129

5c a p t u l o

c i n c o

Arriba: La enzima acetilcolinesterasa, con el inhibidor reversible clorhidrato de donepecilo (Aricept, se muestra en rojo) ocu-pando el sitio activo. Se usa Aricept para mejorar las funciones mentales en pacientes con enfermedad de Alzheimer. Se creeque acta inhibiendo la descomposicin del neurotransmisor acetilcolina en el cerebro, prolongando as los efectos del neuro-transmisor. (Sin embargo, no afecta el curso de la enfermedad). [PDB 1EVE]. (Vase esta figura a todo color al final del libro).

Propiedadesde las enzimas

Se ha tenido la ocasin de comprobar de qu manera las formas tridimensionales delas protenas les permiten desempear papeles estructurales y de transporte. Ahorase describirn sus funciones como enzimas. Las enzimas son catalizadores biolgi-cos selectivos de una eficiencia extraordinaria. Toda clula viva dispone de cientos de en-zimas distintas que catalizan las reacciones esenciales para la vida. Aun los organismosvivos ms simples contienen mltiples copias de cientos de enzimas diferentes. En los or-ganismos multicelulares, el complemento de las enzimas vara de un tipo celular a otro.La mayor parte de las enzimas que se describen en este libro pertenecen a las ms comu-nes que son virtualmente encontradas en todas las clulas. Estas enzimas catalizan lasreacciones de las rutas metablicas centrales, necesarias para mantener la vida.

La mayor parte de las reacciones catalizadas por enzimas no procederan a veloci-dades apreciables bajo condiciones fisiolgicas en ausencia de las enzimas. El papelprincipal de las enzimas es aumentar las velocidades de tales reacciones. En forma tpi-ca, las reacciones catalizadas por las enzimas son de 103 a 1020 veces ms rpidas quelas mismas sin catalizar.

Un catalizador es una sustancia que acelera la llegada a un equilibrio. Un cataliza-dor puede cambiar en forma temporal durante la reaccin, pero no cambia en el proce-so general, porque se recicla para participar en varias reacciones. Los reactivos se unena un catalizador y los productos se disocian de l. Un catalizador no cambia la posicindel equilibrio de la reaccin (es decir, no hace que una reaccin no favorable sea favo-rable). Ms bien reduce la cantidad de energa necesaria para que se efecte la reaccin.Los catalizadores aceleran las reacciones tanto hacia adelante como hacia atrs al con-vertir un proceso de uno o dos pasos en varios pasos menores, cada uno con menornecesidad de energa que la reaccin no catalizada. El captulo siguiente describe losdetalles de la forma en que las enzimas actan como catalizadores.

Las enzimas son muy especficas para los reactivos o sustratos sobre los que actan,y vara el grado de especificidad hacia el sustrato. Algunas enzimas actan sobre un gru-

130 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

Las molculas de ARN cataltico se descri-ben en los captulos 21 y 22.

po de sustratos relacionados y otras slo sobre un simple compuesto. Muchas enzimas po-seen estereoespecificidad ya que slo actan sobre un estereoismero del sustrato. Quizel aspecto ms importante de la especificidad de una enzima es la especificidad de reac-cin, esto es, la falta de formacin de subproductos como desperdicios. La especificidadde reaccin se refleja en la pureza excepcional del producto (100% en esencia) muchomayor que la pureza de productos de reacciones tpicas catalizadas en qumica orgnica.La especificidad de las enzimas no slo ahorra energa a las clulas sino que tambin evi-ta la formacin de productos metablicos potencialmente txicos.

Las enzimas pueden hacer ms que slo aumentar la velocidad de una sola reac-cin muy especfica. Algunas tambin pueden combinar, o acoplar, dos reacciones quenormalmente seran separadas. Esta propiedad permite que la energa ganada en unareaccin se use en una segunda reaccin. Las reacciones acopladas son una propiedadcomn de muchas enzimas; por ejemplo, la hidrlisis del ATP se acopla con frecuenciaa reacciones metablicas menos favorables.

Algunas reacciones enzimticas funcionan como puntos de control en el metabo-lismo. Como se podr apreciar, el metabolismo se regula en una variedad de formas,que incluyen alteraciones en las concentraciones de enzimas, sustratos e inhibidores deenzima, as como la modulacin de los niveles de actividad de ciertas enzimas. Las en-zimas cuya actividad es regulada, tienen en general, una estructura ms compleja quelas enzimas no reguladas. Con pocas excepciones, las enzimas reguladas son molculasoligomricas que tienen sitios de enlace separados para sustratos y moduladores, com-puestos que actan como seales de regulacin. El hecho de que la actividad enzimti-ca pueda ser regulada es una propiedad importante que distingue a los catalizadoresbiolgicos de los que se encuentran en un laboratorio de qumica.

El nombre enzima deriva de una palabra griega que significa en la levadura. In-dica que dichos catalizadores estn presentes en el interior de las clulas. A finales delsiglo XIX se estudi la fermentacin de los azcares por accin de clulas de levadura.Los vitalistas (que sostenan que los compuestos orgnicos slo podan ser formadospor clulas vivas) afirmaban que se necesitaban clulas intactas para la fermentacin.Los mecanicistas decan que las enzimas en las clulas de levadura eran las que catali-zaban las reacciones de fermentacin. Esta ltima conclusin fue respaldada por la ob-servacin de que los extractos de levadura, sin contenido de clulas, pueden catalizar lafermentacin. A este hallazgo pronto sigui la identificacin de las reacciones indivi-duales y de las enzimas que las catalizan.

Una generacin despus, James B. Summer cristaliz, en 1926, la primera enzima(ureasa) y demostr que era una protena. En la siguiente dcada se purificaron cincoenzimas ms y se encontr que tambin eran protenas: pepsina, tripsina, quimotripsina,carboxipeptidasa y la enzima Old Yellow (una flavoprotena NADPH oxidasa). Desdeentonces se ha demostrado que casi todas las enzimas son protenas, o protenas mscofactores. Algunas molculas de ARN tambin presentan actividad cataltica, perousualmente no se les llama enzimas.

En este captulo se describe a las enzimas y sus propiedades, comenzando con su cla-sificacin y nomenclatura. Despus se tratar el anlisis cintico (mediciones de veloci-dades de reaccin) destacando la forma en que los experimentos cinticos pueden revelarlas propiedades de una enzima y la naturaleza de los complejos que forma con los sustratosy los inhibidores. Por ltimo, se describen los principios de inhibicin y activacin de enzi-mas reguladoras. En el captulo 6 se explica la forma en que trabajan las enzimas a nivelqumico y para ilustrar la relacin entre la estructura de la protena y la funcin enzimticael uso de serina proteasas. El captulo 7 se dedica a la bioqumica de las coenzimas, mo-lculas orgnicas que ayudan a algunas enzimas en su papel cataltico al proporcionar gru-pos reactivos que no se encuentran en las cadenas laterales de aminocidos. En los captulosrestantes se presentan muchos otros ejemplos de las cuatro propiedades principales de lasenzimas: 1) pueden desempearse como catalizadores, 2) catalizan reacciones muy espec-ficas, 3) pueden acoplar reacciones y 4) su actividad puede ser regulada.

5.1 Las seis clases de enzimas

Los nombres en la mayor parte de las enzimas metablicas se forman agregando el su-fijo asa al nombre de sus sustratos, o a un trmino descriptivo de la reaccin que ca-talizan. Por ejemplo, la ureasa tiene a la urea como sustrato. La alcohol deshidrogenasa

5.1 Las seis clases de enzimas 131

1

23

4

56

Distribucin de todas las enzimas conoci-das por nmero de clasificacin EC. 1: oxi-dorreductasas, 2: transferasas, 3: hidrolasas,4: liasas, 5: isomerasas, 6: ligasas.

COO

C O

CH3Piruvato

NAD

COO

C HHO

CH3L-Lactato

+ + +NADH H

Lactatodeshidrogenasa

(5.1)

COO

C O

CH3Piruvato

+

COO

(CH2)2

COO

C HH3N

L-Glutamato

+

-Cetoglutarato

COO

C O

(CH2)2

COOL-Alanina

COO

C H

CH3

H3NAlanina transaminasa

(5.2)

O

P O

O

O PirofosfatasaH2O+PO

O

O

2

O

P O

O

HO

Pirofosfato Fosfato

(5.3)

cataliza la remocin de hidrgeno de los alcoholes (es decir, la oxidacin de alcoholes).Unas pocas enzimas, como la tripsina y la amilasa, se conocen por sus nombres histri-cos. Muchas enzimas recin descubiertas reciben su nombre de acuerdo con sus geneso de alguna caracterstica no descriptiva. Por ejemplo, el nombre de Rec A se debe algen recA y el de HSP70 es de una protena de choque producida por calor; ambas enzi-mas catalizan la hidrlisis del ATP.

Un comit de la Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular (IUBMB,de International Union of Biochemistry and Molecular Biology) mantiene un esquema declasificacin que asigna categoras a las enzimas de acuerdo con la clase general de reac-cin qumica orgnica que es catalizada. Las seis categoras son: oxidorreductasas, trans-ferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas; se definirn ms adelante con un ejemplopara cada una. El esquema de clasificacin de la IUBMB asigna un nmero nico, lla-mado nmero de clasificacin de la enzima, o nmero EC (de enzyme classification)para cada enzima. La IUBMB tambin asigna un nombre sistemtico a cada enzima. Elnombre sistemtico puede ser distinto del nombre comn de la enzima. En este libro,usualmente se referir a las enzimas por sus nombres comunes. La base de datos de laclasificacin completa, se puede ver en www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/.

1. Las oxidorreductasas catalizan las reacciones de oxidacin-reduccin. La ma-yor parte de esas enzimas se llaman, en general, deshidrogenasas. Tambin hayotras enzimas en esta clase que se llaman oxidasas, peroxidasas, oxigenasas o re-ductasas. En bioqumica hay cada vez ms la tendencia a citar esas enzimas porsu nombre formal, oxidorreductasas, y no por los nombres ms comunes en laspublicaciones no muy recientes de bioqumica. Un ejemplo de una oxidorreduc-tasa es la lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27), llamada tambin lactato:NADoxidorreductasa. Esta enzima cataliza la conversin reversible de L-lactato en pi-ruvato. La oxidacin de L-lactato se acopla a la reduccin de la coenzima nicoti-namida adenina dinucletido (NAD).

2. Las transferasas catalizan las reacciones de transferencia de un grupo y puedennecesitar la presencia de coenzimas. En las reacciones de transferencia de grupo,una parte de la molcula del sustrato se suele enlazar en forma covalente con laenzima o con su coenzima. Este grupo incluye las cinasas, enzimas que catalizanla transferencia de un grupo fosforilo del ATP. La alanina transaminasa, cuyonombre sistemtico es L-alanina:2-oxiglutarato aminotransferasa (EC 2.6.1.2), esun ejemplo tpico de esta clase.

3. Las hidrolasas catalizan hidrlisis. Son una clase especial de transferasas dondeel agua sirve como aceptor del grupo transferido. La pirofosfatasa es un ejemplosencillo de una hidrolasa. El nombre sistemtico de esta enzima es difosfato fos-fohidrolasa (EC 3.6.1.1).

132 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

C O

CH3Piruvato

+ H ODixido de

carbono

+CO

CH3Acetaldehdo

HPiruvatodescarboxilasa

COO

C O (5.4)

Alaninaracemasa

HC

L-Alanina

COO

CH3D-Alanina

COO

NH3CH

CH3

H3N (5.5)

NH4

L-Glutamato

COO

(CH2)2C

C HH3N

OO

ATP ++

L-Glutamina

COO

(CH2)2

C

C HH3N

O NH2

PiADP ++Glutaminasintetasa

(5.6)

4. Las liasas catalizan la lisis de un sustrato, al generar un enlace doble; son reac-ciones de eliminacin, no hidrolticas y no oxidantes. En direccin inversa, lasliasas catalizan la adicin de un sustrato a un doble enlace de un segundo sustra-to. Una liasa que cataliza una reaccin de adicin en las clulas es frecuentemen-te llamada sintasa. La piruvato descarboxilasa pertenece a esta clase de enzimasya que descompone al piruvato en acetaldehdo y dixido de carbono. El nombresistemtico de la piruvato descarboxilasa, 2-oxo-cido carboxi-liasa (EC 4.1.1.1.)casi nunca se emplea.

5. Las Isomerasas catalizan cambios estructurales dentro de una misma molcula(reacciones de isomerizacin). Como estas reacciones slo tienen un sustrato yun producto son de las reacciones enzimticas ms simples. La alanina racemasa(EC 5.1.1.1) es una isomerasa que cataliza la interconversin de L-alanina y D-alanina. El nombre comn es igual al nombre sistemtico.

6. Las ligasas catalizan la ligadura o unin de dos sustratos. Estas reacciones nece-sitan un suministro de energa potencial qumica de un nuclesido trifosfato, co-mo el ATP. Las ligasas son usualmente llamadas sintetasas. La glutaminasintetasa, o L-glutamato:amoniaco ligasa (formadora de ADP) (EC 6.3.12) usa laenerga de la hidrlisis del ATP para unir glutamato y amoniaco para producirglutamina.

De los ejemplos anteriores, es posible ver que la mayor parte de las enzimas tienenms de un sustrato, aunque el segundo sustrato pueda ser slo una molcula de agua.Ntese tambin que, aunque las enzimas catalizan las reacciones tanto directas comoinversas, se usan flechas de una direccin cuando el equilibrio favorece un gran excesode producto frente al sustrato. En el equilibrio, una enzima cataliza las reacciones direc-ta e inversa con la misma velocidad.

5.2 Experimentos cinticos revelan propiedadesde las enzimas

El estudio de las propiedades de las enzimas se iniciar examinando las velocidades dereacciones catalizadas por las mismas. Tales estudios pertenecen a la categora de cinti-ca enzimtica (del griego kinhtikoj en movimiento). ste es el lugar adecuado para co-

5.2 Experimentos cinticos revelan propiedades de las enzimas 133

Recuerde que las concentraciones se re-presentan con corchetes: [P] representa laconcentracin de producto, [E] la concen-tracin de enzima y [S] la concentracindel sustrato.

[S]

[P]

0.05 M 0.1 M 0.2 M

Tiempo

0.2 M

0.1 M

0.05 M

Figura 5.1

Velocidad de una reaccin qumica simple. a) Se grafica la cantidad de producto elabo-rado durante cierto tiempo para diversasconcentraciones iniciales de sustrato. La velo-cidad inicial, v0, es la pendiente del progresode la curva al iniciar la reaccin. b) La veloci-dad inicial en funcin de la concentracin ini-cial del sustrato. La pendiente de la curva esla constante de velocidad.

menzar con la propiedad ms importante de las enzimas que es la de actuar como catali-zadores, que aceleran las velocidades de las reacciones. La cintica enzimtica proporcio-na una informacin indirecta acerca de especificidades y mecanismos catalticos de lasenzimas. Los experimentos cinticos tambin revelan si una enzima est regulada.

Durante la primera mitad del siglo XX, la mayor parte de la investigacin en enzimasse limitaba a experimentos cinticos. Dichas investigaciones revelaron la forma en que lasvariaciones en las condiciones experimentales o los cambios en la concentracin de enzi-ma o sustrato afectan las velocidades de las reacciones. Antes de describir en detalle la ci-ntica enzimtica, se repasarn los principios de la cintica de sistemas qumicos noenzimticos. Estos principios se aplicarn entonces a las reacciones enzimticas.

A. Cintica qumica

En los experimentos cinticos se examina la relacin entre la cantidad de producto (P)que se forma en una unidad de tiempo ([P]/t) y las condiciones experimentales bajolas que se efecta la reaccin. La base de la mayor parte de las mediciones cinticas es laobservacin de la rapidez, o velocidad (v), de una reaccin, la cual vara en forma direc-ta con la concentracin de cada reactante (seccin 1.4). Esta observacin se expresa enuna ecuacin de velocidad. Por ejemplo, la ecuacin de velocidad para la conversin noenzimtica del sustrato (S) en el producto (P) en una reaccin de isomerizacin, es

(5.7)

La ecuacin de velocidad refleja que la velocidad de una reaccin depende de la con-centracin del sustrato ([S]). El smbolo k es la constante de velocidad e indica la veloci-dad o la eficiencia de una reaccin. Cada reaccin tiene una constante de velocidaddiferente. Las unidades de la constante de velocidad para una reaccin simple son s1.

Al avanzar una reaccin, la cantidad de producto ([P]) aumenta y la cantidad desustrato ([S]) disminuye. En la figura 5.1a se ve un ejemplo del avance de varias reac-ciones. La velocidad es la pendiente de la curva durante determinado intervalo de tiem-po. La forma de las curvas indica que la velocidad decrece respecto al tiempo, lo cualera de esperarse.

En este ejemplo hipottico, la velocidad de la reaccin llega a ser cero al final,cuando se consume el sustrato. Eso explicara por qu la curva se aplana cuando lostiempos son grandes. (Vase ms adelante otra explicacin). Es interesante conocer larelacin entre la concentracin del sustrato y la velocidad de una reaccin ya que si seconocen estos dos valores ser posible aplicar la ecuacin 5.7 para calcular la constan-te de velocidad. La nica concentracin exacta de sustrato es la que se prepara al comen-zar el experimento. Esta concentracin cambia durante el experimento. La velocidad dela reaccin en el inicio preciso de la reaccin es el valor que se desea conocer. Este va-lor representa la velocidad de la reaccin a una concentracin conocida del sustrato an-tes de que cambie.

La velocidad inicial (v0) se puede determinar a partir de la pendiente del progresode las curvas (figura 5.1a) o de las derivadas de esas curvas. En la figura 5.1b se ve unagrfica de velocidad inicial en funcin de la concentracin de sustrato que es una lnearecta. La pendiente de la curva en la figura 5.1b es la constante de velocidad.

Una mejor descripcin de esta reaccin sencilla sera

(5.8)

El experimento que muestra la figura 5.1 slo determina la constante de velocidad di-recta (en direccin de avance) ya que se reunieron los datos bajo condiciones en las queno haba reaccin inversa. sta es otra razn importante para calcular la velocidad ini-cial (v0) y no la velocidad en algn momento posterior. En una reaccin reversible, elaplanamiento del progreso de las curvas no representa la velocidad cero. Slo indicaque no hay aumento neto del producto al paso del tiempo porque la reaccin ha llegadoal equilibrio.

S k1

k-1P

[P]t

= v = k[S]

134 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

[E]

v

Figura 5.2Efecto de la concentracin de enzima ([E])sobre la velocidad inicial (v0) de una reaccincatalizada por enzima a una [S] fija de satura-cin. La velocidad de reaccin est influidapor la concentracin de la enzima, pero no por la concentracin de otro reactante, S.

En una reaccin ms complicada que de un slo paso, como la reaccin S1 S2 P1 P2, la velocidad es determinada por las concentraciones de ambos sustratos. Si es-tn presentes ambos sustratos a concentraciones similares, la ecuacin de velocidad es

(5.9)

La constante de velocidad para reacciones donde intervienen dos sustratos tiene las uni-dades M1s1. Estas constantes de velocidad se pueden determinar estableciendo con-diciones en las que la concentracin de un sustrato es muy alta y la otra se hace variar.La velocidad de la reaccin slo depende, en este caso, de la concentracin del sustratolimitante de la velocidad.

B. Cintica enzimtica

Uno de los primeros y grandes avances en bioqumica, fue el descubrimiento de que lasenzimas se unen en forma transitoria a los sustratos, resultado de la investigacin de lacintica enzimtica. Emil Fischer, en 1894, propuso que una enzima presenta una plan-tilla rgida, o cerradura, y que el sustrato es la llave que le corresponde. Slo los sustra-tos especficos se pueden ajustar a determinada enzima. Los primeros estudios decintica enzimtica confirmaron que una enzima (E) se une a un sustrato para formar uncomplejo enzima-sustrato (ES). Los complejos ES se forman cuando los ligandos seunen de manera no covalente a sus lugares adecuados en el sitio activo. El sustrato reac-ciona en forma transitoria con la protena catalizadora (y con otros sustratos, en unareaccin multisustratos) para formar el producto de la reaccin.

Imagnese ahora una reaccin enzimtica simple, la conversin de un sustrato enun producto catalizada por una enzima. Aunque la mayor parte de las reacciones enzi-mticas tiene dos o ms sustratos, se pueden describir los principios generales de la ci-ntica enzimtica suponiendo el caso sencillo en que hay un sustrato y un producto.

(5.10)

Esta reaccin se efecta en dos pasos distintos: la formacin del complejo enzima-sustrato y la reaccin qumica actual, acompaada por la disociacin del producto. Ca-da paso transcurre con una velocidad caracterstica. La velocidad total de una reaccinenzimtica depende de las concentraciones tanto del sustrato como del catalizador (la en-zima). Cuando la cantidad de enzima es mucho menor que la cantidad de sustrato, lareaccin depende de la cantidad de enzima.

La lnea recta de la figura 5.2 ilustra el efecto de la concentracin de la enzima sobrela velocidad de reaccin, en una reaccin de seudoprimer orden. Estas condiciones seusan en cuantificaciones de enzima donde se determinan concentraciones de stas. Laconcentracin de una enzima en una muestra se puede determinar con facilidad compa-rando su actividad con una curva de referencia parecida a la curva modelo de la figura5.2. Bajo estas condiciones experimentales hay cantidades suficientes de molculas desustrato para que cada molcula de enzima se una a una molcula de sustrato y forme uncomplejo ES; a esta condicin se le llama saturacin de la E con el S. Los anlisis de en-zima miden la cantidad de producto formado en determinado tiempo. En algunos mtodosde anlisis se puede usar un espectrofotmetro para registrar y obtener continuamente losdatos; en otros mtodos las muestras se extraen y analizan a intervalos. La cuantificacinse hace a pH y temperatura constantes, que se suelen escoger para obtener una actividadenzimtica ptima, o para aproximarse a las condiciones fisiolgicas.

Si se comienza una reaccin catalizada por una enzima mezclando sustrato y enzi-ma, no hay producto presente durante las primeras etapas de la reaccin. Bajo estascondiciones se puede ignorar la reaccin inversa, donde P se combina con E y se con-vierte en S. Entonces, la reaccin se puede describir con

(5.11)

Las constantes de velocidad k1 y k1 en la reaccin 5.11 gobiernan las velocidades deasociacin de S con E y de disociacin de S a partir de ES, respectivamente. Este primer

E + S k1

k-1ES

k2

" E + P

E + S ES E + P

v = k[S1][S2]

5.3 Ecuacin de Michaelis-Menten 135

[P]

0

2 E

E

[P]

t

Tiempo (t)

v0 ==Pendiente inicial t[P]

t

[P]

Figura 5.3Curva de avance de una reaccin catalizadapor enzima. [P] es la concentracin de pro-ducto y aumenta a medida que avanza lareaccin. La velocidad inicial de la reaccin,v0, es la pendiente de la parte lineal inicial dela curva. Ntese que la velocidad de reaccinse incrementa al doble cuando se agrega eldoble de enzima (2 E, curva superior) a unamezcla de reaccin que, por lo dems, esidntica.

paso es un equilibrio de interaccin de enlace parecido a la unin del oxgeno con la he-moglobina. La constante de velocidad para el segundo paso es k2, la velocidad de for-macin del producto a partir de ES. Ntese que la conversin del complejo ES enenzima libre y producto se indica con una flecha de una direccin porque la velocidadde la reaccin inversa (E P EP) es insignificante. La velocidad, medida durante es-te corto periodo es la velocidad inicial (y 0), que fue descrita en la seccin anterior. Laformacin y disociacin de los complejos ES son reacciones que suelen ser muy rpi-das ya que slo se forman y se rompen enlaces no covalentes. En contraste, la conver-sin de sustrato en producto suele ser la velocidad limitante. Es durante este pasocuando se produce la alteracin qumica del sustrato.

La cintica enzimtica se diferencia de la cintica qumica simple porque las veloci-dades de reacciones catalizadas por enzimas dependen de la concentracin de la enzima ysta nunca es un producto ni un sustrato de la reaccin. Las velocidades tambin difierenporque el sustrato debe unirse a la enzima para poder convertirse en el producto.

En una reaccin catalizada por enzima, las velocidades iniciales se obtienen delprogreso de las curvas, igual que en las reacciones qumicas. La figura 5.3 muestra el pro-greso de las curvas a dos concentraciones distintas de la enzima en presencia de una altaconcentracin inicial de sustrato ([S] >> [E]). En este caso, la velocidad de formacindel producto depende de la concentracin de la enzima y no de la concentracin del sus-trato. Los datos de experimentos como los de la figura 5.3 se pueden usar para graficarla curva de la figura 5.2.

5.3 Ecuacin de Michaelis-Menten

Las reacciones catalizadas por enzimas, como cualquier reaccin qumica, se puedendescribir en forma matemtica como ecuaciones de velocidad. En ellas, varias constan-tes indican la eficiencia y especificidad de una enzima y en consecuencia son tiles paracomparar las actividades de varias enzimas o para evaluar la importancia fisiolgica de unadeterminada enzima. Las primeras ecuaciones de velocidad fueron deducidas a princi-pios de 1900 examinando los efectos de variaciones en la concentracin de sustrato. Lafigura 5.4a en la pgina siguiente muestra un resultado tpico, donde la velocidad inicial(y 0) de una reaccin es graficada en funcin de la concentracin de sustrato ([S]).

Los datos se pueden explicar con la reaccin presentada en la ecuacin 5.11. Elprimer paso es una interaccin bimolecular entre la enzima y el sustrato para formar uncomplejo ES. A altas concentraciones de sustrato (parte derecha de la curva de la figu-ra 5.4) la velocidad inicial no cambia mucho cuando se agrega ms S. Ello indica que lacantidad de enzima ha llegado a ser limitante de la velocidad de esta reaccin. La con-centracin de la enzima es una parte importante de la reaccin general, como es de es-perarse para la formacin de un complejo ES. A bajas concentraciones de sustrato(parte izquierda de la curva de la figura 5.4), la velocidad inicial es muy sensible a cam-bios de concentracin de sustrato. Bajo esas condiciones, la mayor parte de las molculasde enzima todava no se han unido al sustrato y la formacin del complejo ES depende dela concentracin de sustrato.

La pendiente de la curva de y 0 en funcin de [S] es la de una hiprbola rectangular.Las curvas hiperblicas son indicativas de procesos donde hay una disociacin simple,como se pudo apreciar en la disociacin del oxgeno desde la oximioglobina (seccin4.13B). Esta es una evidencia ms de que la reaccin sencilla que se estudi es bimo-lecular, implicando la asociacin de E y S para formar un complejo ES.

La ecuacin de una hiprbola rectangular es

(5.12)

donde a es la asntota de la curva (el valor de y a un valor de x infinito) y b es el puntodel eje x que corresponde a un valor igual a a/2. En los experimentos de cintica enzi-mtica, y y0 y x [S]. El valor asinttico (a) se llama Vmx. Es la velocidad mximade la reaccin a concentraciones de sustrato infinitamente grandes. Con frecuencia se in-dica el valor de Vmx en las grficas de y0 contra [S], pero no es obvio por qu se escogi

y =ax

b + x

136 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

a) Maud Menten (1879-1960) y b) Leonor Michaelis (1875-1949), precursores en la ci-ntica enzimtica.

esta asntota en particular. Una de las caractersticas de las curvas hiperblicas es queparecen aplanarse a concentraciones moderadas de sustrato, a un valor que parece sermucho menor que la Vmx. La Vmx real no se determina tratando de estimar la posicinde la asntota a partir de la forma de la curva. Ms bien se determina en forma precisa ycorrecta ajustando los datos a la ecuacin general de una hiprbola rectangular.

El trmino b en la ecuacin general de una hiprbola rectangular se llama constan-te de Michaelis (Km), y se define como la concentracin de sustrato cuando y0 es iguala la mitad de la Vmx (figura 5.4b). La ecuacin completa de velocidad es

(5.13)

Esta es llamada la ecuacin de Michaelis-Menten, por Leonor Michaelis y MaudMenten. Ntese cmo la forma general de la ecuacin se compara con la ecuacin 5.12.La ecuacin de Michaelis-Menten describe la relacin entre la velocidad inicial de unareaccin y la concentracin del sustrato. En la seccin que sigue se deducir la ecuacinde Michaelis-Menten por un mtodo cintico para despus examinar el significado delas diversas constantes.

A. Deduccin de la ecuacin de Michaelis-Menten

Una deduccin comn de la ecuacin de Michaelis-Menten, debida a George E. Briggsy J. B. S. Haldane, es llamada la derivacin del estado estable. Esta deduccin postulaque hay un intervalo de tiempo (llamado estado estable, o estado estacionario) duranteel cual se forma el complejo ES a la misma velocidad con la que se descompone, demodo que la concentracin de ES es constante. La velocidad inicial se usa en la deriva-cin del estado estable porque se asume que la concentracin de producto ([P]) es insig-nificante. Tal estado estable es una condicin comn para las reacciones metablicas enlas clulas.

Al suponer que la concentracin de ES en estado estable es constante, entonces lavelocidad de formacin de producto depende de la velocidad de la reaccin qumica yde la velocidad de disociacin de P para abandonar la enzima. El paso limitante de lavelocidad es hacia el lado derecho de la reaccin 5.11 y la velocidad depende de la cons-tante de velocidad k2 y de la concentracin de ES.

(5.14)

La derivacin del estado estable resuelve la ecuacin 5.14 para [ES], usando trminosque se pueden medir, como la constante de velocidad, la concentracin total de la enzima([E]total) y la concentracin de sustrato ([S]). Se supone que [S] es mayor que [E]total,

ES k2

" E + P v0 = k2[ES]

v0 =Vmx[S]Km + [S]

Orden cero con respecto a S

Primer orden con respecto a S

Vmx

v0

[S]0

Vmx

[S]0

Vmx2

Km

v0

Figura 5.4Grficas de velocidad inicial v0 en funcin de la concentracin de sustrato ([S]) para unareaccin catalizada por enzima. a) Cada puntodel experimento se obtiene de una curva sepa-rada usando la misma concentracin de enzima. La forma de la curva es hiperblica. A bajas concentraciones de sustrato, la curvatiende a una recta que asciende con muchapendiente. En esta regin de la curva, la reac-cin depende mucho de la concentracin desustrato. A altas concentraciones de sustrato, laenzima est casi saturada y la velocidad inicialde la reaccin no cambia mucho cuando se aumenta ms la concentracin del sustrato. b) La concentracin del sustrato que corres-ponde a la mitad de la velocidad mxima sellama constante de Michaelis (Km). La enzimaest a la mitad de la saturacin cuando S Km.

5.3 Ecuacin de Michaelis-Menten 137

pero no necesariamente es saturada. Por ejemplo, rpidamente despus de que se mez-cla una cantidad pequea de enzima con sustrato, [ES] se vuelve constante ya que la ve-locidad total de descomposicin de ES (la suma de las velocidades de conversin de ESen E S y en E P) es igual a la velocidad de formacin del complejo ES a partir deE S. La velocidad de formacin de ES a partir de E S depende de la concentra-cin de la enzima libre (molculas de enzima que no estn en la forma de ES), que es[E]total [ES]. La concentracin del complejo ES permanece constante hasta el consu-mo del S, causado por el acercamiento de [S] a [E]total. Se puede expresar lo anterior enuna ecuacin matemtica:

Velocidad de formacin de ES Velocidad de descomposicin de ES

(5.15)

Se reordena la ecuacin 5.15 para reunir las constantes de velocidad.

(5.16)

La relacin de las constantes de velocidad en el lado izquierdo de la ecuacin 5.16 es laconstante de Michaelis, Km. A continuacin, de esta ecuacin se despeja [ES] en variospasos.

(5.17)

Esto se desarrolla:

(5.18)

Se renen los trminos [ES],(5.19)

y

(5.20)

La ecuacin 5.20 describe la concentracin de ES en el estado estable mediante trmi-nos que se pueden medir en un experimento. Si se sustituye el valor de [ES] en la ecua-cin de velocidad (ecuacin 5.14), el resultado es

(5.21)

Como se indica en la figura 5.4a, cuando la concentracin de S es muy alta, la en-zima est saturada y esencialmente, todas las molculas de E estn presentes como ES.Si se agrega ms S casi no hay efectos sobre la velocidad de reaccin. La nica formade aumentar esa velocidad es s se agrega ms enzima. Bajo esas condiciones, la velo-cidad es la mxima velocidad (Vmx), y esta velocidad se calcula con la concentracintotal de la enzima y la constante de velocidad k2. As,

(5.22)

por definicin. Esto se sustituye en la ecuacin 5.21 y se llega a la forma ms familiarde la ecuacin de Michaelis-Menten:

(5.23)

Ya se explic que esta forma de la ecuacin de Michaelis-Menten describe adecuada-mente los datos de experimentos cinticos. En esta seccin se demostr que se puede

v0 =Vmx[S]Km + [S]

Vmx = k2[E]total

v0 = k2[ES] =k2[E]total[S]Km + [S]

[ES] = [E]total[S]Km + [S]

[ES]1Km + [S]2 = [E]total[S]

[ES]Km = 1[E]total[S]2 - 1[ES][S]2

[ES]Km = 1[E]total - [ES]2[S]

k-1 + k2k1

= Km =1[E]total - [ES]2[S]

[ES]

k11[E]total - [ES]2[S] = 1k-1 + k22[ES]

138 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

Enzima kcat(s1)*

Papana 10

Ribonucleasa 102

Carboxipeptidasa 102

Tripsina 102 (to 103)Acetilcolinesterasa 103

Cinasas 103

Deshidrogenasas 103

Transaminasas 103

Anhidrasa carbnica 106

Superxido dismutasa 106

Catalasa 107

* Las constantes catalticas slo se presentan como rdenes de magnitud.

TABLA 5.1 Ejemplos de constantescatalticas

deducir la misma ecuacin a partir de una consideracin terica de las implicaciones dela reaccin 5.11, la ecuacin para una reaccin catalizada por enzima. La concordanciaentre la teora y los datos brinda la confianza de que las bases tericas de la cintica en-zimtica estn bien fundamentadas.

B. Constante cataltica kcat

Cuando la concentracin de sustrato es alta, la velocidad total de la reaccin es Vmx yest determinada por la concentracin de la enzima. La constante de velocidad observa-da bajo estas condiciones se llama constante cataltica, Kcat, y se define como sigue:

(5.24)

donde kcat representa la cantidad de moles de sustrato convertidos en producto, por se-gundo y por mol de enzima (o por mol de sitio activo, para una enzima con multisubu-nidades) bajo condiciones de saturacin. En otras palabras, kcat indica la cantidadmxima de molculas de sustrato convertidas en producto cada segundo por cada sitioactivo. A eso se le llama con frecuencia nmero de recambio. La constante catalticamide la rapidez con que determinada enzima puede catalizar una reaccin especfica; esuna forma muy til para describir la eficacia de una enzima. La unidad de kcat es s1. Elrecproco de kcat es el tiempo necesario para que haya un evento cataltico. Ntese quepara obtener kcat se debe conocer la concentracin de la enzima.

Para una reaccin sencilla, como la 5.11, el paso limitante es ES E P y kcat k2.Muchas reacciones enzimticas son ms complejas. Si hay un paso que claramente sea li-mitante de la velocidad, su constante de velocidad es la kcat de esa reaccin. Si el mecanis-mo es ms complejo, entonces kcat puede ser una combinacin de varias y distintasconstantes de velocidad. Es la causa por la que se necesita una constante de velocidad di-ferente, kcat, para describir la velocidad total de la reaccin catalizada por enzimas. En lamayor parte de los casos se puede suponer que kcat es una buena aproximacin a k2.

En la tabla 5.1 se muestran valores representativos de kcat. La mayor parte de lasenzimas son catalizadores potentes con valores de kcat de 102 a 103 s1. Algunas enzi-mas son catalizadores extremadamente rpidos con valores de kcat de 106 s1 o mayo-res. Por ejemplo, la anhidrasa carbnica de mamferos debe actuar con mucha rapidezpara mantener el equilibrio entre CO2 acuoso y el bicarbonato (seccin 2.10). Como sever en la seccin 6.4B, la superxido dismutasa y la catalasa son responsables de la r-pida descomposicin de los metabolitos txicos de oxgeno, el anin superxido y elperxido de hidrgeno, respectivamente. Las enzimas que catalizan un milln de reac-ciones por segundo suelen actuar sobre molculas pequeas de sustrato que se difundencon rapidez dentro de la clula.

C. Significados de Km

La constante de Michaelis tiene varios significados. La ecuacin 5.16 define a Km comola relacin de las constantes de velocidad combinadas para la descomposicin de ES di-vidida entre la constante para su formacin. Si la constante de velocidad para la forma-cin de producto (k2) es mucho menor que k1 o que k1, como es el caso frecuente, sepuede despreciar k2 y Km equivale a k1/k1. En este caso, Km es igual a la constante deequilibrio de disociacin de ES para dar E S. As, Km es una medida de la afinidadde E hacia S. Mientras menor sea el valor de Km, el sustrato est ms fuertementeunido. Km tambin es uno de los parmetros que determina la forma de la curva de y0en funcin de [S] de la figura 5.4b. Es la concentracin del sustrato cuando la velocidadinicial es la mitad del valor de Vmx. Este significado es consecuencia directa de la ecua-cin general de una hiprbola rectangular.

A veces se usan los valores de Km para distinguir entre diferentes enzimas que ca-talizan la misma reaccin. Por ejemplo, los mamferos tienen distintas formas de lacta-to deshidrogenasa, cada una con valores distintos de Km. Aunque es til imaginar queKm representa la constante de disociacin en equilibrio de ES, para muchas enzimas Km

Vmx = kcat[E]total kcat =Vmx

[E]total

5.4 Las constantes cinticas indican la actividad enzimtica y la eficiencia cataltica 139

es una funcin ms compleja de las constantes de velocidad. Esto es especialmente im-portante cuando la reaccin se efecta en ms de dos pasos.

5.4 Las constantes cinticas indican la actividad enzimtica y la eficiencia cataltica

Est demostrado que las constantes cinticas km y kcat se pueden usar para medir las ac-tividades relativas de las enzimas y los sustratos. En la mayor parte de los casos, Km esuna medida de la estabilidad del complejo ES, y kcat es similar a la constante de veloci-dad para la conversin de ES en E P, y cuando el sustrato no es limitante (regin A,figura 5.5). Recurdese que kcat es una medida de la actividad cataltica de una enzimae indica cuntas reacciones por segundo puede catalizar una molcula de enzima.

Al revisar la regin B de la hiprbola en la figura 5.5. La concentracin de S esmuy baja y la curva se aproxima a una recta. Bajo estas condiciones, la velocidad dereaccin depende de las concentraciones del sustrato y de la enzima. En trminos qu-micos, es una reaccin de segundo orden, y la velocidad depende de una constante develocidad de segundo orden, que se define por

(5.25)

Es interesante conocer cmo se determina esta constante de velocidad de segundo ordenya que indica la velocidad de la reaccin catalizada por la enzima bajo condiciones fisio-lgicas. Cuando Michaelis y Menten escribieron toda la ecuacin de velocidad por prime-ra vez, usaron la forma que inclua a kcat[E]total en vez de Vmx (ecuacin 5.24). Ahora queya se comprende el significado de kcat es posible sustituir kcat[E]total en lugar de Vmx en laecuacin de Michaelis-Menten (ecuacin 5.23). Si se considera slo la regin de la curvade Michaelis-Menten donde la [S] es muy baja, esta ecuacin se puede simplificar des-preciando la [S] en el denominador ya que [S] es mucho menor que Km.

(5.26)

Al comparar las ecuaciones 5.25 y 5.26 se comprueba que la constante de velocidad desegundo orden se aproxima mucho a kcat/Km. As, la relacin kcat/Km es una constantede velocidad aparente de segundo orden para la formacin de E P a partir de E S

v0 =kcat[E][S]Km + [S]

=kcat

Km [E][S]

v0 = k[E][S]

Regin B:

Regin A: ESkcat

+E PkcatKm +E P+E S

ES +E P)+ S(E

Vmx

[S]

Regin Akcat=v0 [E]1[S]0

Regin B

=v0 [E]1[S]1kcatKm

v0

Figura 5.5

Significados de kcat y de kcat/Km. La constantecataltica (kcat) es la constante de velocidadpara la conversin del complejo ES a E P, yse mide con ms facilidad cuando la enzimaest saturada con sustrato (regin A de estacurva de Michaelis-Menten). La relacinkcat/km es la constante de velocidad para laconversin de E S en E P, a concentracio-nes muy bajas del sustrato (regin B). Lasreacciones medidas para estas constantes develocidad se resumen bajo la grfica.

140 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

Constante de Constantevelocidad no de velocidadenzimtica enzimtica Eficiencia (kn, en s_1) (kcat/Km en M1s1) cataltica

Anhidrasa carbnica

QuimotripsinaCorismato mutasa

Triosa fosfato isomerasa

Citidina desaminasa

Adenosina desaminasa

Mandelato racemasa

b-Amilasa

Fumarasa

Arginina descarboxilasa

Fosfatasa alcalina

Orotidina 5-fosfato descarboxilasa 2 * 10236 * 1073 * 10-16

3 * 10223 * 10710-1510211069 * 10-16102110910-1310201077 * 10-143 * 10181063 * 10-135 * 10161072 * 10-103 * 10163 * 10610-1010144 * 1084 * 10-62 * 10112 * 10610-52 * 10169 * 1074 * 10-97 * 1077 * 10610-1

TABLA 5.2 Eficiencias catalticas de algunas enzimas

cuando la reaccin total est limitada por encuentros de S con E. Esta relacin tiende aubicarse entre 108 y 109 M1s1, la mxima velocidad a la que dos solutos sin carga pue-den aproximarse entre s por difusin a la temperatura fisiolgica. Las enzimas quepueden catalizar reacciones a esta velocidad tan grande se describirn en la seccin 6.4.

La relacin kcat/Km es til para comparar las actividades de enzimas diferentes.Tambin es posible evaluar la eficiencia de una enzima midiendo su capacidad catal-tica. Este valor es igual a la constante de velocidad de una reaccin en presencia de la en-zima (kcat/Km) dividida entre la constante de velocidad de la misma reaccin en ausenciade la enzima (kn). Es de sorprender que slo se conozcan pocos valores de eficiencia cata-ltica porque la mayor parte de las reacciones qumicas se efecta con lentitud extrema enausencia de las enzimas con tanta lentitud que sus velocidades sin enzima son muydifciles de medir. Con frecuencia, las velocidades de reaccin se miden en recipientes es-peciales de vidrio encerrados en acero a temperaturas mayores de 300C.

La tabla 5.2 contiene una lista de varios ejemplos de eficiencias o capacidades ca-talticas conocidas. Los valores tpicos van de 1014 a 1020, pero algunos son bastantemayores (hasta 1023). La dificultad de obtener constantes de velocidad para reaccionesno enzimticas es confirmada por el tiempo medio de la reaccin catalizada por la oro-tidina-5N-fosfato descarboxilasa que es de unos 78 millones de aos! Los valores deeficiencia cataltica de la tabla 5.2 remarcan una de las propiedades principales de lasenzimas, su capacidad de aumentar las velocidades de reacciones que en el caso normalseran demasiado lentas para tener utilidad.

5.5 Medicin de Km y Vmx

Los parmetros cinticos de una reaccin enzimtica pueden producir informacin va-liosa acerca de la especificidad y el mecanismo de la reaccin. Los parmetros claveson Km y Vmx ya que kcat se puede calcular si se conoce Vmx.

Los datos de Km y Vmx para una reaccin catalizada por enzima se pueden de-terminar de diversas maneras. Es posible obtener ambos valores por anlisis de lasvelocidades iniciales en una serie de concentraciones de sustrato y una concentracinfija de enzima. Para obtener valores fiables de las constantes cinticas, los puntos de [S]se deben extender por abajo y por arriba de Km para producir una hiprbola. Es difcildeterminar Km o Vmx en forma directa con una grfica de velocidad inicial en funcin

5.6 Cintica de las reacciones con sustratos mltiples 141

v0

1

1Vmx

1[S]

1Km

Ecuacin de Lineweaver-Burk :

+1

Vmx=

v0

1 1[S]

Km Vmx

Figura 5.6Grfica de doble-recproca (de Lineweaver-Burk). Esta grfica se obtiene con una transformacin lineal de la ecuacin de Michaelis-Menten. Se grafican los valores de 1/v0 en funcin de los valores de 1/[S].

de la concentracin porque la curva tiende a la Vmx en forma asinttica. Sin embargo,se pueden determinar valores exactos usando un programa de cmputo adecuado paraajustar los resultados experimentales a la ecuacin de la hiprbola.

La ecuacin de Michaelis-Menten se puede reacomodar para obtener valores deVmx y Km a partir de lneas rectas en grficas. La transformacin de uso ms frecuentees la grfica de doble recproco, o de Lineweaver-Burk, en la que se grafican los valoresde 1/y0 contra los de 1/[S] (figura 5.6). El valor absoluto de 1/Km se obtiene con la in-terseccin de la recta con el eje x (es decir, la abscisa al origen), y el valor de 1/Vmx seobtiene con la ordenada al origen. Aunque las grficas de doble recproco no son losmtodos ms exactos para determinar las constantes cinticas, se comprenden con faci-lidad y permiten contar con pautas reconocibles para estudiar la inhibicin enzimtica,un aspecto de extrema importancia en la enzimologa que en breve se examinar.

Se pueden obtener valores de kcat con mediciones de Vmx slo cuando se conoce laconcentracin absoluta de la enzima. Se pueden determinar los valores de Km aun conenzimas que no hayan sido purificadas siempre y cuando sea una sola la enzima en lapreparacin impura la que pueda catalizar la reaccin observada.

5.6 Cintica de las reacciones con sustratos mltiples

Las mediciones cinticas de reacciones con sustratos mltiples (o reacciones de multi-sustrato) son algo ms complicadas que para cinticas enzimticas sencillas con un so-lo sustrato. Sin embargo, para muchos fines, como por ejemplo el diseo de unacuantificacin enzimtica, basta slo con determinar la Km para cada sustrato en pre-sencia de cantidades saturantes de cada uno de los dems sustratos, como fue descritopara las reacciones qumicas (seccin 5.2A). La cintica enzimtica simple que se des-cribe en este captulo se puede ampliar para diferenciar entre varias posibilidades meca-nsticas para reacciones multisustrato, como las reacciones de transferencia de grupo.Eso se hace midiendo el efecto de variaciones en la concentracin de un sustrato en losresultados cinticos obtenidos para el otro.

RECUADRO 5.1 Hiprbolas y rectas

Hemos visto que una grfica de velocidad inicial de una reaccin(v0) en funcin de la concentracin de sustrato ([S]) produce unacurva hiperblica, como las de las figuras 5.4 y 5.5. La ecuacingeneral de una hiprbola rectangular (ecuacin 5.12) y la ecua-cin de Michaelis-Menten tienen la misma forma (ecuacin 5.13).

Es muy difcil determinar Vmx a partir de una grfica dedatos cinticos para la enzima porque la curva hiperblica quedescribe la relacin entre la concentracin del sustrato y la ve-locidad inicial es asinttica hacia Vmx y en forma experimentales difcil alcanzar la concentracin de sustrato requerida paraestimar Vmx. Por estas razones es ms fcil con frecuencia con-vertir la curva hiperblica en una forma lineal que se apegue ala frmula general y mx b, donde m es la pendiente de larecta y b es la ordenada al origen. El primer paso para trans-formar la ecuacin original de Michaelis-Menten en esta formageneral de ecuacin lineal es invertir los trminos, para que lostrminos Km [S] queden arriba (en el numerador) del ladoderecho. Eso se hace obteniendo el recproco de ambos ladostransformacin que podr ser familiar a muchos que conoz-can las curvas hiperblicas.

Los dos pasos siguientes consisten en separar trminos y cance-lar [S] en el segundo trmino del lado derecho de la ecuacin.Esta forma de la ecuacin de Michaelis-Menten se llama ecua-cin de Lineweaver-Burk y se parece a la forma general de unaecuacin lineal, y mx b, donde y es el recproco de v0 ylos valores de x son los recprocos de [S]. A una grfica delos datos en esta forma se le llama grfica de doble recproco.La pendiente de la lnea ser Km/Vmx, y la ordenada al origenser 1/Vmx.

La razn original de esta clase de transformacin fue cal-cular Vmx y Km a partir de datos experimentales. Era ms fcilgraficar los valores recprocos de v0 y [S] y dibujar una rectaque pase por los puntos para calcular las constantes cinticas.Hoy hay programas de cmputo que pueden ajustar con exacti-tud los datos a una curva hiperblica y calcular las constantes,por lo que ya no es necesaria la grfica de Lineweaver-Burk paraesta clase de anlisis. En este libro seguiremos usando grficasde Lineweaver-Burk para ilustrar algunas propiedades genera-les de cinticas de enzimas, pero se usan rara vez para su prop-sito original de anlisis de datos.

1v0

= a KmVmx

b 1[S] +1Vmx

1v0

=Km

Vmx[S]+

[S]Vmx[S]

1v0

=Km + [S]Vmx[S]

142 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

Reacciones consecutivas

Reaccin ping-pong

A B P Q

E EA (EAB) (EPQ) EQ EOrdenada

A B P Q

E

EA EQE

EB

AB

EP

PQAleatoria

(EAB)(EPQ)

E

A Q

E

P B

F(EA)(FP) (FB)(EQ)

Figura 5.7Notacin para reacciones con bisustrato. a) Enlas reacciones consecutivas, todos los sustratosse enlazan antes de liberar un producto. Launin de los sustratos puede ser ordenada oaleatoria. b) En las reacciones ping-pong, unsustrato es enlazado y un producto es liberadodejando una enzima sustituida. Entonces se enlaza un segundo sustrato y se libera un segundo producto, con lo cual la enzima regresa a su forma original.

Las reacciones de multisustrato pueden efectuarse de acuerdo con varios y distin-tos esquemas cinticos llamados mecanismos cinticos porque se deducen en su totali-dad mediante experimentos cinticos. Los mecanismos cinticos son comnmenterepresentados con la notacin introducida por W. W. Cleland. Como se muestra en la fi-gura 5.7, la secuencia de pasos va de izquierda a derecha. La adicin de molculas desustrato (A, B, C, ) a la enzima y la liberacin de productos (P, Q, R, ) desde la en-zima se indican con flechas que apuntan hacia (unin de sustrato) o desde (liberacin deproducto) de la recta. Las diversas formas de la enzima (E libre, complejos ES o com-plejos EP) se escriben abajo de una lnea horizontal. Los complejos ES que sufrentransformacin qumica cuando el sitio activo est lleno se muestran entre parntesis.Las reacciones consecutivas (o secuenciales) (figura 5.7a) requieren que todos lossustratos estn presentes para que se libere algn producto. Estas reacciones secuencia-les pueden ser ordenadas, con un orden obligatorio de enlazamiento de sustratos y deliberacin de productos. Tambin pueden ser aleatorias, sin orden obligatorio de enlaza-miento o liberacin. En las reacciones ping-pong (figura 5.7b), se libera un productoantes de que se enlacen todos los sustratos. En una reaccin ping-pong de bisustrato, seenlaza el primer sustrato, se altera la enzima por sustitucin y se libera el primer pro-ducto, despus de lo cual se une el segundo sustrato, la enzima alterada regresa a su for-ma original y se libera el segundo producto. Debido al enlazamiento covalente de unaporcin de un sustrato a la enzima, a veces al mecanismo de ping-pong se le llama me-canismo de enzima sustituida. La unin y liberacin de ligandos en un mecanismo deping-pong se suelen indicar con lneas inclinadas. Las dos formas de la enzima se repre-sentan por E (no sustituida) y F (sustituida).

5.7 Inhibicin reversible de enzimas

Un inhibidor de enzima (I) es un compuesto que se enlaza con una enzima e interfierecon su actividad. Los inhibidores pueden actuar evitando la formacin del complejo ES

5.7 Inhibicin reversible de enzimas 143

Los inhibidores irreversibles se describenen la seccin 5.8.

o bloqueando la reaccin qumica que lleva a la formacin del producto. Por regla ge-neral, los inhibidores son molculas pequeas que se unen en forma reversible con laenzima que inhiben. Las clulas contienen muchos inhibidores enzimticos naturalesque juegan papeles importantes en la regulacin del metabolismo. Los inhibidores arti-ficiales se usan en experimentos para investigar los mecanismos enzimticos y paradescifrar las rutas metablicas. Algunas medicinas y muchos venenos son inhibidoresde enzimas.

Algunos inhibidores se unen en forma covalente con las enzimas y causando que lainhibicin sea irreversible. La mayor parte de la inhibicin de relevancia biolgica esreversible. Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas con las mismas fuerzas nocovalentes que enlazan a sustratos y productos. Los inhibidores reversibles se diferen-cian de los irreversibles por su fcil eliminacin de soluciones de enzima por mtodoscomo dilisis o filtracin en gel (seccin 3.6). El equilibrio entre la enzima libre (E)ms el inhibidor (I) y el complejo EI se caracteriza por una constante de disociacin. Eneste caso, a la constante se le llama constante de inhibicin, Ki.

(5.27)

Los tipos bsicos de inhibicin reversible son competitiva, acompetitiva y no compe-titiva. Se pueden diferenciar de manera experimental por sus efectos sobre el comporta-miento cintico de las enzimas (tabla 5.3). La figura 5.8, en la pgina siguiente, muestradiagramas que representan los modos de inhibicin enzimtica reversible.

A. Inhibicin competitiva

Los inhibidores competitivos son los que se encuentran con ms frecuencia en bioqu-mica. En la inhibicin competitiva, el inhibidor slo se puede unir a molculas de enzi-ma libre que no estn unidas a sustrato alguno. La inhibicin competitiva se ilustra conlas figuras 5.8a y 5.8b, y por el esquema cintico de la figura 5.9a en la pgina 145.En este esquema slo ES puede llevar a la formacin de producto. La formacin de uncomplejo EI quita a la enzima de su ruta normal.

Cuando un inhibidor competitivo se une con una molcula de enzima, una molcu-la de sustrato no puede unirse a esa molcula de enzima. Al revs, la unin de sustratoy una molcula de enzima evita el enlazamiento de un inhibidor. En otras palabras, S eI compiten por unirse a la molcula de enzima. Ms comnmente, S e I se unen al mis-mo sitio de la enzima, el sitio activo. Este tipo de inhibicin (figura 5.8a) se llama inhi-bicin competitiva clsica. No es la nica clase de inhibicin competitiva. En algunoscasos, como en las enzimas alostricas (seccin 5.10), el inhibidor se une a un sitio di-ferente, lo que altera el sitio de unin del sustrato y evita esta unin (figura 5.8b). A estetipo de inhibicin se le llama inhibicin competitiva no clsica. Cuando estn presentestanto I como S en una solucin, la proporcin de la enzima que puede formar complejosIS depende de las concentraciones de sustrato e inhibidor y de sus afinidades relativashacia la enzima.

La cantidad de EI se puede reducir aumentando la concentracin de S. A con-centraciones suficientemente altas, la enzima puede estar saturada con sustrato.

E + I EI Kd = Ki =[E][I][EI]

Tipo de inhibidor Efecto

Competitivo (I slo se une a E) Aumenta KmVmx permanece sin cambio

Acompetitivo (I slo se une a ES) Vmx y Km desciendenNo cambia la relacin Vmx/Km

No competitivo (I se une a E o a ES) Vmx desciendeKm permanece sin cambio

TABLA 5.3 Efectos de inhibidores reversibles sobre constantes cinticas

144 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

Inhibicin competitiva clsica

I

S

Inhibicin acompetitiva

S

SI

Inhibicin no competitiva

I

S

I S

Inhibicin competitiva no clsica

S

I

Figura 5.8Diagramas de inhibicin enzimtica reversible.En este esquema, las enzimas catalticamentecompetentes estn en gris claro y las enzimasinactivas estn en gris oscuro. a) Inhibicincompetitiva clsica. S e I se unen al sitio acti-vo en una forma mutuamente excluyente. b) Inhibicin competitiva no clsica. La unin de S con el sitio activo evita la uninde I a un sitio separado y viceversa. c) Inhi-bicin acompetitiva. I se une slo al complejoES. La enzima se inactiva cuando se enlazacon I. d) Inhibicin no competitiva. I se puede unir a E o a ES. La enzima se inactivacuando se enlaza I. Aunque al complejo EIpueda unirse todava S, no se forma producto.

5.7 Inhibicin reversible de enzimas 145

Benzamidina

CNH2H2 N

NH

CH2

CH2

CH2

CH

Arginina

CNH2H2 N

NH3 COO

Figura 5.10Benzamidina y arginina. La benzamidinacompite con los residuos de arginina en launin con la tripsina.

En consecuencia, la velocidad mxima es la misma en presencia o en ausencia de un in-hibidor. Mientras ms inhibidor competitivo est presente, se necesitar ms sustratopara llegar a la mitad de la saturacin. Ha sido demostrado que la concentracin de sus-trato correspondiente a la mitad de saturacin es la Km. As, en presencia de concentra-ciones crecientes de un inhibidor competitivo, aumenta la Km. El nuevo valor se suelellamar Km aparente (Kmapp). En una grfica de doble recproco, la adicin de un inhibi-dor competitivo produce una disminucin del valor absoluto de la abscisa al origen(1/Km), mientras que la ordenada al origen (1/Vmx) permanece igual (figura 5.9b).

Muchos inhibidores competitivos clsicos son anlogos al sustrato, compuestosque se parecen en su estructura a los sustratos. Los anlogos se unen a la enzima, perono reaccionan. Por ejemplo, la benzamidina es un inhibidor competitivo de la tripsina(figura 5.10). La tripsina cataliza la hidrlisis de los enlaces peptdicos cuyos gruposcarbonilo contienen residuos de arginina y lisina, y la benzamidina es un anlogo de lacadena lateral de alquilguanidilo en la arginina. La benzamidina acta como inhibidorque compite con los residuos de arginina en pptidos por la unin de la tripsina.

B. Inhibicin acompetitiva

Los inhibidores acompetitivos slo se unen al ES y no a la enzima libre (figuras 5.8c y5.11a). En la inhibicin acompetitiva disminuye la Vmx (aumenta 1/Vmx) por conver-sin de algunas molculas de E en la forma inactiva ESI. Ya que es el complejo ES elque se enlaza con I y la disminucin de Vmx no se revierte por la adicin de ms sustrato.Tambin, los inhibidores acompetitivos hacen descender la Km (vista como un aumentodel valor absoluto de 1/Km en una grfica de doble recproco) ya que los equilibrios deformacin de ES y de ESI son desplazados hacia los complejos, por la unin de I. Ex-perimentalmente, las lneas de una grfica de doble recproco representando concentra-ciones variables de un inhibidor acompetitivo, tienen todas la misma pendiente, lo queindica que los valores de Km y de Vmx decrecieron proporcionalmente (figura 5.11b).Este tipo de inhibicin suele presentarse en las reacciones de multisustrato.

+E P+E S ES+I

EI

Ki

kcatk1k

1

Control

[I]

1[S]

v0

1

1Km

1Vmx

1Km

app

Figura 5.9Inhibicin competitiva. a) Esquema cinticopara ilustrar el enlace de I con E. Ntese quees una ampliacin de la ecuacin 5.11, que incluye la formacin del complejo EI. b) Grfica de doble recproco. En la inhibi-cin competitiva, Vmx permanece sin cam-biar y Km aumenta. La lnea negra llamadaControl es el resultado en ausencia de inhibidor. Las lneas grises son los resultadosen presencia de inhibidor, y la flecha indica la direccin del aumento de la [I].

ES+I

ESI

Ki

+E P+E S

Control

1[S]

v0

1 [I]

Figura 5.11Inhibicin acompetitiva. a) Esquema cinticoque ilustra el enlace de I con ES. b) Grficade doble recproco. En la inhibicin acompe-titiva decrecen tanto Vmx como Km (es decir,aumentan los valores absolutos de 1/Vmx yde 1/Km obtenidos de las coordenadas x y y al origen, respectivamente). La relacinKm/Vmx es la pendiente de las rectas y per-manece sin cambio.

146 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

+E S ES+I

EI + S

+I

ESI

+E P

Ki KiControl

1[S]

v0

1 [I]

Figura 5.12Inhibicin no competitiva clsica. a) Esquemacintico que ilustra el enlace de I con E o conES. b) Grfica de doble recproco. Vmx dismi-nuye, pero Km permanece igual.

C. Inhibicin no competitiva

Los inhibidores no competitivos se pueden unir a la E o al ES y formar complejos inac-tivos EI o ESI, respectivamente (figuras 5.8d y 5.12a). Esos inhibidores no son anlo-gos del sustrato y no se enlazan en el mismo sitio que el S. El caso clsico de inhibicinno competitiva se caracteriza por una disminucin aparente de Vmx (1/Vmx pareceaumentar) sin cambiar de la Km. En una grfica de doble recproco, las lneas de la in-hibicin no competitiva clsica se cruzan en el punto del eje x que corresponde a 1/Km(figura 5.12b). Esta ordenada al origen comn indica que Km no se afecta. El efecto dela inhibicin no competitiva est dada por la interaccin del I con la E y el ES en for-ma reversible, eliminando las molculas de enzima activa en la solucin. Esta inhibi-cin no se puede compensar agregando S. Es rara la inhibicin no competitiva clsica,pero se conocen ejemplos entre las enzimas alostricas. En esos casos, es probable queel inhibidor no competitivo altere la conformacin de la enzima, cuya forma todava lepermita seguir unindose al S pero sin poder catalizar reaccin alguna.

La mayor parte de las enzimas no se apega a la forma clsica de inhibicin no com-petitiva, donde no cambia Km. En la mayora de los casos se afectan tanto la Vmx comola Km, ya que la afinidad del inhibidor hacia la E es distinta que hacia ES. En esos casosse suelen llamar de inhibicin mixta.

D. Usos de la inhibicin enzimtica

La inhibicin enzimtica reversible permite contar con un mtodo poderoso para deter-minar la actividad enzimtica y para alterarla en el tratamiento de enfermedades. Sepuede obtener informacin acerca de la forma y de la reactividad qumica del sitio acti-vo de una enzima a partir de experimentos que impliquen una serie de inhibidores com-petitivos con estructuras alteradas en forma sistemtica.

La industria farmacutica recurre a estudios de inhibicin enzimtica para disearmedicamentos de uso clnico. En muchos casos se usa un inhibidor natural de una enzi-ma como punto de partida para disear un medicamento. En lugar de usar sntesis alea-torias y determinar inhibidores potenciales, algunos investigadores estn recurriendo aun mtodo ms eficiente llamado diseo racional de un frmaco. En teora, con el bancode conocimientos tan amplio acerca de la estructura de las enzimas, hoy pueden dise-arse inhibidores en forma racional que se ajusten al sitio activo de determinada enzi-ma. Los efectos de un compuesto sinttico se determinan primero en enzimas aisladas,y despus en sistemas biolgicos. Aun cuando un compuesto desarrolle una actividadinhibidora adecuada, se pueden encontrar otros problemas. Por ejemplo, puede ser queel frmaco no entre a las clulas diana, o que se metabolice muy rpido y se conviertaen un compuesto inactivo, o que sea txico al organismo husped, o que la clula dianapueda desarrollar resistencia al agente en estudio.

Los progresos en la sntesis de frmacos o medicamentos se ejemplifican por el di-seo de una serie de inhibidores de la enzima purina nuclesido fosforilasa. Esta enzi-ma cataliza una reaccin de degradacin entre fosfato y el nuclesido de guanosinacuya estructura se observa en la figura 5.13a. Con modelado por computadora, se disea-ron las estructuras de inhibidores potenciales y se ajustaron al sitio activo de la enzima.Uno de tales compuestos (figura 5.13b) fue sintetizado y se encontr que es 100 veces

5.8 Inhibicin enzimtica irreversible 147

NH2N

OH

HH

H

HOCH2

H

OH

O

O

N

HN N9

HN

N

N

ClH2C

OOC

HO

H2N

Figura 5.13Comparacin de un sustrato y un inhibidordiseado, de la purina nuclesido fosforilasa.Los dos sustratos de esta enzima son guanosi-na y un fosfato inorgnico. a) Guanosina. b) Un inhibidor potente de la enzima. El N-9de la guanosina se ha sustituido por un tomode carbono. El anillo de benceno clorado seune al sitio de unin de azcares con la enzi-ma, y la cadena lateral de acetato se enlazacon el sitio de unin del fosfato.

ms inhibidor que cualquier compuesto obtenido con el mtodo tradicional de aproxi-macin por ensayo y error. Se espera que el mtodo de diseo racional produzca medi-camentos adecuados para tratar afecciones de autoinmunidad como artritis reumatoidey esclerosis mltiple.

5.8 Inhibicin enzimtica irreversible

En contraste con un inhibidor enzimtico reversible, un inhibidor enzimtico irreversibleforma un enlace covalente estable con una molcula de enzima y elimina as las mol-culas del sitio activo en la poblacin enzimtica. Tpicamente, la inhibicin irreversibleocurre por alquilacin o acilacin de la cadena lateral de un residuo de aminocido enel sitio activo. Hay muchos inhibidores irreversibles naturales, al igual que hay ejem-plos sintticos que se describirn aqu.

Una aplicacin importante de los inhibidores irreversibles es la identificacin de re-siduos de aminocidos en el sitio activo, por sustitucin especfica de sus cadenas latera-les reactivas. En este proceso, un inhibidor irreversible que slo reacciona con un tipo deaminocido se incuba con una solucin de la enzima, la que a continuacin es analizadapara determinar su prdida de actividad. Las cadenas laterales ionizables se modifican conreacciones de acilacin o alquilacin. Por ejemplo, los grupos amino libres, como el grupoe-amino de la lisina, reaccionan con un aldehdo para formar una base de Schiff, la cual sepuede estabilizar por reduccin con borohidruro de sodio (NaBH4) (figura 5.14).

El gas nervioso fluorofosfato de diisopropilo (DFP, de diisopropyl fluorophosphate)es un qumico del grupo de compuestos orgnicos de fsforo que inactivan a las hidro-lasas con una serina reactiva como parte del sitio activo. A estas enzimas se les llamaserina proteasas o serina esterasas, dependiendo de la especificidad de su reaccin. Laquimotripsina una serina proteasa, es una importante enzima digestiva, que es inhibidaen forma irreversible por el DFP (figura 5.15, pgina 148). El DFP reacciona con el re-siduo de serina en el sitio activo de la quimotripsina (Ser-195) y produce diisopropilfos-foril-quimotripsina. En agricultura se usan algunos inhibidores organofsforados comoinsecticidas; otros, como el DFP, son buenos reactivos en la investigacin de enzimas.Los gases nerviosos originales de organofsforo son venenos de toxicidad extrema, de-sarrollados para usos militares. La accin biolgica principal de dichos venenos es lainhibicin irreversible de la acetilcolinesterasa, una serina esterasa que cataliza la hi-drlisis de la acetilcolina, un neurotransmisor. Cuando la acetilcolina liberada de unaclula nerviosa activada se une a su receptor en una segunda clula nerviosa, activandoel impulso nervioso. La accin de la acetilcolinesterasa restaura a la clula a su estadode reposo. La inhibicin de esta enzima puede causar parlisis.

Los inhibidores reversibles con estructuras que les permitan unirse en forma espe-cfica a un sitio activo son ms tiles que los reactivos generales de sustitucin. Estosinhibidores se llaman reactivos dirigidos al sitio activo, o marcadores de afinidad. Elfosfato de bromohidroxiacetona es un marcador de afinidad para la triosa fosfato iso-merasa, que cataliza la interconversin de fosfato de dihidroxiacetona y el 3-fosfato degliceraldehdo. Este inhibidor reacciona con la cadena lateral de un residuo de glutama-to de la enzima (figura 5.16, pgina 148). Con experimentos como ste se identific queel Glu-165 es un componente del sitio activo de la triosa fosfatoisomerasa.

C

NaBH4

H2O

H2O

(CH2)4

CH

O

R

+

NH2

Lys

N

HR

Base de Schiff

(CH2)4

Lys

CH2

NH

R

(CH2)4

Lys Figura 5.14Reaccin del grupo e-amino del residuo de li-sina con un aldehdo. La reduccin de la basede Schiff con borohidruro de sodio (NaBH4)forma una enzima sustituida estable.

En la seccin 6.4A se presentan los deta-lles de esta reaccin de isomerasa.

148 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

F

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Ser-195

C O P O C

F

O

..

CH2

OH

H

H3C

CH3

H

CH3

H3C

C O P O C

F

OH3C CH3

O

H

H3C CH3

H

Ser-195

CH2

C O P O C

OH3C CH3

O

Diisopropilfosforil-quimotripsina

H

H3C CH3

H

Ser-195

CH2

H

Figura 5.15Reaccin de fluorofosfato de diisopropilo (DFP)con un solo residuo de serina, muy nucleoflico(Ser-195) en el sitio activo de la quimotripsina;produciendo diisopropilfosforil-quimotripsina,inactiva. El DFP inactiva las serina proteasas yserina esterasas.

ONaBH4

Br(CH2)2

C

CH2 Br

C

Glu

C

(CH2)2

Glu

O

C

CH2

(CH2)2

Glu

OO

CH2OPO3

O

O

CH2

C O

CH2OPO3

O

CHOH

CH2OPO322

2

Fosfato de bromohidroxiacetonaFigura 5.16Inhibicin irreversible de la triosa fosfato isomerasa. El anlogo 1-bromo del fosfato de dihidro-xiacetona reacciona con la cadena lateral del residuo de glutamato del sitio activo. La reduc-cin del grupo carbonilo del sustituyente mediante NaBH4 evita la migracin del indicador deafinidad hacia otro grupo.

5.9 Enzimas alostricas

Las enzimas alostricas son enzimas cuyas propiedades son afectadas por cambios en laestructura. Los cambios estructurales son ocasionados por interaccin con molculaspequeas. Se plante un ejemplo de alosterismo en el captulo anterior al examinar launin del oxgeno a la hemoglobina. Con frecuencia, las enzimas alostricas no presen-tan cintica clsica de Michaelis-Menten debido a su unin cooperativa del sustrato,como el caso de la hemoglobina, que no es enzima.

La figura 5.17 muestra una curva de y0 en funcin de [S] para una enzima alostricacon enlazamiento cooperativo del sustrato. Las curvas sigmoides se deben a la transicinentre dos estados de la enzima. En ausencia del sustrato, la enzima est en el estado T.La conformacin de cada subunidad presenta una forma en la que se une ineficiente-mente al sustrato y la velocidad de la reaccin es baja. A medida que la concentracinde sustrato aumenta, las molculas de enzima comienzan a unirse al sustrato, aunque laafinidad de la enzima en el estado T sea baja. Cuando una subunidad se une al sustratosufre un cambio de conformacin que la convierte al estado R y se efecta la reaccin.Las propiedades cinticas de la subunidad enzimtica en el estado T y en el estado Rson bastante distintas; cada conformacin podra, por s misma, exhibir una cinticanormal de Michaelis-Menten.

El cambio de conformacin en la subunidad que al principio se enlaza a una mol-cula de sustrato afecta las dems subunidades en la enzima multisubunidades. Las con-formaciones de esas otras subunidades se desplazan hacia el estado R, donde es muchomayor su afinidad hacia el sustrato. Ahora se pueden unir al sustrato a una concentra-cin mucho menor que cuando se hallaban en el estado T.

5.10 Regulacin de la actividad enzimtica

Al principio de este captulo se present una lista de las diversas ventajas que supone eluso de enzimas como catalizadores en reacciones bioqumicas. Es claro que la ventajams importante es acelerar reacciones que de otro modo seran muy lentas para mante-ner la vida. Otra de las ventajas de las enzimas es que su actividad cataltica se puederegular de varias maneras. La cantidad de una enzima se puede controlar regulando lavelocidad de su sntesis o de su degradacin. Este modo de control se presenta en todaslas especies, pero con frecuencia se tarda de muchos minutos a horas sintetizar nuevasenzimas o degradar las enzimas existentes.

En todos los organismos, el control rpido, a escala de segundos o menos, se pue-de lograr mediante modulacin reversible de la actividad de enzimas reguladoras. En

5.10 Regulacin de la actividad enzimtica 149

[S]

v0

Figura 5.17Grfica de la velocidad inicial en funcin de laconcentracin del sustrato para una enzimaalostrica que tiene enlazamiento cooperativodel sustrato.

este contexto las enzimas reguladoras se definen como aquellas cuya actividad sepuede modificar en una forma que afecte la velocidad de una reaccin catalizada por laenzima. (En muchos casos, tales enzimas reguladoras controlan un paso clave en unaruta metablica. Cuando se describa la regulacin de una ruta, a veces se designarncomo enzimas reguladoras a las enzimas que regulan el flujo de metabolitos en unaruta). La actividad de una enzima regulada cambia como respuesta a seales del am-biente y permite que la clula responda a las condiciones variables, con ajuste de lasvelocidades de sus procesos metablicos.

En general, las enzimas reguladoras se vuelven catalizadores ms activos cuandoaumenta la concentracin de sus sustratos o cuando disminuyen las concentraciones delos productos de sus rutas metablicas. Se vuelven menos activas cuando disminuyenlas concentraciones de sus sustratos o cuando se acumulan los productos de sus rutasmetablicas. La inhibicin de la nica enzima inicial en una ruta conserva tanto materia-les como energa, evitando la acumulacin de compuestos intermedios y del productofinal. Las enzimas reguladoras se pueden clasificar por el mtodo de su modulacin:modulacin alostrica no covalente o modificacin covalente.

Los fenmenos alostricos son los responsables del control reversible de numero-sas enzimas reguladoras. En la seccin 4.13C se explic cmo cambia la conformacinde la hemoglobina y su afinidad hacia el oxgeno cuando se le une 2,3-bisfosfoglicera-to. Muchas enzimas reguladoras tambin sufren transiciones alostricas entre los esta-dos activo (R) e inactivo (T), como se describi en la seccin anterior. Estas enzimasdisponen de un segundo sitio de unin para el ligando, alejado de sus centros catalti-cos. Este segundo sitio se llama sitio regulador o sitio alostrico. Un inhibidor o acti-vador alostrico, que tambin se llama modulador alostrico o efector alostrico, se uneal sitio regulador y causa un cambio de conformacin en la enzima reguladora. Estecambio de conformacin es transmitido al sitio activo de la enzima, el cual cambia deforma lo suficiente para alterar su actividad. Los sitios regulador y cataltico son regionesfsicamente diferentes de la protena en general se encuentran en dominios separa-dos, y a veces en subunidades separadas. Las enzimas con regulacin alostrica suelenser ms grandes que otras enzimas. (Ntese que tambin la actividad de una enzima re-guladora se puede controlar por modificacin covalente).

Primero se ha de examinar una enzima que presenta regulacin alostrica (nocovalente) y despus se mencionarn algunas propiedades generales de tales enzimas.A continuacin se describen dos teoras que se proponen para explicar la regulacinalostrica en funcin de cambios en la conformacin de las enzimas reguladoras. Porltimo, se describir un grupo de enzimas reguladoras estrechamente relacionadas lascuales estn sujetas a modificacin covalente.

A. Fosfofructocinasa, una enzima alostrica

La fosfofructocinasa-1 de la bacteria Escherichia coli es un buen ejemplo de inhibiciny activacin alostrica. La fosfofructocinasa-1 cataliza la fosforilacin dependiente deATP del 6-fosfato de fructosa para producir 1,6-bis-fosfato de fructosa y ADP (figura5.18). Esta reaccin es uno de los primeros pasos de la gluclisis, una ruta de degrada-cin de la glucosa generadora de ATP (que se describir en detalle en el captulo 11). Elfosfoenolpiruvato (figura 5.19) es un compuesto intermedio, cercano al final de la ruta

En el captulo 18 se describir la aspartatotranscarbamoilasa (ATCasa), otra enzimaalostrica bien caracterizada.

Fructosa 6-fosfato

CH2OH

HO

OC

C

OHCH

OHCH

H

CH2OPO32

Fructosa 1,6-bifosfato

HO C

OHCH

OHCH

H

CH2OPO32

OC

CH2OPO32

Fosfofructocinasa-1

ATP ADP

Figura 5.18Reaccin catalizada por fosfofructocinasa-1.

150 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

C

CH2

COO

OPO32

Figura 5.19Fosfoenolpiruvato, intermediario de la gliclisisy un inhibidor alostrico de la fosfofructocina-sa-1 de Escherichia coli.

Figura 5.20Conformacin R de la fosfofructocinasa-1 deE. coli. La enzima es un tetrmero de cadenasidnticas. a) Una subunidad, representadapor una cinta. Los productos, fructosa 1,6-bi-fosfato (amarillo) y ADP (verde) estn unidosen el sitio activo. El activador alostrico ADP(rojo) est enlazado en el sitio regulador. b) Tetrmero. Dos estn en azul y dos enprpura. Los productos, fructosa 1,6-bifosfato(amarillo) y ADP (verde) estn enlazados enlos cuatro sitios activos. El ADP, activadoralostrico (en rojo), est unido en los cuatrositios reguladores en la interfase de las sub-unidades. [PDB 1PFK]. (Vase esta figura atodo color al final del libro).

glucoltica, es un inhibidor alostrico de la fosfofructocinasa-1 de E. coli. Cuando laconcentracin de fosfoenolpiruvato aumenta, significa que la ruta metablica estbloqueada ms adelante de ese punto. La produccin continua de fosfoenolpiruvato esevitada al inhibir la fosfofructocinasa-1.

El ADP es un activador alostrico de la fosfofructocinasa-1. Eso puede parecer ex-trao, al contemplar la figura 5.18, pero tngase en mente que la ruta general de la glu-clisis da como resultado la sntesis neta de ATP a partir de ADP. Si las concentracionesde ADP aumentan, esto implica que hay deficiencia de ATP y debe estimularse la glu-clisis. As, el ADP activa la fosfofructocinasa-1, a pesar del hecho (o debido al he-cho?) de que el ATP es hidrolizado en esta reaccin en particular.

El fosfoenolpiruvato y el ADP afectan la unin del sustrato 6-fosfato de fructosacon la fosfofructocinasa-1. Con experimentos cinticos se ha demostrado que hay cuatrositios de enlace en la fosfofructocinasa-1 para el 6-fosfato de fructosa, y con experi-mentos para determinacin de estructura se ha confirmado que la fosfofructocinasa-1de E. coli (Mr 140 000) es un tetrmero formado por cuatro subunidades idnticas. Lafigura 5.20 muestra la estructura de la enzima acomplejada con sus productos, fructosa1,6-bifosfato y ADP, y una segunda molcula de ADP, un activador alostrico. Las cua-tro cadenas alargadas se asocian simtricamente para formar dos dmeros en el olig-mero nativo. Los dos productos estn enlazados en el sitio activo, el cual est entre dosdominios de cada cadena el ADP se une al dominio grande y el 1,6-bifosfato de fruc-tosa se enlaza principalmente al dominio pequeo.

Una propiedad notable de la estructura de la fosfofructocinasa-1 (y una propiedadgeneral de las enzimas reguladoras) es la separacin fsica del sitio activo y el sitio re-gulador en cada subunidad. (En algunas enzimas reguladoras, los sitios activo y regula-dor se hallan en distintas subunidades). El activador ADP se une a cierta distancia delsitio activo, en un orificio profundo entre las subunidades. Cuando el ADP se une al si-tio regulador, la fosfofructocinasa-1 asume la conformacin R, que tiene gran afinidadhacia el 6-fosfato de fructosa. Cuando el fosfoenolpiruvato, un compuesto ms peque-o, se enlaza con el mismo sitio regulador, la enzima asume una conformacin diferen-te, la conformacin T, con menor afinidad hacia el 6-fosfato de fructosa. La transicinentre las conformaciones se logra mediante una pequea rotacin de un dmero rgidorespecto del otro. La cooperatividad de unin con el sustrato depende del movimientoconcertado de un residuo de arginina en cada uno de los cuatro sitios de unin con 6-fosfato de fructosa, cerca de la interfase entre los dmeros. El movimiento de la cadenalateral de esta arginina alejndose del sitio activo hace descender la afinidad hacia el6-fosfato de fructosa. En muchos organismos, la fosfofructocinasa-1 es ms grande yest sujeta a una regulacin alostrica ms compleja que la de E. coli, como se ver enel captulo 11.

Los activadores pueden afectar ya sea la Vmx, o la Km o ambas. Es importantereconocer que la unin de un activador altera la estructura de una enzima y que estaalteracin la convierte en una forma diferente que puede tener propiedades cinticasdistintas. En la mayor parte de los casos, las diferencias entre las propiedades cinti-cas de las formas R y T son ms complejas que las que se estudiaron con los inhibidoresde enzima en la seccin 5.7.

B. Propiedades generales de las enzimas alostricas

La examinacin de las propiedades cinticas y fsicas de las enzimas alostricas hademostrado que poseen las siguientes caractersticas generales:

1. Las actividades de las enzimas alostricas cambian debido a inhibidores y activa-dores metablicos. Con frecuencia, dichos moduladores alostricos no se parecen alos sustratos o a los productos de la enzima. Por ejemplo, el fosfoenolpiruvato(figura 5.19) no se parece al sustrato ni al producto (figura 5.18) de la fosfo-fructocinasa. Una consideracin de las diferencias estructurales entre sustra-tos e inhibidores metablicos llev originalmente, a la conclusin de que losmoduladores alostricos estn unidos a sitios reguladores, separados de los sitioscatalticos.

5.10 Regulacin de la actividad enzimtica 151

2. Los moduladores alostricos se enlazan en forma no covalente a las enzimas queregulan. (Hay un grupo especial de enzimas reguladoras cuyas actividades soncontroladas por modificacin covalente y se describen en la seccin 5.10D). Mu-chos moduladores alteran la Km de la enzima para un sustrato; otros, la Vmx de laenzima. Los moduladores mismos no son alterados qumicamente por la enzima.

3. Con pocas excepciones, las enzimas reguladoras son protenas de subunidadesmltiples. (Sin embargo, no todas las enzimas de subunidades mltiples son re-guladoras). Las cadenas polipeptdicas individuales de una enzima reguladorapueden ser idnticas o diferentes. Para aquellas enzimas que tienen subunidadesidnticas (como la fosfofructocinasa-1 de E. coli), cada cadena polipeptdica puedecontener los sitios cataltico y regulador a la vez y el oligmero es un complejosimtrico que con frecuencia posee dos o cuatro cadenas de protena. Las enzi-mas reguladoras formadas por subunidades diferentes tienen ordenamientos mscomplejos, pero en general simtricos.

4. Toda enzima sujeta a regulacin alostrica posee cuando menos un sustrato parael cual la curva de v0 en funcin del [S] es sigmoidea en lugar de hiperblica(seccin 5.9). La fosfofructocinasa-1 exhibe una cintica de Michaelis-Menten(hiperblica) con respecto a un sustrato, ATP, pero cintica sigmoidea en relacincon su otro sustrato, el 6-fosfato de fructosa. La curva sigmoidea es causada porla cooperacin positiva del enlace del sustrato, lo cual es posible por la presenciade mltiples sitios de enlace del sustrato en la enzima.

La figura 5.21 ilustra el papel regulador que puede desempear el enlazamientocooperativo. La adicin de un activador puede desplazar la curva sigmoidea hacia unaforma hiperblica, con descenso de la Km aparente (la concentracin de sustrato nece-saria para la mitad de la saturacin) y aumento de la actividad a determinada [S]. Laadicin de un inhibidor puede aumentar la Km de la enzima y reducir su actividad a unaconcentracin particular del sustrato.

La transicin alostrica entre las conformaciones activa e inactiva deuna enzima reguladora es rpida. La relacin de R a T se controla por las concentracio-nes de los diversos ligandos y por las afinidades relativas de cada conformacin haciatales ligandos. En los casos ms simples, las molculas de sustrato y activador slo seunen a la enzima en el estado R (ER) y las molculas de inhibidor slo se unen a laenzima en el estado T (ET).

R T

Vmx

[S]

v0Vmx

2

E + Activador

E + Inhibidor

Km

E

KmappKm

app

Figura 5.21Papel de la cooperatividad de enlace en laregulacin. La actividad de una enzima alos-trica con curva sigmoidea de enlazamientose puede alterar marcadamente cuando unactivador o un inhibidor se unen a la enzima.La adicin de un activador puede hacer des-cender la Km aparente, elevando la actividada determinada [S]. Al revs, la adicin de uninhibidor puede elevar la Km aparente y pro-ducir menos actividad a una [S] dada.

Transicinalostrica

ER SER

S

S

ETET I

I

I

(5.28)

La adicin de S causa un aumento en la concentracin de la enzima en su conformacinR. Al revs, la adicin de I aumenta la proporcin de la especie T.

152 CAPTULO 5 Propiedades de las enzimas

Estado RTransicinalostrica

S

S

S

S

S

S

S

S

Estado R

Estado T Estado T

S

SS

SSS

S SS S

S

SS

S SS

S SSS

Figura 5.22Dos modelos de cooperatividad de enlaza-miento de sustrato (S) con una protena tetramrica. a) En el modelo concertado simplificado, todas las subunidades estn enel estado R o en el estado T y S slo se enlazaal estado R. b) En el modelo secuencial, elenlazamiento de S a una subunidad slo convierte esa subunidad a la conformacin R.Las subunidades vecinas pueden quedar en elestado T o pueden asumir las conformacionesentre T y R.

Las molculas de activador se enlazan de preferencia a la conformacin R y causanun aumento en la relacin R/T. Ntese que este esquema simplificado no muestra quehaya muchos sitios de enlace que interactan, tanto para S como para I.

Algunos inhibidores alostricos son competitivos no clsicos (figura 5.8b). Porejemplo, la figura 5.21 describe una enzima que tiene una Km aparente mayor para susustrato en presencia de un inhibidor alostrico, pero una Vmx que no cambia. En con-secuencia, el modulador alostrico es un inhibidor competitivo.

Algunas enzimas reguladoras presentan patrones de inhibicin no competitiva(figura 5.8d). El enlazamiento de un modulador al sitio regulador no evita que el sus-trato se enlace, pero parece que distorsiona la conformacin del sitio activo lo suficien-te para disminuir la actividad de la enzimtica.

C. Dos teoras de la regulacin alostrica

Hay dos modelos que explican la cooperatividad de enlazamiento de ligandos a prote-nas oligomricas que se han ganado el reconocimiento general. Tanto la teora concer-tada como la teora secuencial describen las transiciones cooperativas en trminoscuantitativos simples. La ltima es una teora ms general; la primera es adecuada paraexplicar muchas enzimas alostricas.

La teora concertada, o teora inducida por simetra, fue inventada para explicarla unin cooperativa de ligandos idnticos como los sustratos. Se supone que hay un si-tio de unin por cada subunidad y para cada ligando; tambin que la conformacin decada subunidad est restringida por su asociacin con otras subunidades, y que cuandola protena cambia de conformacin conserva su simetra molecular (figura 5.22a). As,hay dos conformaciones en equilibrio, la R (con gran afinidad hacia el sustrato) y la T(con baja afinidad hacia el sustrato). La unin con el sustrato desplaza al equilibrio.Cuando la conformacin de la protena cambia, tambin lo hace la afinidad de sus sitiosde unin a ligandos. La teora concertada se ampli para incluir la unin de moduladores

5.10 Regulacin de la actividad enzimtica 153

alostricos y se puede simplificar suponiendo que el sustrato slo se enlaza al estado Ry que el inhibidor alostrico slo se une al estado T. La teora concertada se basa en lasimetra estructural observada en las enzimas reguladoras. Parece indicar que todas lassubunidades de una determinada molcula de protena tienen la misma conformacin,sean todas R o todas T; esto es, conservan su simetra cuando pasan del estado T al es-tado R. Los datos experimentales obtenidos con varias enzimas pueden explicarse conesta sencilla teora. Por ejemplo, muchas de las propiedades de la fosfofructocinasa-1de E. coli se ajustan a la teora concertada. En la mayor parte de los casos la teora con-certada no explica en forma adecuada todas las observaciones respecto a determinadaenzima. Su comportamiento es ms complejo que el que sugiere este sencillo modelode dos estados.

La teora secuencial, o teora inducida por ligando, es una proposicin ms general.Se basa en la idea de que un ligando puede inducir un cambio en la estructura terciariade la subunidad a la que se une. Este complej