DRAGO BEŠLO

PRAKTIKUM IZ BIOKEMIJE

(skripta)

veljača, 2014.

http://www.periodni.com/gallery/polarimetar.pnghttp://www.periodni.com/gallery/preuzimanje_slike.php?name=water.png

PREDGOVOR

Svjedoci smo vrlo intenzivnog razvoja tehnika molekularne biologije koja nam omogućuju razumijevanje kemijske osnove života. Poznavanje kemijske osnove života i načina građenja velikih molekula kako u biljnom i životinjskom svijetu (od jednostavnih kemijskih preteča) važno je za razumijevanje života na Zemlji. Naime, potrebno je rasvijetliti koji dio stanice sintetizira velike molekule u vodenom mediju, na tjelesnoj temperaturi i u neutralnoj sredini. Odgovor leži u efikasnim katalizatorima u živim stanicama koji ubrzavaju kemijske reakcije od deset do nekoliko tisuća puta. Ti katalizatori se zovu enzimi. Poznato je da u stanici ima i do nekoliko tisuća enzima. Što je zajedničko svim enzimima? Oni pripadaju grupi spojeva koji se nazivaju proteini, koji su građeni od dugih lanaca aminokiselina. Enzimi se u stanici nalaze u trodimenzionalnom obliku i to su polimerne makromolekule. Imajući u vidu gore navedeno, dolazimo do zaključka da bi se rasvijetlile mnoge reakcije u stanci pomažu nam razne tehnike molekularne biologije i biokemije.

Prilikom izbora tehnika i načina rada s određenim aparaturama, rukovodio sam se mojim dosadašnjim iskustvom rada u laboratoriju. Znam da se sa svim ovim tehnikama studenti neće uspjeti upoznati tijekom rada u laboratoriju pri određenim modulima. Trudio sam se upoznati studente i s tehnikama koje će im možda koristiti u budućem radu.

Prije svakog upoznavanja s vježbama u laboratoriju u okviru svakog poglavlja pokazao sam dio teoretskog dijela koji su studenti naučili tijekom predavanja, ali namjera je bila da imaju mali podsjetnik. I na kraju određene cjeline postavio sam neka pitanja i probleme.

U Osijeku, 10. 02. 2014.

Drago Bešlo

SADRŽAJ:

1. Vodene otopine ………………………………………………………………….……………………….1

1. 1. Izražavanje koncentracija otopina……………....…………………………………………………1

1. 2. Slabe kiseline i baze…………………………………………………………………………....…….…..5

1. 3. Razrjeđivanje pufera…………………………………………………………………………..….……18

1. 4. Ionska jakost pufera…………………………………………………........………………………...….19

2. Aminokiseline……………………………………………………………………………...…………….....23

2. 1. Nomenklatura aminokiselina……………………………………………………...…………….....28

2. 2. Fizikalno kemijska svojstva aminokiselina………………………………..…………………..28

2. 3. Kemijske reakcije aminokiselina…………..……………………………………………..….........34

2. 3. 1. Reakcije amino i karboksilne skupine …………………………....………………………....34

3. Proteini…………………………...…………………………………………………………………………....39

3. 1. Struktura, funkcija i svojstva proteina……………………………………………………........43

3. 2. Principi izoliranja i analitika….………………………………………………………...……….....51

3. 3. Kemijske reakcije proteina…………………………………………………………………………..52

3. 4. Izoliranje proteina iz biološkog materijala………………....………………………….......…57

3. 5. Određivanje koncentracije proteina u biološkom materijalu…………….....…......…59

3. 6. Eksperimentalne metode u biokemiji………………...…………………………………..........62

3. 6. 1. Gel elektroforeza……………………………...………………………………………………..........62

3. 6. 2. Kromatografske metode…………………………..…………………………………….…….......66

3. 7. Optičke i fotometrijske metode…………………………………...………………………………..71

3. 7. 1. Metode koje se zasnivaju na interakciji molekula sa

elektromagnetnim zračenjem…………………………………………………………….........73

3. 7. 2. Lamber-Beerov zakon………………………………………………………………………….......76

3. 8. Metode koje se zasnivaju na sedimentaciji; Ultracentrifuga……………..………....…86

3. 8. 1. Analitička ultracentifuga…………………………………………………………………….....…90

3. 8. 2. Preparativno centrifugiranje…………………………………………………...………………..90

3. 8. 3. Zadaci i problemi.......................................................................................................................94

4. Enzimi…………………………………………………………………………………………..………............99

4. 1. Enzimi kao biološki katalizatori……....………………………………………………………....102

4. 2. Termodinamika i kinetika……………………………………………………………………….....104

4.3. Brzina reakcije i teorija sudara……………………………………………………………….…..106

4. 3. 1. Teorija ukupne brzine reakcije…………………………………………………..………….. 107

4. 4. Glavne karakteristike enzima kao katalizatora…………………………....………....…..110

4. 5. Kinetika kemijskih reakcija……………………………………...……………………...……...….112

4. 5. 1. Osnovni principi kemijske kinetike…………………………....………………………...…112

4. 5. 2. Kinetika enzimskih reakcija……………………………………………………………..……..116

4. 5. 3. Osnovne jednadžbe u kinetici enzimskih reakcija....................................................117

4. 5. 3. 1. Značenje konstante KM....................................................................................................121

4. 5. 3. 2. Karakteristike Michaelis-Menten-ove jednadžbe...............................................122

4. 5. 3. 3. Grafičko prikazivanje Michaelis-Menten-ove jednadžbe..................................123

4. 6. Utjecaj temperature na brzinu reakcije..............................................................................125

4. 7. Utjecaj ostalih čimbenika na brzinu reakcije...................................................................127

4. 7.1. Utjecaj inhibitora na brzinu enzimske reakcije…………………………………...…….127

4. 7. 2. Utjecaj pH na aktivnost enzima……………………………………………………………….136

4. 7. 3. Utjecaj temeperature na brzinu katalizirane reakcije enzimima………….……141

5. Svojstva nekih enzima................................................................................................................142

5. 1. Amilaza............................................................................................................................................142

5. 1. 1. Određivanje ukupne aktivnosti amilaze........................................................................144

5. 1. 2. Ispitivanje utjecaja pH na aktivnost amilaze...............................................................146

5. 2. Ispitivanje aktivnosti invertaze....................................................................................... ......148

5. 3. Ispitivanje utjecaja različitih faktora na aktivnost enzima........................................152

5. 3. 1. Ispitivanje utjecaja duljine vremena provođenja reakcijenana aktivnost

ureaze..................................................................................................... ......................................156

5. 3. 2. Ispitivanje utjecaja toplinskog faktora na aktivnost ureaze.................................157

5. 3. 3. Ispitivanje utjecaja Na+ i PO43- na aktivnost ureaze.................................................158

5. 3. 4. Ispitivanje utjecaja aktivatora i inhibitora na aktivnost ureaze.........................159

5. 3. 5. Ispitivanje utjecaja pH na aktivnost ureaze.................................................................160

6. Literatura............................................................................................................................. ..............162

1

1. U V O D

Za rad u biokemijskom laboratoriju koriste se različite otopine i iz tih razloga je potrebno poznavati

izražavanje njihove koncentracije. Tako da ćemo na početku prikazati mali podsjetnik iz izražavanja

koncentracija otopine.

1. 1. IZRAŽAVANJE KONCENTRACIJA OTOPINA

Molaritet (M) predstavlja broj molova otopljene tvari u jednoj litri otopine. Međunarodni sustav

jedinica (SI) preporučuje izražavanje volumena u m3. Prema tome, 1 litra = 10-3 m3 (po definiciji 1 L = 1

dm3, 1 ml = 10-6 m3 = 1cm3). Molaritet se često koristi kao alternativni način izražavanja koncentracije.

Koncentracije razrijeđenih otopina često se izražavaju u manjim jedinicama:

mmol/l (milimol/litri) = 10-3 M

mol/l (mikromolarna/l) = 10-6 M

nmol/l (nanomolarna/l) = 10-9 M

Aktivitet () je stvarna (efektivna) koncentracija iona u otopini:

http://www.google.hr/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=AdHYlzk8MnLTCM&tbnid=cYPpa1mXHS7dUM:&ved=&url=http://magaza.hammaddeler.com/Potasyum-Antimon-III-Oksit-Tartarat-Trihidrat-250-gr-1080920250,PR-32081.html&ei=h1OsUt60DIbmywO84oGQDA&bvm=bv.57967247,d.bGQ&psig=AFQjCNEfPL36CXppUxryjrz87m3ANGlw2w&ust=1387111687553374

2

M

gdje predstavlja koeficijent aktiviteta koji ovisi o naboju i koncentraciji iona i ukupne ionske jakosti.

Vrijednosti za koeficijente aktiviteta nekih iona prikazani su u Tablici 1.

Ionska jakost ( I ) otopine mjera je jakosti električnog polja koje daju ioni u otopini. Ionska jakost

jednaka je polovini zbroja produkata koncentracije (M) i kvadrata naboja (z) svakog iona u otopini.

Ionska jakost I2

1 izražava se na sljedeći način:

22

1

2

1ii zMI

gdje je Mi molaritet, a zi naboj i-tog iona.

Tablica 1. Koeficijenti aktiviteta nekih iona u otopini

ION KONCENTRACIJA

0,001 M 0,01M 0,1 M

H* 0,975 0,933 0,860

OH- 0,975 0,925 0,805

Acetat - 0,975 0,928 0,820

H2PO4- 0,975 0,928 0,744

HPO42- 0,903 0,740 0,445

PO43- 0,796 0,505 0,160

Citrat - 0,975 0,926 0,810

Citrat 2- 0,903 0,741 0,450

HCO3- 0,975 0,928 0,820

CO32- 0,903 0,742 0,445

Molalitet (m) predstavlja broj molova otopljene tvari u 1 000 g otapala i koristi se u nekim fizikalno---

kemijskim izračunavanjima (npr. krioskopiji i ebulioskopiji). Kod razrijeđenih otopina molalitet i

molaritet su praktično isti.

3

Težinski postotak (w/w) broj je grama otopljene tvari u 100 g otapala (%/w).

Težinsko/volumni postotak (w/v) broj je grama otopljene tvari u 100 ml (cm3) otapala (%/v).

Masena koncentracija (γ) jednaka je omjeru mase (mA) otopljene tvari i volumena (V) otopine. SI

jedinica za masenu koncentraciju jest kg m-3, ali se u laboratoriju češće upotrebljava g dm-3 koja ima

istu brojčanu vrijednost.

= 𝑚𝐴𝑉

Postotak zasićenja predstavlja koncentraciju soli u otopini izraženu kao postotak od zasićene otopine

te otopine na određenoj temperaturi. Proteini se često izoliraju diferencijalnim taloženjem pomoću

neutralnih soli (tvz. isoljavanjem). Najčešće se upotrebljava (NH4)2SO4 zbog svoje velike topivosti u

vodi. Količina (NH4)2SO4 potrebna za pripremanje otopine određenog postotka zasićenja može se

izračunati (dolje primjer) ili se pronaći u biokemijskim tablicama (vidi Tablicu 2).

P r i m j e r :

Specifični je volumen krutog (NH4)2SO4 je 0,565 ml/g. Topljivost (NH4)2SO4 je 700 g/1 000 g H2O.

Potrebno je izračunati:

a) koncentraciju (NH4)2SO4 u zasićenoj otopini na 0o C,

b) količinu krutog (NH4)2SO4 koju treba dodati u 500 ml otopine 40% zasićenja,

(na 0oC) da bi se dobilo 60% zasićenje.

Volumen zasićene otopine (NH4)2SO4 na 0oC je 1 000 ml + 706 x 0,565 ml = 1 399 ml

Masena koncentracija (NH4)SO4 u ovoj otopini je lg505,0

1399

706

Molaritet zasićene otopine je Mmasamol

82,314,132

505

.

505

Moguće je izvesti izraz

2

12

285,01

505

s

sst

U ovom je izrazu t = težina krutog (NH4)SO4 koju treba dodati na 1000 ml otopine čije je početno

zasićenje s1, da bi se postiglo zasićenje s2 (0s11; 0s21). Faktor 505 u brojniku predstavlja

4

koncentraciju (u g/l) 100% zasićene otopine, a faktor 0,285 u nazivniku predstavlja produkt iz

specifičnog volumena i koncentracije zasićene otopine: (0,565 ml/g) x (0,505 g/ml).

Iz naprijed navedenog proizilazi ml

g

l

gt

5009,608,121

6,0285,01

4,06,0505

Tablica 2. Tablica za podešavanje koncentracije otopine (NH4)2SO4 na temperaturi 250C

Željeno zasićenje amonijevog sulfata; % pri 00C

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

Početno zasićenje

Masa (g) (NH4)2SO4 koju treba dodati u 100 cm3 otopine radi postizanja željenog zasićenja

0 10,7 13,6 16,6 19,7 22,9 26,2 29,5 33,1 36,6 40,4 44,2 48,3 52,3 56,7 61,1 65,9 70,7

5 8,0 10,9 13,9 16,8 20,0 23,2 26,6 30,0 33,6 37,3 41,1 45,0 49,1 53,3 57,8 62,4 67,1

10 5,4 8,2 11,1 14,1 17,1 20,3 23,6 27,0 30,5 34,2 37,9 41,8 45,8 50,0 54,5 58,9 63,6

15 2,6 5,5 8,3 11,3 14,3 17,4 20,7 24,0 27,5 31,0 34,8 38,6 42,6 46,6 51,0 55,5 60,0

20 0 2,7 5,6 8,4 11,5 14,5 17,7 21,0 24,4 28,0 31,6 35,4 39,2 43,3 47,6 51,9 56,5

25 0 2,7 5,7 8,5 11,7 14,8 18,2 21,4 24,8 28,4 32,1 36,0 40,1 44,2 48,5 52,9

30 0 2,8 5,7 8,7 11,9 15,0 18,4 21,7 25,3 28,9 32,8 36,7 40,8 45,1 49,5

35 0 2,8 5,8 8,8 12,0 15,3 18,7 22,1 25,8 29,5 33,4 37,4 41,6 45,9

40 0 2,9 5,9 9,0 12,2 15,5 19,0 22,5 26,2 30,0 34,0 38,1 42,4

45 0 2,9 6,0 9,1 12,5 15,8 19,3 22,9 26,7 30,6 34,7 38,8

50 0 3,0 6,1 9,3 12,7 16,1 19,7 23,3 27,2 31,2 35,3

55 0 3,0 6,2 9,4 12,9 16,3 20,0 23,8 27,7 31,7

60 0 3,1 6,3 9,6 13,1 16,6 20,4 24,2 28,3

65 0 3,1 6,4 9,8 13,4 17,0 20,8 24,7

70 0 3,2 6,6 10,0 13,6 17,3 21,2

75 0 3,2 6,7 10,2 13,9 17,6

80 0 3,3 6,8 10,4 14,1

85 0 3,4 6,9 10,6

90 0 3,4 7,1

95 0 3,5

100 0

5

1. 2. SLABE KISELINE I BAZE

Da bi mogli razumjeti ponašanje slabih kiselina i baza u vodenoj otopini, potrebno je razumjeti osobine

i ponašanje većine biomolekula. Veliki broj malih metabolita kao i dijelova biopolimera kiseline su ili

baze. Svojstva velikih molekula potječu od njihovog naboja na određenom pH fiziološke otopine.

Stabilnost prirodne (nativne) konformacije makromolekula ovisi o kemijskoj građi i svojstvima

makromolekule pri fiziološkom pH u stanici. Mnoge laboratorijske tehnike i metode za izoliranje i

ispitivanje ovih tvari zasnivaju se na njihovim kemijskim svojstvima.

A) DEFINICIJA KISELINA I BAZA

Prema Luisovoj teoriji, kiselina se može definirati kao tvar koja može otpustiti protone, a baza kao

tvar koja može primiti protone. U vodenoj otopini ovaj se proces može prikazati na sljedeći način:

HA + H2 O A- + H3O+

A1 B2 B1 A2

[H3O+] = [A-] = X

[HA] = c(HA) - X

K(HA) = X2/c(HA) - X

X2 + K(HA)*X - K(HA)*c(HA) = 0

gdje su A1 i A2 međusobno konjugirani par kiselina, a B1 i B2 međusobno konjugirani par baza. HA je

kiselina jer predaje proton. A- je baza jer može primiti proton, npr. u reakciji u kojoj H2O igra ulogu

kiseline:

A- + H2O AH + OH-

B1 A2 A1 B2

[H3O+]

6

Svaka kiselina ili baza može se karakterizirati svojom konstantom disocijacije (Ka ). Za slabu kiselinu bit

će:

KA H O

H O HAa'

3

2

K

A H O

HAa

3

Konstanta disocijacije slabe kiseline u pravilu mnogo je veća od ionskog produkta vode. Prema tome,

zanemariv je doprinos disocijacije vode koncentraciji hidronij iona i to je razlog zašto se Ka može

prikazati na dva načina, ali najčešće se koristi drugi način izračunavanja.

Za konjugiranu bazu:

KHA OH

A H Ob'

2

K

HA OH

Ab

Kakav je odnos između ovih dviju konstanti? Ako ih pomnožimo dobit ćemo:

K KH O A

HA

HA OH

AH O OHa b

3

314

10 (ionski produkt H2O)

odnosno:

pK pKa b 14

Isti odnos vrijedi i za slabu bazu i njenu konjugiranu kiselinu:

7

K KB H O

BH

BH OH

Btj pK pKa b a b

3 1410 14.

U gornjim jednadžbama primijenjen je uobičajen način izračunavanja: pH H log .

P r i m j e r :

CH3COOH + H2O CH3COO- + H3O+ pKa = 4,76

pKa + pKb = 14

CH3COO- + H2O CH3COOH + OH- pKb = 9,24

H2CO3 + H2O HCO3- + H3O+ pKa1 = 6,10

HCO3- + H2O H2CO3 + OH- pKb1 = 7,90

HCO3- + H2O CO2- + H3O+ pKa2 = 10,25

CO32- + H2O HCO3- + OH- pKb1 = 3,75

NH3 + H2O NH4+ + OH- pKb = 4,70

NH4+ + H2O NH3 + H3O+ pKa = 9,30

CH3NH2 +H2O CH3NH3+ + OH- pKb = 3,36

CH3NH3+ + H2O CH3NH2 + H3O+ pKa = 10,64

Slabe kiseline i baze u vodenim otopinama nisu potpuno disocirane. Na primjer, kod kiselina je jedan

dio u AH a drugi u A- obliku. Postotak disociranog oblika u odnosu na ukupnu količinu kiseline ili baze

8

naziva se stupnjem disocijacije. Odnos disociranog i nedisociranog oblika ovisi o Ka i o pH (koncentraciji

H3O+ iona). Ako se logaritmira jednadžba za Ka i preuredi dobit će se jednadžba:

KH O A

HAK H O

A

HAa a

3

3log log log

log log logH O KA

HAa3

pH pKA

HAa

log

Za slabe baze može se izvesti analogan izraz:

pH pK

B

BHa

log

Ova jednadžba se naziva Henderson-Hasselbachova jednadžba i u biokemiji se mnogo primjenjuje.

B) TITRACIJA SLABE KISELINE

Kada se slaba kiselina titrira jakom bazom, dobit će se krivulja kao na Slici 1., pri čemu se pH u svakom

trenutku titracije može izračunati iz Henderson-Hasselbach-ove jednadžbe. Prije početka titracije pH

će odgovarati pH kiseline:

9

Iz

K

H O A

HAa

3

proizilazi da je pH pK p HAa 1

2

Kada je kiselina djelomično utrošena, pH ovisi o odnosu koncentracija ostatka kiseline i nastale soli,

čija koncentracija odgovara koncentraciji dodane baze:

pH pKA

HAa

log

Kada je 1

2kiseline istitrirana, koncentracija soli jednaka je koncentraciji kiseline pa pH jeste jednako

pKa:

S obzirom da je A HA tada je pH = pKa.

U ovom dijelu pH vrlo malo se mijenja s dodatkom baze (puferska sredina). Kada se cijela kiselina

potroši, pH će biti lužnat zbog hidrolize nastale soli:

KOH HA

Ab

pOH pK p Ab 1

2 pH pOH 14

10

Slika 1. Krivulja titracije slabe kiseline sa jakom bazom

C) LABORATORIJSKI PUFERI

Pojam pufer je grčka riječ koja označava odupiranje promjeni. U kemiji se puferom naziva otopina

slabe kiseline i njene soli (ili otopina slabe baze i njene soli) koja ima osobinu da sprječava velike

promjene pH pri dodatku manjih količina H+ ili OH- iona.1 Poznavanje pufera je za svakog biokemičara

potrebno, kako zbog razumijevanja osnovnih biokemijskih procesa, tako i zbog rutinske primjene u

laboratoriju.

Naime, stanice nekog organizma odupiru se većim promjenama pH i njihovoj vanjskoj okolini. Kao što

je poznato, stanični procesi su vrlo osjetljivi na promjenu pH medija i radi toga pH medija vrlo pažljivo

1 U daljnjem tekstu pisat ćemo H+ umjesto H3O+ itd.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50 60

pH

VOLUMEN DODANE BAZE

TITRACIJA SLABE KISELINE JAKOM BAZOM

TOČKA EKVIVALENCIJE

11

je izreguliran. Unutarstanični procesi zbivaju se pri neutralnom pH ili vrlo blizu neutralnom pH, jer pri

tome pH metabolički procesi teku maksimalnom brzinom. Izuzetak su enzim lizozim koji pripada

skupini hidrolaza posjeduje maksimalnu aktivnost u području pH = 5,00, a pH želučanog soka je negdje

oko 1,5, jer pri tom pH je maksimalna aktivnost pepsina.

U biološkim je sustavima vrlo bitna konstantnost pH, zbog toga su puferi jako bitni kako bi se mogli

oduprijeti promjeni pH poslije nastanka metaboličkih produkata kao što su mliječna kiselina ili

amonijske baze. Najbolji puferski sustavi koji se nalaze u staničnoj tekućini su fosfati, bikarbonati,

aminokiseline i proteini. pH se regulira razdiobom na tvari prisutne u stanici ili izmjenom iona kroz

polupropusnu membranu. U stanici se nalaze molekule, kao npr. proteini, koje sadrže ionizacijske

grupe koje se nalaze u određenim ionizacijskim stanjima koja su važna, kako za konformaciju proteina

tako i njihovu biološku aktivnost. Pojedini su proteini izuzetno osjetljivi na promjenu pH, jer i vrlo mala

promjena uvjetuje njihovu biološku aktivnost. Tako npr. kod hemoglobina, čija je primarna funkcija da

vrši transport O2 od pluća do tkiva, produkti disanja CO2 i H+ omogućuju olakšano oslobađanje kisika.

Za proučavanje metaboličkih procesa in vitro uvjetima potrebno je koristiti puferske sustave.

Namjerna promjena pH koristi se u analitičkim studijama, a ovisi o sadržaju grupa u molekuli, kao npr.

aminokiselina, proteina i nukleinskih kiselina prilikom provedbe elektroforeze ili ionsko-izmjenjivačke

kromatografije. Puferske otopine se odupiru promjeni koncentracije vodikovih iona dodatkom kiselina

ili baza. Veličinu puferskog djelovanja nazivamo kapacitet pufera ( ) , a to je mjera za količinu jake

baze koja je potrebna da bi se pH promijenio za jednu jedinicu:

pHddb

(1)

gdje je d(pH) porast pH koji rezultira dodatkom db baze u cm3.

Miješanjem otopine slabe kiseline i njene soli, kao npr. otopina octene kiseline i otopina natrijevog

acetata (po Brönstad-ovoj i Louis-ovoj teoriji) miješanje je slabe kiseline i njene konjugirane baze pri

čemi se dobije puferska otopina, otopina koja zadržava približno konstantan pH. Konjugirani par

kiselina-baza, koji u stvari čini neki pufer, odgovoran za održavanje konstantnog pH puferske otopine.

12

Djelovanje pufera kod dodatka kiseline ili baze može se prikazati na sljedećim primjerima. Acetatni

pufer neutralizirat će se dodatkom kiseline na taj način što će vodikove ione vezati bazna komponenta,

tj. acetatni anion.

CH3 COO- + H+——> CH3COOH

Dodatkom baze neutralizirat će kisela komponenta pufera, tj. vodikov ion iz octene kiseline.

CH3 COOH + OH- ——> CH3COO - + H2O

Jasno je da kapacitet pufera ovisi o dijelu kiseline i njene konjugirane baze, a maksimalan je kada je

jednaka pH = pKa. Kapacitet pufera ovisi o ukupnoj koncentraciji kiseline i njene soli te njihovom

relativnom odnosu. Najčešće korištene koncentracije kiseline i njene soli obično su reda veličine 0,05

do 0,20 M, a općenito je najbolji puferski kapacitet unutar pH = pKa 1. Ovaj je kriterij zgodno znati

za pufere koji se koriste u istraživanjima. Postoje i određena pravila koja se mogu sumirati:

1. koristiti odgovarajući pufer u odgovarajućem pH području radi što boljeg puferskog

kapaciteta,

2. potrebito je da su što čistije, korištene kemikalije

3. ako je moguće, da su vodene otopine nepropusne kroz biološke membrane,

4. koristiti pufere gdje su enzimi stabilni,

5. koristiti pufere koji su što manje obogaćeni s drugim komponentama,

6. poželjno je da nije toksičan, korišteni pufer

7. potrebito je da je topljiv, korišteni oblik kationa

8. poželjno je da pufer ne apsorbira u vidljivom i ultraljubičastom području.

Iz gore navedenoga nije teško donijeti zaključak kako svi korišteni puferi ne sadrže željena svojstva.

Tako su npr. fosfati polivalentni kationi i često su metaboliti, dok je Tris toksičan, a posjeduje i

inhibitorska svojstva. Međutim, brojni dipolni puferi tipa HEPES i PIPES ispunjavaju gotovo sve

potrebno i vrlo često se koriste za medije kulture tkiva koji još sadrže otopine bikarbonata i fosfata.

Najčešće korišteni puferi su prikazani u Tablici 3.

13

Tablica 3. Najčešće korišteni puferi

NAZIV KEMIKALIJE STRUKTURA pKa Pirofosfat

1,52 2,36 6,60 9,25

Malat

1.92 6,23

Fosfatna kiselina

2,12 7,21

12,32

Glicin 2,34 9,78

Ftalna kiselina

2,95 5,41

Limunska kiselina

3,09 4,75 5,41

Glicilglicin

3,06 8,13

Mravlja kiselina 3,77 Octena kiselina 4,76 Piridin

5,14

MES

6,15

PIPES

6,8

HEPES

7,55

TRIS 8,10 TRICIN

8,15

BICIN

8,35

Borna kiselina

9,23

Hidrogenkarbonat 10,3

Trietilamin (TEA)

10,65

14

Korišteni laboratorijski puferi trebaju imati najveći puferski kapacitet u ispitivanom području.

Ionizacijska stanja pufera ovise o dobivenom pH (tj. količinom miješanja slabih kiselina i njihovih soli)

i vrijednosti konstante disocijacije. Za slabe kiseline jednadžba konstante disocijacije glasi:

RCOOH RCOO- + H+ (2)

kiselina konjugirana baza

a jednadžba konstante disocijacije glasi:

RCOOH

HRCOOKa

(3)

Za slabe baze, kao npr. amini, jednadžba glasi:

RNH2 + H2O RNH3+ + OH- (4)

baza konjugirana baza

a jednadžba konstante disocijacije glasi:

OHRNH

OHRNHKb

22

3

ili izraz za aK vrijednost konjugirane kiseline glasi:

RNH

HRNHKa

2

15

Produkt baiKK za slabe baze jednak je wK , tj. ionski produkt vode.

Imajući u vidu da je aK vrijednost numerički mala, u praksi se mnogo češće koristi apK , a poznato

je da je aa KpK 10log . Zbroj pK vrijednosti slabih baza i konjugiranih kiselina dobije se izraz

.14 ba pKpK pH pufera može se izračunati Henderson-Hasselbach-ovom jednadžbom. Za slabe

kiseline vrijedi oblik:

baza

kiselina

akonjugiranpKpH a 10log ili

oblik

oblik

nineionuzira

ioniziranipKpH a 10log

Kod slabih baza jednadžbe za neionizirane oblike i konjugirane kiseline bit:

kiselinaakonjugiran

bazapKpH a 10log ili

oblik

oblik

ionizirani

nineionizirapKpH a 10log

Opće je poznato ako slaba kiselina prevladava u neioniziranom obliku (npr. –COOH grupa), pri niskoj

pH vrijednosti dok pri visokom pH prevladavat će ionizirani oblik slabe kiseline (npr. COO- grupa).

Točno suprotno za slabe baze pri niskom pH prevladavat će ( npr. –NH3+) konjugirana kiselina, dok kod

visokog pH prevladat će neionizirana (–NH2) slaba baza. Ovakva je osjetljivost pufera važna kod

fizioloških otopina. Poznavanje svojstava pufera važno je u istraživanju u in vitro uvjetima kod

korištenja tehnika elektroforeze i ionskoizmjenjivačke kromatografije.

16

U otopini slabe kiseline i njene soli, pH otopine po Henderson-Hasselbach-ovoj jednadžbi će ovisiti o

pKa kiseline i odnosa koncentracija soli i kiseline:

pH pKsoli

kiselinea log

Ako uzmemo da koncentracija HA odgovara količini kiseline, a koncentracija A- količini soli u puferu,

suma njihovih koncentracija naziva se molaritet pufera. Tako na primjer u 0,2 M acetatnom puferu

suma koncentracija octene kiseline i acetatnih iona je 0,2 M. Mala količina H+ iona koja se doda u

otopinu pufera neutralizira se nastajanjem odgovarajuće količine kiseline HA, i obrnuto, OH- se

neutralizira u reakciji sa HA. Kako se pri ovome mijenja odnos

A

HA

i pH će se malo promijeniti.

Sposobnost pufera da se odupre promjeni pH bit će najveća kada je pH = pKa iako je dio u kojoj jedna

kiselina ili baza mogu biti puferi veća i iznosi pKa 1 (pogledaj krivulju titracije slabe kiseline). U Tablici

2. prikazane su pKa vrijednosti nekih kiselina i baza koje se koriste kao komponente pufera. Za pufere

pri kiselom pH uzimat će se tvari sa pKa 7, a za pufere u baznoj pH tvari sa pKa 7.

Sposobnost pufera da se odupire promjeni pH ovisi o njegovom kapacitetu. Mjera za kapacitet pufera

je promjena pH ovisno o količini dodanih H+ ili OH- iona. Kapacitet se pufera definira kao ona količina

H+ ili OH- iona koju treba dodati da se pH pufera promjeni za 1; prema tome u kiselom i u baznom

smjeru će biti jednako samo u puferima kod kojih je pH = pKa. Prema tome kapacitet pufera ovisi o pH

(radi odnosa prema pKa) i o koncetraciji komponenti pufera (0,2 M pufer ima veći kapacitet od 0,1 M

pufera). Ovakvo razmatranje može se primijeniti i na slabe baze što ćemo uočiti iz sljedećeg primjera.

Primjer:

Reakcija katalizirana enzimom izvodi se u 0,2 M Tris puferu (pKa = 8,1) na pH = 7,8. Kao rezultat reakcije

nastaje 0,3 mol /l H+ iona. Potrebno je:

a) napisati jednadžbu reakcije kojom ovaj pufer najmanje mijenja pH

b) odrediti koncetraciju Tris+ i Triso na početku i na kraju reakcije

c) odrediti pH pufera na kraju reakcije. Koliki bi bio pH kada bi se reakcija provodila bez

pufera?

17

d) kako bi priredili 1 dm3 ovog pufera polazeći od Tris i koncentrirane HCl?

e) u kojem se dijelu pH Tris može upotrijebiti kao pufer? Koliki je kapacitet ovog pufera?

Tris je komercijalni naziv za trihidroksimetil aminometan. Hidroksilne skupine povećavaju topivost

ovog amina u vodi.

a) Reakcije Tris baze sa H+ i OH- ionima:

(HOCH2)3CNH2 + H+ (HOCH2)3CNH3+ (HOCH2)3CNH3+ + OH- (HOCH2)3CNH2

Triso Tris+ Tris+ Triso

b)

pH pKTris

Trisa

o

log

7 8 81. . log

Tris

Tris

o

5.03,0log Tris

Tris o

S obzirom da je Tris Triso = 0,2 proizlazi da je Tris M 0133. i Tris Mo 0 067. na početku

reakcije. Na kraju reakcije je H M 0030. te je zbog toga Tris M 0163. i Tris Mo 0 037. ,

c)

456,7167.0

037.0log1,8 pH

Bez pufera: 52,103,0log pH

Znači, pH pufera se smanjio sa 7,8 na 7,5, a bez pufera bi bio 1,5. Do tako niskog pH reakcija se sigurno

ne bi odvijala, jer bi se enzim prije toga inaktivirao.

d) Izvaže se 0,2 M (31,4 g) Tris

18

e) priredi 0,067 M HCl (2,68 g koncentriranog HCl, dopuni do 1 dm3 sa destiliranom H2O).

S obzirom da pH ovisi o odnosu Tris

Tris

o

pH se u ovom slučaju neće promijeniti.

f) pH pKa 1 81 1. 7.1 pH 9.1

6 8 81. . log

Tris

Tris

o

Tris

Tris

o

0 05.

Tris M 0190.

Tris Triso 002.

Smanjenjem pH za 1 ( 7.8 6.8 ) Tris povećava se sa 0.133 M na 0.190 M što odgovara

H M 0057. (kapacitetu u kiselom dijelu).

Na isti način možemo izvesti za kapacitet ovog pufera u baznom dijelu (pH sa 7.8 8.8) koji će

odgovarati OH M 0051. .

1. 3. RAZRJEĐIVANJE PUFERA

Prema Henderson-Hasselbach-ovoj jednadžbi pH pufera ovisi samo o pKa i odnosu koncentracija

kiseline i njene konjugirane baze, što bi trebalo značiti da se pri razrjeđivanju pufera (dodakom H2O)

pH ne bi trebao mijenjati. Međutim, prilikom velikog razrjeđivanja, tj. smanjenju koncentracije

kiseline i njene baze. pH pufera se ipak malo promijeni. Do ovoga dolazi iz više razloga. Naime,

koeficijenti aktiviteta prilikom razrijeđivanja približavaju se jedinici, a i stupanj disocijacije kiseline ili

njene konjugirane baze povećava se, što dovodi do male promjene pH pufera. Potrebno je brinuti

prilikom velikog razrjeđivanja i uzeti u obzir i koncentraciju H+ iona iz vode.

19

1. 4. IONSKA JAKOST PUFERA

Prilikom ispitivanja utjecaja pH na neku reakciju potrebno je provjeriti jesu li puferi jednake ionske

jakosti, jer kao što je poznato ionska jakost može imati utjecaja na enzimsku reakciju. Puferi različitog

sastava pa čak i puferi istog sastava na različitim pH imaju različitu ionsku jakost. U slučaju potrebe da

se izjednači ionska jakost to se postiže dodatkom potrebne količine neke neutralne soli kao što je npr.

NaCl.

Primjer:

Koji pufer ima veću ionsku jakost: 0,5 M Tris pufer (pH 7,5) ili 0,05 M fosfatni pufer istog pH? Kako

bismo izjednačili ionsku jakost ovih pufera?

Iz Tablice 2. u dodatku očitamo da je pKa za Tris 8,1, a za H3PO4 pKa1 = 2,12, pKa2 = 7,21 i pKa3 = 12,32.

Koeficijente aktiviteta očitamo u Tablici 1.

Prvo ćemo izračunati koncentracije Tris+ i fosfatnih iona. Ako nam je poznata ukupna koncentracija

iona koja iznosi 0,05 M, možemo izračunati koncentracije Tris odnosno fosfatnih iona. Ako znamo da

je koncentracija Cl- iona jednaka koncentraciji Tris+ iona, a koncentracija K+ iona je dva puta veća od

koncentracije fosfatnih iona prema jednadžbi na stranici 2. izračunamo ionsku jakost .

Tris:

Tris

Tris olog1,85,7 Fosfat:

4242

2

4

2

4log2,75,7POHPOH

HPOHPO

MTris 04,0

42

2

4

88,0

64,0log2,75,7

POH

HPO

MCl 04,0 MHPO 37,024

22 112

1

2

1 ClTrisI MPOH 013,042

04,004,02

1

2

1I MMxK 087,0013,037,02

20

222 1087,01013,02037,02

1

2

1xxxI

124,02

1I

Da bi se ionska jakost izjednačila potrebno je dodati 0,084 M NaCl u 1 dm3 Tris pufera. Prilikom dodatka

NaCl pH će se malo izmjeniti (obzirom da ionska jakost utječe na koeficijent aktiviteta) i zato je

potrebno ponovo podesiti pH.

Tablica 4. pKa vrijednosti za opće biološke pufere

Trivijalni naziv Ime pufera pKa na 250C

Pirofosfat (pKa1) 0,85

Oksalat (pKa1) 1,19

Glicerofosfat (pKa1) 1,47

EDTA (pKa1) Etilendiamin tetraoctena kiselina 1,70

Histidin (pKa1) 1,82

Pirofosfat (pKa2) 1,96

Maleat (pKa1) 2,00

Benzenheksakarbonat (pKa1) 2,08

Fosfat (pKa1) 2,12

Brucin tetrahidrat (pKa1) 2,30

Benzen pentakarbonat (pKa1) 2,34

Glicin (pKa1) 2,34

Benzen 1,2,4,5-tetrakarbonat (pKa1) 2,43

Benzen heksakarbonat (pKa2) 2,46

EDTA (pKa2) Etilendiamin tetraoctena kiselina 2,60

Malonat (pKa1) 2,85

Ftalat (pKa1) 2,90

21

Benzen pentakarbonat (pKa2) 2,95

Salicilat 2,98

Benzen 1,2,3-trikarboksilat (pKa1) 2,98

PIPES (pKa3) 1,4-piperazin-(etansulfonska kiselina) 3,00

Tartart (pKa1) 3,02

Fumarat (pKa1) 3,03

Citrat (pKa1) 3,06

Ciklopentan tetra-1,2,3,4-karboksilat (pKa1) 3,07

o-ftalat (pKa1) 3,10

Benzen 1,2,4,5-tetrakarboksilat (pKa1) 3,13

Benzen 1,3,5-trikarboksilat (pKa1) 3,16

Benzenheksakarboksilat (pKa1) 3,24

Dimetilmalonat (pKa1) 3,29

Mandelat 3,36

Butan 1,2,3,4-tetrakarboksilat (pKa1) 3,36

Malitat (pKa1) 3,40

1,1 –cikolheksandikarbonat (pKa1) 3,52

2-metilpropan-1,2,3-trikarboksilat (pKa1) 3,53

Hipurat (pKa1) 3,64

Propan-1,2,3-trikarboksilat (pKa1) 3,67

Formiat (pKa1) 3,75

3,3-dimetilglutarat (pKa1) 3,79

1,1-ciklopentandiacetat (3,3-tetrametilglutarna kiselina) (pKa1) 3,82

Itakonitat (pKa1) 3,84

Laktat 3,86

Benzenpentakarboksilat (pKa1) 3,94

Benzen-1,3,5-trikarboksilat (pKa1) 3,98

Barbiturat 3,98

Askobtat (pKa1) 4,10

22

2,2-dimetilsukcinat (pKa1) 4,11

Sukcinat (pKa1) 4,19

Benzoat 4,20

Oksalat (pKa2) 4,21

Sukcinat (pKa1) 4,21

Citrat (pKa2) 4,76

Acetat 4,76

Piridin 5,23

Citrat (pKa3) 5,40

Sukcinat (pKa2) 5,64

MES 2-(N-Morfolino)etansulfonska kiselina 6,15

Kakodilat Dimetillaurinska kiselina 6,27

Karbonat (pKa1) 6,35

BIS-Tris Bis-(2-hidroksietil)iminotris(hidroskimetil)metan 6,46

ADA N-2-acetamidoiminooctena kiselina 6,59

PIPES Piperazin-N,N'-bis(2-etansulfonska kiselina) 6,76

Pirofosfat 0,85

Oksalat 1,19

Glicerofosfat 1,47

EDTA Etilendiamino tetraoctena kiselina 1,70

Tartarat 3,02

Fumarat 3,03

Glicilglicin 3,0

23

2. AMINOKISELINE

Kako bismo definirali što su aminokiseline? Poznato je iz organske kemije da su to organske kiseline

kojima je na -ugljikovom atomu H-atom zamijenjen NH2-grupom. Prirodne aminokiseline su, osim

malog broja izuzetaka, uglavnom -aminokiseline, pa im pripada i opća formula:

One su sastavni dio proteina, ali se mogu nalaziti i u slobodnom stanju u tjelesnim tekućinama i tkivu

gdje čine rezervoar slobodnih aminokiselina (aminokiselinski "pool"). Aminokiseline služe u prvom

redu za biosintezu proteina, te također mogu poslužiti i za biosintezu mnogih drugih biokemijski važnih

supstanci , kao npr: porfirina, nukleinskih baza, alkaloida, i dr.

Do danas je iz prirodnih produkata izolirano više stotina aminokiselina. Međutim, hidrolizom prirodnih

proteina dobije se uglavnom 20 aminokiselina koje se danas nazivaju osnovnim aminokiselinama.

Klasifikacija aminokiselina može se provesti na više načina. S gledišta proteinske kemije aminokiseline

se dijele prema polarnosti R-ostatka pri pH 6 do 7 (što predstavlja pH unutarstanične tekućine u

organizmu) na četiri skupine:

1) nepolarne

2) polarne nenabijene (neutralne)

3) polarne negativno nabijene (kisele)

4) polarne pozitivno nabijene (bazne)

U Tablicama 5., 6. i 7. prikazane su strukturne formule aminokiselina, njihovi nazivi te troslovne i

jednoslovne oznake.

http://www.periodni.com/gallery/alanine.png

24

Tablica 5. Nepolarne aminokiseline

STRUKTURNA FORMULA

NAZIV AMINOKISELINE

TROSLOVNA OZNAKA

JEDNOSLOVNA OZNAKA

GLICIN Gly G

ALANIN Ala A

VALIN Val V

LEUCIN Leu L

IZOLEUCIN Ile I

FENILALANIN Phe F

TRIPTOFAN Trp W

METIONIN Met M

25

PROLIN Pro P

Tablica 6. Polarne, ali nenabijene aminokiseline

STRUKTURNA FORMULA

NAZIV AMINOKISELINE

TROSLOVNA OZNAKA

JEDNOSLOVNA OZNAKA

SERIN Ser

S

TREONIN Thr T

CISTEIN Cys C

TIROZIN Tyr T

ASPARAGIN Asn N

GLUTAMIN Gln Q

26

Tablica 7. Polarne(kiselo i bazično nabijene) aminokiseline

STRUKTURNA FORMULA

NAZIV AMINOKISELINE

TROSLOVNA OZNAKA

JEDNOSLOVNA OZNAKA

ASPARAGINSKA KISELINA

Asp

D

GLUTAMINSKA KISELINA

Glu E

LIZIN Lys K

ARGININ Arg R

HISTIDIN His H

27

Prema kemijskoj strukturi, aminokiseline se mogu podijeliti u tri skupine i to:

a) alifatske - Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Lys, Arg, Asp, Asn,Glu, Gln,

b) aromatske - Phe, Tyr, Trp,

c) heterocikličke - Pro, His, Trp

Prema Dakin-u aminokiseline se, glede razgradnje ugljikovodičnog R-ostatka, mogu podijeliti u dvije

skupine i to:

a) glukogene, tj. one koje se pri nedostatku ugljikohidrata u prehrani

prevode u šećere preko oksalacetata i fosfoenolpiruvata (glukoneogeneza); u ovu skupinu ubrajamo:

Gly, Ser, Ala, Thr, Val, Asp, Glu, Arg, Pro, Hyp (hidroksiprolin)

b) ketogene, tj. one koje grade "ketonska tijela" (aceton, -ketomaslačnu

kiselinu); u ovu skupinu ubrajamo: Leu, Tyr i Phe.

Trp i Lys ne pripadaju ni jednoj od navedenih dviju skupine.

I na kraju, aminokiseline se dijele na esencijalne (bitne, nezamjenjive) i neesencijalne. Neesencijale su

one koje ljudski organizam kao i sisavci mogu sami sintetizirati, a esencijalne su one koje se moraju

unositi putem hrane. Poznato je da samo biljke i mikroorganizmi mogu sintetizirati sve aminokiseline,

dok životinjski organizmi, pa tako i ljudi sintetiziraja samo 12-14 aminokiselina. Preostale

aminokiseline životinje i ljudi ne mogu biosintetizirati ili ih sporo sintetiziraju pa se moraju unositi

putem hrane kako ne bi došlo do poremećaja u metabolizmu.

Prema Rose-u za ljudski organizam esencijalne aminokiseline su:

Val, Ile, Leu, Thr, Met, Lys, Phe, Trp

a za mlade organizme u razvoju, uz gore navedene esencijalne su i: Arg i His.

28

2. 1. NOMENKLATURA AMINOKISELINA

U biokemiji se uglavnom upotrebljavaju trivijalna imena aminokiselina koja su često dobivena od

naziva prirodnih spojeva biljnog i životinjskog podrijetlo iz kojih su izolirane, pa tako npr. Asp od

asparagusa, Gln i Glu od glutena, Ser od grčke riječi serous-svila, Tyr od grčke riječi tyros-sir, Trp

dobiven hidrolizom proteina pomoću tripsina.

Imena nekih aminokiselina potječu i od strukture bliskih spojeva, kao npr. Val od valerijanske kiseline,

Thr od treoze, Pro od pirolidina i td.

Osim Trp, Asp i Glu imana svih aminokiselina završavaju na in, acil ostaci aminokiselina na il (seril,

glutamil, alanil itd).

2.2. FIZIKALNO-KEMIJSKA SVOJSTVA AMINOKISELINA

Kada su u krutom stanju ili se nalaze otopljene u polarnom otapalu, aminokiseline egzistiraju u

energijom siromašnom stanju, tj. kao dipoli (“zwitter”) ioni:

Ovo objašnjava njihovu visoku točku tališta s obzirom da su aminokiseline kristalni spojevi i to su

njihove karakteristične veličine. Dipolna struktura je također uzrok težoj topljivosti aminokiselina u

nepolarnim otapalima kao i njihovo karakteristično ponašanje u kiselim i baznim otapalima. Dokaz o

postojanju dipolarne strukture nalazimo u Raman-ovim i IR-spektrima, u kojima nedostaju

karakteristične vrpce za NH2- i COOH-grupu, nego se pojavljuju vrpce za -NH3+ i COO-.

Topljivost aminokiselina. Sve aminokiseline, osim malih izuzetaka (Asp, Glu, His, Tyr, Cy-S-S-Cy) dobro

su topive u vodi, amonijaku i drugim polarnim otapalima, a u nepolarnim i u slabo polarnim kao što su

metanol, etanol i aceton slabo su topive. Uzrok ovome je činjenica da je prijelaz nenabijene molekule

29

aminokiseline (I) u dipolarni ion (II) vezan s količinom energije od 44,0 do 51,5 kJ/molu, pa je i

ravnoteža pomjerena gotovo potpuno prema energetski “siromašnijoj” dipolarnoj strukturi (II).

Topljivost aminokiselina ovisi svakako i o prirodi R-ostataka aminokiselina (hidrofilni bočni ostatci

povećavaju topljivost u vodi). Najmanju topljivost u vodi pokazuju aminokiseline kod izoelektrične

točke (pI).

KISELO BAZNA SVOJSTVA AMINOKISELINA

Svaka aminokiselina može se u vodenoj otopini ponašati i kao baza i kao kiselina, tj. kao proton donor

ili proton akceptor, što ovisi o pH otopine. Npr. glicin se kod vrlo niskog pH ponaša kao diprotonska

kiselina, što znači da za vrijeme potpune titracije bazom može otpustiti dva protona:

Ionizacijska sposobnost pojedinih grupa određena je njihovim pK vrijednostima. pK predstavlja onu

pH vrijednost kod koje su u otopini prisutne ekvimolarne koncentracije proton donora i proton

akceptora. Tako će alanin imati dvije pK vrijednosti:

pK1 = pH kod kojeg je

i

pK2 = pH kod kojeg je

H2N CH COOH

R

+NH3 CH

R

COO-

I II

30

Slika 2. Krivulja titracije glicina i jednostavnih aminokiselina

Eksperimentalno određivanje pK1 i pK2 vrijednosti provodi se titriranjem potpuno protoniranog oblika

aminokiseline do dviju ravnoteža koje su uočljive, jer dodatkom OH – iona uzrokuje najmanju promjenu

pH vrijednosti, što je vidljivo na slikama 2., 3., i 4.

COOH

CH2

COO-

CH2H3N+

H3N+

COO-

CH2H2N

31

Slika 3. Krivulja titracije glutaminske kiseline

2

4

6

8

10

12

14

1.0 2.03.0

ekvivalentno dodavanje OH-

pH

pK1 izoelektričnatočka

pK2

pK3

32

Slika 4. Krivulja titracije lizina

2

4

6

8

10

12

14

1.0 2.03.0

ekvivalentno dodavanje OH-

pH

pK1

pK2 izoelektričnatočka

pK3

33

Izoelektična točka aminokiseline (pI) zapravo je onaj pH kod kojeg aminokiselina postoji u obliku

dipolnog iona. To znači da aminokiseline sa samo dvije ionizirajuće grupe imaju u otopini kod pI sljedeći

dominantni oblik:

Izoelektrična točka za alanin 02,62

69,934,2

AlapI

VJEŽBA:

Za vježbu je potrebno:

1. otopina aminokiseline

2. Erlenmayer tikvica

3. pH metar

4. 0,2 M NaOH

5. 0,2 M HCl

6. bireta od 25 cm3

Način provođenja vježbe:

Otopina uzorka. U 100 ml dvostruko destilirane H2O otopljeno je 300 mg aminokiseline. Uzorak

otopljene aminokiseline nalazi se u obliku dipolarnog iona. Alikvot od 40 cm3 uzorka, titrirati uz

kombiniranu elektrodu pH-metra s 0,2 M NaOH. NaOH se dodaje iz birete. Baza se dodaje u malim

obrocima, kako bi grafički prikaz titracije sadržavao što više eksperimentalnih točaka. Drugi alikvot od

40 cm3 otopljene aminokiseline titrira se iz birete s 0,2 M HCl. Nakon svakog dodatka baze odnosno

kiseline uzorak treba dobro promješati i onda očitati pH vrijednost. Na temelju grafičkog prikaza

ovisnosti pH o potrošenim cm3 kiseline odnosno baze treba pretpostaviti o kojoj se aminokiselini radi;

odrediti pK vrijednost funkcionalnih grupa, koje u toku titracije mijenjaju naboj; izračunati

izoelektričnu točku te aminokiseline i pH kod kojeg aminokiselina sadrži najveći broj nabijenih grupa.

Iz utroška kiseline ili baze u pojedinim fazama titracije, pokušajte izračunati molekulsku masu titrirane

aminokiseline!

34

2. 3. KEMIJSKE REAKCIJE AMINOKISELINA

2. 3. 1. REAKCIJE AMINO I KARBOKSILNE SKUPINE

REAKCIJA S NINHIDRINOM

Ninhidrin (3-ketohidrinden) reagira sa svim -aminokiselinama na pH između 4 i 8 dajući ljubičasto

obojen spoj. Na isti način reagiraju primarni amini i amonijak uz razliku da se kod ovih reakcija ne

oslobađa CO2. Prolin i hidroksiprolin u reakciji s ninhidrinom daju kompleks žutog obojenja.

Reakcija je jako osjetljiva i pogodna za detekciju aminokiselina kromatografskom metodom kao i za

njihovo kvantitativno određivanje.

Slika 5. Reakcija aminokiselina s ninhidrinom

R - CH - COOH +

NH 2

O

O

OH

OH

NINHIDRIN

(oksidativna

dezaminacija)

R - C - H + NH 3 + CO 2 +

O

OH H

O

O

HIDRINDANTIN

OH

OH

O

O

+ NH 3 +

O

O

HO

H

N

O

O

+ 3 H2O

RUHEMANN-OVO LJUBIČASTO

35

VJEŽBA:

Materijal i metoda:

Otopina aminokiselina (0,1% otopina)

Otopina ninhidrina (0,1 – 0,2%) svježe pripremljena, a priređuje se tako da se 5 g ninhidrina, 0,5 g

CdCl2, 25 ml dest. H2O, 25 ml octene kiseline dopuni acetonom do 500 ml.

Izvedba vježbe:

Izrezati trake filter papira širine 1,5 – 2 cm . Grafitnom olovkom označi se start na koji se nanese 0,05

ml nepoznatog uzorka i 0,1 i 0,05 ml poznate koncentracije aminokiselina. Traka filter papira se osuši

u struji toplog zraka i provuče kroz otopinu ninhidrinskog reagensa, prosuši na zraku, potom se suši u

sušioniku 10 min. na 800C. Nakon sušenja obojeni dijelovi se isijeku, prenesu u epruvetu u kojoj se

nalazi 10 ml metanola (pipetira se klipnom pipetom). Na sobnoj se temperaturi ostavi 1,5 – 2 sata. Po

isteku vremena otopina se prenese u kivetu i na kolorimetru se očita apsorbancija (zeleni filter).

Kolorimetar se baždari s metanolom.

Cilj vježbe:

Nacrtati baždarnu krivulju i odrediti nepoznatu koncentaciju u uzorku aminokiselina.

REAKCIJA NINHIDRINA S PROLINOM

Slika 6. Reakcija ninhidrina sa prolinom

O

O

OH

OH+ NH

COOH

C N

O

O-

++ CO2

žuti kompleks

Dt

36

GRAĐENJE KOMPLEKSA S TEŠKIM METALIMA

Aminokiseline s ionima metala daju komplekse kelatnog tipa. Najpoznatiji su plavi kompleksi sa Cu2+

koji dobro kristaliziraju, te se kod pojedinih aminokiselina razlikuju po topivosti, pa se na taj način

mogu upotrijebiti za odvajanje aminokiselina.

Slika 7. Reakcija građenja kompleksa s metalnim ionom

REAKCIJE NA SLOBODNE AMINOGRUPE

REAKCIJA SA HNO2

Aminokiseline koje imaju slobodnu NH2 grupu reagiraju s nitritnom kiselinom kao primarni amini

oslobađajući N2 koji se može volumetrijski mjeriti – na tome je zasnovana Van Slyke-ova metoda

kvantitativnog određivanja aminokiselina.

Cu

OH2

OH2

HN CH

C

O

CH2 CH2

CH2

O

O

C

CH NH

CH2 CH2

CH2

O

Bis-DL-prolinato-bakar (II) dihidrat

37

REAKCIJA SA FORMALDEHIDOM

Proteinski lanac je takav da u njemu R-aminokiselinski ostatci imaju slobodnu NH2-grupu. NH2 grupa

može reagirati s formaldehidom dajući pri tome mono i dimetilol-derivate čime se blokira NH2--

- grupa, te slobodne karboksilne grupe mogu reagirati s bazom. Titriranjem s bazom moguće je

odrediti koliko u peptidnom lancu postoji slobodnih karboksilnih skupina.

R-CH-COOH + HCOH R-CH-COOHHCOH R-CH-COOH

NNH2 NH-CH2OH

CH2OH

CH2OH

38

3. PROTEINI

Proteini su polimerne makromolekule, građene od aminokiselina koje su međusobno povezane

peptidnim vezama. Peptidna veza nastaje povezivanjem karboksilne skupine jedne aminokiseline s

amino skupinom druge aminokiseline :

Peptidna veza posjeduje svojstva koja su veoma značajna za prostorni raspored molekula proteina.

1. ona postoji u dva rezonantna (mezomerna) oblika

2. planarna je, tj. svi atomi peptidne veze nalaze se u jednoj ravnini

Slika 8. Peptidna veza; preuzeta od : Richard E. Dickenson and Irvin Geis, The Structure and Action of

Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

H2N CH

R1

COOH + HNH CH COOH- H2O

R2

H2N CH CO NH CH COOH

R1 R2peptidna veza

C N

O

H

C

O-

N+

H

39

3. sposobnost građenja vodikovih veza. Ako se atom vodika približi na udaljenost od 0,28 nm

slobodnom elektronskom paru, hidroksilnoj, amino, karboksilnoj skupini ili molekuli vode,

nastat će vodikova veza. Poznato je da energija vodikovih veza iznosi 10

1 kovalentne

veze. S obzirom da u molekuli proteina postoji velik broj vodikovih veza, prema tome to

je značajna energija koja stabilizira prostorni raspored proteina. Sposobnost stvaranja

vodikovih veza u proteinima imaju dvije peptidne veza koje se nađu jedna iznad druge i to

između amino skupine jedne i karbonilne skupine druge peptidne veze.

Slika 9. Osnovne veličine peptidne veze; preuzeta od: Richard E. Dickenson and Irvin Geis, The

Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

Proteini su izuzetno heterogena skupina spojeva, iako su građeni samo od 20 različitih aminokiselina.

Razlikuju se po veličini molekula, sastavu i slijedu aminokiselina, prostornom rasporedu peptidnog

lanca, komponentama koje nisu aminokiseline i dr.

Predloženo je više načina klasifikacije proteina; po jednoj mogu se podijeliti u dvije skupine:

1. proteini koji sadrže samo aminokiseline – to su jednostavni;

2. proteini koji osim aminokiselina imaju i druge komponente (prostetičke skupine) – to su

složeni proteini.

40

Jednostavni proteini međusobno se razlikuju po topljivosti i mogu se podijeliti na sljedeći način:

PROTEINI TOPLJIVOST NAĐENI U PRIRODI

ALBUMINI Topljivi u vodi i razrijeđenim

vodenim otopinama soli

gotovo u svim organizmima.

GLOBULINI

a) euglobulini

b) pseudoglobulin

Teško topljivi u vodi; topljivi u

razrijeđenim otopinama soli.

Netopljivi u 50% (NH4)2SO4.

Djelomično topljivi u vodi;

topljivi u razrijeđenim

otopinama soli. Netopljivi u

50% (NH4)SO4

gotovo u svim organizmima.

gotovo u svim organizmima.

PROLAMINI Netopljivi u vodi. Topljivi u 50-

90% etanolu.

u biljkama.

GLUTELINI

Netopljivi u vodi, razrijeđenim

otopinama soli i u 50-90%

etanolu. Topljivi u razblaženim

kiselinama i bazama.

u biljkama.

SKLEROPROTEINI

a) kolageni

b) keratini

Netopljivi u većini otapala.

Topljivi u razrijeđenim

kiselinama. Pri ključanju vode

ovi proteini želatiniziraju i

poslije toga su topljivi u vodi.

Topljivi u vodenim otopinama

KHSO4 i otopinama tioglikolne

kiseline.

vezivno tkivo, osobito

hrskavica.

u kosi, koži i noktima.

41

Jednostavni proteini koji se razlikuju od navedenih po aminokiselinskom sastavu i po biološkom

materijalu, a u koje ubrajamo:

PROTEINI TOPLJIVOST NAĐENI U PRIRODI

PROTAMINI

Mala veličina molekula,

molekulska masa približno

5000.

u spermi.

HISTONI

Bogati su bazičnim

aminokiselinama.

u jezgri stanice.

Složeni proteini su podijeljeni prema prostetičkim skupinama na sljedeći način:

PROTEINI PROSTETIČKA GRUPA NAĐENI U PRIRODI

(PRIMJER)

NUKLEOPROTEINI Nukleinske kiseline jezgra

LIPOPROTEINI

Fosfolipidi, glikolipidi i

kolesterol

membrane stanice, krvne

stanice, hilomikroni, HDL,

VLDL, LDL

GLIKOPROTEINI ugljikohidrati membrane stanice

KROMOPROTEINI

pigmenti, npr. hem,

nikotinamid, adenin-

dinukleotid

hemoglobin, citokromi,

mnoge dehidrogenaze

METALOPROTEINI npr. Zn2+, Fe2+ alkohol dehidrogenaza

42

Prema obliku proteini su podijeljeni u dvije osnove skupine: fibrinalni i globularni. Fibrinalni proteini

su izduženi vlaknasti lanci spojeni raznim tipovima veza, a oblikuju vrlo stabilnu netopljivu molekulu.

Tipičan primjer ove skupine proteina su keratin, miozin i kolagen. Molekule globularnih proteina su

približno elipsoidnog oblika. Ovoj skupini pripadaju biološki aktivni proteini, kao što su protutijela i

enzimi.

3. 1. STRUKTURA, FUNKCIJA I SVOJSTVA PROTEINA

Molekule proteina su veoma složene. Dugi polipeptidni lanac koji nastaje povezivanjem nekoliko

stotina aminokiselina, može imati raznolik prostorni raspored. Prostorni raspored aminokiselinskih

bočnih ogranaka nekog proteina predstavlja konformaciju toga proteina. Prostorna struktura nekog

polipeptidnog lanca obuhvaća pojmove sekundarne i tercijarne strukture proteina, koji, pored

primarne i kvaternarne strukture, čini osnovne “strukturne nivoe” molekula proteina.

Polipeptidni lanac posjeduje samo dva stupnja slobodnog okretanja na -ugljikovom atomu po

aminokiselinskom ostatku, i to: kut između C - N atoma je os , a kut između C - C je os . Ovi kutovi

definiraju udaljenost između dviju strana (peptidnih veza) (Slika 10.).

Slika 10. Peptidna veza i mogućnosti rotacije na -ugljikovom atomu. Preuzeto od: Richard E.

Dickenson and Irvin Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

Primarna struktura označava redoslijed (sekvenciju) aminokiselina u polipeptidnom lancu (Slika 11).

43

Slika 11. Aminokiselinski sastav goveđe ribonukleaze; disulfidne veze su označene. Preuzeto od:

Lubert Stryer, Biokemija, Školska knjiga, 1991.

Sekundarna struktura predstavlja strukturu glavnog dijela polipeptidnog lanca koji su prostorno

uređeni na određen pravilan način, tako da gdje god je moguće nagradi najveći broj vodikovih veza. U

ovaj oblik strukture ubrajamo spiralnu strukturu ili - uzvojnicu te nabranu ploču (engl. pleated sheet)

ili -strukturu, kao i strukturu kolagena.

- uzvojnica (heliks) konformacijski je oblik gdje je dio polipeptidnog lanca uvijen u obliku spirale, a

hod jednog uzvoja iznosi 3,6 aminokiselinskih ostataka. Ovaj konformacijski oblik stabiliziran je

vodikovim vezama između susjednih atoma peptidne veze. Ako se u polipeptidnom lancu nađe

aminokiselina prolin, nastupaju odstupanja u strukturi -uzvojnice.

44

Slika 12. Definiranje promjera heliksa p i broj aminokiselinskih ostataka po jednom okretu heliksa n.

Preuzeto od: Richard E. Dickenson and Irvin Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and

Row, Publishers, 1969

Kod -nabrane strukture (ploče), da bi polipeptidni lanci mogli tvoriti vodikove veze između dva

paralelna dijela istog polipeptidnog lanca, potrebno je da se približe jedan drugome tako, da se amino

grupa peptidne veze nađe nasuprot karbonilne grupe peptidne veze na udaljenosti od 0,28 nm.

Međutim, kada je Pauling pokušao prirediti takav model, utvrdio je da nema dovoljno prostora za

bočne ostatke aminokiselina, pa je izvršio korekciju tako, da je “nabrao” ravninu u kojoj se nalaze

međusobno povezani peptidni lanci. Time je postigao da se bočni ostatci aminokiselina nalaze gotovo

okomito u odnosu na ravninu “nabiranja”.

45

Slika 13. Vodikove veze unutar antiparalelnih -ploča. Preuzeto od: Richard E. Dickenson and Irvin

Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

Između dvije nabrane β-ploče peptidne veze tvore vodikove veze između različitih dijelova

polipeptidnog lanca.

Slika 14. Polipeptidni lanac u β–nabranoj ploči: Preuzeto od: Richard E. Dickenson and Irvin Geis, The

Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

46

Slika 15. Dva paralelna peptidna lanca u -nabranoj strukturi. Preuzeto od: Richard E. Dickenson and

Irvin Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

Slika 16. Pakiranje u svili alanina s jedne strane i glicina s druge strane u lancima β-nabrane ploče.

Udaljenost između dviju ploča je različita i iznosi 5,7 Å i 3,5 Å. Preuzeto od: Richard E. Dickenson and

Irvin Geis, The Structure and Action of Proteins, Harper and Row, Publishers, 1969

47

Kolagen je linearni fibrinalni protein koji ubrajamo u supersekundarnu strukturu, i čini osnovu u građi

vezivnog tkiva kože i kostiju s velikom otpornošću na istezanje. Aminokiselinskom analizom utvrđeno

je da se kolagen sastoji od glicina, alanina, prolina i hidroksiprolina. Aminokiselinski sastav peptidnog

lanca kolagena, u kojem svaka treća aminokiselina je prolin ili hidroksiprolin prilikom poprimanja

prostornog oblika, rotacija kod prolina nije u potpunosti slobodna, jer prolin je sekundarni amid, a

poznato je da rotacija na -ugljikovom atomu prolina nije u potpunosti slobodan radi steričkih smetnji,

kao kod ostalih aminokiselina. Radi toga strmija je heliksna struktura lanca u poređenju s -heliksom

u kojem je uspon od 0,286 nm. Međusobno su povezana tri spiralna lanca vodikovim vezama dajući

osnovnu jedinicu, tzv. tropokolagen. Temelj čine strme spirale čiji je promjer 1,4 nm, a dužina 280 nm.

Molekule tropokolagena poredane su jedna do druge i jedna iznad druge tako da su pomaknute za

41 dužine ostavljajući mali prostor koji je vidljiv pod elektronskim mikroskopom kao svjetlije i tamnije

pruge.

Slika 17. Kolagen. Preuzeto od: https://encrypted

tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTBYQAryUKZ0WDGA8elA0sZ6TYw2nXM_czbyD1aPxb961W

mDOsHQA

https://encrypted/

48

Kolagen je glavni vlaknasti protein kože, kostiju, tetiva, hrskavice i zuba. Taj izvanstanični protein

štapićasta je molekula duga oko 300 nm i promjera 1,5 nm. Sastoji se od tri polipeptidna lanca, od koji

svaki sadrži gotovo 1 000 aminokiselina. Nema vodikovih veza duž lanca. Pirolidinski prstenovi

uklanjaju se jedan drugome kad polipeptidni lanac poprima oblik uzvojnice koja ima približno tri

aminokiseline po okretu. Unutrašnjost trolančane uzvojnice vrlo je zbijena, što uvjetuje da glicin bude

prisutan na svakome trećem položaju. Aminokiselinski ostatci s obje strane glicina smješteni su na

vanjskoj strani, gdje ima dovoljno mjesta za glomazne prstenove prolina i hidroksiprolina.

Tercijarna struktura predstavlja konformaciju čitavog polipeptidnog lanca, specifičnu za svaki protein.

Tercijarnu strukturu stabiliziraju različiti tipovi veza. Tako je npr. dugi polipeptidni lanac globularne

molekule proteina uvijen, a takav prostorni raspored stabiliziran je nekovalentnim interakcijama

između bočnih ogranaka aminokiselina u polipeptidnom lancu. U nekovalentne interakcije spadaju

vodikove veze, ionske interakcije, hidrofobne interakcije, te Van der Wallsove sile.

Bazične lizin i arginin, te kisele dikarbonske aminokiseline koje se nalaze u polipeptidnom lancu tvore

ionske veze; cistein je izvor SH-skupine koji sudjeluje u građenju disulfidne veze, dok hidrofobne veze

nastaju kada se aromatski i alifatski aminokiselinski ostatci približe na dovoljnu udaljenost.

Slika 18. Molekula mioglobina. Preuzeto od: http://www.phattimes.com/myoglobin/images/fig1.jpg

http://www.phattimes.com/myoglobin/images/fig1.jpg

49

Kvarterna struktura predstavlja povezivanje više polipeptidnih lanaca koji grade određenu molekulu

proteina. Tako npr. hemoglobin (Slika 19.) sadrži četiri podjedinica (građen je od dvije α i dvije β

podjedinice).

U prirodnoj sredini molekula proteina je u takvom konformacijskom obliku koji osigurava maksimalnu

biološku aktivnost – u “nativnom stanju”. To je obično struktura u kojoj postoji najveći broj interakcija,

vodikovih i disulfidnih veza. Potrebno je napomenuti da se prilikom izoliranja proteina izvjestan broj

ovih veza često narušava, odnosno nestaje, pa se struktura molekula u konformacijskom smislu

mijenja; odnosno protein se denaturira.

Slika 19. Molekula hemoglobina. Preuzeto od:

http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobin/MetalComplexinBlood.html

http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobin/MetalComplexinBlood.html

50

3. 2. PRINCIPI IZOLIRANJA I ANALITIKA

Proteine nije jednostavno dobiti u čistom stanju, osobito globularne, koji se u biološkom materijalu

nalaze u stanicama. Uvjeti u kojima se provodi izoliranje proteina trebali bi biti takvi da se izbjegne

denaturacija (pH, temperatura, otapalo i dr.). Proteini mogu djelovanjem različitih kemijskih spojeva

izgubiti svoju biološku funkciju. Ova pojava se zove denaturacija, a može biti izazvana povišenom

temperaturom (iznad 40 - 50°C), zračenjem, mehaničkim faktorima, solima teških metala ili

djelovanjem jakih kiselina i baza. Denaturacija je posljedica kidanja tercijarnih i sekundarnih,

nekovalentnih veza u molekuli proteina, usljed čega dolazi do odmotavanja polipeptidnog lanca

globularnih proteina i odmatanja α-uzvojnice. Spojevi kao što su urea i gvanidin, koji imaju veliki

afinitet prema stvaranju vodikovih veza, često izazivaju denaturaciju proteina ako su prisutni u većim

koncentracijama. Ovi spojevi narušavaju sekundarnu strukturu proteina, što se koristi u

eksperimentalnom radu. Mnogi proteini su osjetljivi na promjenu oksido-redukcijskog potencijala

okoline. Uzrok tome može biti prije svega oksidacija sulfhidrilnih grupa ili redukcija disulfidnih veza.

Tako je neke proteine moguće pročistiti i ispitati jedino u reducirajućim uvjetima (u prisutnosti

glutationa, -merkaptoetanola i sl.).

Eksperimentalni kriteriji kojima se mjeri stupanj denaturacije smanjena su topljivost, povećanje

reaktivnosti aminokiselinskih ostataka peptidnog lanca, gubitak biološke aktivnosti, promjene oblika i

veličine koje se određuju promjenom viskoziteta i sedimentacijskog koeficijenta, promjene u

apsorpcijskom i fluorescentnom spektru i promjene ORD (optičke rotacijske disperzije).

Globularni proteini se obično izoliraju i odvajaju jedni od drugih na osnovi različite topljivosti. Na

topljivost proteina utječu različiti čimbenici, to su ionska jakost otapala, pH, temperatura i dielektrična

konstanta otapala.

Izoelektična točka proteina je teoretski ona vrijednost pH pri kojoj je ukupni naboj svih grupa koje

mogu disocirati (karboksilna, amino, imido, gvanidinio, hidroksilna i tiolna) jednaka nuli. Površina

proteina uvijek ima izvjesni električni naboj na koji utječe pH, prisutnost elektrolita, otapalo (naročito

voda). Međutim, na određenom pH ukupni neto naboj jednak je zbroju pozitivnih i negativnih naboja

i mnoge molekule se mogu agregirati i time će postati netopljive. Pozitivni i negativni naboji proteina

privlače ione suprotnih naboja.

Topljivost nekih proteina se mijenja iznad 40oC, topljivost drugih proteina se iznad te temperature

povećava, a neki su u tim uvjetima manje topljivi. Iznad 40oC većina proteina počinju se denaturirati,

51

osim nekih izuzetaka. Denaturacija je gotovo kod većine proteina potpuna iznad 60oC, kada je i

topljivost potpuno smanjena.

Proteine je moguće odvojiti i tako da se jedan denaturira (ako postoji specifična osjetljivost na neke

reagense), a drugi ostanu u nativnom stanju. Tako se može za denaturaciju i uklanjanje neželjenih

proteina koristiti pažljivo zagrijavanje otopine iz koje se izoliraju i odvajaju pojedini proteini.

Ribonukleza je stabilna na 90oC, dok se većina drugih proteina na toj temeperaturi denaturira. Pažljiva

kontrola pH također se može koristiti za denaturaciju neželjenih proteina.

Odvajanje proteina iz smjese, pročišćavanje, kao i identifikacija, moguća je na osnovi razlike u veličini

molekula (dijaliza, “molekulsko prosijavanje”), u električnom naboju (ionoizmjenjivačka

kromatografija, preparativna elektroforeza), molekulskoj masi (ultracentrifugiranje), apsorpciji.

Kromatografske su metode koje se vrlo često koriste apsorpcijska i ionoizmjenjivačka kromatografija,

te afinitetna kromatografija.

Ne postoji jedna jedinstvena metoda za karakterizaciju i pročišćavanje proteina; provjeravanje čistoće

vrši se uspoređivanjem različitih postupaka.

3. 3. KEMIJSKE REAKCIJE PROTEINA

Proteini su, s obzirom da aminokiseline posjeduju aminokiselinski R-ostatak, vrlo reaktivne molekule i

mogu stupiti u mnogobrojne reakcije koje nisu karakteristične za sam protein, već za određenu

funkcionalnu skupinu R-ostataka aminokiselina. Reakcija koja je karakteristična za peptidnu vezu je

biuretska reakcija koja služi za kvantitativno i kvalitativno određivanje proteina. Reakcija je zasnovana

na činjenici da biuret koji se dobije zagrijavanjem 2 mola uree i u reakciji sa otopinom bakar sulfata

(0,25% CuSO4) u bazičnoj sredini tvori ljubičasto obojen kompleks (Slika 20.).

52

Biuretska reakcija za kvalitativno dokazivanje proteina u otopini može se koristi i kao kvantitativna

spektrofotometrijska metoda. Ona se zasniva na već opisanom svojstvu bakrenog iona (Cu2+) da s

donorima elektronskih parova, kao ligandima, stvara kompleksni spoj intenzivno plave boje. Na slici

20. je prikazano kako bakarni ion reagira s dušikom iz biuree u kojima je atom dušik donor elektrona.

To svojstvo je primijenjeno i u osnovi reakcije biureta s bakrenim ionom (Slika 20.), a na njemu se

zasniva i metoda za kvantitativno određivanje proteina u otopin, jer se amino-dušik iz peptidne veze

(-CO-NH-) proteina koordinacijski veže za ion bakra (Slika 20.) baš kao i kod biuree. Dakle,

koncentracija stvorenog kompleksa, pa i intenzitet njegove boje u otopini, proporcionalan je broju

peptidnih veza, tj. količini proteina.

Ova reakcija je reproduktivna, pa je potrebna relativno velika količina proteina (1 do 20 mg). Radi

osjetljivosti (5 g proteina) u uporabi je Folin-Ciocalteu reagens po metodi Lowry-a, ali intenzitet

obojenja je srazmjeran količini proteina u otopini, s obzirom da boja ne potiče samo od biuretskog

kompleksa, nego i od redukcije soli fosfovolframove i fosfomolibdenske kiseline (koje se nalaze u

reagensu). Prigodom mjerenja apsorbanci potrebno je uvijek baždariti aparat prema sljepoj probi (tj.

probi gdje nema proteina, a ostale otopine su dodane). Na ovaj način se izmjerena apsorbanca potječe

samo od biuretskog kompleksa. Reagens je vrlo pogodan za praćenje promjene koncentracije proteina

u otopini izoliranog proteina.

2 NH2 C NH2

O NH2

CO

NH

C

NH2

O

D t

53

Slika 20. Reakcija biuree sa bakrenim ionima i reakcija peptidne veze s bakrenim ionima.

KSANTOPROTEINSKA REAKCIJA

Ksantoproteinska reakcija je karakteristična za prisustvo aromatskih aminokiselina (Phe, Tyr i Trp).

Zagrijavanjem proteinske otopine s koncentriranom HNO3 dolazi do nitriranja benzenovog prstena i

taloženja žutog taloga koji prelazi u narančastu boju dodatkom amonijaka.

Cu2+

NH2

C O

NH

C

NH2

O

OH-Cu2+

NH2

CO

NH

C

NH2

OO

NH2

C

NH

O C

NH2

CH2 - CH - COOH

NH2

OH OH

NH2

CH2 - CH - COOH

+ HNO3

NO

O

OH

NH2

CH2 - CH - COOH

+ NH3

OH

NH2

CH2 - CH - COOH

NONH4O

nitrotirozin

54

MILLON-OVA REAKCIJA

Zagrijavanjem proteina s Millon-ovim reagensom (smjesa živinog nitrita i nitrata u suvišku HNO3)

dolazi do nastanka crvenog taloga ako protein sadrži tirozinski ostatak.

GLIOKSILNA ILI ADAMKIEWICH-EVA REAKCIJA

Proteini koji sadrže triptofan kao aminokiselinski ostatak daju s glioksilnom kiselinom uz dodatak

koncentrirane H2SO4 ljubičastu ili purpurnu boju.

OH

NH2

CH2 - CH - COOH

OH

NH2

CH2 - CH - COOH

+

conc. H2SO4

Hg

NaNO2

crveni talog

NO

OHg

NH

CH2

CH-NH2

COOH

+C

O

H

C HO

+

NH

CH2

CH-NH2

COOH

H2O

NH NHC

C

H

O

H

CH2

CH-NH2

COOH

CH2

CH-NH2

COOH

55

SAKAGUCHI-EVA REAKCIJA

Sakaguchi-eva reakcija je karakteristična za gvanidino skupinu arginina. Reakcija se sastoji u sljedećem

pod utjecajem -naftola u bazičnom mediju sa NaOCl (natij hipoklorit) na slobodnu gvanidino skupinu

aminokiseline arginin dolazi do razvijanja crvene otopine. To je kvantitativni dokaz da u proteinu ima

aminokiseline arginina.

CISTEINSKA REAKCIJA

U otopini proteina koja sadrži cistein prilikom zagrijavanja sa svježe pripremljenim Pb(OH)2 dolazi do

izdvajanja crnog taloga.

CNH2NHNH - CH2 - CH2 - CH2 - CH - COOH

NH2

+

OH

NaOCl

ON

O

C

NH

NH

CH2

CH2

CH2

CH - NH2

COOH

56

3. 4. IZOLIRANJE PROTEINA IZ BIOLOŠKOG MATERIJALA

IZOLIRANJE OVALBUMINA IZ BJELANJKA JAJETA

Albumini su proteini biljnog i životinjskog podrijetla, dobro su toplivi u vodi i drugim polarnim

otapalima, a reverzibilno se talože u koncentriranim neutralnim otopinama soli u izoelektričnoj točki.

Ovalbumin je glavni sastojak bjelanjka jajeta (64%). U kristalnom obliku izolirao ga je Hofmeister 1890.

godine. Molekulska masa ovalbumina iznosi 45 000 Da, a to je molekula okruglog kompaktnog oblika.

Reagensi:

1. bjelanjak jajeta

2. zasićena otopina (NH4)2SO4

3. 5% otopina CH3COOH

4. gaza

Postupak :

Potrebno je odvojiti bjelanjak od žumanjka. Nakon odvajanja bjelanjka pristupi se određivanju

volumena bjelanjka jajeta, te se doda 10% od utvrđenog volumena 5% CH3COOH, uz miješanje smjese.

Potom se filtrira kroz gazu. Tijekom filtriranja potrebno je snažnije miješati staklenim štapićem kako

bi se razbile membrane. Po završetku filtriranja, filtratu se doda jednaki volumen zasićene otopine

(NH4)2SO4 pri čemu dolazi do taloženja globulina. Nakon 30 – 60 minuta nastali talog odvoji se

centrifugiranjem. Na ovakav način se izdvoji ovomucin, glikoprotein koji daje viskozitet bjelanjku.

Dobiveni supernatant zasiti se s praškastim (NH4)2SO4 (8,5 g na 100 cm3) pri temperaturi od 20 do 220C,

pri čemu dolazi do taloženja albumina u obliku taloga. (NH4)2SO4 dodaje se polako i uz miješanje, sve

dok se precipitat koji se javlja ne počne otapati.

57

Dobiveni talog odvoji se centrifugiranjem, potom se prenese u čašu koja je potopljena u led i otopi u

manjoj količini destilirane vode (1-2 ml) . U otopinu se zatim dodaje miješanjem u kapima 5% otopina

CH3COOH do pH 4,7. Ukoliko se tijekom dodavanja CH3COOH pojavi talog, potrebno ga je odvojiti

filtriranjem. Poslije podešavanja pH, u malim se obrocima dodaje zasićena otopina (NH4)2SO4 do

pojave zamućenja, potom se ostavi na temperaturi 0 – 20C nekoliko sati. Albumin će se iskristalizirati

u obliku igličastih kristala.

Otopina ovalbumina se potom filtrira i talog otopi u točno određenom volumenu H2O kako bi se poslije

mogla odrediti koncentracija proteina. Koncentracija proteina se određuje metodom po Lowry-u. (koja

je opisana kod određivanja koncentracije proteina na stranici 58..)

IZOLIRANJE PROTEINA IZ PŠENIČNOG BRAŠNA

Iz pšeničnoga brašna mogu se izolirati proteini koji su topljivi u 70% etanolu -glijadini. Prije nego što

se pristupi izolaciji proteina potrebno je iz brašna izdvojiti škrob.

Reagensi:

1. 15 g pšeničnog brašna

2. 70% etanol

3. 0,05 M HCl

4. 0,1 M HCl

5. gaza

6. otopina J2

Način izoliranja je sljedeći: dva sloja gaze polože se na dno čaše i na njih se prenese 15 g pšeničnoga

brašna i malo vode; miješa se sa staklenim štapićem dok se ne stvori talog u obliku gustog tijesta.

Zatim se skupe krajevi gaze i talog ispire u hladnoj tekućoj vodi kako bi se izdvojio škrob. Poslije

ispiranja škroba talog postaje ljepljiv. Pri kraju ispiranja taloga potrebno je vodu ispitati s jodom da li

58

se isprao škrob. U prosjeku je potrebno ispirati oko 20-tak minuta da bi se isprao škrob. Potrebno je

da talog ostane cijelo vrijeme vlažan.

Zatim se pripremi 20 ml toplog 70% etanola, a talog se isiječe na komadiće i stavi u suspenziju vrućega

alkohola. Dobivena smjesa zagrijava se 10 minuta tako da ključa (upotrebljava se uspravno hladilo).

Dekantiranjem se odvoji alkoholna otopina. Ekstrakcija se ponavlja s 10 cm3 ključalog 70% etanola, na

isti način. Alkoholni ekstrakti se spoje.

Alkoholna otopina sadrži glijadin, koji se čuva da bi se kasnije odredila koncentracija proteina.

Koncentracija se određuje metodom po Lowry-u.

Talog koji je ostao neotopljen u etanolu jeste sirovi gluten. Pročišćavanje sirovog glutena može se

izvršiti na sljedeći način: miješanje se vrši u porculanskoj zdjelici s određenom količinom 0,05 M NaOH

da se dobro otopi i filtrira kroz nabrani filter papir. Filtrat koji se dobije služi za određivanje

koncentracije proteina po Lowry-u.

3. 5. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA U BIOLOŠKIM UZORCIMA

Referenca za Lowryevu metodu: Lowry, O. H., Rosenbrouh, N. J. Lewis Farr A. and Randall, R. J. (1951)

Protein measurement with the folinphenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 265

Reagensi:

1. Alkalni bakreni reagens

Otopina A : 2% Na2CO3 u 0,1 M NaOH (za 100 ml potrebno je 2 g Na2CO3 i 0,4 g NaOH)

Otopina B : 0,5% CuSO4 *5H2O u 1% K, Na-tartaratu. Priprema se svježi.

2. “Alkalna otopina”

U 50 ml otopine A doda se 1 ml otopine B. Otopina se priprema neposredno prije analize. Izračuna se

potrebni volumen reagensa u gore navedenom omjeru.

59

3. Standardna otopina BSA

Koristi se goveđi serum albumina (BSA) koncentracije 0,2 mg/ml. Standard se podijeli u manje volmene

(alikvote) od 0,5 ml i zamrzne.

4. Folin-Ciocalteuov reagens

Komercijalni Folin-Ciocalteuov reagens razrijedi se dodatkom destilirane vode u odnosu 1: 1 i to

neposredno prije uporabe. Otopina Folin-Ciocalteuovog reagensa je natrij tungstat i natrij molibdat u

fosfatnoj i kloridnoj kiselini.

5. Standardna otopina proteina

Otopina goveđeg seruma albumina (BSA) koncentracije 0,2 mg/ml.

Baždarni dijagram:

Proba st. ot. BSA

cm 3

Količina proteina (g)

1

2

3

4

0,025

0,050

0,075

0,100

5

10

15

20

Paraleno se radi slijepa proba u koju se umjesto standarda ili uzorka pipetira 0,1 ml destilirane vode.

6. Postupak određivanja

U otpipetirani određeni volumen uzorka (0,1 cm3), standarda i slijepe probe doda se 5 ml alkalne

otopine, smjesa se dobro promiješa na vortexu, te stoji na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon toga

doda se 0,5 ml Folinovog reagensa originalni reagens se neposredno prije uporabe razrijedi

destiliranom vodom u omjeru 1:1). Nakon temeljitog miješanja uzorci stoje 30 minuta na sobnoj

temperaturi, te im se mjeri apsorbancija na valnoj dužini od 540 nm.

60

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA METODOM PO BREDFORD-U

Referenca za Bradfordovu metodu: Bradford M. (1976), Anal. Biochemistry, 248-254

Metoda se zasniva na reakciji proteina sa bojom Coomassie Brilliiant Blue G-250 (CBB) u kiselom

mediju. CBB reagira prvenstveno sa bazičnim i aromatskim bočnim ograncima aminokiselina (Arg, Lys,

His, Tyr, Trp i Phe). U reakciji dolazi do stvaranja kompleksa protein:boja. Boja s proteinom veže se

hidrofobnim reakcijama i ionskim vezama, što stabilizira boju u anionskom obliku i dolazi do promjene

boje iz smeđe u plavu. Pri tome se apsorpcijski maksimum boje pomjera s 465 nm na 595 nm. Ova

metoda u velikoj je upotrebi zbog jednostavnosti, brzine i većeg opsega proporcionalnosti intenziteta

obojenja i koncentracije proteina.

Slobodna aminokiselina, peptid i protein niske molekularne mase ne boje se s Coomassie reagensom.

Općenito masa peptida i proteina mora biti najmanje 3 000 Daltona da se može određivati s ovim

reagensom. U nekim primjenama to može biti prednost. Na primjer, Coomassie proteinski test je

korišten za mjerenje " visoke molekulske mase proteina " tijekom fermentacije u industriji piva .

Reagensi:

1. Bradfordov reagens: 60 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 otopiti u 1 dm3 3% otopine

perklorne kiseline (HClO) i otopinu profiltrirati preko filter papira kako bi uklonili neotopljenu

boju,

2. Osnovna otopina BSA ((BSA)= 1 mg/cm3. Pripremiti po 100 µl otopine standardnog niza

prema sljedećoj shemi:

Standardni niz S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 µg proteina 0 10 20 30 40 50 60

Postupak određivanja:

Istovremeno se priprema u epruvetama standardni niz prema gore prikazanoj shemi (ukupni

volumen+ destilirana voda iznosiu 100 µl) i uzorci nepoznate koncentracije proteina. U 100 µl otopine

proteina (koja sadrži do 20 µg proteina) doda se 2 cm3 Bradford-ovog reagensa i poslije 20---

61

-30 minuta izmjeri se apsorbancija na 595 nm. Ako dolazi do taloženja, potrebno je pripremiti novu

razrijeđenu otopinu uzorka.

Na osnovu izvršenog mjerenja priredi se baždarna krivulja u Excel program i izračuna linearna regresija

da bi se dobila proračunska formula. Proračunska formula koristi se za izračun količine nepoznatog

proteina.

3. 6. EKSPERIMENTALNE METODE U BIOKEMIJI

3. 6. 1. GEL ELEKTROFOREZA

Elektroforeza na gelu je metoda izuzetnih mogućnosti za odvajanje i analizu proteina, nukleinskih

kiselina, te drugih molekula s nabojem. Elekroforetskim postupkom se molekule s nabojem pokreću

prema naprijed kroz porozni gel pomoću električnog polja ostvarenog u puferu koji prožima gel, pri

čemu se molekule odvajaju zahvaljujući svojoj različitoj elektroforetskoj pokretljivosti. Variranja

koncentracije i vrste gela i pufera omogućuju odvajanje molekula, ne samo na osnovi razlike naboja,

već također i razlike u molekulskoj masi, izoelektričnoj točki, te biospecifičnom afinitetu. Tehnika je

brza i prikladna.

PRINCIP RAZDVAJANJA PROTEINA ELEKTROFOREZOM NA AGAROZI I

POLIAKRILAMIDNOM GELU

Elektroforeza na gelu agaroze prvenstveno razdvaja proteine s obzirom na njihov naboj. Gel formira

poroznu mrežu koja služi kao stabilizirajući medij za pufere, čije su pore dovoljno velike da neometano

propuste i najveće proteinske molekule. U većini slučajeva pH pufera se podešava tako da proteini

koji se odvajaju nose isti naboj, ali se međusobno razlikuju po gustoći tog naboja. Kada se ovaj sustav

62

podvrgne djelovanju električnog polja, proteini putuju prema suprotno nabijenoj elektrodi. Što je veći

omjer njihova naboja prema molekulskoj masi, to se brže kreću. Tako se analizirani uzorak na osnovi

gustoće naboja može separirati u seriju odvojenih vrpci, koje najčešće ostaju u gelu, te se identificiraju

bojanjem ili nekim drugim postupkom. Moguće je razdvojene proteine ponovo prevesti u otopinu tako

da se dijelovi gela s vrpcama koje nas zanimaju izrežu i otope u prikladnom mediju.

Elektroforeza u poliakrilamidnom gelu slična je elektroforezi u agarozi, a od nje se razlikuje po tome

što su pore ovoga gela dovoljno malene da uspore veće proteine, usljed čega se striktna separacija

gustoćom naboja modificira efektom prosijavanja. Usljed toga se odvajanje usporava, ali se povećava

rezolucija (separacija) proteina slične gustoće naboja. Tako se npr. serum razdvaja u približno 5 vrpci

na agarozi, a na poliakrilamodnom gelu u približno 20 vrpci.

Ovi najjednostavniji oblici elektroforeze usavršeni su sljedećim postupcima:

1. Elektroforeza u gradijentu - najoptimalniji i najsavršeniji oblik separacije,

2. Elektroforeza u prisustvu detergenta (npr. SDS - natrijdodecil sulfat) - odvajanje je

isključivo na osnovi razlike u veličini molekula, te može poslužiti za određivanje

molekulske mase razdvojenih molekula,

3. Elektroforetsko odvajanje proteina na osnovi razlike u izoelektričnoj točki (izoelektrično

fokusiranje),

4. Dvodimenzionalna elektrofor