konnten grobe Rückschlüsse auf die im Mahlspalt herr-schenden Kräfte gezogen werden. Offenbar kommt dabeider Korngröûe die meiste Bedeutung zu, wogegen Weich-grad oder innere Kornstrukturen nur in einem bestimmtenMaû eine Rolle spielten.

Insgesamt zeigte sich, dass der Vermahlungspro-zess von konditionierten Cerealien auf dem verwendetenMühlensystem auch bei extremen Bedingungen sehr guteSchrotqualitäten lieferte.

Eingegangen am 24. Juli 2001 [K 2908]

Formelzeichen

_m [kg/s] Fördermassenstromn [1/s] Speisewalzendrehzahl_mSpw [kg/s] Fördermassenstrom der

Speisewalze in der Mühle� [kg/m3] SchüttgutdichteVZ [m3] Volumen einer Speisewalzen-

kammerk [±] Anzahl der KammernjZ [±] Füllungsgrad der Zellen

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Einsatz der Membranfiltrationbei der Isolierung von b-Lactoglobulinaus Labmolke*

G E R D K O N R A D * * , B ¾ R B E L L I E S K E U N DT H O M A S K L E I N S C H M I D T

1 Problemstellung

Membrantrennprozesse haben sich zur schonenden Anrei-cherung von Proteinen etabliert. In der Molkerei wird dieUltrafiltration (UF) insbesondere zur Gewinnung von Mol-kenproteinkonzentraten als funktionelles Lebensmittelpro-tein eingesetzt. Die individuellen Molkenproteine besitzencharakteristische nutritive, funktionelle und biologischeEigenschaften, die Molkenproteinkonzentrate nicht haben.Von daher besteht ein groûes Interesse an Verfahren zurTrennung der individuellen Molkenproteine, jedoch keinebekannte Technik wurde bisher im technischen Maûstabrealisiert [1]. Aufgrund der Verwendung von asymmetri-schen Membranen bei der Membranfiltration lassen sichdie in ihrer Molmasse relativ dicht beieinanderliegendenMolkenproteine ohne zusätzliche Verfahrensschritte nichtvoneinander trennen.

Das Hauptprotein der Käsemolke ist das b-Lacto-globulin (b-Lg) mit einem Anteil von etwa 3,2 bis 3,5 g/L. Esist sehr reich an essentiellen Aminosäuren, fördert die Re-sorption von Fettsäuren im Dünndarm und könnte einewirtschaftliche Bedeutung in der pharmazeutischen Indust-rie als Retinolträger oder als Mittel zur Stimulierung derAntikörperbildung erlangen. Es soll auch die Adhäsion pa-thogener Keime im Dünndarm hemmen. Ebenso sind diebemerkenswerten physiko-funktionellen Eigenschaften wieLöslichkeit, Emulgierung oder Gelbildung beim Einsatz alsLebensmittel-Zusatzstoff bekannt. Vor allem die exzellen-ten Gelbildungseigenschaften prädestinieren b-Lg als po-tenziellen Austauscher für die im Zusammenhang mit BSEkritisch diskutierte Gelatine. Bisher konnte sich der prakti-sche Einsatz dieses Proteins nicht realisieren lassen, dapraktikable und kostengünstige Isolationsverfahren fehlten.Mit diesem Thema hat sich unsere Arbeitsgruppe in denletzten Jahren intensiv beschäftigt und ein neues Verfahrenentwickelt, das bis hin zur groûtechnischen Erprobungvorangetrieben wurde.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

* Vortrag anlässlich der GVC-Fachausschuss-sitzung, 7./8. März 2001 in Karlsruhe.

** Dr-Ing. G . KO N R A D, Dr.-Ing. B. L I E S K E ,Prof. Dr.-Ing. T H . K L E I N S C H M I D T, HochschuleAnhalt (FH), Fachbereich Lebensmittel-technologie/Biotechnologie/Verfahrens-und Umwelttechnik, Bernburger Straûe 55,D-06366 Köthen.

M e m b r a n f i l t r a t i o n 1483Chemie Ingenieur Technik (73) 11 | 2001S. 1483±1487 � WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 20010009-286X/2001/1111-1483 $17.50+50/0

2 Beschreibung des Verfahren2.1 Laborverfahren

Das neu entwickelte enzymatische Verfahren beruht auf derunterschiedlichen Zugänglichkeit der individuellen Mol-kenproteine für Pepsin [2]. Nur natives b-Lg ist resistentgegen eine peptische Hydrolyse. Die Ursache hierfür wirddarin gesehen, dass die für Pepsin spezifischen Spaltungs-stellen im Inneren des gefalteten globulären Proteins ver-borgen sind [3]. Somit ist nur denaturiertes b-Lg peptischabbaubar. Das Laborverfahren beginnt mit der Entrahmungder Molke, worauf eine peptische Proteolyse mit sehr gerin-gen Enzym-Substrat-Verhältnissen (E/S = 0,2 %) bei pH 1,8und 37 �C erfolgt. Nach Abschluss der Proteolyse wird dasEnzym thermisch inaktiviert und die Molke mikrofiltriert.Mit Hilfe der Ultrafiltration und Diafiltration wird das b-Lgschlieûlich aus dem MF-Permeat aufkonzentriert und gerei-nigt. Das isolierte Protein wird zum Schluss sprühgetrock-net.

2.2 Filtrationsversuche

Es standen drei unterschiedliche Membranfiltrationsanla-gen, die alle nach dem Cross-flow-Prinzip arbeiteten, zurVerfügung. Im Labor wurde eine Plattenmembrananlage(Minisette, Fa. Pall-Filtron, Roûdorf) benutzt, die mit PES-Membrankassetten vom Typ Omega bestückt war. DieTrenngrenze der verwendeten Membran betrug 30 kDa, unddie Filterfläche eines Moduls ist mit 0,07 m2 angegeben. AlleUF-Versuche wurden bei einer Temperatur von 40 �C undeiner transmembranenen Druckdifferenz von 2,3 bar durch-geführt.

Als Pilotanlage wurde eine UF-Anlage der Fa.UFI-TEC (Oranienburg) verwendet, die bestückt war mitdrei keramischen Membranen der Trenngrenze von 15 kDa(PoroCer-Keramikmembranen GmbH, Hermsdorf) und einerFilterfläche von insgesamt 0,48 m2. Für Versuche zur Mikro-filtration (MF) von saurer Molke wurden in diese Anlagekeramische PoroCer-Membranen mit einer Porengröûe von0,1 lm eingebaut. Der transmembrane Druck wurde bei derMF auf 0,3 bar festgelegt. In den groûtechnischen Versu-chen wurde eine mobile Spiral-UF-Anlage UFI 2S 7.4 P(Fa. UFI-TEC, Oranienburg) eingesetzt. Die Anlage wurdemit zwei Spiralwickelmodulen (MFK 618; Fa. Koch Int.,Düsseldorf) der Trenngrenze von 10 kDa und einer Filter-fläche von je 6 m2 ausgerüstet.

Zur quantitativen Beschreibung der Membran-filtration wird der Flux JV benutzt.

Jv �VPermDt A

(1)

Hierbei ist Dt die Zeit [h] und A die Filterfläche [m2]. Durchden Flux ist es möglich, die Widerstände der reinen Memb-ran (RM) [m±1] und der Deckschicht (RD) nach der Darcy-Gleichung zu errechnen [4]:

RM �Dp

g Jv(2)

wobei Dp der transmembrane Druck [bar] und g die dynami-sche Viskosität des Permeats [mPa s] darstellen. Nach Auf-bau einer Deckschicht gilt unter stationären Bedingungen:

R = RM + RD (3)

2.3 Analytische Methoden

Die Proben vom b-Lg wurden nach den üblichen Standard-methoden auf Trockenmasse, Gesamt-Stickstoff, Nicht-Pro-tein-Stickstoff (NPN) Lactose, Asche und Fett analysiert.Der Denaturierungsgrad wurde nach der pH 4,6/7,0 Pro-tein-Löslichkeit sowie nach einem spektrophotometrischenVerfahren ermittelt [4]. Mit Hilfe der SDS-PAGE erfolgte dieUntersuchung der Reinheit des Proteins (PhastSystem,Pharmacia) sowie mit der FPLC unter Verwendung derAnionenaustauscher-Säule Mono Q (Pharmacia) [5].

3 Ergebnisse3.1 Pilotverfahren

Das erste Problem, das im Ablauf des Vorhabens zu klärenwar, betraf das Scale up des erarbeiteten Laborverfahrensin den kleintechnischen Maûstab. Von besonderem Inte-resse waren die Fragen der Beibehaltung der Nativität deszu isolierenden Proteins unter den kleintechnischen Ver-suchsbedingungen, die Schaffung der Grundlagen für dieAuslegung der Membranfiltration im groûtechnischen Maû-stab und Fragen der Ausbeute und Reinheit bis hin zurTrocknung.

Das Verfahren konnte erfolgreich in den Pilot-maûstab ohne ¾nderung der Verfahrensschritte des Labor-verfahrens überführt werden. Die Proteinhydrolyse mitPepsin erfolgte dabei in 50 kg Chargen bei pH 1,8, 40 �C undüber einen Zeitraum von 2,0 h hinweg. Bei der anschlieûen-den Ultrafiltration lag der Flux im stationären Bereich unterVerwendung keramischer Membranen (15 kDa) bei etwa30 L/h m2, was auch die Laborergebnisse bestätigte, wo eindurchschnittlicher Flux von 27,8 L/h m2 ermittelt wurde. ImLabor kam allerdings eine Cross-flow-Anlage mit PES-Membranen der Trenngrenze von 30 kDa zum Einsatz. DieErgebnisse der Ultrafiltration mit den unterschiedlichenAnlagen sind in Tab. 1 zusammengefasst.

Tabelle 1.Angewandte Prozessparameter bei der UF von peptischbehandelter saurer Molke (pH 1,8) und ermittelte Membran-Kennwerte im Bereich der stationären Leistung.

Parameter Omega-Membran-kassette

keramischeMembran

Spiral-wickel-modul

Trenngrenze [kDa] 30 15 10

Temperatur [�C] 40 40 40

Transmembraner Druck [bar] 2,3 2,3 2,3

Überströmgeschwindigkeit [m s±1] 0,31 3,5 4,5

Membranwiderstand RM [m±1] 0,7 � 1012 8,0 � 1012 0,3 � 1012

Deckschichtwiderstand RD [m±1] 2,6 � 1013 4,0 � 1013 3,2 y 1012

W I S S E N S C H A F T L I C H E K U R Z M I T T E I L U N G E N1484Chemie Ingenieur Technik (73) 11 | 2001

Nachdem ein Konzentrierungsfaktor (VCR) von15 erreicht wurde, begann die Diafiltration mit Wasser, wo-bei mit fünf Volumenanteilen Wasser gearbeitet wurde. Dererreichte Flux war pH-abhängig und der Kurvenverlauf ent-sprach dem in Abb. 1 dargestellten Verlauf. Nach einerSprühtrocknung war das im Pilotmaûstab isolierte Proteinfast zu 100 % nativ und elektrophoretisch rein. Auf Basisdieser Ergebnisse wurde ein technisches Verfahren für dieVerarbeitung von jeweils 10 000 L Molke konzipiert und un-ter Molkereibedingungen erfolgreich getestet. Über die er-zielten Ergebnisse soll im Folgenden berichtet werden.

3.2 Technisches Verfahren

Die notwendige Filterfläche wurde bei der vorgegebenenLeistung auf 12 m2 festgelegt. In Abb. 2 ist der typische zeit-liche Filtrationsverlauf von peptisch behandelter saurerMolke sowohl für die UF als auch für die MF aufgetragen. Eswird deutlich, dass sich der Flux bei der Ultrafiltration vonsaurer Molke auch in der technischen Anlage für längereZeit bei etwa 30 L/hm2 im stationären Zustand befindet.Dieser Kurvenverlauf war in vier 10 000-L-Chargen wieder-holbar. ¾hnliche Werte wurden zuvor schon in den Labor-und kleintechnischen Versuchen erreicht, trotz Anwendungunterschiedlicher Anlagentypen. Die PVDF-Membranen

überstanden auch die niedrigen pH-Werte über einen Zeit-raum von 12 Monaten, ohne Schaden zu erleiden.

Der Membranwiderstand der verwendeten Spiral-wickelmembranen war mit 0,3 � 1012 m±1 etwas niedriger alsbei den keramischen Membranen (8,0 � 1012 m±1) wie auchbei den Membrankassetten vom Typ Omega (0,7 � 1012 m±1)(s. Tab. 1). Der Deckschichtwiderstand lag im Bereich desstationären Fluxes bei allen UF-Versuchen jeweils etwa umeine Zehnerpotenz über den Widerständen der reinen Mem-branen. Daraus resultierten ähnliche Kurvenverläufe beiden Versuchen vom Labor bis hin zum technischen Maûstab.

Das abfiltrierte Permeat ist nicht als umweltbe-lastendes Abprodukt anzusehen. Es enthält noch diegesamte ursprünglich in der Molke vorhandene Lactose-menge. Nach Neutralisation und Aufkonzentrierung lässtsich Milchzucker aus dem Permeat gewinnen. Da das Per-meat aber wegen der vorausgegangenen peptischen Hydro-lyse reich an Aminosäuren und niedermolekularen Pepti-den ist, sollte es sich auch als Substrat für Fermentierungeneignen, wobei vermutlich sogar auf die sonst notwendigeSupplementierung mit teuerem Hefeextrakt verzichtet wer-den kann.

Die sauren b-Lg-Konzentrate wurden durch Dia-filtration mit Leitungswasser in der UF-Anlage bis zum Er-reichen von pH 4,0 gewaschen und anschlieûend nach Neu-tralisation mit Natronlauge erneut diafiltriert. Abb. 1 zeigtdie ermittelte Abhängigkeit des Fluxes vom pH-Wert. Ty-pisch ist, dass die Filtratleistung umso geringer ist, je dich-ter man am isoelektrischen Bereich des b-Lg filtriert. Es istdaher ratsam, diesen Bereich durch Neutralisation mit Na-tronlauge möglichst zu umgehen. Durch diesen pH-Wechsellassen sich zudem Begleitstoffe entfernen, die unter saurenBedingungen unlöslich und im neutralen Bereich löslichsind. Je nach Intensität der Diafiltration konnte das b-Lg biszu einem Proteingehalt von 90 % aufkonzentriert werden.Das Rückhaltevermögen der UF-Membranen für b-Lg be-trug bei allen Versuchen > 99 %.

Werden klarlösliche Produkte verlangt, muss dasb-Lg zur Abtrennung des Restfettes und einiger noch inSpuren vorhandener Lipoproteine zusätzlich mikrofiltriertwerden. Hier hat sich die Cross-flow-Technik mit 0,1 lmkeramischen Membranen bewährt. Ein typischer Filtra-tionsverlauf bei der MF von saurer Molke ist in Abb. 2 dar-gestellt. Erwartungsgemäû sinkt der Flux bei der MF raschauf Werte um 80 L/hm2, um dann bei dieser Leistung ohneZwischenreinigung lange Zeit konstant zu bleiben. Ursachefür dieses minimale Fouling ist der niedrige pH-Wert, derdie Bildung anorganischer Niederschläge auf den Membra-nen verhindert.

Die Sprühtrocknung war völlig problemlos. Da b-Lg nicht hygroskopisch ist, konnte die Ablufttemperatur imSprühturm bis auf 70 �C gesenkt und somit ein maximalerGrad an Nativität des b-Lg gewährleistet werden.

3.3 Optimierungsergebnisse

Durch Optimierungsarbeiten ergaben sich im technischenVerfahrensablauf überraschende Vereinfachungen, die als

Abbildung 1.Abhängigkeit der Leistung der Diafiltration vom pH-Wert derMolke.

0

10

20

30

40

1 2 3 4 5 6

pH

Flu

x [l/

h m

-2]

a

Abbildung 2.Abhängigkeit der Leistung der Membranfiltration vomKonzentrierungsverhältnis der sauren Molke (pH 1,8; 40 �C);Dp bei MF = 0,3 bar; Dp bei UF = 2,3 bar.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Volumen-Konzentrationsverhältnis

Flu

x [l

/h m

²]

MF (0,1 µm)UF (10 k Da)

13 h

24 h

M e m b r a n f i l t r a t i o n 1485Chemie Ingenieur Technik (73) 11 | 2001

Patent angemeldet wurden (s. Abb. 3). Diese betreffen inerster Linie die Einsparung eines separaten Hydrolyse-schrittes, eine Reduzierung des Enzym-Substratverhältnis-ses von 0,5 % auf 0,05 %, Vereinfachungen der Reinigungs-prozedur durch Verwendung von Trinkwasser anstelle vondest. Wasser und der Verzicht auf die Nanofiltration zurEntsalzung.

Das Verfahren wurde in vier Chargen von insge-samt 40 000 L Molke wiederholt. Die Ausbeute an b-Lg wur-de von 1,65 g/L Molke im Laborverfahren bis auf maximal2,64 g/L durch die genannten Veränderungen gesteigert.

3.4 Vergleich der Ausbeute, Reinheit und Nativi-tät mit unterschiedlich gewonnenen Mustern

Es sind viele Laborverfahren zu Isolierung von b-Lg be-kannt, wobei nur wenige technisch praktikabel sind. AlsBeispiele für praktikable Lösungen seien die selektive Fäl-lung in 3%-iger Trichloressigsäure (TCE) nach F O X et al. [8]genannt, das Aussalzverfahren von M A T É und K R O C H T A [9]mit 7 % Kochsalz, bei pH 2 und einer 15%-igen Molkenpro-tein-Isolatlösung sowie die selektive thermische Fällungvon M A U B O I S et al. [10] wobei ein Ultrafiltrat mit 10 % Pro-tein bei pH 3,8 für 30 min auf 55 �C erwärmt wird. Nach Ab-zentrifugieren der unlöslichen Bestandteile wird der Über-stand diafiltriert und getrocknet.

Ein Vergleich der genannten Methoden hinsicht-lich technischer Machbarkeit, Ausbeute, Reinheit und Nati-vität zeigt die Überlegenheit dieses sehr schonenden enzy-matischen Verfahrens gegenüber den genannten Verfahren.Die detaillierten Ergebnisse hierzu sind inzwischen ver-öffentlicht [7] und sollen hier deshalb nur kurz zusammen-gefasst werden (s. Tab. 2).

Die Reinheit und Nativität der technisch gewon-nenen sprühgetrockneten Muster unterschieden sich nichtsignifikant von Charge zu Charge. Das getrocknete b-Lggleicht elektrophoretisch dem Standard-Reinstprotein von

Sigma (s. Abb. 4). Der Grad an Nativität der gewonnenen b-Lg-Chargen wurde mit 95 ± 98 % nach der Sprühtrocknungermittelt.

4 Schlussfolgerungen und Ausblick

Es wurde die Anwendung der Membranfiltration zur Isolie-rung von nativem b-Lg aus peptisch behandelter Molke un-tersucht und das Verfahren in unterschiedlichen Maûstäbengetestet. Dabei kamen Membranen aus verschiedenenWerkstoffen und in unterschiedlicher Modulbauweise zumEinsatz.

Die Pilotversuche und die groûtechnischen Ver-suche bestätigen, dass das enzymatische Verfahren zur Iso-lierung von b-Lg aus Molke, gekoppelt mit der Membranfil-tration, zuverlässig bis hin zum technischen Maûstabbetrieben werden kann. Im stationären Bereich des Per-meatflusses wurde bei allen getesteten UF-Anlagen ein Fluxvon etwa 30 L/hm2 ermittelt, wobei die Membranen ein

Abbildung 3.Verfahrensflieûbild zur technischen Isolierung vonb-Lactoglobulin aus Molke.

Molke

Zentrifugieren Molkenrahm

HCl, Pepsin

Pepsinhydrolyse +Ultrafiltration (VCR 18) Permeat E/S=0,05%; pH 1,8

Lactosegewinnung

Mikrofiltration (0,1 µm)

Wasser

Diafiltration Lactose, HCl, Salze

Sprühtrocknung

-Lactoglobulin, nativβ

Abbildung 4.SDS-Gelelektropherogramm von b-Lactoglobulin-Mustern,hergestellt nach verschiedenen Verfahren. Spur 1, LMWMarker; Spur 2, Standard-b-Lg von Sigma; Spur 3, neues b-Lg(Pepsin-Hydrolyse); Spur 4, b-Lg nach selektiver thermischerPräzipitation; Spur 5, b-Lg nach Aussalzverfahren; Spur 6,b-Lg nach TCE-Fällung.

Tabelle 2.Chemisch-analytische und biochemische Ergebnisse von b-Lg-Präparaten, isoliert im Pilotmaûstab nach unterschiedlichenVerfahren.

Parameter TCE-Fällung

Aussalz-verfahren

ThermischeFällung

Pepsin-Hydrolyse

Trockenmasse [%] 92,8 94,6 93,8 93,1

Protein i.T. [N � 6,38] 83,7 86,7 85,4 84,3

NPN [mg/g] 9,0 9,2 7,6 7,8

Lactose [%] 5,6 4,5 6,3 6,5

Asche [%] 3,2 1,1 1,7 1,4

a-Lactalbumin[mg/g Pulver]

12 49 74 15

Reinheit [%]a 91,8 86,5 82,5 94,1

Ausbeute [%]b 44,9 46,7 49,6 67,3

a bestimmt mittels IE-FPLC (Mono Q Säule)b berechnet auf einen b-Lg Gehalt in der Molke von 3,3 g L±1

W I S S E N S C H A F T L I C H E K U R Z M I T T E I L U N G E N1486Chemie Ingenieur Technik (73) 11 | 2001

Rückhaltevermögen für b-Lg von > 99 % aufwiesen. Das Ver-fahren kommt ohne umweltbelastende Abprodukte aus. Dasabfiltrierte Permeat kann weiterverwertet werden. Je nachIntensität der Diafiltration lassen sich b-Lg-Konzentrate miteinem Proteingehalt bis zu 90 % i. T. gewinnen. Das Verfah-ren wurde in vier Chargen von insgesamt 40 000 L Molkeohne Probleme wiederholt.

Mit der Verfahrensentwicklung wurde derGrundstein für eine wirtschaftliche Verwertung diesesMolkenproteins gelegt.

Wir möchten uns bedanken für die Finanzierung des Projektesdurch das Kultusministerium des Landes Sachsen-Anhalt.Ferner gilt unser Dank der Frischli-Molkerei WeiûenfelsGmbH für die Unterstützung und Zusammenarbeit.

Eingegangen am 11. Juni 2001 [K 2893]

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