de

15, 30 e 60 minutos não detectou-se grau de significância estando os resultados

compatíveis com os citados na literatura consultada (FREITAS et.al., 2003).

Ao compararmos os resultados obtidos para a ferritina sérica entre os grupos

de reperfusão em diferentes tempos observou-se que a variação obtida entre os

tempos de 15,30 e 60 minutos foram não significativos não havendo variação

significativa da ferritina sérica entre os grupos comparados. Já quanto comparamos

os grupos com tempos de reperfusão de 15,30 e 60 minutos com o grupo de

reperfusão com tempo de 120 minutos observou-se um nível significância menor que

1%, sendo o resultado obtido para a ferritina sérica para o tempo de reperfusão de

120 minutos muito superior aos grupos de reperfusão para 15,30 e 60 minutos

(Figura 22).

Figura 22 - Concentração de ferritina (ng/ml) de ratos submetidos ao clampeamento (isquemia) seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.

4.4. CONCLUSÃO

A concentração de ferro pode não ser alterada após clampeamento e

reperfusão do pedículo hepático em diferentes tempos, ao passo que a ferritina pode

ter aumento da concentração após reperfusão em tempos mais longos.

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Software Jandel Sigma Stat para Windows (Jandel Corporation, 1993).

5. CONCLUSÕES GERAIS

A concentração de ferro pode não ser alterada após clampeamento e

reperfusão do pedículo hepático em diferentes tempos, ao passo que a ferritina pode

ter aumento da concentração após reperfusão em tempos mais longos.

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DISSERTAÇÃO PALU FINAL