ZUSCHRIFTEN

Ein wasserlosliches Prodrug von Taxol rnit der Fahigkeit zur Selbstorganisation ** Kyriacos Costa Nicolaou *, Rodney Kiplin Guy, Emmanuel Nicolaou Pitsinos und Wolfgang Wrasidlo

Taxol 1 (Abb. l a ) ist ein neues Antitumormittel, das ur- spriinglich aus der Pazifischen Eibe (Taxus breviJolia)[" isoliert wurde. Er hat infolge seiner erheblichen biologischen Aktivitlt in vivor2I intensive Forschungsbemuhungen von Chemi- kernL3 -'I> Biologen[2*61 und Medizinern['] ausgelost. Trotz sei- ncs klinischen Einsatzes bei der Behandlung von Patientinnen mit Eierstockkrebs und ungeachtet der Tatsache, daR es als grol3erer Fortschritt in der Krebs-Chemotherapie gefeiert wird, ist ein groRer Nachteil von Taxol seine extrem geringe Wasser- loslichkeit ( < 5 x M). Sie ist der Gruiid dafur, daR es in einer Mischung mil Cremaphor (einem polyoxyethylierten Rizi- nusol) und Ethanol verabreicht wird. Diese Darreichungsform lost haufig signifikante Nebenwirkungen aus, zu denen starke U berempfindlichkeitsreaktionen gehoren"'. Obwohl einige die- ser klinischen Probleme durch medikamentose Vorbehdndlung und langsame Infusion des Medikaments iiber llngere Zeitab- stande umgangen werden k o n n e ~ ~ [ ~ ] . ist es eher miihsam, das vollstandige Behandlungsprotokoll zu erstellen; einc umfassen- de Ubenvachung der Prozeduren und der Patienten ist erforder- lich['Ol. Die klinische Anwendung des Medikaments wurde we- gen seiner beeindruckenden Wirksamkeit trotz dieser Mlngel vorangetrieben. Mit einer wasserloslichen Form von Taxol konnten diese Schwierigkeiten viillig vermieden werden und so- wohl seine Anwendungsmoglichkeiten erweitert als auch sein pharmakologisches Profil drastisch verbessert werden.

Es sind zahlreiche Versuche unternommen worden, die LBs- lichkeit und die pharmakologischen Eigenschaften des Taxols zu verbessern[l - ''I. Zu den bemerkenswertesten Taxolderiva- ten, die bisher synthetisiert wurden, gehoren jene, bei denen die C-2'- und die C-7-Hydroxygruppe des Molekiils funktionalisiert sind und die bei In-vivo-Aktivierung unter Freisetzung von Ta- xol zerfallen. Verbindungen dieser Art, also solche, bei denen der Wirkstoff erst im Korper freigesetzt wird, werden als Pro- drugs bezeichnet. Infolge fortdauernder Schwierigkeiten rnit der Loslichkeit und der Bioverfiugbarkeit konnte sich keines dieser Prodrugs in der klinischen Anwendung durchsetzen. Um diese Verbindungen mit Erfolg einsetzen zu konnen, mussen ihre Ei- genschaften gleichsam auf Messers Schneide stehen: Einerseits miissen sie fur die Vcrabreichung hydrophil sein, andererseits miissen sie fur thcrapeutische Zwecke lipophil sein. Dariiber hinaus miissen sie sich schnell von der hydrophilen in die Iipo- phile Form umwandeln, um eine Ausscheidung iiber die Nieren zu vermeiden.

Im Rahmen eines Arbeitsprogramms. dessen Ziel der Entwurf und die chemische Synthese neuer C-2'- und C-7-Derivate des Taxols ist, stellten wir Taxol-2'-methylpyridiniumacetat, Taxol-

[*I Prof. Dr. K. C. Nicolaou, R. K. Guy, E. N. Pitsinos, W. Wrasidlo Department of Chemistry, The Scripps Research Institute 10666 North Torrey Pines Road. La Jolla, CA 92037 (USA) und Department of Chemistry, University of California San Diego, 9500 Gilrnan Drive, La Jolla. CA 92093 (USA) Telefax: Int. + 619:554-6738

[**I Wir danken Dr. R. Milligan und Dr. X. Chan fur die TEM-Untersuchungen, S. Mauch fiir die In-vivo-Tierverstiche, R. Merlock fur die Entwickluog und Durchfuhrung der HPLC- und Tubuti-Exprimente, Gary Siuzdak fur die Hil- fe bei der Massenspektrometric und D.-H. Huang f6r seine Unterstutzung bei den NMR-Studien. Diese Arbeit wurde gefiirdert von den National Institutes of Health (USA), einem Graduiertenstipendium des Office of Naval Rcsearch (USA, fur R. K. G.) und dem Scripps Research Institute.

1672 6 L'CH Vedagsgesellschafi inhH, D-69451 Weinhem, 1994

H

2: Taxol-2'-methylpyridiniurnacetat (TaxoIB'-MPA)

Abb. 1. a) Fonneln von Tax01 1 und Taxol-2'-MPA 2 ; b) Synthese von Taxol-2'- MPA 2; und c) miiglicher Mechanismus der Freisetrung von Taxol 1 aus Tdxol-2'- MPA 2. Methode: Taxol(10.2 mg, 0.012 mmol) wurde in Dichlormethan (0.4 mL) geliist und bei Raumtemperatur unter trockenem Argon nacheinander rnit frisch destilliertem Triethylamin (5 pL, 0.036 mmol, 3 Aquiv.) und 2-Fluor-1 methylpyri- diniumtosylat (10.0 mg, 0.035 mmol, 2.9 Aquiv.) versetzt. Die klare. farblose Lo- sung nahm schnell einc schwach gelbe Farbung an. Nach 30 min Riihren bei Raum- temperatur war die Reaktion vollstPndig (kein Taxol mehr vorhanden). Die anschlieBende HPLC-Analyse (Vydak 22.5 mm x 250 mm CIB-SBule, Gradient aus 10 mM NH,OAc-Puffer (PH 6.0)/Methanol, 9 mlmin-', UV, R,: Taxol-2'-MPA, 26.2 min; Taxol, 28.2 min) zeigte uur eine Verbindung. Das Rohprodukt wurde mit HPLC gereinigt und ergab nach Entfernung des Liisungsmittels im Vakuum Pro- dukt 2 (11 mg) in 90% Ausbeute. 'H-NMR (CDCI,, SO0 MHzj: 6 = 1.07 (s, 3H, C16-H), 1.11 (s. 3H, C17-H), 1.62 (s. 3H, Ci9-H), 1.76 (s, 3H, C18-H), 1.85 (m, 1H. C6-b-H), 2.00 (s, 3H. C10-OAc), 2.1-2.2 (bm, 2H. C14-H), 2.2 (s, 3H. C4- OAc), 2.53 (sundm iiberlagert, 4H, C6-H, Gegenion OAc), 3.67 (d, 1 H: J =7.0 Hr, C~-H).~.O~(S,~H,N-CH~),~.IO(~, lH.J=ESHz,C20-H,AvonAB),4.22(d, 1 H, J = 8.5, C20-H, R von AB). 4.31 (dd. IH , J = 8.7, 10.7 Hz, C7-H), 4.87 (dd, 1H,J=1.0.7.7,C5-H),5.50(d,lH,C2-H,J=7.0),5.70(bt, IH , J=8.0,CZ-H). 5.95 (dd, I H , J=1.0, 8.0, C13-H), 6.20 (s, l H , CIO-H), 6.46 (bd, l H , J=10.0, CYHj , 7.08 (t, l H , N-H, J=7.5) , 7.33 ~7.45 (m. 7H, Ar-H), 7.57 (t. 2H, J = 8, 4r-H), 7.69 (d, 2H, J = 9.0, EL. Ar-H), 7.79 (d, 1 H, J = 9.0Ar-H), 8.01 (dd, 2H. ~ = 1 . ~ , 8 . 0 , A r - H ) , 8 . 1 4 ( d , I H , J = 8 . 0 , A r - H ) , 8 . ~ ~ ~ d , 2 H , J=7.0,Ar-H),8.41 (t. 1 H. J = 7.0, Py-H), 10.48 (d, 1 H, J =7.0, Py-H). 1R (in Snbstanz, KCI-PreWling) t[cm-'] = 3640-3120 (bm), 3030-2870 (bm), 2320 (m), 1720 (s), 1630 (m). 1560 (m), 1500 (m). 1360 ( s ) , 1160 (m), 1070 (m), 700 (m). UVlVIS (CHCI,): A,,,[nm] = 254, 280. FAB-HRMS: ber. fur Mt C,,H,,O,,N,: 945.3810; gef. 945.3810.

2'-MPA 2, her (Abb. 1 a), eine Verbindung, die ziemlich reaktiv gegeniiber einem nucleophilen Austausch sein sollte['*]. Die Synthese dieser Verbindung gelang nach der Methode von Mu- kaiyama et al. aus Taxol 1 und 1 -Fluor-1-methylpyridinium- tosylat (1.2 Aquiv.) in Dichlormethan (25"C, 0.5 h)1'91. Reini- gung iiber Umkehrphasen-Hochdruckflussigkeitschromatogra- phie (RP-HPLC) und nachfolgendes Lyophilisieren unter Aus- tausch des Gegcnions (Tosylat gegen Acetat) ergab reines Taxol-2'-MPA 2 als weiBen, amorphen Feststoff in einer Aus- beute von 90 Yo (Abb. 1 b). Spektroskopische und analytische Daten stimmen mit Struktur 2 iiberein. Erste Untersuchungen, die nachstehend beschrieben werden, zeigten, daB diese Verbin- dung eine Reihe von wichtigen Eigenschaften hat: Hydrolyse- stabilitat, hohe Wasserloslichkeit, die Fahigkeit, in menschlichem Plasma schnell Tax01 freizusetzen, Cytotoxizitat und Antitumor- eigenschaften iihnlich denen des Taxols sowie die Fahigkeit zur Selbstorganisation.

Taxol-2'-MPA 2 ist sowohl in festem Zustand als auch in wll3ri- gen Losungen sehr stabil. Bei allen Untersuchungen wurden als

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ZUSCHRIFTEN

alleinige Zersetzungsprodukte Taxol 1 und das F‘yridinon, das bei der Hydrolyse des Pyridiniumsalzes entsteht (Abb. 1 c), nachge- wiesen. Infolge der unterschiedlichen Retentionszeiten unter den angewendeten HPLC-Bedingungen und der unterschiedlichen UV-Absorptionsmaxima (A2s0/A254 = 1.6 fur 2 und 0.3 fur I), konnte die Stabilitat von 2 leicht mit HPLC unter UV-Detek- tion gepruft werden. Taxol-2-MPA 2 ist in festem Zustand bei Raumtemperatur mindestens 30 Tage vollig stabil. In Wasser, 5proz. Dextrose- oder 0.9proz. Salzlosung ist 2 bei Raumtempe- ratur einige Tage stabil (Abb. 2), eine langsame Zersetzung setzt nach 4 Tagen ein. In Phosphat-gepufferter Salzlosung (PBS)

steriles Wasser oder PBS (pH 6.2) oder 5% Dextrose-Lbsung L steriles Wasser oder

PBS (pH 6.2) oder 5% Dextrose-Lbsung

0.9- L

rnenschliches Serum

0.1 -

0 I I I I ~ I

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660

0.9-

0.8- 1 0.7-

2 0.6-

$ 0.5- a f - rnenschliches Serum

8 0.3- v)

I-

CJ 0.4

, , \

.- g 0.2-

0.1 -

0 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660

t [SI - hbb. 2. Geschwindigkeit der Freisetzung von Taxol aus Taxol-2’-MPA 2 in wa0ri- gen Losungen bei 25 ‘C. In Wasser und wZBrigen Pufferlosungen (horizontale Linic) 1st 2 stabil. Dagegen beweist die Dichlormethan-Extraktion von Plasma, das mit 2 behandelt worden war, daB 2 in diesem Medium innerhalh von 10 min vollstandig in Taxol 1 umgewandelt wird (Kurve, 20% der Gesamtmenge wurde bei dieser Extraktion mriickgewonnen). Methode: Taxol-2’-MPA 2 wurde mit ciner fiinfmi- niitigen Ultraschallbehandlung im wHBrigen System gelost. Zu den angegebenen Zeiten wurden Prohen entnommen, in Dichlormethan gegeben (um die Reaktion abzubrechen) und mit einem Waters-Maxima-HPLC-GerZt analysiert, das mit ei- nem Autoinjektor bestiickt war [3.9x 300mm C1X-Saule mit einer Vorsaule be- stiickt; FlieBgeschwindigkeit 1.5 mLmin-’ ; Elutionsmittelgradient A-B iiber 30 min, wobei A 80% 80 mM Ammoniumacetat (pH 6.0) und B 100% Methanol; UV-Dioden-Array-Detektor]. Das Verhaltnis von 2 (R, = I 6 2 min) zu Taxol (1, R, = 16.8 min) wurde au5 den relativen Flichen der Signale bestimmt (nach Nor- mierung mit zuvor bestimmten Eichkurven). Die Stahilitatsuntersuchungen in wan- rigen Losungen wurden uber einen Zeitraum von iiber zwei Wochen fortgesetzt. Dabei trat in den gepufferten Losungen geringfiigig Zersetzung auf.

oder Ammoniumacetat-Puffern mit pH 6.0 bis 7.3 ist 2 bei Raumtemperatur mindestens 21 Tage stabil. In Sproz. HCI (pH l.l), Kochsalzlosung (ca. 6 M waBrige NaC1-Losung), ebenso wie in waBrigen ethanolischen Losungen ist Taxol-2’- MPA 2 in unterschiedlichem MaDe begrenzt stabil. Am wichtig- sten ist jedoch, daD 2 sich schnell in Taxol 1 umwandelt, wenn es bei 37 “C rnit menschlichem Plasma behandelt wird (< 10 Minu- ten, Abb. 2 ) . Auch mit reinem Albumin wird schnell Taxol 1 freigesetzt. Dariiber hinaus wurden nach Verabreichung von tritiiertem 2 an Mause nur 5 YO der Verbindung als Taxol iiber die Nieren ausgeschieden, ein Ergebnis, das in volliger Uberein- stimmung rnit dem Verhalten von Taxol selbst stehtrZo1. Diese Ergebnisse weisen nachdriicklich darauf hin, daB 2 in vivo als ein Prodrug von Taxol fungiert. Es ist zu beachten, daD die ausgezeichnete Bioverfiigbarkeit von 2 im Gegensatz zu einer Reihe bekannter Protaxole[’61 steht, die schnell uber die Nieren ausgeschieden werden[’’]. Die Freisetzung von Taxol aus 2 ist

vermutlich das Ergebnis eines nucleophilen Angriffs von Wasser oder einem anderen Nucleophil auf die 2-Position der Pyri- diniumeinheit, wie er in Abbildung 1 c gezeigt ist. Unklar ist noch, ob diese schnelle Reaktion in menschlichem Plasma Enzym-unterstutzt verlauft.

Die Loslichkeiten und Verteilungskoeffizienten von Taxol-2’- MPA 2 und Taxol 1 wurden rnit HPLC bestimmt. In 100 mM Phosphat-gepufferter Kochsalzlosung (PBS) betrug die Loslich- keit von 2 1.5 mM, und der Verteilungskoeffizient (Octanol/ Wasser) betrug 50 (Taxol: <0.0015 m~ bzw. 10000). Die Los- lichkeit von Taxol liegt an der Nachweisgrenze des verwendeten HPLC-Gerhts und bildet somit einen oberen Grenzwert. Die Loslichkeit von 2 dagegen reprasentiert einen unteren Grenz- wert, weil eine Konzentration gewahlt wurde, bei der die Losung klar und nicht kolloidal war. Verbindung 2 zeigt in mehreren Puffersystemen im pH-Bereich von 6.2 bis 7.4 ahnliche Loslich- keiten. In reinem Wasser scheint die Loslichkeit nur durch die Bildung klarer, farbloser Gele bei hohen Konzentrationen (> 20 mM) begrenzt zu sein. Diese Daten zeigen deutlich, daB 2 in Wasser um GroBenordnungen besser loslich ist als die Stammverbindung Taxol 1. Die Loslichkeiten von 2 in einer Reihe von waBrigen Systemen sind betrachtlich hoher als die klinisch relevanten Dosen (3-30 p ~ ) von Taxol. Mikrotubuli-Polymerisation/Depolymerisations-Experimen-

te[”] mit Taxol-2’-MPA 2 zeigten Effekte, die denen sehr ih - neln, die mit Guanosin-5’-triphosphat(GTP)-Kochsalzlosungen in Kontrollversuchen beobachtet wurden. Sie unterscheiden sich aber drastisch von den Effekten, die von Taxol hervorgeru- fen werden. So stabilisierte 2 die Mikrotobuli bei Zugabe von CaCI, nicht, was die fehlende intrinsische Aktivitat der Verbin- dung und ihre chemische Stabilitat im Versuchsmedium wider- spiegelt. Dieser Befund stimmt mit dem Verhalten anderer 2’- substituierter Derivate iiberein[23-251. Taxol 1, das aus mensch- lichem Plasma zuruckgewonnen wurde, zu dem Verbindung 2 zugegeben worden war, zeigte die erwartete Stabilisierung der Mikrotubuli, was beweist, daB 2 als Prodrug fur Taxol fungiert.

Taxol-2’-MPA 2 wurde auf seine Cytotoxizitat gegenuber einer Auswahl von Zellinien gepruft, zu denen Leukamie-, Eierstock-, Lungen- und Brustcarcinome und Melanomzellen gehorten (Abb. 3 ) . Die Cytotoxizitltsprofile von 2 wurden mit denen von Taxol verglichen. Sie sind recht ihnlich, obgleich einige Unter- schiede zu erkennen sind. Beide Verbindungen zeigten IC0- Werte im Bereich von bis lo-’’ M und Mittelwerte nahe I nM. Extrem hohe Cytotoxizitat wurde fur menschliche Leuk- amie, metastasierende Melanome und cervicale Carcinome ver- zeichnet. Insgesamt - und wie fur ein Taxol-Prodrug zu envar- ten - zeigt 2 die gleiche bemerkenswerte Tumorzellenselektivitat und Zellinienspezifitit wie Taxol.

Die vielversprechenden In-vitro-Ergebnisse und das Loslich- keitsprofil von Taxol-T-MPA 2 veranlaBten uns, sein In-vivo- Verhalten zu untersuchen und es rnit dem von Taxol zu verglei- chen. Dazu wurden nackte Mause mit menschlichen Prostata- carcinom-Xenotransplantaten verwendet (Abb. 4). Im Gegen- satz zu Taxol 1 wurde Verbindung 2 ohne Cremaphor in steriler Sproz. waiDriger Dextroselosung verabreicht. Damit wurde bewie- sen, daD die Verbindung einfach in Form einer Pille verabreicht werden kann und somit ein erster Vorteil gegenuber der Stamm- verbindung aufgezeigt. Mehrere Experimente mit Mausen bele- gen, daB Taxol-2’-MPA die gleiche wachstumshemmende Wir- kung auf Tumore hat wie Tax01 bei gleicher molarer Konzentra- tion ; dabei haben beide Verbindungen deutliche Antitumor-Ei- genschaften, wie der Vergleich rnit Kontrollversuchen zeigt (Abb. 4). Am beeindruckendsten ist ein Befund aus Untersu- chungen mit aquimolaren Dosierungen bei der maximal tole- rierten Dosis (MTD) Taxol: Wahrend die Taxolgruppe deutlich

1673 Angens. Chem. 1994, 106, Nr. 15/16 (0 VCH Verlagr~esellsrhaft mbH, 0-69451 Wrinheim, i994 0044-8249i94/15i5-i673 $10.00 f .25/0

ZUSCHRIFTEN

Human T-cell leukemia (MOLT) Metastatic melanoma (M24-MET)

Human promyelomomlc leukemia (HL-60) Human squamous carcinoma. cervix (SIHA)

Human ovarlan carcinoma (OVCAR-3) Lung adenocarclnoma (UCLA-P3) Pancreatic carcinoma (CAPAN 1) Human neumblastoma (SK-N-SH)

Human colon adenocarclnoma (HT-29) Human breast ductal carclnoma (BT-549)

Human CNS cancer (U251) Lung adenocarcinoma (H322)

Mouse leukemia (L1210) Melanoma (816-FO)

Melanoma EK-Mel28) Normal mammary epithllial cells (HMEC) Normal human dermal fibroblast (NHDF)

Human perlrenal cell carcinoma (786-0) faxol-2'-MPA

Chinese hamster ovary cells (CHO) Normal human PBL (RPMI 7666)

I I I I I I I

-4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 '

kl IC50 Abb. 3. Cytotoxizitaten von Taxol-2'-MPA 2 und Taxol 1 gegeniiber einer Reihe von Zellinien. Methode: Die Zcllcn wurden auf Gewebekulturplatten (96 Vertiefungen) mit den folgenden Kontrollen aufgebracht : keine Zellen und toxische Kontrolle (1 x M Natrium-dodecylsulfat(SDS). Der Wirkstoffwurde in die erste Reihe der Vertiefungen gegeben und nach Standardverdiinnungmethode ausgehend von diesen Vertiefungen ver- diinnr. Die Triger wurden 72 h bei 3 7 T , unter 5% Kohlendioxid in steriler LuR, in einem feuchtgehahencn Brutschrank bclassen. AnschlieDend wurde in jede Vertiefung eine L6sung (50 pL) yon 2.3-Bis(methoxy-4-nitro- 5-sulfophenyl)-~-[(plienylaminojcarbonyl]-2~-tetrazoliumh~droxid XTT. 1 mgmL-') in PBS (100 mM) gege- hen. In Anwcscnheit von IebensfZhigen Zellen wird diese farblose klare Losung enzymatisch umgewandelt, wab

LU einer Rosafarbung fiihrt. Die Gewebekulturplatten wurden bei 450 nm rnit einem Mikroplattenleser (Molecu- lar Devices Themomax) gelescn

250

200

1 100

V[rnm3]

50

n 0 5 10 15 20 25 30

t [dl - Abb. 4. In-vivo-Wirksamkeit von Taxol-2'-MPA 2 im Model1 rnit nackten Miusen mit Prostatatumor-Xenotransplantaten: 5 % Dextrose (e), Taxol (A) und Taxol-2'- MPA ( 0 ) . Methode: Das Tumormodell wurde aus einer ATTC-PC-3-Prostalalu- morzellinie erzeugt, die unter Standard-Zellvermehrungsbedingungen gehalten wurde (37"C, 5 % Kohlendioxid in sterilrr Luft). Jede Gruppe bestand aus acht rufillig ausgewihlten weiblichen nackten Mausen, $0 daD sich eine Gesamtpopula- tion von 24 ergibt. Mit einem Hamocytometer geldhlte Zellen, die in Hanks Me- dium (Gibco, Grand Island,NY) suspendiert wurden. wurden subkutan implantiert (10' Zellen in 0.4 mL je Maus). Das Wachstum der festen Tumore wurde jeden dritten Tag kontroUiert und das Volumen gemfD der Gleichung (Langex Breite)*(0.5) bestimmt. Aquimolare Mengen der Testverbindungen (1.0 pM) wurden an den Tagen 1, 3, 5 , 7, 9 und 11 intraperitoneal iujiziert, wobei folgende Medien benutzt wurden: Kontrolle, 5 % Dextrose in Wassrr (DSW); Taxol, suspendiert in CramaphorIDSW (5/95, 18.0 mgkg-' Korpergewicht des Tieres): Taxol-2'-MPA, gelost in DSW (23.9 mg/kg Korpergewicht des Tieresj. Die Verfahren ZUI Aufrecht- erhaltung von Tumoren und experimentelle Einzelheiten entsprachen den Protokoi- len. die vom Developmental Therapeutics Program des National Cancer Institute (NCI) veroffentlicht werden. Folgerungen iiber die Wirksamkeit wurden mit ANO- VA (Varianzanalyse) gezogen, gefolgt vom t-Test (statistisches Verfahrenj. Zum Beispiel: Tag 9 (schlimmster Fall): Nachdem ANOVA auf 0.06-Nivcau eine signifi- kante Varianz zeigt, ergibt der t-Test, daB Taxol und Taxol-2'-MPA sich auf 0.04-Nib veau deutlich von den Kontrollen unterscheiden. Nach Tag 9 ist jeder Datensatz hei einer Vertrauensgrenze von iiber 0.05 deutlich verschieden von den anderen. Die Daten sind als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt.

1674 0 VCH Ver lu~sgese lkhr f t mbH, 0-69451 Weinheim. 1994

toxisch war (vier von acht Tieren am Ende der Studie tot), zeigte Taxol-2'-MPA kei- ne sichtbare Toxizitat (vier von acht Tie- ren dieser Gruppe waren am Ende dieser Studie zusltzlich tumorfrei).

Die ungewohnliche Struktur von Ta- xol-2'-MPA und seine hohe Loslichkeit in wal3rigen Medien veranlaDte uns, zu un- tersuchen, ob diese Verbindung die Fahig- keit zur Selbstorganisation hat. Moleku- lare Selbstorganisation ist ein Phanomen von betrachtlichem aktuellen Tnterecse. Ein erheblicher Reiz riihrt von der Miig- lichkeit her, rnit diesem ProzeB Nano- strukturen rnit potentiellen Anwendungen in der Materialforschung und in der Me- dizin aufzubauen[26-281. Inmitten dieser Untersuchungen stehen die Beitrage der Chemie, die den Entwurf und die Synthese selbstorganisierender Molekiile beinhal- ten, zu denen auf Lipiden basierendel'"] und H-verbriickte Strukturen geho- renL3'I. Auch lebende Systeme bedienen sich zum Aufbau von Nanostrukturen in weitreichendem AusmaB der Selbstorga- nisation. Ein bekanntes Beispiel sind die Mikrotubuli, das Ziel von Tax01 in dcr ZeIle L3 '1.

Taxol-2'-MPA 2 organisiert sich - abhangig von der Natur des Mediums - zu mehreren Arten von Molekiilverbanden, dar- unter regulare Helices und Micellen. Dieser eher zufallige Re- fund iiberrascht nicht, denn die molekulare Struktur von 2 ist idcal zur Selbstorganisation gee ig r~e t [~~ -341. Sie verbindet ein stark hydrophobes Segment (Taxolgeriist) rnit einem polaren Teil (Pyridiniumeinheit), eine charakteristische Eigenschaft mehrerer selbstaggregierender Molekiile. Dieses Verhalten kennt man von planaren Amphiphilen wie dem antiasthmatisch wirkenden Dinatriurncromoglycat ; bei kugelformigen Molekii- len wie dem hier diskutierten ist es unseres Wissens nach unbe- kannt. Dariiber hinaus induziert die Chiralitat der Struktur al- lern Anschein nach eine Helicitat in den langen Nanostrukturen, die aus diesem Bauelement aufgebaut ~ e r d e n [ ~ ' - ~ ' ] . Wahrcnd w2Drige Losungen von 2 bei allen untersuchten Konzentrationcn (< 1 x 10-3 M) optisch klar waren, zeigten gepufferte Losungcn mit Konzentrationen iiber 1 x M rnit dem bloDen Auge be- trachtet einen blauen Schimmer und eine diffuse Streuung mo- nochromatischen Lichts, beides charakteristische Eigenschaftcn von Kolloiden. Bei hoheren Konzentrationen bilden sich kollo- idale Gele. UV-Absorptionsrnessungen bei 340 nrn, einer Wcl- lenlange, bei der 2 nicht absorbiert, zeigten einen exponentiellen Anstieg der optischen Dichte (OD) iiber 4 x M. Auch dieser Befund ist charakteristisch fur die Bildung eines Kolloids. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestatigte die

Anwesenheit von supramolekularen Strukturen in diesen Lo- sungen. So zeigten 1 mM Losungen von 2 in PBS bei TEM-Un- tersuchungen einheitliche Aggregate von fibrillirer Struktur (Abb. 5 A) rnit helicalen Konformationen. Diese Nanostruktu- ren waren unterschiedlich lang (his zu 80 nm), wiesen aber einen konsistenten Durchmesser von ca. 8 nm rnit einer helicalen Drc- hung von etwa sieben Einheiten pro Windung (Abb. 5, Ein- schub). Zusatzlich enthielten frisch beschallte wXDrige Losun- gen von 2 (1 mM) spharische Strukturen (Abb. 5B) rnit einem einheitlichen Durchmesser von etwa 5 nm, wahrend hochkon- zentrierte Losungen (kolloidal, ca. 2 x M) eine komplizier- tere molekulare Architektur offenbarten. Die urspriinglichen

0044-8~49/94;1515-1674 S 10.00+ .25/0 Angew. Chem. 1994, 106, Nr. 15/f6

ZUSCHRIFTEN

Abb. 5. A) Die TEM-Aufnahme von Taxol-2'-MPA 2 (1 mM in 100 mM PBS) bei 25 OOOfacher VergraDcrung (Negativfarbungen mit Phosphowolframat) zeigt die helicalen fibrillaren Nanostrukturen. die in gepufferten Losungen dieser Verbin- dung obcrhalb dcr kririschcn Aggregationskonzentration (CAC) vorliegen. U) Die TEM-Aufnahmc von Taxol-2'-MPA 2 (1 mM in H,O) bei 45000facher VergroRe- rung (Ncgativfarbung mit Uranylacetat,! zeigt die sphirischen Nanostrukturen; die in nicht-gepufferten Losungen dieser Verbindung uber der CAC vorliegen. Ein- schub: Die VergroBerung einer der Fibrillen von Teilbild A &I die helicale Verdril- lung.

Flden hatten sich zu weiteren Uberstrukturen zusainmengela- gert (Abb. 6).

Wir habcn die ncuen physikalischen, chemischen und biologi- schen Eigenschaften von Taxol-2'-MPA 2 beschrieben, einer Verbindung, die in einem Schritt in hoher Ausbeute aus Taxol 1 zuganglich ist. Diese Verbindung 2 ist, sowohl i n Bezug auf die Loslichkeit in wal3rigen Medien als auch bezuglich des In-vivo-

Abb 6 TkM-Aufnahme von Taxol-2-MPA 2 (2mM in l 00mv PBS) bei 10 000facher VergroRerung

Verhaltens gegeniiber Tumor-Xenotransplantatcn, der Stamm- verbindung Taxol I als Antitumormittel iiberlegen. Die hier prasentierten Daten lassen vermuten, daB Taxol-2'-MPA 2 ein Hauptkandidat fur die Entwicklung zum Antitumormittel ist. Andere Taxane, z.B. TaxotereL""', konnten analog inodifiziert werden, um zu effektiveren Wirkstoffen 7u gelangen. Daruber hinaus konnten andere fuiiktionclle Gruppen ahnlich der Pyri- diniumeinheit an den 2'-, 7- oder anderen geeigneten Positionen

der Taxane eingefiihrt werden, um die neuen Einheiten mit sol- chen Eigenschaften auszustatten. Die beeindruckenden Eigen- schaften dieses Wirkstoffs konnten seiner Fahigkeit zugeschrie- ben werden, sich in waIJrigem Medium selbst zu Nano- strukturen zu organisieren. Momentan versuchen wir, den Zu- sammenhang zwischen Nanostruktur und Wirkstoffaktivitit aufzuklaren.

Eingegangen am 11. April 3994 [Z 6x381

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