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Escherichia coli
“O que vale para E. coli vale para elefantes”
Jacques Lucien Monod (1910 –1976)
Práticas microbiológicas
Escherichia coli
-Presente no intestino-Caracterizada em 1855 pelo Dr
Theodor Escherich– Cepa O157:H7 patogênica a
humanos– Cepa K-12 comensal– Auxilio nos estudos
pioneiros da biologia molecular• 100 mil publicações
(Lederberg, 2004)
Escherichia coli
• Unicelular na forma de bastão• Cresce rapidamente a 37oC
– ciclo de 20 min• Pouco exigente nutricionalmente• Meio mínimo ou rico
– Glicose - melhor fonte de C– Extrato de levedura - essenciais– Triptona e Peptona: fonte aminoácidos
Escherichia coli• Todas cepas derivam da K-12 • Denominação
– Nome do Laboratório e números representam sequencia de obtenção da cepa
– Cepas mais utilizadas (DH10, BL21, JM 109, HB 101, DH5a, XL blue,......)
• Nomenclatura para genes e marcas genéticas- 3 letras em itálico ou sublinhado indica locus
genético auxotrófico (his ou his -1)- Varias enzimas usa letras maiúsculas para
indicar locus (hisA, hisB)- O fenótipo é escrito em letra maiúscula His+ ou
His
Escherichia coli-DH10B
F- endA1 recA1 galE15 galK16 deoR nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ-
- BL21 (AI) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])
http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21.28AI.29
4.609.221 pares de base
Mapa de marcas e genético
SequenciamentoConjugação e mutantes auxotroficos
Plasmídeo
• DNA extra cromossomial– São menores que o principal– Alto replicativos– tamanho de 1 a > 200 Kpb– Determinam característica com resistência a
antibióticos ou síntese de enzimas de restrição
• Deles derivam os vetores utilizados na biologia molecular– Clonar fragmentos
Tipos de plasmídeos
Vetores de clonagem
• Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb– pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET
• Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético
Vetores de clonagemPlasmídeo
• Características para uso:– origem de replicação– marcadores de seleção
• resistência a antibiótico (ampR, tetR, CamR, KanR, )• gene lacZ - amino terminal b-galactosidase
(complementa)– IPTG e X - Gal
– sítio múltiplo de clonagem (MCS)– tamanho (quanto menor melhor!)
• Manipulação após purificacão– larga escala– “mini-prep” ou lise alcalina
Clonagem
pBR3221o plasmídeo -1977Bolivar et al 1977
Plasmídeos naturais
pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1
4363 pb
Seleção Transformação Placa Réplica
pUC81982
Vieira & Messing(pBR322 and M13mp8)
Plasmídeo pUC
• Mutanção no gene rop– Permite um maior numero de copias por celula
• Sistema lacZ’• Adicionar ao meio
– IPTG = isopropil thio galactose– X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-
galactopiranosídeo (branco/azul)
Bactérias para Transformação
• Células não apresentam fator de conjugação
• Não apresentam DNA plasmidial
• Precisam ser preparadas– Tornar-se competentes
• Transformação– Quimiotransformação– Eletroporação
F-
Prática Microbiológicas
Condições
• Estéril– Ambiente de
manipulação– Regentes e meio de
cultivo– Vidraria– Práticas devem
manter o ambiente estéril
Fluxo Laminar
Cultivo e conservação
• Meio cultivo– Indefinido– definido
• Consevação de microrganismos – Meses – placa de petri a 4oC, tubo inclinado.– 1ano – “stab”– 4 ano –
•glicerol 15-20% a -70 oC•DMSO entre 7-8% a -70 oC
Inoculação
• Inoculação– Estoque ou de um
cultivo
Isolamento
• Colônia isolada– formada a partir de
1 UFC (unidade formadora de colônia)
– Estoque ou de um cultivo
– Certificar da pureza do isolado
Curva de Crescimento
• Trabalhar com DNA recombinante priorizar fase exponencial (107 UCF, 109 UCFdificulta aeração)
• Inoculo inicial, colônia isolada, pré-cultivo (109), diluir de 10 ou 100 vezes, avaliar curva de crescimento por algumas horas
Curva de Crescimento
Pratica Microbiológicas-Contagem
– Diluição Serial• 1UCF entre 8-
16hs forma uma colônia visível ao olho nu
– Absorbância• 400-600 nm• 0,7 limite
Transferência horizontal de DNA