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E’ POSSIBILE “FAR EVOLVERE”
LE PROTEINE IN LABORATORIO
EVOLUZIONE GUIDATA
PROTEINE CON FUNZIONI OTTIMIZZATE O “NUOVE”
Selezione
Ricombinazione
Mutazione
VARIABILITA’ GENETICA
L’EVOLUZIONE NATURALE RICHIEDE TEMPO
IN LABORATORIO UN ESPERIMENTO DI EVOLUZIONE GUIDATA PUO’ ESSERE
COMPLETATO IN ALCUNI MESI
EVOLUZIONE GUIDATA - STRATEGIA GENERALE
IL PERCORSO SEGUITO DA UNA PROTEINA NEL CORSO DELLA SUA EVOLUZIONE PUO’ ESSERE DESCRITTO COME: Fitness landscape (scenario del successo evolutivo): descrive le possibilità che si presentano ad una data proteina in termini di fitness. Per esplorare queste possibilità la sequenza della proteina deve variare all’interno di uno…. Spazio di sequenza: La complessità della diversità dei sistemi proteici:
20n
E’ MOLTO DIFFICILE ESPLORARE TUTTE LE POSSIBILITA’ IN UN TEMPO RAGIONEVOLE
LA VARIABILITA’ DELLA POPOLAZIONE DI PROTEINE DA OTTENERE DI SOLITO E’ LIMITATA DA RAGIONI OGGETTIVE
STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE DIRETTA
Complessità (genotipo)
Espressione
Identificazione del fenotipo
PRINCIPALI STRATEGIE DI ESPRESSIONE
Requisito essenziale: associazione genotipo-fenotipo
• librerie di espressione in procarioti ed eucarioti (cell display)
• librerie di espressione su batteriofagi (phage display)
Problemi: efficienza di introduzione del DNA nelle cellule
• librerie di espressione su ribosomi (ribosome display)
- mRNA tradotti in vitro su ribosomi - arresto della traduzione indotto - la proteina viene esposta sulla superficie del ribosoma
Problemi: valido soprattutto per proteine con proprietà di legame
IDENTIFICAZIONE DEI CLONI
SELEZIONE IN VIVO
SCREENING
SCREENING
Alcune proprietà misurabili: -torbidità -pH -Assorbanza/fluorescenza -Calore
CONFRONTO TRA STRATEGIE DI IDENTIFICAZIONE
METODO VANTAGGI LIMITI --------------------------------------------------------- SELEZIONE (connessione attività-vitalità cellulare)
selezione dei positivi falsi positivi (vitali ma non ottimali)
-----------------------------------------------------------------------------------
eliminazione di varianti misura indiretta non volute enzimatica
----------------------------------------------------------------------------------- saggi su popolazioni complessità della
molto vaste (ca. 1010) manipolazione ----------------------------------------------------------------------------------- SCREENING (cloni individuali - spesso richiesti substrati cromogenici o fluorogenici)
saggio di attività diretto complessità della manipolazione
----------------------------------------------------------------------------------- saggi in condizioni saggi su popolazioni non vaste
non naturali (ca. 105 se automatico ----------------------------------------------------------------------------------- valutazione di più parametri precisione abbassa la resa -----------------------------------------------------------------------------------
CHE VUOL DIRE POPOLAZIONE COMPLESSA?
IN REALTA’ I VALORI CHE SI RAGGIUNGONO SONO INFERIORI (20-40%)
METODI PER CREARE UNA POPOLAZIONE COMPLESSA
• ceppi ad elevata frequenza di mutagenesi • mutageni chimici • PCR a bassa fedeltà (error-prone)
- attività 3’->5’ esonucleasica - MnCl2 - - sbilanciamento dei precursori - numero di cicli aumentato - pH
*Problemi: preferenza di mutazioni A<->G e T<->C bassa probabilità di sostituzioni multiple vicine
MUTAGENESI CASUALE SU REGIONI ESTESE minore livello di complessità ma su tutta la sequenza
• Random Insertion deletion mutagenesis (RID): tagli casuali con Cs(IV)-EDTA
• Frammenti del gene originario sono sostituiti da oligonucleotidi sintetici contenenti:
- singole posizioni casuali - più posizioni casuali - sottoframmenti semi-casuali
*Oligonucleotidi: sintesi automatica in fase solida (codoni di stop evitati --> solo G o C in terza posizione
MUTAGENESI CASUALE SU REGIONI LIMITATE Maggiore livello di complessità locale
In generale i risultati migliori si ottengono inserendo poche mutazioni per volta in cicli successivi
Directed Evolution
Mutazioni
Moltissimi Geni Mutati
Identificazione della
proprietà voluta
Gene originale
Proteine
STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE GUIDATA
MOLTE MUTAZIONI LETALI
PER EVITARE LE VARIANTI NON FUNZIONALI SI PUÒ SFRUTTARE IL LAVORO GIÀ FATTO DALLA EVOLUZIONE NATURALE!
In natura
In laboratorio
RICOMBINAZIONE
• DNA shuffling: frammentazione + PCR
• StEP (Staggered Extension Process): estensione corta + PCR
• Random-priming: primers casuali + PCR
UTILIZZA LA VARIABILITA’ GIA’ PRESENTE IN REGIONI SEPARATE DI UNA SEQUENZA (O PIU’ SEQUENZE)
RICOMBINAZIONE
SU GENE SINGOLO
SU GENI MULTIPLI DI UNA FAMIGLIA PROTEICA
Incroci di molecole
LO SPAZIO DI SEQUENZA ESPLORATO E’ MOLTO DIVERSO
CEFALOSPORINASI
Identità
Singolo ciclo
ANCHE I RISULTATI SONO DIVERSI!
INTERFERONI = AGENTI ANTIVIRALI E ANTITUMORALI
20 GENI NON-ALLELICI DUPLICATI CON ELEVATA IDENTITA’ DI SEQUENZA (85-98%)
DNA SHUFFLING SU IFN-alfa2a
L’EVOLUZIONE GUIDATA HA PRODOTTO RISULTATI IMPORTANTI
PROTEINE PRIMORDIALI = PROTEINE “TUTTOFARE”
PROTEINE MODERNE= PROTEINE SPECIALIZZATE
COSA CI SUGGERISCE?
GLI ESPERIMENTI DI EVOLUZIONE GUIDATA HANNO AVUTO MENO SUCCESSO DEL PREVISTO
SI TROVA QUELLO CHE SI CERCA!
MIGLIORARE LE FUNZIONI ESISTENTI E’ PIU’ FACILE CHE TROVARE FUNZIONI NUOVE
I PIU’ RECENTI ESPERIMENTI DI EVOLUZIONE GUIDATA SONO CONCETTUALMENTE DIVERSI
E FORSE PIU’ SIMILI ALLA EVOLUZIONE NATURALE
POPOLAZIONE VARIA, “ROBUSTA” E CON
QUALITA’ NASCOSTE
SELEZIONE
NUOVE FUNZIONI
MUTAZIONI NEUTRALI
NO SELEZIONE
NUOVA FUNZIONE
GENE ORIGINALE