Dynamique interne du noyau dune cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas

Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante : étude par diffusion dynamique de

la lumière

Michaël Suissa

Sous la direction de :M. Eric Freyssingeas

Laboratoire de Physique

etM. Christophe Place

Laboratoire transdisciplinaire Joliot-Curie

MODIFICATION DE L’ORGANISATION SPATIALE ET TEMPORELLE DU NOYAU

=MODIFICATION DE L’ETAT CELLULAIRE

Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante.


CELLULE : unité de structure fondamentale de la plupart des organismes vivants.

2 types de cellules:

Procaryotes : sans noyau (bactéries,…) Eucaryotes : disposant d’un noyau (hommes, animaux, plantes,…)

Noyau : délimité par la membrane nucléaire

Noyau contient ADN, support information génétique. Découverte récente : grande organisation structurelle et dynamique

Microscopies -> vision globale de la structure,

développer une technique -> approche globale de la dynamique

interne du noyau



• Projet : étudier la dynamique du noyau d’une cellule vivante

par : Diffusion Dynamique de la Lumière.

• Idée : mesurer les fluctuations; en sortir des informations sur

l’ensemble des propriétés dynamiques internes

PlanPlan

I> INTRODUCTION

II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES

III> RESULTATS

IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

Contient ADN sous forme compactée : la chromatine

Molécule d’ADN + protéines (histones, …)

CHROMATINEUnité de base : nucléosome

1) Le noyau

I> Introduction

Territoires chromosomiques

1) Le noyau

Répartition de la chromatine dans le noyau non aléatoire : dans territoires chromosomiques (Manuelidis, 1985 et 1990)

Reconstruction en 3D de la répartition des territoires chromosomiques dans le noyau d’un fibroblaste (Bolzer et al., 2005)

I> Introduction

Territoires chromosomiques entourés par espace interchromosomique (Cremer et Cremer, 2001) : éléments nécessaires à l’expression des gènes et à la réplication de l’ADN

Espace interchromosomique•Corps nucléaires •Protéines•Polymérases •ARN•Nucléotides

Territoires chromosomiquesChromatine

I> Introduction

1) Le noyau

Pores nucléaire

Mouvement des territoires chromosomiques dans le noyau. (Belmont,

2001)

Dans territoires chromosomiques :•Mouvement de la chromatine à l’intérieur du territoire chromosomique. (Belmont et al., 2001, 2003).

•Changement de « structure » de la chromatine : Décondensation et

condensation de la chromatine pour permettre la transcription, la réplication et les

réparations de l’ADN.

Dans espace interchromosomique :• Mouvement de diffusion des protéines et des complexes ARN-protéines à

l’intérieur du noyau : Mesure du coefficient de diffusion D de ces « objets » :

10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 ; (Shav-Tal et al., 2004).

• Réactions biochimiques.

I> Introduction

2) Dynamique du noyau

I> Introduction

2) Dynamique du noyauBIOLOGIE PHYSIQUE

Chromatine Polymère

Protéines Particules colloïdales

Noyau => Système hors équilibre car système actif : activité biochimique continuelle ; en permanence réactions chimiques consommant de l’énergie et produisant de la chaleur (en particulier, synthèse de l’ARN : transcription, et de l’ADN : réplication).

Technique physique adaptée pour analyse dynamique polymères, particules colloïdales :

DIFFUSION DYNAMIQUE DE LA LUMIÈRE

Technique sensible aux variations spatio-temporelles n(r,t) de l’indice de réfraction n du milieu traversé par la lumière.

i.e. de la composition, de la concentration, de l’organisation du milieu.

i.e. de la composition, de la concentration, de l’organisation du milieu.

I> Introduction

3) Diffusion dynamique de la lumière

POUR NOYAU : mouvements et changements de structure de la chromatine, diffusion des complexes de macromolécules, réactions biochimiques.

DDL :

Analyse des variations temporelles de l’intensité de la lumière diffusée par le noyau au cours d’un processus particulier : le

cycle cellulaire

Information globale sur la dynamique du noyau

Avantages de la DDL pour la dynamique du noyau :

• Mesures globales ; pas uniquement informations sur « objets » fluorescents.

• Mesure physique non-invasive et non-destructrice pour la cellule, contrairement aux expériences de fluorescence ; si bon choix de la longueur d’onde et de la puissance.

• Temps caractéristiques accessibles de 10-5 s à 10 s et, échelle de l’ordre de quelques 500 nm.

I> Introduction

4) DDL par le noyau d’une cellule vivanteDDL

Cycle cellulaire, 4 phases différentes : G1, S, G2 et M.

I> Introduction

4) DDL par le noyau d’une cellule vivantePhénomène fondamental : le cycle cellulaire

Effet du cycle cellulaire sur la dynamique interne du noyau ?

Assemble le fuseau mitotique, prépare la cellule à la mitose

Termine la division cellulaire

Déclenche l’anaphase et conduit à la cytodiérèse

Déclenche la machinerie de réplication de l’ADN;

Réplique l’ADN

PlanPlan

I> INTRODUCTION


III> RESULTATS


II> Montage expérimental et protocolesII> Montage expérimental et protocoles

1) Principe du montage expérimental

Cellules immobiles car adhérentes

2 types de contraintes expérimentales à satisfaire :

• Contrainte « physiologique » : Environnement physiologique des cellules doit permettre développement normal des cellules pendant les expériences (de quelques heures à quelques jours).

• Contraintes « optiques » : a)Viser le noyau d’une cellule b) Focaliser le faisceau laser sur le noyau d’une cellule (5 m ≤ diamètre noyau ≤ 10 m). c) Faire l’image du volume illuminé par le laser sur un détecteur.

II> Montage expérimental et protocoles

1) Principe du montage expérimental

Cellules dans milieu de culture DMEM avec HEPES (pour préserver le

pH).

1°) Chambre de culture placée horizontalement dans incubateur ; adhésion des cellules sur lamelle inférieure en 3 heures

2°) Chambre de culture placée, verticalement, dans « étau » thermostaté.


2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture

Cellules SHEP visualisées 48h après introduction dans chambre de culture

A t=0, confluence = 1/3Objectif x10

Excellente survie et prolifération des cellules


2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture

20 µm


3) Contraintes « optiques »

• Diamètre noyau 6-7 µm focalisation faisceau laser avec objectif microscope.

• Recueillir lumière diffusée selon plusieurs angles :-> Montage à l’horizontal,-> Diffusion de la lumière « vers l’avant ».

Noyau

Laser


3) Contraintes « optiques »Puissance irradiation 0,1 - 0,5 mWAngle de diffusion variable

Dans la cellule.I(noyau) = 20-200 u. a

I(cyto.) = 5-20 u. a

Dans le milieu.I = 1-2 u. a.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

10-6 10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10

g(t)_milieug(t)_noyaug(t)_cytoaplasme

g(t)

t (sec)


4) Validation du montageMesures sur différents systèmes :1) Mesures sur sphères de latex diluées ( 220 nm) avec focalisation laser à

1-2 m de la parois : beaux signaux mono-exponentiels ; Diffusion homodyne.

2) Fonctions d’auto-corrélation mesurées pour différentes positions de

focalisation du laser

SHEP : Neuroblastes (précurseurs des neurones) cancéreux.

SHEP ? Adhérentes, gros noyau, cycle cellulaire continu et régulier (durée = 15 heures), …Aussi culture simple, « robustes ».

Pour notre étude : cellules neuroblastomes de la lignée SHEP


5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes

Population « normale » de SHEP :

Problème : synchroniser les cellules dans le cycle pour connaître la phase du cycle des cellules à l’instant de la mesure.

• Blocage des cellules en fin de G1 par utilisation de HU. (HU : Hydroxyurée Molécule à effet cytobloquant ; empêche la cellule d’entrer en phase S)• Puis redémarrage synchronisé (« en phase ») après élimination de HU.



60 % G0/1

15 % S

25 % G2+M

Etudier effet HU sur le cycle cellulaire des SHEP par cytométrie en flux

MAISCytométrie en flux sur cellules en boîte de Pétri dans incubateur

CO2

Conditions différentes de notre montage : lame de verre, sans CO2

Etude par expériences de

cytométrie en flux

En parallèle

Observations visuelles d’échantillons placés

dans le montage



Détermination de la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire par cytométrie en flux

• Un intercalant fluorescent de l’ADN est ajouté à une suspension « cellulaire ».

• Les cellules sont irradiées par un laser qui excite le colorant.

• L’intensité de fluorescence émise par le noyau est mesurée.

La cytométrie en flux permet de déterminer la « quantité » d’ADN présente dans la cellule



Pic G0/1

Pic G2+MPhase S

Intensité fluorescenceContenu en ADN

Nom

bre

de c

ellu

les

Pas de mitose

Par cytométrie en flux Dans le montageElimination HU

Non éliminé48 heures

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

% de G0/1

% de S

% de G2+M

Temps [heure]

Pas de mitose



Eliminé après10 heures (t0)

80% des cellules entrent en mitose

à t0+17 heures

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10Temps [heure]

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

% de G0/1

% de S

% de G2+M

Temps [heure]

Pas de mitose



Eliminé après15 heures (t0)

80% des cellules entrent en mitose

entre t0+9 et t0+10 heures

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Temps [heure]

1ère série de mitoses après élimination HU

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

% de G0/1

% de S

% de G2+M

Temps [heure]

HU éliminé après 10 heures HU éliminé après 15 heures

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Temps [heure]

MesuresS

MesuresG2

MesuresM

MesuresG0/1

0

20

40

60

80

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

% de G0/1

% de S

% de G2+M

Temps [heure]

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10Temps [heure]

PlanPlan

I> INTRODUCTION


III> RESULTATS


• Signal non stationnaire : •Modulations sur temps longs (plusieurs dizaines de secondes)•Variations brutales d’intensité (toutes les 7-8 s)

•Fluctuations

III> Résultats

Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes

Fonction d’auto-corrélation mesurée à = 21°.

III> Résultats

Principe autocorrélation : comparer fonction avec une version décalée d’elle même en temps. <I(0)I(t)>

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10

t [s]

Fonction d’auto-corrélation mesurée à = 21°.

III> Résultats

2 temps caractéristiques Ajustement par fonction :

(A1.exp(-(t/1)) + A2.exp(-t/2))2 + B.

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10

t [s]

2.6

2.65

2.7

2.75

2.8

2.85

2.9

10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1

(<N>)

Premières observations :

• Variations importantes de <N>.

• A2 > A1 ; A1 de 5 à 25 % de l’amplitude du signal

dynamique.

• Pas de corrélation entre <N> et 1, ou 2.

• Pas de corrélation entre A1 et 1, ni entre A2 et 2.

• Pas de corrélation entre 1 et 2 ; processus de relaxation

indépendants.

• 0,4 ≤ ≤ 1 ; pas de corrélation entre et 1.

III> Résultats

III> Résultats : temps 1 (qualitatif)

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

Quantité

1 mesurés sur des cellules majoritairement en S

01020304050607080

4:00:00 6:00:00

1 [ ]ms

temps après relargage


0 2 4 6 8 10 12 140

20

40

60

80

Quantité

1 2mesurés sur des cellules majoritairement en G

0

10

20

30

40

50

60

70

80

7:00:00 9:00:00

τ1 [ms]

temps après relargage


0 2 4 6 8 10120

20

40

60

80

Quantité01020304050607080

1:00:003:00:005:00:00

1 [ ]ms

temps

1 1mesurés sur des cellules en G

Phase CC(nb mes/nb de noyaux)

Echelle Valeurs [10-3 s]

Pics

[10-3 s]

G0/1

(182/24)15-70

20; 40; (55)

0

4

8

12

16

20

24

0 20 40 60 80 100 120 140 160

1 [10-3 ]s

III> Résultats : temps 1 (quantitatif)

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0 100 20 10-3 40 10-3 60 10-3 80 10-3 100 10-3 120 10-3 140 10-3 160 10-3

1 [ ]s



Pics

[10-3 s]

G0/1

(182/24)15-70

20; 40; (55)


0

4

8

12

16

20

24

0 20 40 60 80 100 120 140 160

1 [10-3 ]s



Pics

[10-3 s]

G0/1

(182/24)15-70

20; 40; (55)

S

(252/44)5-40

20; (15);

(35-40)

0

0,008

0,016

0,024

0,032

0,04

0,048

0,056

0 100 20 10-3 40 10-3 60 10-3 80 10-3 100 10-3 120 10-3

Proba_G1

Proba_S

1 [ ]s




Pics

[10-3 s]

G0/1

(182/24)15-70

20; 40; (55)

S

(252/44)5-40

20; (15); (35-40)

G2

(138/18)5-30 10; 25

0

0,008

0,016

0,024

0,032

0,04

0,048

0,056

0 100 20 10-3 40 10-3 60 10-3 80 10-3 100 10-3 120 10-3

Proba_G1

Proba_S

Proba_G2

1 [ ]s




Pics

[10-3 s]

G0/1

(182/24)15-70

20; 40; (55)

S

(252/34)5-40

20; (15); (35-40)

G2

(138/18)5-30 10; 25

M

(42/6)5-30 10

0

0,008

0,016

0,024

0,032

0,04

0,048

0,056

0 100 20 10-3 40 10-3 60 10-3 80 10-3 100 10-3 120 10-3

Proba_G1

Proba_S

Proba_G2

Proba_M

1 [ ]s


• Dynamique complexe : • Pour toutes les phases distributions différentes certainement dues à différents processus biologiques.• 1 plus court plus on avance dans le cycle cellulaire.

• Relaxation rapide associée à exponentielle étirée (0,4 < 1 => Distribution large de temps caractéristiquesExplication possible : Nombreux processus dans le noyau = succession de processus hiérarchisés avec temps caractéristiques différents : analogie possible avec le « vieillissement » (Castaing et Souletie, 1991).

=> Distribution log-normale des temps de relaxation1 et liés à la moyenne et à l’écart type de la distribution

A l’heure actuelle, pas de lien entre les distributions de 1 et un, ou plusieurs, processus biologiques

III> Résultats : temps 1

Phase CCEchelle Valeurs

[s]

Pics

[s]

G0/1 0,2-2 0,5

S 0,2-1,2 0,45

G2 0,5-2 0,75; (1,5-2)

M 0,3-1 0,75 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 1 2 3 4 5 6

Proba G1

Proba S

Proba G2

Proba M

2 [ ]s


Estimation temps de relaxation lent peu précise <= problème estimation ligne de baseNéanmoins : • Pour toutes les phases, distribution ajustable par loi log-normale.• Différences entre les distributions de chaque phase : différences moins prononcées que pour 1.

Origines possibles de ce temps de relaxation : • Diffusion de complexes ARN-Protéines :

10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 (Shav-Tal et al., 2004). temps de relaxation, 1/Dq2 (avec q vecteur d’onde ; dépend de l’angle de

diffusion). Ici : q2 ≈ 2,21.1013 m-2 => dans la gamme : 0,5 - 4 sec.

• Mouvement de la chromatine à l’intérieur des territoires chromosomiques (Levi et al., 2005) ; temps de relaxation attendus : ~ la seconde.


PlanPlan

I> INTRODUCTION


III> RESULTATS


1) Conclusions DDL

V> Conclusions et perspectives

Mise au point d’un montage expérimental original et protocoles

Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes

Analyse par autocorrélation 2 temps caractéristiques indépendants

Temps rapide : • quelques dizaines de millisecondes, • distribution très différente selon phase du cycle cellulaire,• signature de relaxations s’effectuant par un ensemble de processus hiérarchisés

Temps lent :• de l’ordre de la seconde• distributions changent légèrement au cours du cycle cellulaire• gamme de temps compatible avec résultats sur diffusion de complexes ARN-protéines dans le noyau.

• Travailler sur le signal brut de l’intensité diffusée.

• Trouver des liens entre la dynamique du noyau et des processus biologiques.Utilisation d’agents pharmacologiques pour bloquer des processus bien particuliers et analyser la nouvelle dynamiqueCoupler les mesures de diffusion avec des mesures de fluorescence Lien entre dynamique et activité biochimique.

• Mesurer la dynamique sur d’autres systèmes : apoptose, autres lignées cellulaires que les SHEP, à l’intérieur du cytoplasme.

3) Perspectives DDL


Phénomène inattendu : quand une cellule entre en apoptose après avoir été irradiée, plusieurs voisines entrent

également en apoptose



Etude du mode de transmission de la mort par apoptose.

Contact ou diffusion ? Séparation des cellules grâce à des motifs carrés

50 µm250 µm

Objectif x10 Objectif x40


REMERCIEMENTSEquipe E. Goillot : support pour partie bio

M. B. Berge : idée originale

M. J.F. Palierne : aide pour acquisition du signal

M. P. Borgnat : aide pour traitement du signal

Mme M. Barbi : démarrage de l’expérience

Evolution de la distribution des temps caractéristiques 1

en fonction de l’angle de diffusion

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 20 40 60 80 100 120 140

Proba_(16°)

Proba_(23°)

Proba_(27°)

Distribution de probabilité

1 [ ]ms

10

100

10 100

16°23°27°

position pics

1/q2

Evolution de la distribution des temps caractéristiques 2

en fonction de l’angle de diffusion

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 1 2 3 4 5 6 7

Proba (16°)

Proba (23°)

Proba (27°)

Distribution de probabilité

2 [ ]s

0.1

1

1 10" " Pic de la distribution de

2

1/q

: 1,7Pente

Evolution de la distribution du coefficient d’étirement au cours du cycle cellulaire

0

1

2

3

4

5

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2

G1

S

G2

M

Densité en probabilité

Evolution de la distribution de <N> au cours du cycle cellulaire

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0 200 400 600 800 1000

Proba G0/1

Proba S

Proba G2

<N>

2.75 109

2.8 109

2.85 109

2.9 109

2.95 109

3 109

0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10

<I(0)I(t)>

t [s]

Fonction d'autocorrélation de la lumière diffusée par le cytoplasme d'une cellule en phase G1

(Ajustement par cumulants)

Fonction d’autocorrélation de l’intensité de la lumière diffusée par le cytoplasme d’une

cellule en phase G1 (ajustement par cumulants)

1 seul temps caractéristique « lent » entre : 0,1 s et 5 s

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Dynamique interne du noyau dune cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas