DNA Metabolizam 1 Dio

Embed Size (px)

Citation preview

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

DNA metabolizam podrazumijeva procese replikacije, popravka i rekombinacije. DNA je jedina makromolekula za koju postoji sistem za reparaciju. elije preureuju svoju genetsku informaciju procesom koji se zove rekombinacija.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Mapa hromozoma E.coliMapa pokazuje relativne pozicije gena koji su vani u metabolizmu DNA. Jedna minuta oznaava 40000 baznih parova. Geni su oznaeni sa tri mala slova u italiku. Skraenica ukazuje na funkciju gena.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Replikacija DNA je semikonzervativna. Svaki od dva lanca DNA slui kao kalup za sintezu novog lanca i pri tome nastaju dvije nove DNA molekule, svaka sa jednim novim i jednim starim lancem. Hipotezu o semikonzervativnoj replikaciji postavili su Watson i Crick neposredno po publiciranju njihovog rada o strukturi DNA (1953)

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Hipoteza je potvrena genijalnim eksperimentom Matthewa Meselsona i Franklina Stahla 1957. god. koji su u vie generacija uzgajali elije E.coli u mediju koji sadri 15N, teki izotop nitrogena umjesto normalnog mnogo rasprostaranjenijeg lakog izotopa 14N.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Sav nitrogen u DNA bio je 15N (na gornjem dijelu slike plava traka nakon centrifugiranja u gradijentu gustoe CsCl). Kada se elija premjesti u medij koji sadri samo laki izotop 14N, celularna DNA, nakon jedne generacije, nalazit e se na viem poloaju u gradijentu gustoe (purpurna traka). U drugoj generaciji nastaju dvije hibridne DNA i dvije lagane DNA (obiljeene crvenom bojom) to potvruje semikonzervativnu replikaciju.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Sinteza DNA je visokokoordiniran proces u kojem se roditeljski DNA lanci istovremeno odvijaju i repliciraju. Replikacijske ralje su mjesta gdje se odvija DNA, a razdvojeni lanci brzo repliciraju.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Replikacija zapoinje na jednom mjestu koje se naziva origin-poetak.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Replikacija bakterijskog hromozoma odvija se u dva smjera i oba kraja replikacijske petlje imaju aktivne replikacijske ralje.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Novi lanac DNA uvijek se sintetizira u 5' 3' smjeru, gdje je slobodna 3' OH mjesto gdje se produava DNA. Poto su dva DNA lanca antiparalelna, lanac koji slui kao kalup ita se od 3' kraja prema 5' kraju. Ako se sinteza oba lanca odvija u 5' 3' smjeru jedan od novih DNA lanaca sintetizira u kraim segmentima, koji su nazvani Okazakijevi fragmenti.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Okazakijevi fragmenti dobili su naziv prema Reiji Okazakiju koji je pronaao da se jedan od dva nova lanca DNA sintetizira u kratkim segmentima. Okazakijevi fragmenti mogu biti dugi od nekoliko stotina do nekoliko hiljada nukleotida, zavisno od tipa elije.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

SINTEZA DNA SE ODVIJA U 5' 3' SMJERU

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Jedan lanac sintetizira se kontinuirano a drugi diskontinuirano. Kontinuirani ili vodei lanac je onaj u kome se 5' 3' sinteza odvija u istom smjeru u kome se kreu replikacijske ralje. Diskontinuirani ili tromi lanac je onaj u kome se 5' 3' sinteza odvija u smjeru koji je suprotan smjeru kretanja replikacijskih ralji. Sinteza vodeeg i tromog lanca je usklaena i strogo koordinirana.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Enzimi koji razgrauju nukleinske kiseline nazivaju se nukleaze ili DNaze, ako su specifine za DNA. Svaka elija sadri nekoliko razliitih nukleaza koji pripadaju dvjema glavnim klasama: egzonukleazama i endonukleazama. Egzonukleaze razgrauju DNA sa krajeva molekule i djeluju u 5 3 smjeru, ili 3 5 smjeru, to znai da uklanjaju nukleotide samo sa 5 odnosno 3 kraja jednog od lanaca dvolanane nukleinske kiseline.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Endonukleaze razgrauju DNA lanac na bilo kojem mjestu pri emu se molekula cijepa na manje fragmente Postoje klase endonukleaza koje cijepaju DNA samo na specifinim nukleotidnim sekvencama. To su restrikcione endonukleaze i vane su u biotehnologiji.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

DNA sintetiziraju enzimi DNA polimeraze. 1955. A. Kornberg i sar. preistili su i okarakterizirali DNA polimerazu iz elija E. coli. Ovaj enzim nazvan je DNA polimeraza I. Detaljna istraivanja DNA polimeraze I pojasnila su osnovne karakteristike procesa sinteze DNA koje su zajednike za sve DNA polimeraze.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Osnovna reakcija je nukleofilni napad 3-hidroksilne skupine nukleotida koji se nalazi na 3 kraju rastueg lanca na 5--fosfat dolazeeg deoksinukleozid 5trifosfata.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

U ovoj reakciji otputa se anorganski difosfat ( pirofosfat ). Opta reakcija se moe prikazati: (dNMP)n + dNTP ( dNMP ) n+1 + PPi DNA produena DNA

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Nekovalentno slaganje baza i interakcije pri sparivanju baza pomau stabilizaciju produene DNA u odnosu na slobodni nukleotid. Stvaranje proizvoda pokree i hidroliza osloboenog pirofosfata, djelovanjem enzima pirofosfataze.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Eksperimenti sa DNA polimerazom I doveli su do definiranja dva glavna preduslova za odvijanje polimerizacije DNA. 1.Sve polimeraze trebaju kalup. Reakcijom polimerizacije upravlja kalup, koji je lanac DNA, a polimerizacija se odvija po principu sparivanja baza kako su to pretpostavili Watson i Crick. To je bio prvi primjer biosintetske reakcije za ije je odvijanje potreban kalup.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

2. Za polimerizaciju je neophodan primer ( klica ili pokreta). koji ima slobodnu 3-hidroksilnu grupu na koju se dodaju nukleotidi.

Primer je segment lanca, komplementaran sa kalupom,

DNA polimeraze mogu dodavati nukleotide samo na ve postojei lanac. Primeri su esto oligonukleotidi RNA, a ne DNA.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Prosjean broj nukleotida koji polimeraza doda prije nego disocira sa kalupa naziva se procesivnost. DNA polimeraze se znaajno razlikuju po procesivnosti: jedne dodaju samo nekoliko nukleotida prije nego to disociraju sa kalupa, druge ih dodaju vie hiljada.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Replikacija se odvija sa izuzetnom tanou tako da se u E. coli napravi jedna greka na svakih 109 do 1010 dodanih nukleotida.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Tokom polimerizacije, razlikovanje odgovarajuih od pogrenih nukleotida ne vri se samo na osnovu hidrogenskih veza koje odreuju pravilnost sparivanja izmeu komplementarnih baza nego i na osnovu geometrije standardnih A = T i G C baznih parova.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Netaan nukleotid se moe spariti hidrogenskim vezama na kalup, ali se ne moe smjestiti u aktivno mjesto DNA polimeraze I. Neodgovarajue baze e biti odbaene prije nego se stvori fosfodiesterska veza.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Tanost same reakcije polimerizacije ipak je nedovoljna da objasni visok stupanj tanosti kojom se odvija replikacija. polimeraze ugrauju netaan nukleotid na svakih 104 do 105 tanih nukleotida. U in vivo uslovima postoje dodatni enzimski mehanizmi kojima se greke umanjuju.

In vitro mjerenjima utvreno je da DNA

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Jedan mehanizam, bitan za praktino sve DNA polimeraze, je zasebna 3 5 egzonukleazna aktivnost koja dvostruko provjerava svaki dodati nukleotid. 3 5 egzonukleazna aktivnost omoguava enzimu da ukloni tek dodati nukleotid i visoko je specifina za pogrene bazne parove.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

3 5 egzonukleazna aktivnost enzima koja se naziva kontrolno itanje ne predstavlja jednostavni obrat reakcije polimerizacije, jer u njoj ne sudjeluje pirofosfat. Polimerazna aktivnost i aktivnost kontrolnog itanja DNA polimeraze su zasebne enzimske aktivnosti i mogu se mjeriti odvojeno. Kontrolno itanje poboljava tanost polimerizacije za 102 do 103 puta.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

DNA polimeraza I, koja je monomer, sadri na jednom polipeptidnom lancu dva zasebna aktivna mjesta. Za jedno aktivno mjesto vezana je polimerazna aktivnost enzima, a za drugo aktivnost kontrolnog itanja. DNA polimeraza ostavlja priblino jednu greku na svakih 106 do 108 dodatih baza. Dodatnu tanost obezbjeuje zaseban enzimski sistem koji popravlja pogreke pri sparivanju baza koje su preostale nakon replikacije.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Primjer korekcije pogreke pomou 3 5 egzonukleazne aktivnosti DNA polimeraze I.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

E.coli ima najmanje 5 DNA polimeraza. Primarna uloga DNA polimeraze I nije u replikaciji, nego u temeljitom ienju tokom replikacije, rekombinacije i popravljanja DNA. Ove posebne funkcije vezane su za 5 3egzonukleaznu aktivnost enzima.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

DNA polimeraza II je enzim koji sudjelije u popravljanju DNA. DNA polimeraza III je kljuni replikacijski enzim E. coli. DNA polimeraze IV i V su identificirane 1999. god. i sudjeluju u neobinom nainu popravljanja DNA.

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet Tuzla

Predavanja iz predmeta Biohemija I

Prof. Dr. Lejla Begi

Kada se domen koji ima 53 egzonukleaznu aktivnost ukloni sa enzima, preostali fragment (Mr 68000) naziva se veliki Klenow fragment koji ima ouvanu polimeraznu aktivnost i aktivnost kontrolnog itanja.

Veliki Klenow fragment