Neophodne u mnogim naunim oblastima:imunologiji, endokrinologiji i neuroendokrinologiji, molekularnoj biologiji, virusologiji, farmakologiji, kao i u drugim oblastima istaivanja vezanim za reprodukciju

koriste za odreivanje velikog broja supstanci u uzorcima razliitog porekla (krvni serum, mleko, plazma, tkivo...): peptidnih hormona, ne-peptidnih hormona, ciklinih nukleotida, imunoglobulina, lekova, virusnih proteina, enzima.

Gde se koriste ove metode?ELISA i srodne analize(enzyme linked immuno sorbent assay)

RIA prve u nizu

zasnivaju se na originalnim zapaanjima Yalowu i Bersona (1953) da male koncentracije antitela na insulin mogu da se detektuju zahvaljujui njihovoj sposobnosti da vezuju radioaktivni insulin (insulin obeleen I-131).

Radioimunoloka analiza (RIA) je zbog svoje preciznosti nala iroku primenu u mnogim zemljama, ali naunici nisu prestali da rade na iznalaenju jo podesnijih metoda koje ne bi zahtevale posebne laboratorije, skupe instrumente i korienje radioizotopa.

Otkriem enzimimunolokih metoda (EIA) za odredjivanje koncentracije supstanci kao to su hormoni, imunoglobulini, lekovi i dr. u tome se donekle i uspelo. Ove metode se zasnivaju na istom principu, samo to je kod RIA antigen obeleen radioizotopima, a kod EIA odreenim enzimom.

ELISAvan Weemen, BK Clinical Chemistry, 51, 12, 2005. ELISARIA

Osnovna karakteristika metode je obeleavanje" jedne od komponenti enzimom:

Ag ili Ab: tzv. primarno Ab (1st Ab) ili sekundarno Ab (2nd Ab) Aktivnost enzima u kompleksu odreuje se na osnovu indikatorske reakcije tog enzima sa odreenim supstratom koji se dejstvom enzima transformie u bojeni produkt. Postoje kompetitivni tip analize i nekompetitivni sendvi - tip analize koja se najee koristi kod odreivanja koncentracije proteinskih hormona. ELISA - princip metode

"obeleen Ag ili Ab"ELISA - princip metode1) kompetitivni tip 2) ne-kompetitivni tip

Metoda je visoko specifina :

zbog mogunosti primene uskospecifinih Ab

posebno preienih stabilnih enzima jednostavne kinetike (alkalna-fosfataza, -D-galaktozidaza, peroksidaza rena)

korienja jasno definisanih supstrata i hromogena (supstanci koje daju bojeni produkt, ili produkt koji se karakterie fluorescencijom, odnosno luminescencijom)

koliina nastalog produkta meri se fotometrom, odnosno fluorometrom ili luminometrom

metoda ima veliku osetljivost, lako se primenjuje i ima mogunost merenja malih koncentracija Ag u biolokom materijalu

Kompetitivni tip analize

1st Ab fiksirano za podlogu kompetituju Ag (standard ili uzorak) i Ag obeleen enzimom + supstrat = bojaKoliina bojenog produkta obrnuto srazmerna koliini antigena u standardu, odnosno uzorku (videti grafik standardne krive).

Nekompetitivni sendvi-tip analize 1st Ab fiksirano dodaje se Ag (standard ili uzorak) drugi put 1st Ag 2nd Ab obeleeno enzimom

Koliina bojenog produkta srazmerna koliini antigena u standardu, odnosno uzorku (videti grafik standardne krive)

Nekompetitivni sendvi-tip analize 1st Ab fiksirano dodaje se Ag (standard ili uzorak)1st Ab obeleeno enzimom

FIA

Fluorescentno-imunoloke analize

Osnovna karakteristika metode je Ag ili Ab obeleeno supstancom koja fluorescira, npr. Eu

Stepen fluorescencije meri se fluorimetrom.

Kao i kod ELISA testa postoje kompetitivni i ne-kompetitivni tip analize.

DELFIA za progesteron i tiroksinkompetitivni tip analize

DELFIA komplet za TSHDva antitela protiv razliitih antigenih determinanti na antigenu. Jedno antitelo vezano za vrstu fazu i za njega se vezuje jedna antigena determinanta molekula TSH, a drugo je obeleeno Eu i ono se vezuje za drugu antigenu determinantu istog molekula. Dodavanjem odgovarajueg rastvora dolazi do oslobaanja jona Eu i formiranja fluorescentnog signala koji je proporcionalan koncentraciji hormona u standardu, odnosno uzorku.ne-kompetitivni sendvi tip analize

Primer protokola-DELFIA za progesteron

Nema problema sa NSB

Nespecifino vezivanje obeleene komponente za vrstu podlogu minimalno

U mnogim komercijalnim kompletima se ne odredjuje.

Postoje kompleti gde se to radi.

Kontrola kvaliteta imuno analizaAntitela velika specifinost (unakrsna reakcija) i veliki afinitet prema antigenu

Standardi: Antigen standarda i antigen iz uzorka moraju da reaguju identino sa specifinim antitelima

Koncentracijski opseg izmeu najveeg i najmanjeg standarda mora biti dovoljno irok da obuhvati najvei broj oekivanih koncenracija antigena u uzorku.

Odnos izmeu pojedinih standarda kao i odnos izmeu celokupnog koncentracijskog opsega i radnog razblaenja antitela, mora da bude takav da odreivanje koncentracije antigena u uzorku bude precizno u svakom delu standardne inhibicione krive

Optimizacija analize

Homolog (sve komponente od iste vrste) i heterolog sistem (pr. pacovski LH antigen, govedji anti-LH serum, standard pacovski LH

Radni rastvor Ab vezuje 30 -50 % Ag u odsustvu Ag

Ag koncentracija manja od najmanjeg standarda (zbog osetljivosti)

Radni opseg standardne krive : 15 90% od B0

Puferski sistemi, inertni protein-nosai, aditivi, konzervansi...

Vreme inkubacije, temperatura, zapremina inkubacionog sistema (mikrotitar ploe)

Kontrola kvaliteta:

Specifinost -napravi se standardna kriva za datu supstancu i odredi ED50Primer: RIA za estradiol , kros-reakcija estrona na antitelo za estradiol

kros-reakcija =

Osetljivost ona koncentracija standarda gde je B za 10% manje od B0

Preciznost izraunavaju se koeficijenti varijacije unutar eseja i izmedju dva eseja

Tanost odredjuje se na dva naina - test paralelizma - uzorak +

ED50 (estradiola)ED50 (estrona)x 100

ELISA -Kompetitivni tip analize za cAMP

ELISA -Kompetitivni tip analize za cAMP

Biohemija Acetilholinesteraze

Acetilacija i priprema uzoraka

Preraunavanje preko standardne krive

apsorbancaSSPreraunavanje preko standardne krive

B koliina Ag* koji je formirao kompleks sa AbT ukupna koliina Ag* i predstavlja B+FB0 maksimalno vezivanje Ag* za Ab u odsustvu neobeleenog AgNSB - nespecifino vezivanje

Prisustvo neobeleenog antigena inhibira formiranje obeleenog kompleksa. Stepen inhibicije je srazmeran koliini neobeleenog antigena.Da bi odredili nepoznatu koncentraciju Ag, stepen kompetitivne inhibicije u nepoznatom uzorku poredimo sa stepenom kompetitivne inhibicije standarda. Izraava se najee odnosom: B/B0 Osnovni pojmovi koje treba da znamo: