Z Lebensm Unters Forsch (1983) 177:117-120 Zeitschrift for

Lebensmittel- Untersuchung

und-Forschung @J. F. Bergmann VerIag 1983

Diinnschichtchromatographische Bestimmung von Pyrantel in Kuhmilch und Blutserum nach peroraler Applikation yon Banminth

Roland Gauch 1, Urs Leuenberger 1, Werner Limacher 2, Urs Miiller 1 und Melchior Schfillibaum 2

1 Kantonales Laboratorium, Muesmattstral3e 19, CH-3012 Bern, Schweiz 2 Eidgen6ssische Forschungsanstalt fiir Milchwirtschaft, Sektion Hygiene, CH-3094 Liebefeld, Schweiz

The Determination by Thin Layer Chromatography of Pyrantel in Cow's Milk and Blood Serum After Oral Administration of Banminth

Summary. After oral administrat ion o f the anthelmin- tic Banminth to cows the effective agent pyrantel ap- peared unchanged in b lood serum and milk. After a therapeutic dose o f 12,1 mg pyrantel tar t ra te/kg b o d y weight, a max imum level o f 8-9 gg/1 could be found in milk 0-24 h after the application; the highest concen- trat ion o f 22 gg/1 in blood serum appeared after 10 h and the half-life time of elimination was ca. 15 h. Pyrantel determinat ion in milk and blood serum was performed by quanti tat ive thin layer chromatography . Positive results could be verified by HPLC.

Zusammenfassung. N a c h peroraler Appl ikat ion des Entwurmungsmit te ls Banminth an K/ihen konnte nachgewiesen werden, dab der Wirks tof f Pyrantel un- vergndert in das Blutserum und in die Milch iibertritt. Bei therapeutischer Dosierung yon 12,1 mg Pyrantel- tar t ra t /kg K6rpergewicht t raten in der Milch in den er- sten 24 Std nach Appl ikat ion Maximal -Konzent ra t io- nen von 8-9 gg/1 auf. Im Blutserum wurden 10 Std nach Appl ikat ion H6chs tkonzent ra t ionen von ca. 22 Ixg/1 gemessen, die Eliminationshalbwertszeit betrug ca. 15 Std. Die Best immung erfolgte durch quanti tat ive Dfinnschichtchromatographie; positive Befunde konn- ten durch H P L C abgesichert werden.

Einfiihrung

Banminth ist ein Breitspektrum-Anthelrninticum (Entwurmungsmit- tel) zur Prophylaxe und Therapie der Magendarmnematosen und wurde erstmals von Austin [1] und Mc Farland [2] Ende der sechziger Jahre beschrieben. Es enth/ilt als Wirksubstanz 12,5% Pyranteltar- trat (Abb. 1) und ist ftir die Behandlung yon Rindcrn, Schafen und Schweinen vorgesehen.

Faulkner [3] und Figdor [4] zeigten, dab beim Rind nach einma- liger oraler Verabreichung von 25 mg markiertem Pyranteltartrat/kg K6rpergewicht rund 40-60% der Radioaktivitfit mit den Faeces und 10-25% mit dem Urin innerhalb 96 Std ausgeschieden werden, Das resorbierte Pyrantel scheint einer starken Metabolisierung unterwor-

fen zu sein. Nur 9,4% der mit dem Harn ausgeschiedenen Aktivitfit waren auf unverfindertes Pyrantel zuriickzuf/ihren, was lediglich ca. 2 % der applizierten Menge entsprach. Keiner der vielen Metaboliten konnte identifiziert werden. Schon 4 Std nach Verabreichung stieg die Radioaktivit~it des Plasmaspiegels auf ihren H6chstwert yon ent- sprechend ca. 2,5 mg Pyranteltartrat/1, um innerhalb yon 48 Std auf 0,25 rag/1 abzusinken.

Da Banminth weit verbreitet auch beim Milchvieh angewendet wird, interessierte die Frage, ob und in welchem AusmaB Pyrantel in die Milch iibertritt. Diesbeziigliche Angaben in der Literatur fehlen. Die yon Figdor [4] und Lynch [5] angewendeten Bestimmungsmetho- den, nach welchen N-Methyl-l,3-propandiamin (MAPA) nach basi- scher Hydrolyse als Leitsubstanz in Serum, Kot und Urin bestimmt wird0 konnten fiir Milch nicht fibernommen werden; MAPA scheint bei der Hydrolyse sofort mit Milchbestandteilen weiterzureagieren und kann nicht mehr in freier Form aus dem Reaktionsgemisch iso- liert werden.

Im folgenden wird eine Methode beschrieben, die es erlaubt, unverfindertes Pyrantel in Milch oder Serum zu best immen und zu best/itigen. Die Methode wurde ffir die quantitative Best immung von Pyrantel in Blut- serum und Milch yon zwei mit Banminth behandelten Kiihen eingesetzt.

Material und Methoden

A Geriite

Wasserbad, pH-Meter, Zentrifuge fiir 150-ml-G1/iser, DC-Auftrage- gerfit Linomat III (Camag, CH-4132 Muttenz, Schweiz), DC-Dop- peltrogwanne (Camag), Tauchwanne (Desaga, CH-8810 Horgen, Schweiz), Heizliifter, Chromatogramm-Spektralfotometer PMQ 2 (Zeiss, Oberkochen, BRD), Integrator SP-4000 (Spectra-Physics, Santa Clara, Calif. USA), isokratische HPLC-Antage mit UV-De- tektor LCD 725 (Kontron, CH-8048 Zfirich, Schweiz) und Stahl- trenns~ule 30 cm gefiillt mit Lichrosorb RP-2 5 ~tm (Merck Art. 9306) UV-Lampe (Camag Art. 29062).

B Chemikalien

Salzsgure ca. 12,5%: Salzs~iure 25% (Merck Art. 316) 1 + 1 V/V mit Wasser verdiinnen; 2-Propanol pro anal. (Merck Art. 9634), NaOH

" , J

Abb. 1. Pyranteltartrat: Trans-l-methyl-l,4,5,6-tetrahydro-2-(2-(2- thienyl) vinyl] pyrimidin-hydrogentartrat (1 : 1)

118 R. Gauch et al.: Bestimmung von Pyrantel in Kuhmilch und Blutserum

30%: 30 g Aetznatron pro anal. (Merck Art. 6498) in 70 ml Wasser 16sen; Dichlormethan pro anal. (Merck 6050) destilliert, Chloro- form reinst (Merck Art. 2431) destilliert, Natriumsulfat pro anal. wasserfrei (Merck Art. 6649), 0,05 m-Schwefelsfiure, m-Natronlauge Methanol reinst (Merck Art. 6008), Diethylamin z. Synth. (Merck Art. 803010), Ameisens/iure pro anal. (Merck Art. 264), 1,4-Dioxan pro anal. (Merck Art. 9671), Acetonitril pro anal. (Merck Art. 3); Tauchl6sung (Vorsicht, Schutzbrille!): 2 g Eisen-(III)-chlorid pro anal. (Merck Art. 3943) in 20 ml Wasser 16sen, langsame Zugabe yon 30 ml konz. Schwefels~iure, nach Abkiihlen Zugabe yon 220 ml Ace- ton rein; Pyrantel-Standardl6sung: Pyranteltartrat (Pfizer AG, CH- 8021 Ziirich, Schweiz) in Methanol 16sen, 42,8 mg/l; Faltenfilter SS 595V2, ~ 15cm (Schleicher und Schuell, CH-8714 Feldbach, Schweiz), Diinnschichtplatten Kieselgel 60 F254 (Merck Art. 5715).

I. Densitometrie (Absorption bei 290 nm)

Meganordnung: Monochromator (290 nm)-Probe, Spaltbreite 0,2 ram. Durch die Eigenabsorption des Pyrantels bei 290 nm k6n- hen negative Proben bereits erfaBt werden.

2. Densitometrie (Absorption bei 530 nm)

Positive Proben bediirfen weiterer Bestfitigungen: Zu diesem Zweck die Platte w~ihrend 5 s in die Tauchl6sung tauchen, anschlieBend senkrecht w/ihrend 1 rain auf Filterpapier stellen und w~ihrend 15 min im Trockenschrank bei 120 °C trocknen. MeBanordnung: Monochromator (530 nm)-Probe, Spaltbreite 0,03 mm.

C Prinzip der Methode

Aus der Milch resp. dem Blutserum die Basenfraktion extrahieren, konzentrieren und dfinnschichtchromatographisch auftrennen. Die Pyrantelzonen auf drei verschiedene Arten densitometrisch auswer- ten. Positive Resultate mit HPLC best/itigen.

D Herstellung und Reinigung der Extrakte

Milch. 50 ml Milch in einem 100-ml-Schlifferlenmeierkolben im Wasserbad auf ca. 40 °C erwgrmen, mit ca. 0,5 ml konz. Salzsfiure auf pH 4,0 einstellen und mit 15 ml 2-Propanol versetzen, Zur Desorption der Pyrantelbase und Ausf/illung der Milchproteine w/ih- rend 20 min auf 60 °C erw~irmen. Die noch heiBe Suspension durch ein Faltenfitter in einen 50-ml-MeBzylinder filtrieren. 45 ml des Fil- trates in einem 150-ml-Zentrifugenglas mit Schliffstopfen mit 2 ml Natronlauge 30% und 50 ml Dichlormethan schiitteln, wobei die Py- rantelbase in die untere Dichlormethan-Phase iibergeht. Die weitere Aufarbeitung ist identisch mit jener von Blutserum.

Blutserum. 25 ml dutch Zentrifugation gewonnenes Blutserum mit 1 ml Natronlauge 30% alkalisch machen, mit 15 ml 2-Propanol und 50 ml Dichlormethan versetzen und schfitteln, wobei die Pyrantelba- se in die untere organische Phase fibergeht.

Die aus Milch oder Blutserum erhaltene Dichlormethanphase zur vollst~ndigen Trennung w~ihrend 20 rain, bei 3 000 x g zentrifu- gieren. Die/iberstehende wfiBrige Phase absaugen und verwerfen, wghrenddem die organische Phase mit ca. 10 g wasserfreiem Na- triumsulfat versetzen, um die Emulsion zu brechen. Die klare L6sung durch wenig Watte in einen 100-ml-Scheidetrichter filtrieren und die Pyrantelbase in I0 ml 0,05 m-Schwefets/iure schfitteln. Das Dichlor- methan verwerfen und die schwefelsaure Phase nochmals mit 5 ml Dichlormethan schiitteln. Die wggrige Phase anschliegend mit 2 ml m-Natronlauge basisch machen und mit 50 ml Dichlormethan schiit- teln. Diese organische Phase mit wenig wasserfreiem Natriumsulfat trocknen, dutch Watte in einen 100-ml-Spitzkolben filtrieren und bei 45 °C auf ca. 1 ml eindampfen. Diesen Extrakt in ein ca. 2-ml-F1/isch- chen fiberffihren und mit einem Stickstoffstrom zur Trockene ein- dampfen. Den Riickstand in 50 gl Methanol/Chloroform (1 + 1) auf- nehmen ( = Probe16sung).

E Quantitative D~nnschichtchromatographie

50 gl ProbelSsung quantitativ mit dem Linomat III auf eine Lfinge yon 7 mm auf die Diinnschichtplatte auftragen. Von der Pyrantel- Standardl/Ssung in gleicher Weise 5/20/40 gl auftragen, entsprechend 6,25/25/50 Ixg Pyranteltartrat/1 Milch.

Laufmittel. Dichlormethan/Methanol/Diethylarnin (60 + 20 + 20 V/ V). (Re-Wert des Pyrantels: ca. 0,2).

3. Densitometrie (Fluorescenz)

Wird die pyrantelhaltige, durch die Tauchl6sung gef/irbte Zone w/ih- rend mind. 60 rain im Abstand von 4 mm mit UV-Licht 366 nm be- strahlt, bildet sich eine fluorescierende Verbindung. Meganordnung: Hg-Lampe-Filter 366 nm-Probe-Monochromator (490 nm), Spaltbreite 0,6 mm.

F Bestiitigung mit HPLC

Pyrantelhaltige Proben ein zweites Mal aufarbeiten mit dem Zweck a) das quantitative Dfinnschichtresultat zu best~itigen, und b) die pyrantelhaltige DC-Zone in einem unabh/ingigen Chrornato-

graphiesystem zu verifizieren. Nach der Densitometrie bei 290 nm die pyrantelhaltige Zone un-

ter dem UV-Licht bei 254 nm markieren und mit der Absaug-Eluti- onsvorrichtung [6] (Prinzip ,,Miniaturstaubsauger") von der Platte absaugen. Mit 2 ml eines Gemisches aus Chloroform/Methanol/ Diethylamin (10+ 10+0,5 V/V) die Pyrantelbase auf dem Schicht- material in ein 10-ml-Schliffreagensglas eluieren und im Stickstoff- strom zur Trockene eindampfen.

Den Rtickstand mit 1 ml 0,1 m-Natronlauge und 2 ml Dichlor- methan versetzen und schiitteln. Die fiberstehende Phase absaugen und verwerfen. Die Dichlormethanphase mit wenig wasserfreiem Natriumsulfat trocknen, dutch Watte in ein Gewindefliischchen ill- trieren und im Stickstoffstrom zur Trockene eindampfen. Den Rtick- stand in 200 gl Methanol 16sen. HPLC-Bedingungen: Elutionsmittel Dioxan/Acetonitril/Ameisen- s~iure/Wasser (500 + 500 + 70 + 20 V/V), DurchfluBrate 1 ml/min, Detektionswellenl/inge 290 nm, Einspritzmenge 40 gl. Retentionszeit des Pyrantels: 4,6 min. Bei Zusatzversuchen yon 50 p~g Pyranteltar- trat/1 Milch wurden Wiederfindungsraten yon 69 +_ 5 % (n = 5) ermit- telt. Nachweisgrenze bei ca. 0,3 Ixg Pyranteltartrat/1 Milch resp. Se- r u i n .

G Behandlung der Versuchski~he und Probenahme

Zwei Kfihe der Simmentaler Rasse wurden mit Banminth, 15sliches Pulver 12,5% (Firrna Pfizer), gemgB Herstellerempfehlung oral be- handelt:

Kuh 1. Gewicht ca. 620 kg, Alter 4 Jahre, Lactationsmonat 4, Milch- leistung 22 kg/Tag. - - Dosierung: 1 × 60 g Banminth (12,1 mg Py- ranteltartrat pro kg K6rpergewicht).

Kuh 2. Gewicht ca. 680 kg, Alter 9 Jahre, Lactationsmonat 8, Milch- leistung 10 kg/Tag. - Dosierung: 1 × 200 g Banminth (36,8 mg Py- ranteltartrat pro kg K6rpergewicht).

Am Tag vor und wghrend vier Tagen nach der Behandlung mor- gens und abends Milchproben aus den Gesamtgemelken fassen und Blutproben entnehmen. Entnahrne der Blutproben jeweils unmittel- bar nach dem Melken.

R. Gauch et al.: Bestimmung von Pyrantel in Kuhmilch und Blutserum

Tabelle 1. Pyrantel-Konzentrat ionen in der Milch und im Blut- serum von zwei Kiihen nach peroraler Verabreichung yon Ban- minth

Probenahme Milchspiegel gg/1" Serumspiegel gg/1" bei einer Dosierung bei einer Dosierung

12 mg/kg 36 mg/kg 12 mg/kg 36 mg/kg

Leerwert 0 0 0 0 10 Std nach 8,1 38,0 21,9 32,3

Applikation 24 8,6 24,8 10,4 24,0 36 2,7 12,9 5,9 17,8 48 2,0 8,1 3,2 7,8 60 0,3 4,6 - - 72 0 2,6 0,9 1,9 84 0 1,7 96 0 0,7 ca. 0,3 0,7

Resultate umgerechnet auf 100% Wiederfindungsrate, berechnet als Pyranteltartrat

i P

Abb. 2 (links). Densitogramme von Milchextrakten der Kuh 2, ge- messen bei 290 nm. - a Leerwert (Milch vor Applikation). - b 24 Std nach Applikation (4,6gg Pyrantel/1), c 60 Std nach Applikation (24,8 pg Pyrantel/1) (P Pyrantel). Rechts). Densitogramme von Milchextrakten der Kuh 2, gemessen als Fluorescenz nach Anffir- bung und UV-Bestrahlung. - a Leerwert. - b 10 Std nach Applikation (38 gg/1)

Ergebnisse und Diskussion

Die nach peroraler Applikation yon Banminth an Kfi- hen festgestellten Wirkstoff-Konzentrationen sind in Tabelle 1 aufgefiihrt.

Aus diesen Resultaten ist ersichtlich, dab Pyrantel bei therapeutischer Dosierung yon ca. 12 mg/kg K6r- pergewicht in unver/inderter Form im Blutserum in ei- ner Konzentration von ca. 20 l-tg/1 und in der Milch von 8-9 gg/l nachgewiesen werden kann. In Ubereinstim-

119

b, C,

P !

Abb. 3. HPLC-Chromatogramme yon desorbierten DC-Zonen. - a Leerwert (Milch der Kuh 2 vor Applikation). - b 10 Std nach Appli- kation (38 gg/1, Kuh 2), c Standard ab Platte (P Pyrantel, I= In j ek - tion)

mung mit Faulkner [3] muB das Maximum der Serum- konzentration bei < 10 Std nach der Applikation lie- gen. Die Eliminationshalbwertszeit betrfigt fiir Serum und Milch ca. 15 Std. Bei 3 fach h6herer Dosierung lag die Maximal-Konzentration in der Milch rund 4real h6her.

Die Auswertung dieser Versuche hat auch gezeigt, dab die beschriebene Methode fiir den Nachweis von Pyrantel in Blutserum und Milch geeignet ist. In Abb. 2A sind die Densitogramme yon Milchextrakten bei Absorptionsmessung 290 nm abgebildet, wfihrend Abb. 2B entsprechende Densitogramme nach FeC13- Nachweis und UV-Bestrahlung zeigt (Fluorescenzmes- sung). In Abb. 3 schlieBlich sind die mit HPLC erhalte- nen Best/itigungschromatogramme wiedergegeben.

Durch die drei verschiedenen Densitometrie-Bedin- gungen (Absorption bei 290 rim; nach FeC13-Nachweis bei 530 nm; nach UV-Bestrahlung Fluorescenzmes- sung bei 366/490 nm), sowie nach Abheben, Eluieren und HPLC konnte die Selektivitfit erheblich gesteigert werden. Das Ubertragen von bereits auf DC getrenn- ten Substanzen auf die HPLC (2-dimensionale indirekte Kopplung von DC mit HPLC) entspricht etwa dem on- line-Verfahren in der Gaschromatographie; neuerdings wird diese Technik auch mehr und mehr in der HPLC angewendet, wo durch Hintereinanderschalten ver- schiedener Trennphasen eine Selektivitfitssteigerung erm/Sglich wird. Mit geeigneter DC-Abhebetechnik der gewfinschten Substanzzonen gelingt es ohne weiteres, auch im Nanogramm-Bereich verlustarm zu arbeiten.

Anhand der gemessenen Milchleistung und den ge- fundenen Konzentrationen ergibt sich, dab vonder verabreichten Menge Pyrantel bei beiden Dosierungen rund 0,02-0,03%o unverfindert in die Milch fibergehen.

• In Anbetracht der starken Metabolisierung ist nicht auszuschliel3en, dab ein Teil der unbekannten Metabo-

120 R. Gauch et al.: Bestimmung von Pyrantel in Kuhmilch und Blutserum

liten auch fiber die Mi lch ausgeschieden wird. Diese Ta t sachen mfissen nun tox ikologisch und lebensmit te l - recht l ich beur te i l t werden, da im Z u s a m m e n h a n g mi t der pe ro ra l en Pyran te l -Verabre ichung an Milcht ie re zur Zei t keine War te f r i s t en ffir die Mi lchab l ie fe rung festgelegt sind.

In der Schweizer ischen Lebensmi t t e lve ro rdnung Art . 42 Abs . l g ist eine Milch, welche Arzne imi t te l ent- hfilt, als n icht e inwandfre i zu be t r ach ten und v o m Ver- kehr auszuschl iegen. Im gleichen Sinne ~iugert sich auch das Schweizerische Mi lchl ie ferungsregula t iv in Art . 56 Abs . le: Verbo ten ist das Inve rkehrb r ingen yon Mi lch yon Kfihen, die mi t Arzne imi t t e ln behande l t wurden, welche in die Mi lch f ibergehen k6nnen , und zwar wfihrend der Behand lung und drei Tage dar i ibe r hinaus, sofern das Mi t te l n icht eine l~ingere Sperrf r is t er forder t .

De r Gese tzgeber ha t nun zu beurtei len, ob sich auf- g rund der beschr iebenen Versuche besondere M a g n a h - men bezfiglich Absetzf r i s t und To le ranzwer t in Mi lch aufdr~ngen.

Dank. Frl. H. Haldimann und Herrn H.P. Bghler sei fiir die zuverl/is- sige Mitarbeit herzlich gedankt.

Literatur

1. Austin WC, Courtney W, Danilewicz JC, Morgan DH, Conover LH, Howes HL jun, Lynch JE, Mc Farland JW, Cornwell RL, Theodorides VJ (1966) Nature 212:1273-1274

2. Mc Farland JW, Conover LH, Howes HL jun, Lynch JE, Chis- holm DR, Austin WC, Cornwell RL, Danilewicz JC, Courtney W, Morgan DH (1969) J Med Chem 12:1066-1079

3. Faulkner JK, Figdor SK, Monro AM, Sehach yon Wittenau M, Stopher DA, Wood BA (1972) J Sci Food Agric 23:79-91

4. Figdor SK, Schach yon Wittenau M, Lynch MJ (1978) J Assoc Off Anal Chem 61:1228-1231

5. Lynch MJ, Bartolucci SR (1982) J Assoc Off Anal Chem 65:227- 233

6. Gauch R, Leuenberger U, Miiller U (1981) Mitt Gebiete Lebensm Hygiene 72:418428

Eingegangen am 21. Februar 1983

Aus der Industrie

Optimierung der Diinnschichtchromatographie dutch Baron-DC-Lift

Lothar Baron, Laborger/ite (Frhr.-v.-Hund- biss-Str. 2, D-7752 Insel Reichenau, TeL 0 75 34/73 80) Argumente

Komfort und Arbeitsqualitiit. Einfachste Be- dienung; Hfinde werden vor L6sungsmittel- dampf geschiitzt, da das manuelle Einffihren und Entnehmen der Platten entffillt.

Das Beaufsichtigen der DC-Platten stellt keine Belastung mehr dar; andere Arbeiten k6nnen ohne st6rende Unterbrechung ausge- f/ihrt werden.

Reproduzierbare Entwicklungszeiten; keine St6rung des Dampfraumes durch Wir- belbildung wie beim iiblichen Abnehmen des Tankdeckels.

Arbeitsquantitiit und WirtschaftIichkeit. Er- hebliche Steigerung des Analysendurchsatzes, da auch in Pausen und Besprechungen und nach Arbeitsende DC-Ausfiihrung m6glich ist,

Steigerung geht parallel mit Entlasmng des Laborpersonals. Speziell bei langsam lau-

fenden Fliegmitteln groger Vorteil durch Ausnutzen der Nachtzeit.

Ubergelaufene und vergessene DC's ge- h6ren der Vergangenheit an. Amortisation - Beispiel. Naeh betriebswirt- schaftlicher Rechnung stellt eine ffir quantita- tive Auswertung vorbereitete DC-Platte einen Wert yon mindestens DM 20,- dar. Bei nur ei- ner geretteten oder zus~itzliehen Platte pro Woche hat sich das Ger/it nach gut einem Jahr amortisiert! Testangebot. Ein vierw6chiger unverbindli- cher Test wird Sie fiberzeugen. Arbeitsweise. Die vorbereitete DC-Platte wird auf die Liftplatte gestellt. Nach Einstellen der gewfinschten Entwicklungszeit an der Ger~ite- Uhr kann der Vorgang durch kurzes Antip- pen der Start-Taste gestartet werden.

Danach 1/iuft alles automatisch ab. Die VerschluB-Klappe 6ffnet so weit, dab die Lift- platte abgesenkt werden kann. Wenn die Lift- platte den Grund der Entwicklungskammer erreicht hat, schlieBt die Verschlug-Klappe wieder.

Nach der vorgew/ihlten Entwicklungszeit 6ffnet die VerschluB-Klappe; die Liftplatte f'~ihrt nach oben und die Offnung wird wieder geschlossen. A.uBerhalb der Kammer kann dann das L6sungsmittel verdunsten.